Bioenergética: Citrocromo C Reductasa

BIOENERGÉTICA Y TRANSPORTE: ACTIVIDAD DE
LA CITOCROMO C REDUCTASA
1º BIOQUÍMICA. UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ ELCHE (ALICANTE)
ACTIVIDAD DE LA CITOCROMO C REDUCTASA
*ESPECTROS DEL CITOCROMO C OXIDADO Y REDUCIDO
Los citocromos son proteínas transportadores de electrones que participan en los fenómenos de fosforilación
oxidativa. Presentan grupos hemos cuyo átomo de Fe puede alternar entre dos estados: Fe+2 o Fe+3 según se
encuentre reducido u oxidado respectivamente. Para saber si un citocromo está oxidado o reducido podemos
obtener su espectro de absorción. Cuando están reducidos aparece un tercer pico de absorción, llamado , que
no aparece en el estado oxidado del citocromo. Concretamente, en el caso del citocromo c este pico aparece a
una longitud de onda de 550 nm.
Un grupo de prácticas se encargó de confirmar este hecho haciendo el espectro de absorción tanto para
citocromo c oxidado como reducido. Para reducir el citocromo in vitro se usó el ditionito sódico. El resultado
obtenido certificó que el citocromo c reducido presenta un pico a 550 nm que no aparecía cuando éste estaba
oxidado. Para ello se preparó en un tubo de ensayo 30 l de sustrato, así como 20 l de enzima, 900 l de
tampón y 100 l de Tween−20. En total se trabajó con un volumen de 1030 l. Se hizo el espectro de
absorción y se obtuvo un máximo de absorción de 0,524 a 550 nm.
A= ·c·l
0,524 = 21 · c ·1; c = 0,0249 mM.
V · C = V´ · C´
1030 l · 0,0249 mM = 30l · C´; C´ = 0,8549 mM
V · C = V´ · C´
60 l · 0,8549 mM = 1080 l · C´; C´= 0,04749 mM
Hemos cogido 60 l por que este fue el volumen que se asignó a nuestro grupo, el grupo 5. Las
concentraciones correspondientes a los otros grupos fueron:
GRUPO
1
2
3
4
5
6
VOLUMEN
20 l
30 l
40 l
50 l
60 l
80 l
CONCENTRACIÓN
0,0164 mM
0,0244 mM
0,0322 mM
0,0399 mM
0,0474 mM
0,0621 mM
*MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE LA CITOCROMO C REDUCTASA
1
El objetivo de este apartado es medir la transferencia de electrones desde el citocromo c reducido al citocromo
c oxidado, formándose citocromo c reducido que tendrá un pico de máxima absorción a una longitud de onda
cercana a los 550nm. Esta transferencia está catalizada por nuestra enzima, la citocromo c reductasa, y para
medir su actividad se siguió el protocolo marcado en la página 125 del guión de prácticas. Nuestro grupo usó
60 l de citocromo c oxidado como sustrato.
Los resultados obtenidos aparecen en la tabla de la página siguiente:
CONCENTRACIÓN VELOCIDAD
TIEMPO (seg.) ABSORBANCIA550
(mM)
(mM / seg.)
0
0,385
0,018
0
10
0,409
0,019
1,9 · 10−3
20
0,449
0,021
1,05 · 10−3
30
0,476
0,022
7,33 ·10−4
40
0,502
0,023
5,75 ·10−4
50
0,526
0,025
5 ·10−4
60
0,549
0,026
4,33 ·10−4
70
0,569
0,027
3,85 ·10−4
80
0,587
0,027
3,37 ·10−4
90
0,605
0,028
3,11 ·10−4
100
0,621
0,029
2,9 ·10−4
110
0,635
0,03
2,7 ·10−4
120
0,649
0,03
2,5 ·10−4
130
0,661
0,031
2,38 ·10−4
140
0,673
0,032
2,28 ·10−4
150
0,683
0,032
2,13 ·10−4
180
0,708
0,033
1,83 ·10−4
210
0,728
0,034
1,61 ·10−4
240
0,744
0,035
1,45 ·10−4
300
0,766
0,036
1,2 ·10−4
360
0,781
0,037
1,02 ·10−4
La representación del valor de la concentración de producto aparecido con respecto al tiempo se representa a
continuación:
2
De la gráfica anterior consideramos los 8 primeros puntos. Los representamos e hicimos un ajuste lineal. Los
resultados aparecen en la siguiente representación gráfica.
