secuencias de nucleotidos codificantes para polipeptidos

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 073 411
kInt. Cl. : C12N 15/32
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
C12N 1/21
C12P 21/02
A01N 63/00
A01H 5/00
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 88401121.4
kFecha de presentación : 06.05.88
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 295 156
kFecha de publicación de la solicitud: 14.12.88
T3
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54 Tı́tulo: Secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos dotados de una actividad larvicida
contra lepidópteros.
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73 Titular/es: Institut Pasteur
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72 Inventor/es: Sanchis, Vincent;
30 Prioridad: 10.06.87 FR 8708090
28, rue du Docteur Roux
F-75724 Paris Cédex 15, FR
Centre National de la Recherche
Scientifique y
Institut National de la Recherche
Agronomique
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.95
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45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.08.95
Aviso:
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Lereclus, Didier;
Menou, Ghislaine;
Lecadet, Marguerite-Marie;
Martouret, Daniel y
Dedonder, Raymond
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74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
La invención se refiere a secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos dotados de una actividad
larvicida contra lepidópteros.
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Se refiere más especialmente a medios, en particular secuencias nucleotı́dicas, polipéptidos o también
vectores o cepas bacterianas, modificados por dichas secuencias y que expresan polipéptidos que permiten
elaborar preparados larvicidas activos contra lepidópteros, preferentemente contra Spodoptera littoralis
(en lo sucesivo, S. littoralis) o contra Mamestra brassicae (en lo sucesivo llamado M.brassicae) o capaces
de transformar las plantas a tratar, confiriéndoles este tipo de actividad.
Se sabe que la mayorı́a de los aislamientos de B. thuringiensis presentan una actividad tóxica con
respecto a larvas de más de cien especies de lepidópteros.
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Esta actividad proviene de la capacidad de las cepas de B. thuringiensis para sintetizar, cuando se
produce la esporulación, inclusiones cristalinas de naturaleza proteica, o δ-endotoxinas, bajo el control
de uno o varios tipos de genes.
Se ha mostrado que la actividad de tales polipéptidos está contenida en la mitad NH2 -terminal o
N-terminal de la proteı́na.
Los trabajos realizados han mostrado la alta especificidad de las δ-endotoxinas contra las larvas de
una especie determinada.
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A causa de esta alta especificidad, numerosas especies de lepidópteros, principalmente de la familia
de los Noctuidos, solamente reaccionan débilmente a los preparados comerciales disponibles de B. thuringiensis.
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Esto es especialmente aplicable en la especie S.littoralis, insecto polı́fago que constituye el principal
parásito del algodón y de otros cultivos industrialmente importantes. Entre estos cultivos, citaremos el
maı́z, el ricino, el tabaco, el cacahuete, plantas forrajeras tales como el trébol o la alfalfa, o bien productos
hortelanos, como la col o el tomate.
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Se comprende pues, el interés en disponer de medios que incidan especı́fica y eficazmente en la familia
de los Noctuidos y principalmente en S.littoralis o M.brassicae.
Los genes de δ-endotoxinas identificados hasta el momento no codifican un polipéptido activo preferentemente respecto de S. littoralis.
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En una publicación aparecida en “Molecular Biology of Microbial Differentiation”, págs. 217-222,
Sept. 1984, Klier et al han descrito la expresión en E. coli de un fragmento BamHI de 13 kb de un gen de
una proteı́na cristalina de B.thuringiensis aizawai 7.29. Este fragmento de ADN expresa un polipéptido
de aproximadamente 130 kDa.
La búsqueda por los inventores de una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido activo
preferentemente contra los Noctuidos, más particularmente contra S.littoralis, les ha llevado a estudiar
los aislamientos naturales de dos cepas de B.thuringiensis cuya actividad larvicida en cuanto a S. littoralis parece más elevada que la de los preparados industriales elaborados a partir de otras cepas de
B.thuringiensis.
Se trata de las cepas aizawai 7-29 y entomocidus 6-01.
El estudio de dichos aislamientos ha permitido evidenciar la existencia de varios genes de δ-endotoxinas
de estructuras diferentes y de diferentes especificidades entre los cuales se hallan dos genes preferentemente activos contra P.brassicae pero poco activos contra la mariposa del algodón y un gen inactivo
respecto de P.brassicae y de S.littoralis.
Estudiando el ADN total de dichos aislamientos y efectuando las hibridaciones apropiadas, seguidas
de la clonación de los fragmentos identificados mediante hibridación, los inventores han constatado que es
posible aislar secuencias nucleotı́dicas implicadas en genes de δ-endotoxinas que codifiquen polipéptidos
activos, preferentemente contra S.littoralis.
La invención tiene pues por objetivo proporcionar secuencias nucleotı́dicas capaces de codificar por
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lo menos la parte NH2 terminal de una δ-endotoxina tóxica contra Noctuidos, preferentemente contra
S.littoralis o M. brassicae.
Tiene igualmente por objetivo proporcionar un polipéptido tóxico contra los Noctuidos.
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La invención se refiere además a un procedimiento para la obtención de la mencionada secuencia y de
un polipéptido que exhiba la actividad deseada, ası́ como a los medios intermediarios tales como vectores
y cepas bacterianas utilizables para obtener el polipéptido.
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La invención se refiere además a las aplicaciones de dichas secuencias y polipéptidos para la elaboración
de preparados larvicidas contra los Noctuidos, en particular contra S. littoralis y para la transformación
de las plantas susceptibles de ser infectadas por estas larvas.
La invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica por lo menos una parte de la región
N-terminal de un polipéptido especı́ficamente tóxico contra larvas de lepidópteros de la familia de los
Noctuidos, preferentemente contra S.littoralis, caracterizada por su capacidad de hibridarse con un gen
capaz de expresar un polipéptido tóxico contra larvas de S.littoralis.
Según otro aspecto de la invención, la secuencia nucleotı́dica se caracteriza porque es sustentada por
una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 3kb, tal como fue obtenida mediante recombinación
genética in vitro de secuencias nucleótı́dicas de B.thuringiensis capaces de hibridarse con las sondas 1,
2 y 3 de pHTA2, a las que se hace referencia en la figura 2. El fragmento de 3kb corresponde más
especialmente al fragmento de restricción HindIII - PstI.
Las secuencias de nucleótidos de la invención se caracterizan, además, porque incluyen sitios en el
orden siguiente: HindIII-HincII-Bg1II-KpnI-HindIII-PstI.
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Estas secuencias de nucleótidos se obtienen preferentemente por recombinación genética in vitro de
secuencias de ADN que proceden de por lo menos una cepa de B.thuringiensis. En una variante de
realización de la invención, se emplean dos cepas diferentes de B.thuringiensis.
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Para la obtención de estas secuencias nucleotı́dicas, dos cepas de B.thuringiensis son particularmente
apropiadas, las que corresponden a aizawai 7-29 y a entomocidus 6-01, depositadas el 21 de abril de 1987,
respectivamente bajo los números 1-661 y 1-660, en la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) (Colección nacional de cultivo de microorganismos) en Paris.
Las secuencias de nucleótidos de la invención codifican ventajosamente un polipéptido capaz de formar
un complejo inmunológico con anticuerpos dirigidos contra polipéptidos que presentan actividad larvicida
contra S.littoralis.
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Una secuencia de nucleótidos según la invención se caracteriza porque posee la capacidad de hibridarse
con una sonda formada a partir de la secuencia (I) que presenta el siguiente encadenamiento:
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Las secuencias nucleotı́dicas que codifican por lo menos una parte de la región N-terminal de un polipéptido tóxico de manera especı́fica contra las larvas de lepidópteros de los Noctuidos, preferentemente
contra S.littoralis, se caracterizan porque incluyen el encadenamiento (I) definido anteriormente.
