Tesis Arcos N. - Repositorio de la Universidad de Fuerzas Armadas

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA
AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
TEMA: ANÁLISIS DE LOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS
E17K, E17S Y L357P DEL GEN AKT1, Y SU ASOCIACIÓN CON
CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS E
INMUNOHISTOQUÍMICAS EN LA POBLACIÓN MESTIZA
ECUATORIANA AFECTA CON CÁNCER DE MAMA.
AUTOR: ARCOS VILLACÍS, NATHALY ALEXANDRA
DIRECTOR: DR. MARCELO GRIJALVA, M.D., Ph. D.
CODIRECTOR: DRA. PATRICIA JIMÉNEZ., M.Sc.
SANGOLQUÍ
2015
ii
CERTIFICACIÓN
Dr. Marcelo Grijalva, M.D., Ph. D.
Dra. Patricia Jiménez., M.Sc.
Certifican:
Que el trabajo titulado “Análisis de los polimorfismos genéticos E17K,
E17S y L357P del gen AKT1, y su asociación con características
histopatológicas e inmunohistoquímicas en la población mestiza ecuatoriana
afecta con cáncer de mama”, realizado por Nathaly Alexandra Arcos
Villacís, ha sido guiado y revisado periódicamente y cumple normas
estatutarias establecidas en el Reglamento de Estudiantes de la Universidad
de las Fuerzas Armadas- ESPE.
Sangolquí, Mayo 2015
Dr. Marcelo Grijalva, M.D., Ph. D.
DIRECTOR
Dra. Patricia Jiménez., M.Sc.
CODIRECTOR
iii
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD
Yo, NATHALY ALEXANDRA ARCOS VILLACÍS
Declaro que:
El proyecto de grado denominado “Análisis de los polimorfismos
genéticos E17K, E17S y L357P del gen AKT1, y su asociación con
características histopatológicas e inmunohistoquímicas en la población
mestiza ecuatoriana afecta con cáncer de mama”, ha sido desarrollado con
base a una investigación exhaustiva, respetando derechos intelectuales de
terceros, conforme las citas que constan al pie de las páginas
correspondientes,
cuyas
fuentes
se
incorporan
en
la
bibliografía.
Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.
En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad
y alcance científico del proyecto de grado en mención.
Sangolquí, Mayo 2015
Nathaly Alexandra Arcos Villacís
iv
AUTORIZACIÓN
Yo, NATHALY ALEXANDRA ARCOS VILLACÍS
Autorizo que:
El proyecto de grado denominado “Análisis de los polimorfismos
genéticos E17K, E17S y L357P del gen AKT1, y su asociación con
características histopatológicas e inmunohistoquímicas en la población
mestiza ecuatoriana afecta con cáncer de mama”; sea publicado en la
biblioteca virtual de la Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE.
Sangolquí, Mayo 2015
Nathaly Alexandra Arcos Villacís
v
DEDICATORIA
Este trabajo lo dedico sobre todo a Dios, pues es Él quien ha sido mi
principal guía, no sólo de esta investigación sino de mi vida. Él me ha
fortalecido en todo tiempo y ha permitido que este trabajo llegue a buen fin.
Dedico también este trabajo a mi Madre del Cielo y a mi familia: Pablo,
María Alicia, mi madre y a mi padre, Antonio Arcos, que desde el cielo ha
velado siempre por mí.
vi
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios por ser el motor de este y cada proyecto de mi vida, ya
que juntos hemos caminado y avanzado cada etapa. Sin su misericordia, Su
amor, Sus fuerzas, este trabajo no habría sido posible.
Agradezco al Dr. Marcelo Grijalva, Director de este proyecto, y a la Dra.
Patricia Jiménez, Codirectora, por su colaboración en esta investigación, su
guía y su apoyo.
Al Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de las
Américas (UDLA), que me permitió llevar a cabo esta investigación en su
prestigioso laboratorio. Al Dr. César Paz-y-Miño, por dar acogida a este
proyecto y permitirme adquirir experiencia laboral, de gran valor. Al Blgo.
Andrés López, por su dirección en el proyecto, su paciencia y su guía en cada
etapa del estudio. A cada uno de los profesionales y amigos que trabajan en
el IIB, por compartir sus experiencias y permitirme adquirir nuevos
conocimientos que serán de gran utilidad en mi futuro profesional.
A mi familia, ya que sin ellos este sueño no tendría el mismo sentido, por
su apoyo incondicional y su amor, que me empujan a no rendirme y dar mi
mayor esfuerzo.