Del valor de la pendiente obtengo el valor de la velocidad máxima que en este caso es de 0,000232 mM /
segundo para una concentración de 0,047 mM. El resto de los grupos realizaron este mismo proceso para
obtener el valor de Vmax. Los resultados obtenidos para cada uno de los grupos fue de:
GRUPO
1
2
3
4
5
6
SUSTRATO (mM)
0,0164
0,0244
0,0322
0,0399
0,0474
0,0621
1/S
60,975
40,983
31,055
25,062
21,097
16,103
VMAX (mM / seg)
5,46 · 10−5
8,5 · 10−5
0,00011
0,0002
0,00023
0,0009
1/V
18315,018
11764,705
9090,909
5000
4347,826
1111,111
3
El valor de 1/S y 1/V se calcula con el fin de realizar la representación de Lineweaver−Burk.
La representación de estos valores nos dará el valor de KM y VMAX de la citocromo reductasa. Para ello
usamos el programa informático Hyper. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:
LA BACTERIORRODOPSINA: BOMBA DE H+ EN HALOBACTERIA
*PREPARACIÓN DE LAS MEMBRANAS:
Partimos de un tubo en cuyo interior encontramos un cultivo de halobacterias. Estas aparecen como una masa
viscosa de color rojizo. Este color rojizo se debe básicamente a la presencia de grandes cantidades de una
proteína de membrana, la bacteriorrodopsina, cuyo cromóforo es el retinal. Añadimos 10 ml de agua destilada
a nuestro cultivo de bacterias con el fin de provocar la lisis debido a un paso de agua hacia el interior celular,
más concentrado que el medio externo. Tras ello se produce una centrifugación a 13.000 g durante 15
minutos, obteniendo un pellet que es lógicamente lo que nos quedamos. Este precipitado obtenido se
resuspende en 10 ml (y no 100 ml cómo se nos dice en el guión!!) de 0,1 M de NaCl y DNAasa con el fin de
hidrolizar el DNA liberado pues este provoca una gran viscosidad lo cual no es adecuado para realizar
centrifugaciones. Tras un período de incubación largo realizamos otra centrifugación, esta vez a 40.000 g
durante 40 minutos. Las características de nuestro cultivo de halobacterias se pueden definir según los valores
de D.O.600 y D.O.560 que nos indican el crecimiento y la cantidad de retinol que se ha formado
respectivamente. Los valores obtenidos fueron de D.O.600 = 0,72 y D.O.460 = 1,02.
4
*PREPARACIÓN DEL GRADIENTE DE SACAROSA:
Para la preparación del gradiente de sacarosa partimos de una disolución madre de sacarosa al 60%. Para ello,
pesamos 60 gramos de sacarosa y lo disolvemos en 40 gramos de agua destilada, o sea, en 40 ml de agua
destilada pues la densidad del agua destilada es de 1 g/ml. Tras ello se procede a la obtención de 3,6 ml de
sacarosa al 50%, 45%, 40% 35% y 30%. En el caso de la solución de sacarosa al 60% se echaron solamente
1,5 ml al tubo de centrífuga y no 3,6 ml. Los cálculos necesarios se muestran a continuación:
V · C = V´ · C´
3,6 ml · 50% = V´ · 60%; V´ = 3 ml del frasco de sacarosa al 60% y 0,6 ml de agua destilada para así
alcanzar los 3,6 ml que necesitamos.
V · C = V´ · C´
3,6 ml · 45% = V´ · 60%; V´ = 2,7 ml de sacarosa al 60% y 0,9 ml de agua destilada
V · C = V´ · C´
3,6 ml · 40% = V´ · 60%; V´ = 2,4 ml de sacarosa al 60% y 1,2 ml de agua destilada
V · C = V´ · C´
3,6 ml · 35% = V´ · 60%; V´ = 2,1 ml de sacarosa al 60% y 1,5 ml de agua destilada
V · C = V´ · C´
3,6 ml · 30% = V´ · 60%; V´ = 1,8 ml de sacarosa al 60% y 1,8 ml de agua destilada
Una vez obtenidas las distintas disoluciones de sacarosa se procedió a la preparación del gradiente de
densidad. Para ello, y con la ayuda de una pipeta Pasteur se fueron depositando las distintas concentraciones
de sacarosa, empezando por la más concentrada, la de sacarosa al 60%. Una vez hecho se depositó la muestra
y se procedió a la centrifugación. Los resultados los obtuvimos al día siguiente pues la centrifugación se llevó
a cabo durante 24 h a 70.000 g y a una temperatura de 4º C. Como en el caso de la mayoría de los grupos, no
obtuvimos membrana púrpura pero sí membrana roja situada en la interfase 40−45%. En el caso de que
hubiéramos obtenido membrana púrpura ésta tendría que haber aparecido por debajo de la membrana roja.