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Ventajosamente, la secuencia de nucleótidos que se caracteriza por el encadenamiento definido anteriormente codifica una parte de un polipéptido que posee una actividad larvicida contra S.littoralis más
elevada que la de los polipéptidos codificados por aislamientos naturales, conocidos actualmente por sus
efectos contra S.littoralis.
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El estudio de dicha secuencia de nucleótidos muestra que se caracteriza por un codon de iniciación
ATG situado en la posición 241 a partir del cual se ha identificado un marco de lectura abierto de 750
nucleótidos.
Esta secuencia se caracteriza igualmente por un sitio de unión GGAGG de los ribosomas en las posiciones 230 a 234.
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Según otro aspecto, la secuencia de nucleótidos de la invención se caracteriza porque incluye, por
encima del codon ATG, una secuencia que va del nucleótido en posición 137 al nucleótido en posición
177, mostrando una homologı́a muy acusada con la región encontrada por Wong et al, (1983) y descrita
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en (16) por encima del gen de la proteı́na cristalina de la cepa kurstaki HD1 Dipel (BTK) y de la que los
autores han mostrado que contenı́a tres promotores BtI, BtII y Ec, que son respectivamente funcionales
en B.thuringiensis y E.coli. La homologı́a de estas secuencias es de aproximadamente un 70%.
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La invención se refiere igualmente a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia (II) de
aminoácidos siguiente:
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Una identificación mejor de la secuencia de nucleótidos aislada de las cepas anteriormente descritas,
depositadas en el CNCM, ha permitido constatar que el nucleótido situado en la posición 273 es la guanina (G), siendo entonces la valina el aminoácido resultante del codon GTA.
Ahora bien, la lectura del nucleótido que corresponde a esta posición 273 en la solicitud FR.8708090
del 10 de junio de 1987, habı́a conducido a mencionar a la timina (T) y, como aminoácido resultante del
codon TTA, a la leucina.
Otra secuencia de nucleótidos de la invención se caracteriza por su capacidad de hibridación con una
sonda formada a partir de la secuencia (III), que presenta el siguiente encadenamiento:
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Particularmente, secuencias nucleotı́dicas de la invención que codifican de forma especı́fica un polipéptido tóxico contra larvas de lepidópteros de la familia Noctuidos, preferentemente contra S.littoralis,
incluyen o están constituidas por el encadenamiento (III) definido anteriormente.
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El encadenamiento (III), comprendido en la secuencia de nucleótidos de la invención, contiene 2711
nucleótidos. Este fragmento incluye especialmente el promotor potencial del gen de la δ-endotoxina activa
sobre S.littoralis.
Forman parte naturalmente del marco de la presente invención, las secuencias modificadas de nucleótidos con respecto a los encadenamientos (I) o (III) descritos anteriormente, en la medida en que
estas modificaciones no dan lugar a variaciones sensibles de la toxicidad del polipéptido codificado por la
secuencia modificada, contra S.littoralis.
Estas modificaciones pueden por ejemplo consistir en deleciones, sustituciones o recombinaciones.
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De este modo, las secuencias de nucleótidos (I) y (III) comprenden en su posición 611 un nucleótido
variable que corresponde a la adenina (A) en la secuencia (I) y a la citosina (C) en la secuencia (III).
Estos nucleótidos forman parte de la composición de los respectivos codones GAA y GCA que codifican
respectivamente los aminoacidos ácido glutámico (GLU) y alanina (ALA) en las secuencias respectivas
II y IV.
Igualmente, cualquier secuencia nucleotı́dica capaz de hibridarse con la de los encadenamientos (I)
o (III), tal como la obtenida mediante transformación enzimática inversa del ARN correspondiente o
también mediante sı́ntesis quı́mica, forma parte igualmente del marco de las definiciones de la invención.
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La secuencia de nucleótidos de fórmula (III) empieza por un codon de iniciación ATG situado en la
posición 241 y que representa el principio de un marco de lectura abierto de 2470 nucleótidos.
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La invención se refiere además a una secuencia de nucleótidos caracterizada porque codifica un polipéptido que comprende la siguiente secuencia (IV) de aminoácidos:
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La invención se refiere asimismo a los vectores recombinantes de expresión y de clonación que comprenden más particularmente, por lo menos una secuencia de nucleótidos tal como la definida anteriormente,
en particular por lo menos una parte de la secuencia de aproximadamente 3kb.
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Un vector recombinante particular es por ejemplo un plásmido que comprende el fragmento HindIIIPstI de la secuencia de nucleótidos de la invención, insertado en un vector pUC9. Un primer vector
preferido es el plásmido pHT71 sobre cuya construcción se informa en los conjuntos que luego se mencionarán, que incluye un fragmento HindIII-PstI de ADN según la invención, constituı́do únicamente por
ADN procedente de la cepa aizawai 7-29.
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Otro vector recombinante está constituido por el plásmido pHT 671, cuya construcción se explica en la
figura 4. Este plásmido incluye un fragmento quimérico HindIII-PstI, obtenido fusionando un fragmento
HindIII-HincII de ADN de 1,1 kb procedente de la cepa entomocidus 6-01, con un fragmento HincII-PstI
de 1,9 kb, que proviene de la cepa aizawai 7-29.
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Forman parte igualmente del marco de la invención, las cepas bacterianas modificadas que incluyen
una de las secuencias nucleótidas definidas anteriormente o bien un vector recombinante de expresión y
de clonación definido anteriormente, preferentemente el plásmido pHT 671 o el plásmido pHT71.
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La invención se refiere además a un polipéptido tóxico contra las larvas de lepidópteros y preferentemente contra S. littoralis, que ataca, a las hojas del algodonero o las de los otros cultivos que se
mencionaron anteriormente, caracterizado porque es capaz de formar un complejo inmunológico con anticuerpos dirigidos contra polipéptidos con actividad larvicida contra S.littoralis.
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La invención se refiere más particularmente a la parte NH2 -terminal de dicho polipéptido que posee
actividad larvicida.
El extremo de la parte NH2 -terminal activa responde a la secuencia (II) de aminoácidos expuesta
anteriormente.
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Un polipéptido preferido de la invención es el que responde a dicha secuencia (II) y responde a la secuencia (IV) de aminoácidos que se ha expuesto en las páginas anteriores. Este polipéptido que responde
a la secuencia (IV) comprende 823 aminoácidos. Su peso molecular calculado es de 92906 Da.
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Dicha secuencia de δ-endotoxina se ha comparado a las secuencias en aminoácidos de las δ-endotoxinas
que proceden de otras cepas de B.thuringiensis activas contra lepidópteros y cuyos genes se han aislado y
secuenciado anteriormente: se trata de las ..- endotoxinas de las cepas kurstaki HD1 (19), kurstaki HD73
(20), berliner 1715 (21) y (22), Sotto (23) y aizawai IPL7 (24).