A mis amigos, que han sido también un pilar de mi vida y me han animado
en cada etapa a seguir adelante, confiando en Dios y en su respaldo.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CERTIFICACIÓN ............................................................................................ ii
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD .................................................... iii
AUTORIZACIÓN ............................................................................................ iv
DEDICATORIA ............................................................................................... v
AGRADECIMIENTO ...................................................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS ........................................................................... vii
ÍNDICE DE CUADROS Y TABLAS ................................................................ xi
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................... xii
ÍNDICE DE GRÁFICOS ............................................................................... xiii
RESUMEN .................................................................................................... xv
ABSTRACT .................................................................................................. xvi
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN .....................................................................1
1.1 Formulación del problema ........................................................................ 1
1.2 Justificación del problema ........................................................................ 2
1.3 Objetivos de la investigación .................................................................... 3
1.3.1
Objetivo General ................................................................... 3
1.3.2
Objetivos Específicos ........................................................... 3
1.4 Marco Teórico........................................................................................... 5
1.4.1
Aspectos Generales: Cáncer ................................................ 5
1.4.1.1
Concepto y origen ................................................................................. 5
1.4.1.2
Incidencia mundial................................................................................. 6
1.4.1.3
Tumores .................................................................................................. 8
1.4.1.4
Genética del cáncer: oncogenes y genes supresores de
tumores……. .............................................................................................................. 9
1.4.2.
Cáncer de mama ................................................................ 10
1.4.2.1
Concepto............................................................................................... 10
viii
1.4.2.2
Epidemiología ...................................................................................... 10
1.4.2.3
Aspectos preliminares y factores de riesgo ................................... 12
1.4.2.3.1 Aspectos preliminares ..................................................................... 12
1.4.2.3.2 Factores de riesgo ........................................................................... 15
1.4.2.4
Clasificación del cáncer de mama .................................................... 16
1.4.2.4.1 Clasificación histológica .................................................................. 16
1.4.2.4.1.1 Carcinoma ductal.......................................................................... 17
1.4.2.4.1.2 Carcinoma lobulillar o lobular ..................................................... 20
1.4.2.4.1.3 Carcinoma inflamatorio ................................................................ 22
1.4.2.4.1.4 Tipos especiales de carcinoma invasivo del seno .................. 22
1.4.2.4.2 Clasificación molecular ................................................................... 24
1.4.2.4.2.1 Tipos luminal A, luminal B ........................................................... 24
1.4.2.4.2.2 Tipo HER2 ..................................................................................... 25
1.4.2.4.2.3 Tipo basal ...................................................................................... 25
1.4.2.5
Tratamiento .......................................................................................... 26
1.4.2.6
Genética del cáncer de mama .......................................................... 28
1.4.2.6.1 Mutaciones genéticas hereditarias................................................ 28
1.4.2.6.2 Mutaciones genéticas adquiridas .................................................. 29
1.4.2.7
Análisis del gen AKT1: implicaciones en el cáncer de
mama………………………………………………………………………………..30
1.4.2.7.1 La vía de señalización PI3K/AKT .................................................. 30
1.4.2.7.2 AKT1 .................................................................................................. 31
1.4.2.7.2.1
Concepto y rol en el desarrollo del cáncer .............................. 31
1.4.2.7.2.2
Mutaciones en AKT1 .............................................................. 32
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS .................................................. 35
2.1 Revisión Bibliográfica ............................................................................. 35
2.2 Muestreo................................................................................................. 35
2.3 Diseño de Primers .................................................................................. 36
2.4 Análisis de historias clínicas ................................................................... 37
2.5 Análisis de laboratorio. Procesamiento de muestras .............................. 39
2.5.1
Extracción de ADN ............................................................. 39
2.5.1.1
Extracción de ADN a partir de sangre periférica ............................ 39
ix
2.5.1.2
Extracción de ADN a partir de tumores embebidos en
parafina……………………………………………………………………………..40
2.5.2
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .................... 42
2.5.2.1
Estandarización de PCR .................................................................... 42
2.5.3
Secuenciación .................................................................... 43
2.5.3.1
Purificación del producto PCR mediante columnas ....................... 43
2.5.3.2
Reacción de secuencia ...................................................................... 44
2.5.3.3
Purificación de la reacción de secuenciación ................................. 45
2.6 Análisis estadístico ................................................................................. 46
CAPÍTULO 3: RESULTADOS ....................................................................... 47