Recogimos la fracción de membrana roja con una pipeta Pasteur y con especial cuidado par así recoger la
mínima cantidad posible de sacarosa. Tras ello, se midió la absorbancia de la misma a longitudes de onda
comprendidas entre 240 y 700 nm, obteniendo 3 picos de máxima absorción.
(nm)
538
502
475
ABSORBANCIA
0.657
0.89
0.811
Si hubiéramos obtenido membrana púrpura y hubiéramos hecho este barrido desde 240 a 700 nm tendríamos
únicamente un pico a 560 nm que correspondería al retinal. Seguramente una de las principales causas por las
cuales no pudimos obtener dicha membrana fue por un mal proceso de lisado de la bacteria.
*DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD TRANSPORTADORA DE H+ :
5
En este apartado de la práctica se quería demostrar la presencia de transporte de protones (variación el pH del
medio) como consecuencia del transporte electrónico. En primer lugar ajustamos el pH a una valor de pH de
7,2 ( a pesar de que en el guión ponía de pH 7,5) para así poder partir de una valor de referencia a partir del
cual pudiéramos observar la variación en el pH como consecuencia de la variación en la concentración de
protones externa. Una vez estabilizado el pH sometimos a la muestra de bacterias a ciclos de luz−oscuridad de
16 minutos total de duración (luego 8 minutos de luz seguidos de 8 minutos de oscuridad). Con ayuda de un
pHmetro se observaron los cambios producidos en el pH como consecuencia de estos ciclos.
LUZ
OSCURIDAD
(cada 8 min)
7.20
7.22
7.10
7.08
(cada 8 min)
7.22
7.18
7.10
7.08
Tras observar estos resultados decidimos subir el pH a 8, para observar una mejor variación. Además de ello
se tomaron medidas no cada 8 minutos sino a los 3, 5 y 7 minutos durante el ciclo de luz, dejando
posteriormente 8 minutos de oscuridad y ver así si se recuperaba el sistema. Los resultados obtenidos fueron
los siguientes: luz al minuto 3, 5 y 7. Dejando posteriormente 8 minutos de oscuridad y viendo si el sistema se
recupera:
TIEMPO
3 minutos de LUZ
5 minutos de LUZ
7 minutos de LUZ
8 minutos de
OSCURIDAD
VALOR DE pH
7,93
7,85
7,84
7,74
Tras los 8 minutos de oscuridad vimos que el sistema no se recuperó y que el pH continuó bajando hasta 7,74
cuando debería haber pasado todo lo contrario, es decir, debería haber aumentado. Esto era lo esperado pues
no habíamos conseguido aislar la membrana púrpura y por tanto la determinación de la actividad
transportadora de protones no nos iba a dar correctamente.
CUESTIONES:
1.− ¿Qué ocurriría si en vez de un inhibidor de la ATP−sintasa como el DCCD se pusiera un inhibidor de la
bacteriorrodopsina?
Si pusiéramos un inhibidor de la bacteriorrodopsina no obtendríamos gradiente de protones y en
consecuencia, no obtendríamos variación en el valor de pH. Hay que aclarar que la bacteriorrodopsina
únicamente se encarga del transporte de protones al exterior pero no de la síntesis de ATP a partir de la fuerza
protón−motriz almacenada, de esto último se encarga la ATPsintasa.
2.− ¿Y un desacoplador?
Un desacoplador es un análogo a la ATP−sintasa pero sin capacidad para crear ATP a partir de la fuerza
protón−motriz. Luego la presencia de un desacoplador provocaría un gradiente de protones (pues no estamos
afectando a la bacteriorrodopsina) pero sin síntesis de ATP.
6
19/04/02 12:51
Linear Regression for Data1_B:
Y=A+B·X
Parameter Value Error
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
A 0.018 1.92879E−4
B 2.32143E−4 4.61069E−6
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
R SD N
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
0.99637 2.98807E−4 8
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
KM = −7,122 · 10−2
VMAX = −1,32 · 10−4 mM/ seg
Los valores obtenidos tanto de KM como de VMAX son incoherentes pues son de signo negativo.
7