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Los resultados de estas comparaciones indican que todas son diferentes en la segunda cuarta parte
de la molécula (aminoácidos 281 a 620), mientras que la parte NH2 -terminal (aminoácidos 1 a 280) y
el dominio COOH-terminal (aminoácidos 621 a 1175) de la proteı́na se conservan mucho y únicamente
difieren en algunos aminoácidos. Por el contrario, la δ-endotoxina que corresponde a la secuencia (IV)
citada anteriormente presenta diferencias importantes con las otras δ-endotoxinas, tanto en la parte
NH2 -terminal (aminoácidos 1 a 280) como en la segunda cuarta parte de la molécula (aminoácidos 281 a
620). Los resultados de estas comparaciones indican asimismo que la mitad NH2 -terminal de la molécula
(aminoácidos 1 a 620), que corresponde a la fracción tóxica de la proteı́na, solamente presenta un 46%
de homologı́a con las otras δ-endotoxinas. Las diferencias más importantes se situan en la segunda mitad
de la parte tóxica de la molécula (aminoácidos 281 a 620) con sólo un 36 % de aminoácidos idénticos,
presentando por la parte NH2 -terminal (aminoácidos 1 a 280) un 58 % de aminoácidos idénticos con las
otras δ-endotoxinas. Estas importantes diferencias no se han observado nunca hasta ahora en la parte
NH2 -terminal de la fracción tóxica de la molécula, entre las δ-endotoxinas activas contra los lepidópteros.
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Para obtener una secuencia de nucleótidos que formen parte del marco de la invención, que codifiquen
por lo menos la parte activa de un polipéptido que presenta una toxicidad especı́fica contra larvas de
lepidópteros de la familia de los Noctuidos, preferentemente contra S.littoralis, se ha recurrido, según la
invención, a las etapas siguientes, a saber:
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- realización de una hibridación molecular entre, por una parte, una secuencia de nucleótidos de una cepa
de B.thuringiensis activa contra S.littoralis, y por otra parte, por lo menos dos secuencias nucleotı́dicas,
utilizadas como sondas que proceden de la parte 5’ de un fragmento de restricción de un gen de δendotoxina de B.thuringiensis, parte que codifica la parte NH2 -terminal del polipéptido activo sobre las
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larvas lepidoptéricas, y de la parte 3’ de dicho fragmento, que codifica la parte COOH del polipéptido,
- aislamiento del fragmento hibridizado,
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- su clonación en un vector, seguido de su purificación.
Ventajosamente, las sondas de hibridación utilizadas se obtienen a partir de un gen de δ-endotoxina
que procede de la cepa aizawai 7-29 que codifica una proteı́na de 130 kDa, activa contra P.brassicae e
inactiva contra S.littoralis, habiendo sido clonado dicho gen en el plásmido recombinante pHTA2.
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En un modo de realización del procedimiento anterior, el fragmento recombinado al vector en la etapa
de clonación, se elabora a partir de un fragmento de restricción HindIII-PstI que procede de una única
cepa de B.thuringiensis, preferentemente aizawai 7-29. En particular, dicho fragmento es transportado
preferentemente por el plásmido recombinante pHTA6 tal como ha sido aislado mediante una sonda constituı́da por un fragmento PvuII de 2kb del plásmido pBT15-88 que corresponde a la parte interna de un
gen del cristal cromosómico de la cepa berliner 1715, a partir de clones transformantes que encierran secuencias nucleotı́dicas procedentes de cepas B.thuringiensis activas contra larvas lepidoptéricas inter-alia
de S.littoralis.
En otro modo de realización de la invención, el fragmento recombinado en el vector en la etapa de
clonación, se elabora a partir de varias secuencias de nucleótidos procedentes de vectores recombinantes
que contienen secuencias nucleotı́dicas de por lo menos dos cepas diferentes de B.thuringiensis, que poseen idénticos mapas de restricción y que contienen ellas mismas la totalidad o parte de las secuencias de
nucleótidos capaces de codificar un polipéptido activo, preferentemente contra S.littoralis.
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En este caso, el fragmento recombinado utilizado en la etapa de clonación es un fragmento de aproximadamente 3 kb, elaborado ventajosamente a partir de un fragmento de restricción HindIII-HincII de
aproximadamente 1,1 kb que procede de la cepa entomocidus 6-01 y de un fragmento HincII-PstI de
aproximadamente 1,9 kb de la cepa aizawai 7-29. Corresponde a un gen truncado de δ-endotoxina.
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Los fragmentos de restricción HindIII-HincII e HincII-PstI son transportados más especialmente por
los plásmidos recombinantes respectivos pHTE6 y PHTA6 aislados mediante la sonda constituida por el
fragmento PvuII mencionado anteriormente.
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El estudio de la toxicidad, contra las larvas de lepidópteros, de las cepas bacterianas modificadas
mediante las secuencias de nucleótidos definidas anteriormente, ha permitido poner de manifiesto su actividad tóxica elevada, principalmente respecto a las orugas de S.littoralis.
Esta actividad se ha estimado con respecto al ı́ndice de especificidad que corresponde a la relación
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CL50S.littoralis
CL50P .brassicae
en la cual “CL50” representa la concentración letal que mata al 50% de las larvas en 72 horas.
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La utilización de tal ı́ndice permite evaluar la actividad de las cepas bacterianas estudiadas, sin tener
que considerar la tasa de expresión de los polipéptidos.
Los resultados obtenidos, de los que se informa en los ejemplos siguientes, y los valores de DL 50 que
de ellos se deducen, han mostrado que las cepas bacterianas modificadas según la invención presentan
una actividad tóxica contra S.littoralis más especı́fica que las proteı́nas cristalinas nativas de las cepas
azawai 7-29 o berliner 1715.
La invención se refiere, pues, a la aplicación, para la elaboración de preparados larvicidas tóxicos,
preferentemente contra S.littoralis, de dichas cepas modificadas, de vectores recombinantes que contienen
las secuencias nucleótidas definidas anteriormente, particularmente del plásmido pHT671 y del plásmido
pHT71, y de estas mismas secuencias.
Los preparados larvicidas de la invención se caracterizan pues porque contienen una cantidad eficaz
de polipéptidos tal como los que se han definido anteriormente o que se expresan mediante las secuencias
nucleótidas a las que anteriormente se ha aludido.
Para producir tales polipéptidos, se emplean ventajosamente los genes truncados de δ-endotoxina que
corresponden a las secuencias nucleótidas de la invención.
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Estos genes pueden utilizarse para producir en exceso el polipéptido tóxico en microorganismos que
permiten la expresión de los vectores recombinantres anteriormente citados. Las cepas de microorganismos apropiados incluyen E.coli o B.subtilis.
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Estos genes truncados pueden volver a introducirse en las cepas de B.thuringiensis o en especies
emparentadas tal como B. cereus, según las técnicas clásicas, por ejemplo, mediante transformación,
conjugación o transducción. Estas técnicas permiten producir el polipéptido tóxico en grandes cantidades sin tener que modificar previamente la región natural del promotor de los genes de δ-endotoxina de
B.thuringiensis.
Esta transformación se puede efectuar utilizando métodos derivados de la transformación de los protoplastos de B.subtilis según (11) o de las células vegetativas de B.thuringiensis tal como se describe en
(12).
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La introducción de plásmidos recombinantes mediante un sistema del tipo conjugación, se puede llevar
a cabo utilizando B. thuringiensis como cepa huésped y B.subtilis o Streptococcus faecalis como cepas de
tipo donador, operando según (13) y (14).
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En una variante, las secuencias nucleotı́dicas se introducen en microorganismos que habitan en el medio o en asociación con las plantas y que son capaces de expresar los vectores recombinantes que contienen
dichas secuencias. La introducción se puede efectuar en microorganismos tales como Pseudomonas, operando según el procedimiento descrito en (17), mediante la intermediación de vectores plasmı́dicos que
contienen el transposón Tn5 y el gen de la toxina, o en Azospirillum o Rhizobium mediante la intermediación de vectores suicidas derivados del plásmido RP4 y de plásmidos movilizadores funcionales en las
bacterias gram negativas (pRK2013 por ejemplo) según los procedimientos descritos en (18).
