Química Orgánica II Ácidos Nucleicos Trabajo Práctico de Laboratorio 6 Tema: Ácidos Nucleicos Los nucleótidos se unen entre sí en el ADN y el ARN por enlaces éster fosfato entre el componente de fosfato de un nucleótido y el componente de azúcar del nucleótido siguiente. Las bases nitrogenadas que constituyen parte del ADN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). O N N CH2 O N Una característica importante de las bases nitrogenadas es su carácter aromático. Ello les confiere la capacidad de absorber luz en la zona ultravioleta del espectro en torno a los 260 nm, lo cual puede aprovecharse H2C para determinar el coeficiente de extinción del ADN y calcular la concentración de los ácidos nucleicos. N O O O O P O NH2 NH2 R O P O O O Otra de sus características es que presentan tautomería o isomería de grupos funcionales. En las bases nitrogenadas se dan dos tipos de tautomerías: tautomería lactama-lactima, donde el hidrógeno migra del nitrógeno al oxígeno del grupo oxo (forma lactama) y viceversa (forma lactima), y tautomería imina-amina primaria, donde el hidrógeno puede estar formando el grupo amina (forma amina primaria) o migrar al nitrógeno adyacente (forma imina). La adenina sólo puede presentar tautomería aminaimina, la timina y el uracilo muestran tautomería doble lactama-lactima, y la guanina y citosina pueden presentar ambas. NH O N O R R1 O HN - CH2 O O N R O O P O- NH2 N N O CH2 N O O O P O O N R - R= H/OH R1=H/CH3 Fig. 1. Representación de la estructura covalente de los ácidos nucleicos. Química Orgánica II Ácidos Nucleicos NH2 NH N N N H N N H O N H HN N H N H H2 N N N H HN OH HO N H N H N HN N H N N O N O OH N N OH HN N OH N HN O N H HO N O N N HO N H O HN HN N HN O NH NH2 NH N H2 N N H N NH2 O N HN N HO N Fig 2. Formas tautoméricas predominantes Por otro lado, y aunque se trate de moléculas no polares, las bases nitrogenadas presentan suficiente carácter polar como para establecer puentes de hidrógeno, ya que tienen átomos electronegativos (nitrógeno y oxígeno) que presentan carga parcial negativa, y átomos de hidrógeno con carga parcial positiva, de manera que se forman dipolos que permiten que se formen estos enlaces débiles. Estos puentes se forman respetando una estricta complementariedad: A sólo se aparea con T mediante dos puentes de hidrógeno, y G sólo con C mediante 3 puentes de hidrógeno. Dado que en el ARN no existe T, la complementariedad se establece entre A y U mediante dos puentes de hidrógeno. La complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones debido a que permite procesos como la replicación del ADN, la transcripción de ADN a ARN y la traducción del ARN en proteínas. El modelo de estructura en doble hélice del ADN fue propuesto en 1953 por James Watson y Francis Crick en su artículo denominado “Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid” que fue publicado el 25 de abril de 1953 en la revista Nature. Esta labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedió por sus descubrimientos en relación con la estructura molecular de los ácidos nucleicos y su significación para la transmisión de la información en la materia viva. En rigor, Chargaff en 1940 fue quien descubrió que, en el ADN, las proporciones de purinas eran idénticas a las de pirimidinas, la "equimolecularidad" de las bases ([A]=[T], [G]=[C]); con esta información y junto con los datos de difracción de rayos X proporcionados por Rosalind Franklin fue que trabajaron Watson y Crick propusieron para proponer el modelo de la doble hélice de ADN. Química Orgánica II Ácidos Nucleicos H2N O NH NH2 N N N N O N N HN N N N N H2N O O T=A GΞC Fig. 3. Apareamientos de bases nitrogenadas a pH 7 A valores de pH extremos las bases nitrogenadas se protonan o se ionizan perdiendo la posibilidad de aparearse mediante la misma cantidad de interacciones puente de hidrógeno que lo hacen normalmente a pH fisiológico. O NH H2N N NH N HN O NH2 N N N HN N N N O O H2N NH2 O N N Apareamientos a pH 3 O H2N N N N N N N N N N O OH N H2N Apareamientos a pH 11 Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’– OH (hidroxilo) en la desoxirribosa. Las dos cadenas se disponen en direcciones inversas antiparalelas. Química Orgánica II Ácidos Nucleicos El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos sólo se han observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformación que adopta el ADN depende de su secuencia, la cantidad y dirección de superenrollamiento que presenta, la presencia de modificaciones químicas en las bases