Lab5-Desarrollo_Mapas_Restriccion

Biol. 3030 – Biología del Desarrollo
Ejercicio 5 – Mapas de restricción
Introducción:
Con este ejercicio se pretende demostrar los principios básicos de
mapas
de
plásmidos
usando
enzimas
de
restricción
mediante
simulaciones y prácticas de bioinformática.
Enzimas de restricción:
Las enzimas de restricción fueron descubiertas por su habilidad de
degradar, digerir o restringir DNA extraño y son exclusivas de
procariotas. Ellas pueden distinguir entre el DNA normalmente
presente en la célula de aquel DNA que aparece por ejemplo por la
infección de un bacteriófago. Ellas defenderán a la célula de la
invasión cortando ese DNA extraño en fragmentos y dejándolo no
funcional.
Las
enzimas
mayormente
utilizadas
en
la
investigación
reconocen
secuencias
palindrómicas
de
4-6
pb.
Estas
secuencias leen lo mismo
de 5’3’ en ambos lados
de la doble cadena, son
específicas
para
cada
enzima y son conocidas
como
lugares
de
restricción (Figura 1).
La enzima hace un corte
en
el
enlace
fosfodiesterico
del
DNA
Figura 1. – Ejemplos de sitios de
en
una
posición
restricción para varias enzimas conocidas.
específica.
Sus
nombres
Asegúrese de notar el aspecto palindrómico
de la secuencia. Que indican las flechas?
provienen de la bacteria
(genero/especie/cepa) de la
cual se purifican así como el número purificadas de esta.
Bajo condiciones apropiadas,
(concentración de sal, pH y
temperatura), enzimas como EcoRI dejan un fragmento escalonado
(mientras AluI dejaría uno romo) en cada punto de la secuencia que
se encuentre su lugar de restricción. El número de fragmentos y los
tamaño depende de la ubicación de estos lugares en la secuencia
completa. Estas enzimas nucleasas se clasifican en endonucleasas y
exonucleasas dependiendo si necesitan o no extremos libres en un DNA
para digerir la molécula.
Plásmidos e Ingeniería genética
1
Los mapas de plásmidos han revolucionado la biología molecular y
pavimentado el camino para la industria de la biotecnología. Con
esta técnica el biólogo molecular puede evaluar rápidamente el éxito
que podría tener en experimentos de clonación, así como identificar
fácilmente plásmidos y los rasgos asociados a estos en los
organismos.
Los plásmidos son moléculas relativamente pequeñas de DNA extracromosomal de arreglo circular que se pueden replicar en la bacteria
independientemente del cromosoma. Por lo general estos contienen
genes que codifican para la resistencia a antibióticos, esto le da a
la bacteria que lo tenga una ventaja de selección sobre otras
bacterias que compitan por el medio de crecimiento. Rutinariamente
los científicos sacan ventaja del DNA del plásmido y de la defensa
natural de la bacteria (enzimas de restricción) como la base de la
biotecnología (Figura 2). Una vez que el plásmido es cortado en
fragmentos
por
la
enzima, estos pueden
ser unidos o ligados a
un pedazo de DNA de
cualquier
otro
organismo que también
hayan sido cortado con
la misma enzima. El
DNA-plásmido
híbrido
resultante
se
puede
introducir
en
bacterias
por
transformación.
Este
híbrido se replicará
por
si
mismo
como
antes, solo que el DNA
insertado
ahora
también es perpetuado
junto
a
el.
El
fragmento de DNA ajeno
al
plásmido
se
le
llama
que
fue
Figura 2 – Plásmido S5. Note sitio Ori, secuencia
“clonado”
y
al
beta lactamase y los múltiples lugares de
plásmido se le llama restricción
“vector”.