Los genes truncados están sólo en las cepas de Bacilli, o en una variante, se asocian a diferentes genes
de δ-endotoxina, lo que permite obtener cristales sintetizados por estas cepas especı́ficamente tóxicas,
contra especies dadas de Noctuidos, o tóxicos a la vez contra Noctuidos e insectos sensibles a las otras
δ-endotoxinas. Estas recombinaciones, efectuadas in vitro o in vivo con las secuencias nucleotı́dicas de la
invención y de otros genes de δ-endotoxinas que presentan especificidades tóxicas diferentes, conducen a
la construcción de nuevos genes que codifican nuevas proteı́nas tóxicas hı́bridas que presentan un amplio
espectro de actividad contra los insectos. Estos nuevos genes y estas nuevas proteı́nas forman parte
igualmente del marco de la invención.
En estas aplicaciones, las secuencias nucleotı́dicas de la invención pueden transferirse y expresarse en
plantas sensibles a S.littoralis con el fin de disminuir los destrozos causados por estos insectos.
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Entre las plantas a proteger, citaremos: el algodón, el trébol, el tomate y la alfalfa.
La transferencia del gen truncado en las plantas del algodón, puede llevarse a cabo mediante transformación, empleando cepas tales como Agrobacterium tal como se describe en (15).
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La invención se refiere además a las células vegetales, las plantas y las semillas que contienen las
secuencias nucleótidas que se han definido anteriormente.
Las células vegetales según la invención son células cuyo genoma, tras transformación mediante un
procedimiento no esencialmente biológico, posee de manera estable una secuencia de nucleótidos capaz
de expresar un polipéptido tóxico contra S. littoralis, tal como la que se ha definido anteriormente. La
invención se refiere igualmente a las células vegetales procedentes de su división.
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Las plantas según la invención son plantas transformadas mediante un procedimiento no esencialmente
biológico, que tienen particularmente como predador a S.littoralis, cuyo genoma posee de manera estable
una secuencia de nucleótidos tal como la que se ha definido anteriormente, que es capaz de expresar un
polipéptido tóxico contra S.littoralis. Se trata también de plantas procedentes de su reproducción, de su
multiplicación o de crecimientos hı́bridos.
60
Según otro aspecto, la invención se refiere a plantas que tienen particularmente como predador a
S.littoralis, que posee además de sus caracteres genotı́picos y fenotı́picos iniciales, la propiedad de expresar un polipéptido tóxico preferentemente contra S.littoralis, originándose esta propiedad de la inserción
en su genoma mediante manipulación genética de una secuencia de nucleótidos capaz de expresar el men15
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cionado polipéptido.
5
La invención se refiere además a semillas que son capaces de producir una planta tal como la definida
anteriormente o que proceden de tal planta, caracterizadas porque han integrado en su genoma, mediante
manipulación genética, una secuencia de nucleótidos descrita anteriormente.
Otras caracterı́sticas y ventajas de la invención se harán evidentes en la descripción que sigue, haciendo referencia a los ejemplos, en los cuales:
10
- la figura 1, representa el mapa de restricción de los plásmidos pHTA6 y pHTE6,
- la figura 2, el mapa de restricción de un gen de una proteı́na cristalina de la cepa aizawai 7.29 clonado
en el plásmido pHTA2 y que define los fragmentos de ADN que se utilizan como sonda,
15
- la figura 3, presenta el fragmento de 6,6kb clonado en pHTA6 y el resultado de una hibridación efectuada
entre dicho fragmento y las sondas descritas en el figura 2,
- la figura 4, el mapa de restricción del plásmido pHT671, y
20
25
- la figura 5, las fotografı́as de las pruebas de inmunodifusión.
Los experimentos de hibridación llevados a cabo para la puesta en práctica de la invención se han efectuado a 42◦C durante 24, horas en una solución que contiene 5 x SSC, 30% de formamida y 1 Denhardt
(7) en presencia de la sonda de ADN marcada con p32 . Los filtros se lavaron a 420 C, 20 mn, utilizando
sucesivamente las siguientes soluciones: 5 x SSC en 30 % de formamida, 5 x SSC, 2 x SSC, 1 x SSC y 0,5
x SSC antes de secado a temperatura ambiente.
Ejemplo 1
30
Construcción de una secuencia de ADN de aproximadamente 3kb que contiene un gen quimérico de una
toxina insecticida.
Esta construcción comprende:
35
1) la preparación de bibliotecas genómicas de B.thuringiensis.
2) la selección y caracterización de clones transformantes que contengan los genes de una proteı́na cristalina y de secuencias nucleotı́dicas responsables de la actividad larvicida,
40
3) recombinación in vitro de dichas secuencias en un vector de clonación con construcción del plásmido
pHT671.
Estas diferentes etapas se llevan a cabo de la manera siguiente:
45
1) Preparación de bibliotecas genómicas de B.thuringiensis.
El ADN total de las cepas aizawai 7-29 y entomocidus 6-01 de Bacillus thuringiensis se purifica utilizando el método que se menciona en (1) y 50µg de cada ADN purificado se digieren completamente con
el enzima de restricción PstI.
50
El ADN digerido por PstI se analiza mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8 %,
obteniéndose a partir de éste, mediante electroelución, fragmentos de ADN de un tamaño de 5 a 8 kb,
de la forma descrita en (2).
55
60
Los fragmentos de ADN purificados de 5-7 kb de la cepa aizawai 7-29 se unen al ADN del vector de
clonación pUC18 digerido por PstI según (3).
Los fragmentos de ADN purificados de 5-8 kb de la cepa entomocidus 6-01 se unen al ADN del vector
de clonación pUC9 digerido por PstI. Las células de E.coli JM83 se transforman con la mezcla de unión,
tal como se describe en (4).
Los clones transformantes de E.coli se seleccionan en un medio LB que contiene 100 µg/ml de ampi16
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cilina.
2) - Aislamiento y caracterización de los clones transformantes que contienen los genes de una proteı́na
cristalina.
5
A) Detección de células de E.coli transformadas mediante un fragmento interno de un gen de la proteı́na
cristalina marcado con p32 , que se utiliza como sonda:
10
15
Clones transformantes que contienen plásmidos recombinantes que llevan el gen de la proteı́na cristalina se detectan mediante hibridación en colonias, según el método descrito en (5), utilizando como
sonda un fragmento PvuII de 2 kb del plásmido pBT 15-88 (EMBO J., 1: 791-799), que corresponde a
una parte interna del gen de la proteı́na cristalina, situado en el cromosoma de la cepa berliner 1715.
B) Caracterización de los plásmidos recombinantes presentes en los clones que reaccionan con la sonda
anteriormente citada.
Dos plásmidos recombinantes, pHTA6 y pHTE6, aislados respectivamente de las bibliotecas genómicas
construı́das a partir de las cepas aizawai 7-29 y entomocidus 6-01, presentan una homologı́a con dicha
sonda. En cada caso, se ha clonado un fragmento de ADN de aproximadamente 6,6 kb.
20
El mapa de restricción de los dos plásmidos se expone en la figura 1. La comparación de los sitios de
restricción muestra que los dos fragmentos de ADN clonados parecen idénticos.
25
30
35
40
45
50
55
Con el objeto de delimitar las secuencias que corresponden al gen de la δ-endotoxina, se utilizan como
sondas diferentes fragmentos de ADN marcados con p32 , ADN que proviene de un gen de la proteı́na
cristalina anteriormente caracterizado y clonado en el plásmido recombinante pHTA2. Este último gen
de la proteı́na cristalina originario igualmente de la cepa aizawai 7-29 codifica una proteı́na de 130 kd
activa contra P.brassicae pero no contra S.littoralis. Este tipo de gen posee el mismo mapa de restricción
que el gen de la δ-endotoxina procedente de la cepa berliner 1715. En la figura 2, se muestra el mapa de
restricción de dicho gen de la proteı́na cristalina de la cepa de aizawai 7.29 clonado en el plásmido pHTA2.