y las condiciones de la solución, tales como la concentración de iones de metales y poliaminas. Estructuralmente las diferencias están basadas en las conformaciones del anillo del azúcar y del enlace N-glicosídico. De las tres conformaciones, la forma "B" es la más común en las condiciones existentes en las células. La forma "A" es una espiral que gira hacia la derecha, más amplia que la "B", con una hendidura menor superficial y más amplia, y una hendidura mayor más estrecha y profunda. Fig. 4. Estructura secundaria del ADN B La forma "A" ocurre en condiciones no fisiológicas en formas deshidratadas de ADN, mientras que en la célula puede producirse en apareamientos híbridos de hebras ADN-ARN, además de en complejos enzima-ADN. Los segmentos de ADN en los que las bases han sido modificadas por metilación pueden sufrir cambios conformacionales mayores y adoptar la forma "Z". En este caso, las hebras giran hacia la izquierda, lo opuesto a la forma "B" más frecuente. Estas estructuras poco frecuentes pueden ser reconocidas por proteínas específicas que se unen a ADN-Z y posiblemente estén implicadas en la regulación de la transcripción. Posibles conformaciones de la ribosa y/o desoxirribosa: el azúcar puede presentar forma de “sobre” o forma E de "Enveloppe" cuando uno de los carbonos queda por fuera del plano, o forma de “media silla” o forma T de "Twist" cuando dos de los carbonos quedan por fuera del plano y en lados opuestos. Además, para cada uno de estos carbonos la conformación puede ser "endo", si el carbono está dirigido hacia donde lo está el carbono 5', o "exo", si está dirigido hacia el lado opuesto. Los únicos carbonos que pueden dar lugar a estos plegamientos son los carbonos 2' y 3'. Química Orgánica II Ácidos Nucleicos En el caso del enlace N-glicosídico puede aparecer la conformación "anti" si la parte más voluminosa de la base queda alejada del azúcar, o la conformación "syn" si el plano de la base nitrogenada está dirigido hacia el azúcar. La conformación "anti" es más estable que la conformación "syn". NH2 NH2 NH2 NH2 N N N N N N N N HO HO H H H H OH R Sym H H H H OH O O H O HO HO O O H N N N O N H OH R H H H Sym H H OH H H Anti Anti Fig. 5. Conformaciones del enlace N-glicosídico en Adenosina y Citosina En el ADN-B la conformación que adopta el azúcar es E C2'-endo y anti para el enlace Nglucosídico de todas las bases. El ADN A es una doble hélice dextrógira, con un surco menor poco profundo y un poco más amplio que el surco mayor, que es más profundo. En comparación a la doble hélice del ADN-B, ésta es más abierta, tiene mayor diámetro y una disposición de las bases nitrogenadas más alejada del eje de la hélice. Las bases nitrogenadas están muy inclinadas respecto de la horizontal, más próximas entre sí y localizadas más simétricamente respecto al centro. La conformación que adopta el azúcar es E C3'-endo y anti para el enlace N-glucosídico de todas las bases. El ADN Z es una doble hélice levógira, con un surco menor estrecho y profundo y un surco mayor imperceptible. En comparación ADN-B, la doble hélice tiene menor diámetro y es más larga, la unidad estructural son dos pares de bases. Las bases están muy poco inclinadas respectoa la normal (9º). La conformación del azúcar es E C2'endo para las pirimidinas E C3'-endo para las purinas, mientras que el enlace glicosídico es anti para pirimidinas y syn para purinas. A B Z Fig. 6. Comparación de las estructuras de ADN A, B y Z Química Orgánica II Ácidos Nucleicos Propiedades químicas de los ácidos nucleicos En medio ácido suave es posible obtener los ácidos apurínicos a partir de ADN de acuerdo a la siguiente reacción general: O O NH NH N O N O O O H H O O H H H N N O O- P N N O A través del análisis del mecanismo de reacción es posible racionalizar por que la unión N-glicosídica que se hidroliza corresponde a las bases púricas y porqué sólo se hidrolizan las mismas de muestras de ADN y no de ARN en estas condiciones. O NH2 H O H H O H P H O- O OH O H O H H O H P O NH2 H+ H N O- N H suave O O NH2 H H O H P H N O- N O O O O O H H O H O H O H H N NH O O- P N O N NH2 H H O H H O- P O OH O O H H O H O P H H H O O- H H O H H O- P O O Análisis del mecanismo de hidrólisis en medio ácido sobre 2`desoxinucleósidos ¿Cuál es el N más básico de una base púrica? H NH2 La posición de protonación se justifica por la posibilidad de plantear estructuras contribuyentes al híbrido de resonancia del ácido conjugado que explican que aún tratándose de un átomo de nitrogéno sp2 resulta más