Mapas de Plásmidos
Los plásmidos
se pueden describir o representar en mapas en
términos de la localización de los sitios de restricción
usando
experimentos simples y lógica. El procedimiento en general es
digerir el plásmido con dos enzimas por separado (digestiones
simples) y una digestión simultánea con ambas enzimas (digestión
2
doble). Los tamaños de los productos de digestión se analizan en una
electroforesis y luego se usa la lógica para determinar la posición
relativa de los sitios de restricción. Como los plásmidos son
circulares, el número de fragmentos representan el número de cortes
o lugares de restricción. Como sería si el DNA fuera lineal? Para
visualizar este concepto mejor se puede utilizar una banda de goma y
cortarla con una tijera una vez, dos veces y así sucesivamente y
contar los pedazos luego de cada corte. La parte mas informativa del
los mapas de plásmidos resulta del uso de la lógica para solapar la
información de las digestiones simples con la de la doble. Como los
cortes con una enzima solapan con los cortes de la segunda enzima?
Hay detalles claves que ayudan:
- Queda cualquiera de los fragmentos sin cortarse cuando se usa
la segunda enzima.
- Los tamaños de los fragmentos de la digestión doble suman al
tamaño de uno de los fragmentos de la digestión simple?
- Algún fragmento se mantiene del mismo tamaño aun cuando lo
exponga a la segunda enzima? Revise el siguiente ejemplo
(figura 3)
Un plásmido de 1000 pb es digerido y los fragmentos separados en gel
de agarosa.
Marcador de
tamaño (pb)
Sin cortar
(pb)
1000
700
500
300
200
1000
Corte con
Enzima A
(pb)
Corte con
enzima B
(pb)
1000
Corte con
ambas (pb)
700
300
500
300
200
Figura 3. Ejemplo de análisis de datos sobre digestión de plásmidos con
enzimas d restricción.
Note que hay dos fragmentos de 1000pb (sin cortar y cortado con la
enzima B), pero corren igual en la gel? No necesariamente! Hay
pequeñas diferencias en la migración de un plásmido si está sin
cortar-relajado, lineal, o sin cortar-superenrrollado. También
3
fragmentos de tamaños parecidos
pueden co-migrar en la agarosa y
fragmentos muy pequeños pueden no observarse en la gel por la
sensibilidad de la tinción o porque se salen de la misma.
Como se lee un Mapa de plásmido?
Un mapa de plásmido incluye información básica sobre 1) el tamaño,
2) los genes presentes, 3) el origen de replicación y 4) los lugares
de restricción para enzimas. Los plásmidos a utilizarse en este
ejercicio salieron del pTZ18U pero contienen diferentes insertos de
DNA. Cualquiera de las enzimas marcadas como presentes en ellos se
podrían usar para analizarlos. Como la molécula es circular hay un 0
arbitrario y todos los lugares de restricción son indicados con un
número entre 0 y el total de pb en el plásmido. Los tamaños de los
fragmentos se calculan restando
o sumando los puntos en el
plásmido. El nombre del plásmido y su tamaño aparece en el centro
del circulo. El origen de replicación aparece marcado como Ori, el
gen para beta-lactamasa (enzimas que confiere la resistencia contra
ampicilina) y la localización para el DNA de bacteriófago lambda son
mostradas (Figuras 2 y 4).
Procedimiento:
1. Se le suministrarán hojas con secuencias para que identifique
lugares de restricción para enzimas y simule la actividad de
estas.
2. Se le suministrará un mapa de un plasmido para que conteste
preguntas sobre fragmentos, diagrame geles y construya mapas
usando bases de datos de bioinformática y simuladores.
3. Contestara las preguntas que acompañan cada ejercicio.
4. Virtual
lab
para
electroforesis
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/vi
rgel.html
5. Virtual
lab
para
mapas
con
enzimas
de
restricción
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes
/maps.html
6. Enzimas
de
restricción
y
otras
enzimas
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes
/index.html
4
Preguntas sobre lectura de
plásmidos:
1. usando
el
mapa
del
plásmido 2, prepare una
lista de las enzimas que
podrían dañar el gen de
la beta-lactamasa y la
secuencia de lambda.
2. Cual
plasmido
grande
el
2
Porque?
es
el
mas
5?
3. Usando el plasmido 2, cuantos lugares para PvuII hay. Cual es la
localización de cada uno? Si lo usaras para digerir este
plasmido, cuantos fragmentos se obtendrían?