Los trazos fuertes indicados en la parte superior del mapa corresponden a los fragmentos utilizados como
sondas de hibridación.
Los plásmidos pHTA6 y pHTE6 se hidrolizan mediante distintas endonucleasas de restricción, se analizan mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,8 % y se hibridizan con las diferentes sondas.
La transferencia del ADN a filtros de nitrocelulosa se realiza según el método se SOUTHERN descito
en (6). La hibridación se realiza a 420 C durante 24 horas en una solución que contiene: 5X SSC, 30% de
formamida y una mezcla 1X Denhardt descrito en (7) en presencia de una sonda de ADN marcada con
p32 . Los filtros se lavan seguidamente a 420 C durante 20 minutos, utilizando sucesivamente las soluciones
siguientes: 5 SSC en 50 % de formamida, 5 SSC, 2 SSC, 1 SSC y 0,5 SSC, antes de secarse a temperatura
ambiente.
Los resultados de estos experimentos de hibridación se resumen en la figura 3. Aparece que cada
extremo de los fragmentos de ADN de 6,6 kb clonados, presenta una homologı́a con las sondas. El fragmento PstI-KpnI de 1,5 kb que reacciona con la sonda n◦ 3 corresponde al extremo 3’ de un gen de la
proteı́na cristalina presente a la vez en las cepas aizawai 7-29 y entomocidus 6-01. Como se indica en la
figura 3, las sondas n◦ 1 y n◦ 2 que corresponden al extremo 5’ del gen de la δ-endotoxina de pHTA2,
se hibridizan con el fragmento HindIII-HincII de 1,1 kb contenido en el plásmido pHTA6. La sonda n◦ 3
que cubre el extremo 3’ del gen de la δ-endotoxina de pHTA2, se hibridiza con el fragmento HindIII-PstI
de 0,4 kb contenido en el plásmido pHTA6. Debe resaltarse que se obtiene una débil señal de hibridación
con la sonda n◦ 2, mientras que las otras dos sondas dan señales fácilmente detectables.
A partir de estos resultados, los inventores han establecido que el fragmento de ADN HindIII-PstI
de 3 kb corresponde a gran parte de un gen de la δ-endotoxina que empieza cerca del sitio HindIII
central. En vista de los resultados de los experimentos de hibridación, resulta claro que el gen de la
δ-endotoxina presenta diferencias sustanciales con los caracterizados en la técnica anterior. Basándose en
estos resultados, se ha decidido clonar el fragmento de 3 kb HindIII-PstI en el vector pUC9.
60
17
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3) Construcción del plásmido pHT 671 que contiene un gen quimérico reconstituı́do de la toxina insecticida.
5
10
15
El fragmento de ADN HindIII-HincII de 1,1 kb procedente del plásmido pHTE6 y el fragmento de
ADN HincII-PstI de 1,9 kb procedentes del plásmido pHTA6 se purifican en geles de agarosa.
Se mezclan y unen cantidades iguales de los dos fragmentos de ADN purificados y del ADN de pUC9
digerido con HindIII y PstI. La mezcla de unión se utiliza para transformar células competentes de E.coli
JM83, seleccionándose seguidamente las células transformadas de E. coli en medio LB que contiene ampicilina. Uno de los clones recombinantes interesante examinado contiene un plásmido designado por
pHT671, cuyo mapa de restricción se ha determinado y se representa en la figura 4. Este plásmido
(pHT671) contiene un fragmento de ADN de 3 kb insertado en el vector pUC9. Esta secuencia de ADN
tiene idéntico mapa de restricción que los fragmentos HindIII-PstI de 3 kb contenidos en los plásmidos
pHTA6 y pHTE6, pero corresponde a una molécula de ADN reconstituida construida mediante recombinación in vitro a partir de secuencias de ADN que proceden de cepas aizawai 7-29 por una parte, y de
entomocidus 6-01, por otra.
Ejemplo II
20
25
Estudio de la secuencia nucleotı́dica de la región del promotor y de la región que codifica la parte NH2 terminal de la δ-endotoxina activa contra los Noctuidos.
El fragmento HindIII-HincII de pHT671 se secuencia según el método descrito en (8) utilizando un
sistema M13. Para obtener fragmentos de ADN clonados parcialmente superpuestos que serán utilizados
en la secuenciación del ADN, se recurrió al método de la subclonación por deleción en M13, desarrollada
por DALE et al (9).
La secuencia de 940 nucleótidos del fragmento HindIII-HincII que posee una longitud de aproximadamente 1 kilobase, corresponde al encadenamiento I mencionado anteriormente.
30
35
40
45
El análisis de dicha secuencia muestra que el marco de lectura abierto mayor empieza en la posición
241 y que un sitio potencial de unión a los ribosomas GGAGG se encuentra seis pares de bases por encima
de dicho codon ATG (posición 230 a 235). La región localizada entre los nucleótidos 137 y 177 (posición
-103 a -63 por encima del codon ATG) presenta una importante homologı́a con la región presente por
encima del gen de la proteı́na cristalina de la cepa kurstaki HD1 Dipel (BTK) secuenciada por WONG et
al (1983) y descrita en (16) y de la cual los autores han mostrado que contiene tres promotores BtI, BtII
y Ec funcionales en B.thuringiensis y E.coli, respectivamente. La comparación entre las secuencias de
aminoácidos deducidas de los 750 primeros nucleótidos de los genes de BTK y pHT671, muestra que estos
polipéptidos presentan diferencias significativas a nivel de la mitad N-terminal de la parte activa procedente de la protoxina (solamente un 66% de homologı́a estricta). Es importante resaltar que es la primera
vez que un gen de la δ-endotoxina aislado a partir de una cepa activa contra los lepidópteros codifica un
polipéptido que presenta diferencias sustanciales en dicha región. Efectivamente, este dominio N-terminal
aparece muy conservado (más del 97% de homologı́a estricta) entre todos los genes de proteı́nas cristalinas
activos sobre lepidópteros que se han secuenciado hasta ahora. Además, los inventores han mostrado que
la tasa de variabilidad es del mismo orden si se consideran las secuencias nucleotı́dicas de pHT671 y de
los otros genes del tipo lepidópteros.
Ejemplo III
50
Construcción de una secuencia de ADN de 2,7 kb aproximadamente que contiene un gen de una toxina
larvicida.
Para llevar a cabo esta construcción se ha utilizado el ADN de la cepa aizawai 7.29 de B.thuringiensis
hasta la etapa de realización del plásmido pHTA6 tal como se ha descrito en el ejemplo I.
55
El fragmento HindIII-PstI de aproximadamente 2,7 kb obtenido a partir del plásmido pHTA6, se
ha subclonado seguidamente en el vector pUC9, previamente hidrolizado por los enzimas de restricción
HindIII-PstI, para dar el plásmido pHT71.
60
18
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Ejemplo IV
Estudio de la secuencia de nucleótidos que constituye el plásmido pHT71 que codifica un polipéptido tóxico
contra las larvas de lepidópteros de la familia de los Noctuidos.
5
10
El fragmento HindIII-Pst-I de 2,7 kb de pHTA6, que se ha subclonado en pHT71, se secuenció mediante la técnica de Sanger et al (8), utilizando el fago M13mp19 y el sistema de subclonación mediante
deleciones desarrollado por Dale et al (9). Este sistema permite obtener fagos M13 que contienen una
serie de fragmentos de ADN parcialmente superpuestos y que pueden utilizarse para la secuenciación del
ADN.