básico que la amina primaria, que en este caso sustituye en la posición 6 y que aparentemente presenta hibridación sp3. N N H N N HO H O H H OH R H NH2 NH2 N N N N HO N N N N HO H O H O H H OH R H H H H OH R H H Acido conjugado de adenosina H Química Orgánica II Ácidos Nucleicos Habiendo definido la posición más básica es posible plantear el mecanismo de hidrólisis ácida de nucleósidos púricos sobre estructuras en conformación sym. La proximidad espacial del oxígeno anular de la desoxirribosa con el nitrógeno protonado de la posición 3 de la base púrica que se encuentra en conformación sym justifica el planteo de un mecanismo de hidrólisis de nucleósidos con protonación de oxígeno anular que implica la ruptura del enlace entre el carbono anomérico y el oxígeno anular en la etapa lenta de la reacción. NH2+ NH2 NH2 N N N N N N HO N N HO N N H O HO OH H H OH R H H N N OH H H OH R H H H H OH R H H O H H NH2 NH2 N N N N N H N HO HO OH O H H OH H H (H, OH) H H H OH R N N HO OH O H H OH R H O H H R Así mismo a la luz de este mecanismo es posible justificar la mayor labilidad del enlace N-glicosídico en nucleósidos de 2´-desoxirribosa y de ribosa. La etapa determinante de la velocidad de reacción es la protonación del oxigeno anular y su consecuente ruptura del enlace sigma con el carbono anomerico. Debido a que la basicidad del oxigeno anular en los 2´-desoxirribonucleosidos se ve aumentada por la ausencia del efecto inductivo del OH en posición 2´ , se favorecería la protonación del oxigeno anular comparada con los ribonucleosidos. Complementariamente a lo discutido en párrafos anteriores el ARN es más lábil en medio básico que el ADN, obteniéndose como producto de su hidrólisis una mezcla de nucleósidos monofosforilados en las posiciones 2´y 3´. Este comportamiento experimental puede racionalizarse a través del siguiente mecanismo de reacción: Química Orgánica II Ácidos Nucleicos N NH O N CH2 O N NH2 O O N O NH2 NH H2C N OH N NH2 N CH2 O O O N OH NH2 O O P O O O N O O H2 C O- O P OO CH2 N O O O NH2 N P N O O O- O O OH O HN O- CH2 O O N OH O O P HO- O - N O O N O- CH2 O NH2 O N P O O O O O O P O- HO N O- N O N N O O NH2 N CH2 O O O CH2 O O- NH2 P O- N HO N N N CH2 O N OH O O P O- O- O O P O O O - P O O O- - HO N OH O CH2 O O O P O O OH N N OH CH2O N HOH O O P OO- NH2 N HN NH N NH2 O O NH2 NH2 N HN HN O N O CH2 O O P OO N CH2 O N H O O P NH OH HO CH2 O O N HO CH2O O OH O O P O O O N OH P OO- N N Química Orgánica II Ácidos Nucleicos Extracción y caracterización de los constituyentes de los ácidos nucleicos Objetivos: Caracterizar químicamente los componentes de ácidos nucleicos extraídos a partir de tejido vegetal Materiales Buffer de Lisis celular: 40mL de agua, 5 mL de Detergente, 1 cucharadita de NaCl Material Vegetal: ½ banana Agente precipitante: Etanol al 96% bien frío Desarrollo de la técnica: Colocar el material vegetal en el tubo falcon, luego agregue el buffer de lisis celular y homogenizar con varilla de vidrio. Colocar el tubo con el material homogenizado en centrifuga durante 10 min. a 5000 rpm. Filtrar el sobrenadante con un algodón y embudo, colectarlo en un nuevo tubo falcon. Sobre éste último agregue el etanol frío en una proporción 2:1 (etanol:filtrado). Espere unos segundos y comenzará a ver como se precipita el ADN en el alcohol, el ADN tiene una apariencia de mucus blanco y fibroso. Dejar reposar unos minutos, y centrifugar 10 min. a 5000 rpm. Luego de este último proceso descarte el sobrenadante con la ayuda de una varilla de vidrio. Resuspender el pellet obtenido en 10 mL de agua a fin de comenzar a trabajar sobre ésta macromolécula (ADN). CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE LOS COMPONENTES ESTRUCTURALES DEL ADN HIDROLISIS ÁCIDA DE ADN Coloque el ADN obtenido en un erlenmeyer, agregarle 30 ml de H2SO4 al 10% y calentar a baño maría durante 30 minutos. En caso de excesiva evaporación agregar agua destilada. Reconocimiento de azúcares. Reacción de Molisch. A 5 ml de la solución anterior, agregar 4 gotas de solución de α-naftol, agitar y añadir por las paredes del tubo 3 ml de H2 SO4 concentrado. Observar los resultados. Caracterización de fosfatos: Colocar 3 ml de la solución en un tubo de ensayo y alcalinizar con NH4OH. Acidificar con HNO3 concentrado y agregar luego, 3 ml de molibdato de amonio al 30%. Calentar y observar los resultados. Caracterización de bases púricas: A 3 ml de la solución agregarle NH4OH hasta la reacción alcalina y luego, gota a gota, solución de AgNO3 al 10 %. Observar los resultados.