4. Cuales son los tamaños de los fragmentos generados por PvuII en
S2?
5. Como se verán en una gel? Dibuja la gel y rotula carriles y los
fragmentos con sus tamaños
5
6. Ahora simularas una doble digestión con EcoRI y PstI.
Determina los tamaños. Completa la siguiente tabla:
Enzimas 
Fragmentos
Plásmido S2 (5869 pb)
EcoRI
PstI
Ambas
Total
7. Si el plásmido S2 fuera digerido y analizado en una gel de
Agarosa como se vería la gel? Diagrame la gel con los cortes
simples en carriles separados y con la digestión doble en un
tercer carril.
Construcción de un Mapa de Plásmido
1. El primer paso en la construcción de un mapa de restricción de
un plásmido es determinar cuantas veces se encuentra en el un
lugar de restricción. Veamos la data para el plásmido S5. Los
datos en la siguiente tabla son de digestiones dobles usando a
Eco RI y Pst I. Tambien hay datos de digestiones simples con
las mismas enzimas. Los números en las columnas representan los
6
tamaños de los fragmentos generados al digerirlo con cada
enzima.
Enzimas 
Fragmentos
Plásmido S5(9841 pb)
EcoRI
PstI
9481
2860
2838
1986
1093
468
164
72
Ambas
2832
2817
1986
1093
468
164
72
43
Total
Preguntas para el mapa de plásmido
1. Cuan grande es el plasmido S5? Como lo sabes?
2. Observa los datos de la digestión con EcoRI. Cuantos fragmentos
hay? Cortó la enzima el plásmido o este se quedó como un
circulo? Como puedes estar seguro?
3. Compara los datos de la digestión con PstI con los de la
digestión con EcoRI. Cuantos fragmentos hay con PsTI? Cuantos
lugares de restricción hay para PsTI?
4. Cuantos fragmentos hay cuando ambas enzimas se usan
simultáneamente para digerir a S5? Contesta esto la pregunta si
EcoRI digiere o no al plásmido? Porque?
7
5. Algun fragmento de la digestión con PsTI posee también un lugar
de reconocimiento para EcoRI? Cual es? Como sabes esto?
6. Dibuja el fragmento de PstI que también es reconocido por EcoRI
para documentarlo.
Preparación de un Mapa
La preparación de un mapa de restricción es un ejercicio de
pensamiento crítico y lógica. El plasmido S5 es difícil para formar
su mapa por que tiene mucho lugares para PstI. Con estos datos se
hace muy difícil colocar todos los lugares de restricción en orden.
Es mas fácil un mapa del plásmido S3.
7. En la siguiente tabla están los datos generados de la digestión
del plásmido S3 con las mismas enzimas. Cuantas veces corta cada
enzima? Cuales son los tamaños de los fragmentos?
Enzimas 
Fragmentos
Plásmido S3 (________________pb)
EcoRI
PstI
6504
4507
863
2860
Ambas
3687
2817
820
43
Total
8. De los datos de la digestión simple con EcoRI se desprende que
los tamaños no son iguales. Prepara un posible mapa y rotula
los lugares para Eco R1con sus tamaños.
8
9. Ahora dibuja un mapa sugerido para los lugares de PstI en S3.
Recuerda rotular lugares y tamaños de los fragmentos.
10.
Dibuja el mapa circular del plásmido S3 digerido con ambas
enzimas. Marca los tamaños de cada fragmento y rotula los
lugares de restricción con las enzimas correspondientes.
11. Habrá algún otro orden posible para los lugares de restricción
en el plásmido S3 para estas dos enzimas? Como tu resolverías entre
estas posibilidades cual es las mas correcta?
9
12. Si hubieras corrido una gel con estos fragmentos,
alguna banda o fragmento en la gel? Cual? Porque?
faltaría
Enlaces de interés.
Biotechnology and Genetic Engineering
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/index.h
tml
Molecular toolkit
http://www.vivo.colostate.edu/molkit/
Restriction Maps
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html
Restriction Digest Maps
http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07dna/restrictio
n/
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