La secuencia de nucleótidos de dicho fragmento de 2,7 kb que corresponde al encadenamiento (III)
mencionado anteriormente, se ha determinado en las dos cadenas de ADN, excepto en los 212 últimos
nucleótidos (posiciones 2500 a 2711) que únicamente se han secuenciado sobre una sola cadena.
15
La secuencia nucleotı́dica de dicho fragmento Hind-III-PstI posee una longitud de 2711 nucleótidos.
Dicho fragmento contiene el promotor potencial ası́ como la mayorı́a del gen de la δ-endotoxina activa
contra S.littoralis.
20
Ejemplo V
Estudio de la toxicidad especı́fica de los clones recombinantes de E.coli JM83 (pHT671) y JM83 (pHT71)
contra S.littoralis.
25
30
La toxicidad de los clones recombinantes de E.coli JM83 que contienen pHT671 y de E.coli JM83
que contienen pHT71 se determinó mediante pruebas biológicas sobre orugas de la especie P.brassicae y
S.littoralis como se describe por LECADET y MARTOURET en (10). Los resultados se compararon con
la toxicidad especı́fica de las proteı́nas cristalinas nativas y purificadas a partir de las cepas berliner 1715
y aizawai 7-29 entomocidus 6.01 B.cereus 569 (que contienen el plásmido pBT45, pAMβ1) contra las dos
especies de insectos. La toxicidad especı́fica del clon recombinante y de las cepas de B.thuringiensis se
expresa en términos del “ı́ndice de especificidad” definido anteriormente.
Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 1 adjunta.
35
40
En dicha tabla, para las cepas de E.coli, la concentración 1 corresponde a un cultivo bacteriano de
14 horas concentrado 20 veces y desintegrado mediante ultrasonidos; para las cepas de B.thuringiensis
la concentración se expresa en µg de proteı́na cristalina por µl de preparado. La actividad tóxica de los
preparados se evaluó mediante ingestión forzada de 5µl de preparado por parte de orugas en el quinto
estadio de desarrollo, o por una técnica de ingestión libre utilizando larvas en el segundo estadio de
desarrollo.
TABLA 1
Toxicidad comparada de un clon recombinante y de dos cepas
de B.thuringiensis contra S.littoralis y P. brassicae.
45
Capas y
plásmidos
S. littorales
P.brassicae
50
CL50
2◦ estadio
larvario
CL50
5◦ estadio
larvario
CL50
5◦ estadio
larvario
>1
0,04
>1
>1
>1
0,13
>1
>1
>1
0,72
0,03
>1
Indice de
especificidad
CL50 S.littoralis
Cl50 P.brassicae
55
60
JM83
JM83
JM83
JM83
(pUC18)
(pHT671)
(pHTA2)
(pHTA4)
19
0,2
> 30
-
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TABLA 1 (Continuación)
Toxicidad comparada de un clon recombinante y de dos cepas
de B.thuringiensis contra S.littoralis y P. brassicae.
5
Capas y
plásmidos
10
S. littorales
P.brassicae
Indice de
especificidad
CL50 S.littoralis
Cl50 P.brassicae
CL50
2◦ estadio
larvario
CL50
5◦ estadio
larvario
CL50
5◦ estadio
larvario
ND
0,5
>1
> 0,5
ND
0,11
0,007
15,7
ND
0,02
0,04
0,5
ND
0,028
0,012
2,3
ND
0,38
0,054
7
15
20
25
30
35
JM83 (pHT71)
berliner 1715
cristales nativos
aizawai 7,29
cristales nativos
entomocidus 601
cristales nativos
B. cereus 569
(pBT45,pAMβ1)
El examen de los valores de CL50 resumidos en esta tabla 1 muestra que los extractos proteicos de los
clones recombinantes JM83 (pHT671) y JM83 (pHT71) son preferentemente tóxicos contra S.littoralis.
En segundo lugar, una comparación de los valores del ı́ndice de especificidad muestra que la actividad
larvicida de los clones recombinantes es más especı́fica a razón de 2,5 veces contra S.littoralis que las
proteı́nas cristalinas nativas de la cepa aizawai. Además, los clones recombinantes de JM83 (pHT671) y
JM83 (pHT71) son muy activos contra otro insecto de la familia de los Noctuidos, Mamestra brassicae
(para el clon JM83 (pHT671) por ejemplo, el valor CL50 es de 0,02, utilizando las larvas del segundo
estadio de desarrollo).
Estos dos resultados muestran que el gen de la toxina larvicida construı́do y clonado en los plásmidos
pHT671 y pHT71 codifica una proteı́na especı́ficamente activa contra S. littoralis.
40
45
50
55
60
Otros preparados obtenidos a partir de clones recombinantes que contienen plásmidos que transportan genes que codifican otros tipos de δ-endotoxinas (pHTA2 y pHTA4) no son activos contra
S.littoralis: se puede observar que el plásmido pHTA2 codifica una δ-endotoxina especı́ficamente activa contra P.brassicae, mientras que el plásmido pHTA4 codifica una δ-endotoxina cuyo insecto diana
no se ha identificado aún. Se puede igualmente observar que las inclusiones cristalinas producidas por
una cepa de Bacillus cereus que ha recibido el plásmido pBT45, uno de los plásmidos de la cepa aizawai
7-29 que lleva también un gen de δ-endotoxina (el gen de origen plasmı́dico de la cepa aizawai 7-29), son
igualmente especı́ficamente activos contra P.brassicae.
Se obtienen resultados similares utilizando, en lugar de extractos bacterianos en bruto, extractos proteicos solubles preparados a partir de distintos clones recombinantes de E.coli.
Basándose en los valores de la CL50 expuestos en la tabla anterior y en un peso individual medio
de 41 mg por larva L5 (quinto estadio larvario) de S.littoralis, el valor de la DL50 se ha estimado en
2,4µg/gramo de larva para los cristales nativos de la cepa aizawai 7-29.
Sobre estas mismas bases y sobre la base de factores de equivalencia que permiten pasar de la masa
bacteriana total a la cantidad de proteı́nas especı́ficas (un 2% aproximadamente de las proteı́nas totales
en E.coli JM83 (pHT671), la DL50 que corresponde a la toxina producida por la expresión en E.coli JM83
del gen según la invención clonado en el plásmido pHT671, se ha determinado y estimado en un valor
próximo a 5,5 a 6µg/gramo de larva.
Sobre estas mismas bases, y tras determinación de la CL50 de extractos proteicos solubles preparados
20
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a partir de cultivos triturados de E.coli JM83 (pHT671), el valor de la DL50 que corresponde a la toxina
presente en estos extractos se estimó en 4,15 µg/gramo de larva.
5
10
En los dos casos, y particularmente en el caso de los triturados de E.coli, los valores de DL50 calculados son aproximados y superiores al de los cristales nativos, ya que no se trata de toxina purificada.
Sin embargo, estos datos indican sin ambigüedades que el gen que se expresa por pHT671 determina una
δ-endotoxina que presenta la especificidad contra S.littoralis. Efectivamente, el mismo tipo de estimación
realizado con extractos de E.coli JM83 (pHTA2) que llevan un gen de δ-endotoxina de especificidad diferente, conduce a valores de 30 a 50 veces superiores de la DL50 de los extractos solubles, contra S.littoralis
(135 a 350µg/gramo de larva).
Los datos precedentes permitirán al experto en la materia elaborar fácilmente preparados larvicidas
activos con las proteı́nas de la invención.
15
Se han llevado a cabo otras pruebas de toxicidad utilizando larvas en el segundo estadio larvario de
M.brassicae, S.frugiperda y S.littoralis. Los resultados obtenidos, expresados en términos de LC50 tal
como se definió para la tabla 1, se exponen en la tabla 2.
20
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35
(Ver Tabla en página siguiente)
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Del examen de la tabla 2 destaca que los extractos bacterianos brutos del clon recombinante JM83
(pHT671) son tóxicos contra M.brassicae y S.littoralis (los valores de CL50 son respectivamente de 0,02
y 0,03) y débilmente tóxicos contra S.frugiperda (CL50 de 0,5).
5
Los extractos del clon recombinante E. coli JM83 (pHTA2) son débilmente activos respecto a
S.frugiperda y S.littoralis, y en absoluto tóxicos respecto a M.brassicae. Los extractos del clon recombinante JM83 (pHTA4) no son tóxicos contra M.brassicae y S.littoralis y son débilmente tóxicos respecto
a S.frugiperda.
10
Estos resultados confirman la fuerte toxicidad especı́fica de las proteı́nas obtenidas a partir de pHT71
y de pHT671 respecto a S.littoralis y muestran que esta clase de proteı́na cristalina es también muy activa
respecto a M.brassicae.
Ejemplo VI
15
Estudio de la especificidad de los polipéptidos expresados por los clones formados mediante introducción
de los plásmidos pHT671 y pHT71 en E.coli.
20
Este estudio se ha llevado a cabo gracias a pruebas de inmunodifusión. Los resultados se indican en
la figura 5 (que comprende las figuras 5A y 5B).
La puesta en práctica del experimento de inmunodifusión se ha realizado conforme al protocolo siguiente:
25
Se situaron extractos solubles de proteı́nas de clones de E.coli que contenı́an los plásmidos pHT671,
pHTA4, pHTA2 o pHT71, y pUC18 en los pocillos n◦ 2,3,4,5,6, respectivamente. Una muestra de un
cristal purificado solubilizado de aizawai 7-29 se situó en el pocillo n◦ 1, con el fin de servir de control
positivo.
30
En la prueba expuesta en relación a la figura 5A se ha utilizado y situado en el pocillo central un
antisuero contra todas las δ-endotoxinas de aizawai 7-29 que contenı́an anticuerpos de conejo dirigidos
contras las proteı́nas cristalinas solubilizadas.
35
Se observó en todos los casos una lı́nea de inmunoprecipitación, excepto en el del extracto de E.coli
que contenı́a el vector plasmı́dico solo (pocillo n◦ 6).
Se ha observado que las lı́neas de inmunoprecipitación procedentes de los pocillos n◦ 4 y n◦ 5 se cruzan, lo que muestra que los productos codificados por los plásmidos pHTA2 y PHT71 respectivamente,
presentan determinantes antigénicos diferentes.
40
En la prueba indicada en la figura 5B, el antisuero utilizado contenı́a anticuerpos policlonales de conejo contra las proteı́nas cristalinas de berliner 1715.
45
Se observó una lı́nea de inmunoprecipitación con los extractos de E.coli JM83 (pHTA4) (pocillo n◦
3) y JM83(pHTA2) (pocillo n◦ 4). En cambio, los clones E.coli JM83 (pHT71) (pocillo n◦ 5), JM83
(pHT671) (pocillo n◦ 2) o JM83 (pUC9) (pocillo n◦ 6) no dan inmunoprecipitación.
50
De esto se puede deducir que los genes de las proteı́nas cristalinas aislados en pHTA4 y pHTA2 expresan polipéptidos que poseen determinantes antigénicos comunes con las proteı́nas cristalinas de berliner
1715, cepa que no es especı́ficamente activa contra S.littoralis.
55
Por el contrario, los extractos brutos de E.coli que contienen los plásmidos pHT671 y PHT71 contienen polipéptidos que poseen determinantes antigénicos comunes con las proteı́nas cristalinas de la cepa
aizawai 7.29, que no están relacionados desde el punto de vista inmunogénico con las proteı́nas cristalinas
de la cepa berliner 1715.
Estos resultados confirman los que se han dado anteriormente en relación con la especificidad de los
genes aislados en los plásmidos pHT71 y pHT671.
60
Ensayos de precipitación antı́geno-anticuerpo han permitido determinar el nivel de expresión de los
genes de δ-endotoxina en diferentes clones recombinantes.
23
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Los resultados obtenidos han mostrado que la proteı́na cristalina representa entre un 7 y 10% de las
proteı́nas celulares totales de E.coli JM83 (pHTA2), entre un 2 y 3 % en E.coli JM83 (pHT671) y entre
0,5 y 1 % en E.coli JM83 (pHTA4) y E.coli JM83 (pHT71).
5
Las referencias bibliográficas a las que se alude en los ejemplos, son las siguientes:
(1) KLIER, A.F., LECADET, M-M. and DEDONDER, R., 1973, Sequential modifications of RNA
polymerase during sporogenesis in Bacillus thuringiensis, Eur. J. Biochem., 36 : 317-327.
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Cold Spring Harbor Laboratory Press, New-York.
(3) VIEIRA, J. and MESSING, J., 1982, The pUC plasmids, and M13mp7 derived system for insertion
mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers, Gene, 19 : 259-268.
15
(4) LEDERBERG, E.M. and COHEN, S.N., 1974, Transformation of Salmonella thyphimurium by plasmid deoxyribonucleic acid, J. Bacteriol., 119 : 1072-1074.
20
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REIVINDICACIONES
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1. Secuencia de ADN que codifica por lo menos una parte de la región N-terminal de un polipéptido
especı́ficamente tóxico contra larvas de lepidópteros de la familia de los Noctuidos, caracterizada porque
contiene un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb que corresponde al fragmento de restricción
HindIII-PstI que procede de B. thuringiensis cepa aizawai 7.29.
2. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento de restricción
HindIII-PstI es capaz de hibridarse con las sondas 1,2,3 de pHTA2 expuestas en la figura 2.
10
3. Secuencia de ADN según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende sitios en el
orden siguiente:
HindIII-HincII-Bg1II-KpnI-HindIII-PstI.
15
4. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque codifica un polipéptido capaz
de formar un complejo inmunológico con anticuerpos dirigidos contra polipéptidos con actividad larvicida
contra S.littoralis.
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5. Secuencia de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque codifica un polipéptido tóxico
de S.littoralis.
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6. Secuencia de ADN que codifica un polipéptido tóxico contra larvas de lepidópteros de la familia de
los Noctuidos, caracterizada porque comprende un fragmento de ADN que corresponde al fragmento de
restricción HindIII-HincII de aproximadamente 1,1 kb que procede de B.thuringiensis cepa entomocidus
6-01, fusionado con un fragmento de restricción HincII-PstI de aproximadamente 1,9 kb que procede de
B.thuringiensis cepa aizawai 729.
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7. Secuencia de ADN según la reivindicación 6, caracterizada porque codifica un polipéptido capaz
de formar un complejo inmunológico con anticuerpos dirigidos contra polipéptidos con actividad larvicida
contra S.littoralis.
8. Secuencia de nucleótidos caracterizada porque posee la capacidad de hibridarse con una sonda
formada a partir de la secuencia (I) que presenta el siguiente encadenamiento:
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o a partir de la secuencia (III) que presenta el encadenamiento siguiente:
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9. Secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido especı́ficamente tóxico contra las larvas de
lepidópteros de la familia de los Noctuidos, preferentemente contra S.littoralis, caracterizada porque
comprende el encadenamiento (I) ó (III) definido en la reivindicación 8.
5
10. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8 ó 9, caracterizada porque presenta un codon
de iniciación ATG situado en posición 241.
11. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada por un sitio de unión a
los ribosomas GGAGG, en las posiciones 230 a 234.
10
15
12. Secuencia según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque comprende la secuencia comprendida entre los nucleótidos en posición 137 y 177 (posición -103 a -63 por arriba del codon
de iniciación ATG) que es homóloga a razón de aproximadamente por lo menos un 70% con la región
presente por arriba del gen de la proteı́na cristalina de la cepa kurstaki -HD1 Dipel (BTK) que contiene
los tres promotores BtI, BtII y Ec funcionales en B.thuringiensis y E.coli, respectivamente.
13. Secuencia de nucleótidos, caracterizada porque codifica un polipéptido que comprende la secuencia (II) de aminoácidos siguiente:
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o caracterizada porque codifica un polipéptido que comprende la secuencia (IV) de aminoácidos siguiente:
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14. Vector recombinante de expresión y de clonación que comprende por lo menos una parte de la
secuencia nucleotı́dica tal como ha sido definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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15. Plásmido según la reivindicación 14, caracterizado porque se trata de pHT671 tal como se
representa en la figura 4, o de pHT71 que comprende un fragmento de ADN HindIII-PstI constituido
únicamente por ADN procedente de la cepa aizawai 7-29 clonado en un vector pUC9 previamente hidrolizado con los enzimas HindIII y PstI.
16. Cepas bacterianas modificadas, caracterizadas porque tras transformación, comprenden una
secuencia de nucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 13.
17. Cepa bacteriana según la reivindicación 16, caracterizada porque comprende por lo menos un
vector recombinante según la reivindicación 14 ó 15.
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18. Polipéptido tóxico contra las larvas de lepidópteros y preferentemente contra S.littoralis, caracterizado porque es capaz de formar un complejo inmunológico con los anticuerpos dirigidos contra
polipéptidos con actividad larvicida contra S. littoralis, que responden a la secuencia (II) o a la secuencia
(IV) de aminoácidos.
19. Polipéptido según la reivindicación 18, caracterizado porque comprende la secuencia (II) o la
secuencia (IV) de aminoácidos definidas en la reivindicación 13.
20. Procedimiento para la obtención de una secuencia nucleótı́dica según la reivindicación 1 que codifique por lo menos una parte de la región N-terminal de un polipéptido especı́ficamente tóxico contra las
larvas de lepidópteros de la familia de los Noctuidos, preferentemente contra S.littoralis, caracterizado
por las siguientes etapas:
- realización de una hibridación entre, por una parte, una secuencia de nucleótidos de una cepa de B.
thuringensis activa contra S.littoralis y por otra, una o varias secuencias de nucleótidos utilizadas como
sondas, que proceden, por un lado, de la parte 5’, y de la parte 3’ por el otro, de un fragmento de
restricción de un gen de una δ-endotoxina de B.thuringiensis cepa aizawai 7-29, codificando dichas partes
5’ y 3’, respectivamente la parte N-terminal y la parte COOH-terminal de un polipéptido de 130 kd
tóxico contra los lepidópteros y particularmente activo contra P.brassicae e inactivo contra S. littoralis,
habiendo sido clonado dicho gen en el plásmido recombinante pHTA2 tal como se representa en la figura
2,
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- aislamiento del fragmento,
- su clonación en un vector, seguido de su purificación.
40
21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque el fragmento recombinado en
el vector en la etapa de clonación se elabora a partir, por lo menos de una secuencia de nucleótidos
procedente de, como mı́nimo, un vector recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos de, por
lo menos, una cepa de B. thuringiensis.
45
22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque el fragmento recombinado en
el vector en la etapa de clonación se elabora a partir de varias secuencias de nucleótidos procedentes de
vectores recombinantes que contienen secuencias de nucleótidos de, por lo menos, 2 cepas diferentes de
B.thuringiensis, que poseen los mismos mapas de restricción y que contienen ellas mismas la totalidad o
parte de las secuencias de nucleótidos capaces de codificar un polipéptido activo preferentemente contra
S.littoralis.
50
23. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque el fragmento recombinado en
el vector en la etapa de clonación se elabora a partir de un fragmento de restricción HindIII-PstI que
procede de la cepa aizawai 7-29.
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24. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque el fragmento recombinado en el
vector en la etapa de la clonación se elabora a partir de un fragmento de restricción HindIII-HincII que
procede de la cepa entomocidus 6-01 y de un fragmento de restricción HincII-PstI que procede de la cepa
aizawai 7-29.
25. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque el fragmento de restricción
recombinado según la reivindicación 23 es transportado por un plásmido pHTA6 tal como el que se re35
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presenta en la figura 1 y porque los fragmentos de restricción recombinados según la reivindicación 24,
HindIII-HincII e HincII-PstI, son transportados por los plásmidos recombinantes respectivos pHTE6 y
pHTA6, siendo dichos plásmidos pHTA6 y pHTE6 según se representa en la figura 1 tales como aislados
mediante una sonda constituı́da por un fragmento PvuII de 2kb del plásmido pBT15-88 correspondiente
a la parte interna de un gen del cristal cromosómico de la cepa berliner 1715, a partir de clones transformantes que contienen secuencias nucleotı́dicas procedentes de cepas B.thuringiensis activas contra larvas
de lepidópteros inter-alia de S.littoralis.
26. Composición larvicida con actividad preferente contra S. littoralis, caracterizada porque contiene una cantidad eficaz de polipéptido tal como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 18
y 19 expresado por las secuencias nucleotı́dicas según una de las reivindicaciones 1 a 13, por el vector
según la reivindicación 14, o por el plásmido según la reivindicación 15, o por la cepa bacteriana según
cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17.
27. Aplicación de las secuencias de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para
producir un polipéptido tóxico contra los lepidópteros, preferentemente S.littoralis, en microorganismos
capaces de expresar vectores recombinantes que contienen dichas secuencias, tales como E.coli. B.subtilis,
B. cereus o B.thuringiensis.
28. Aplicación según la reivindicación 27, caracterizada porque las secuencias de nucleótidos se
introducen en microorganismos que viven en el entorno o en asociación con las plantas, tales como
Pseudomonas, Azospirillum o Rhizobium y que son capaces de expresar los vectores recombinantes que
contienen tales secuencias.
29. Aplicación según la reivindicación 27 o 28, caracterizada porque las secuencias de nucleótidos
se introducen en los microorganismos en asociación con diferentes genes de δ-endotoxina.
30. Aplicación de las secuencias de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 a la
transformación de las plantas sensibles a S.littoralis, caracterizada porque comprende la transferencia
y la expresión de dichas secuencias en dichas plantas.
31. Células vegetales cuyo genoma, tras transformación mediante un procedimiento no esencialmente
biológico, posee de manera estable una secuencia de nucleótidos capaz de expresar un polipéptido tóxico
contra S.littoralis, tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y células procedentes
de su división.
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32. Plantas que tienen particularmente como predador a S.littoralis, transformadas mediante un
procedimiento no esencialmente biológico, cuyo genoma posee de manera estable una secuencia de nucleótidos, tal como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, capaz de expresar un polipéptido
tóxico contra S.littoralis, y plantas procedentes de su reproducción, de su multiplicación o de crecimientos
hı́bridos.
33. Planta que tiene particularmente como predador a S.littoralis, que poseen, además de sus caracteres genotı́picos y fenotı́picos iniciales, la propiedad de expresar un polipéptido tóxico que responde a la
secuencia de aminoácidos definida en la reivindicación 13, preferentemente contra S.littoralis, resultando
dicha propiedad de la inserción en su genoma, mediante manipulación genética, de una secuencia de
nucleótidos capaz de expresar el mencionado polipéptido.
32. Grano capaz de dar una planta según la reivindicación 32 ó 33 o procedente de una planta, caracterizado porque ha integrado en su genoma, por manipulación genética, una secuencia de nucleótidos
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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