3.1 Recolección de muestras ....................................................................... 47
3.2 Clasificación de muestras tumorales ...................................................... 47
3.2.1
Tipo de carcinoma de mama .............................................. 47
3.2.2
Edad del paciente ............................................................... 48
3.2.3
Lateralidad .......................................................................... 49
3.2.4
Estadío tumoral................................................................... 50
3.2.5
Invasión a nódulo linfoide ................................................... 51
3.2.6
Grado tumoral/Histológico .................................................. 51
3.2.7
Receptores hormonales ...................................................... 52
3.2.8
Tipo de cáncer en base a receptores hormonales .............. 53
3.2.9
Márgenes quirúrgicos ......................................................... 54
3.3 Determinación de Genotipos .................................................................. 54
3.3.1
Extracción de ADN ............................................................. 54
3.3.2
Reacción en cadena de polimerasa (PCR) ......................... 55
3.3.2.1
Polimorfismos AKT1-E17 ................................................................... 56
3.3.2.2
Polimorfismo AKT1-L357P................................................................. 56
3.3.3
Secuenciación capilar ......................................................... 57
3.3.4
Análisis estadístico ............................................................. 60
x
3.3.4.1
Frecuencias genotípicas y alélicas ............................................. 60
3.3.4.2
Análisis de características clínicas en pacientes con cáncer de
mama y asociación con el tipo de cáncer .................................................... 61
3.3.4.3
Asociación del polimorfismo E17K con características clínicas
de pacientes con cáncer de mama....................................................................... 63
CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN ........................................................................... 66
CAPÍTULO 5: CONCLUSIONES .................................................................. 72
CAPÍTULO 6: RECOMENDACIONES .......................................................... 73
CAPÍTULO 7. BIBLIOGRAFÍA ...................................................................... 74
CAPÍTULO 8. ANEXOS ................................................................................ 80
xi
ÍNDICE DE CUADROS Y TABLAS
Cuadro 1. Diferencias entre tumores benignos y malignos………………..…8
Cuadro 2. Subtipos de cáncer de mama determinados por perfiles de
expresión génica. ......................................................................................... 26
Tabla 1. Incidencia y mortalidad por cáncer en población general ................ 6
Tabla 2. Criterios de selección empleados en el estudio............................. 35
Tabla 3. Descripción de las variables de estudio......................................... 37
Tabla 4. Condiciones estandarizadas para la PCR ..................................... 43
Tabla 5. Condiciones estandarizadas para la reacción de secuencia ......... 45
Tabla 6. Distribución de frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo
E17K ............................................................................................................ 60
Tabla 7. Distribución de características clínicas en pacientes con CM en
función del tipo de cáncer (clasificación molecular) ..................................... 62
Tabla 8. Distribución
de
características
clínicas, histopatológicas e
inmunohistoquímicas en pacientes con CM en función del genotipo
presentado, para la variante polimórfica E17K ............................................ 64
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Pictograma de la incidencia de cáncer de mama en el mundo. ... 11
Figura 2. Tasas estimadas de incidencia y mortalidad del cáncer de mama
en el mundo. ................................................................................................ 12
Figura 3. Tejido mamario normal. ............................................................... 13
Figura 4. Ganglios linfáticos relacionados al seno. ..................................... 14
Figura 5. Tipos de tumores en cáncer de mama ......................................... 17
Figura 6. Carcinoma ductal in situ ............................................................... 18
Figura 7. Grados de carcinoma ductal hasta la generación de CDI ............ 19
Figura 8. Carcinoma lobulillar in situ. .......................................................... 20
Figura 9. Carcinoma lobulillar invasivo ........................................................ 21
Figura 10. Carcinoma inflamatorio. ............................................................. 22
Figura 11. Células tumorales en carcinoma mucinoso................................ 23
Figura 12. Células tumorales en carcinoma papilar .................................... 24
Figura 13. Esquema de la vía de señalización PI3K/AKT ........................... 31
Figura 14.Electroforesis de muestras de ADN extraído, de la población de
estudio en geles de agarosa al 2%. ............................................................. 55
Figura 15. Electroforesis del fragmento de ADN de interés para el análisis
del SNP E17, de 198 pb, en un gel de agarosa al 2% ................................. 56
Figura 16. Electroforesis del fragmento de ADN de interés para el análisis
del SNP L357P, de 142 pb, en un gel de agarosa al 2% ............................. 57
xiii
Figura 17. Identificación del polimorfismo L357P por secuenciación capilar
y distribución en población total de estudio ................................................. 58
Figura 18. Identificación del polimorfismo E17K por secuenciación capilar
y distribución en población total de estudio.. ............................................... 59
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
tipo de carcinoma......................................................................................... 48
Gráfico 2. Distribución de la población de estudio afecta con CM según la
edad del paciente......................................................................................... 49
Gráfico 3. Distribución de la población de estudio afecta con CM en base
a la lateralidad.............................................................................................. 49
Gráfico 4. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
estadío tumoral ............................................................................................ 50
Gráfico 5. Distribución de la población de estudio afecta con CM en
función de la invasión de células tumorales a nódulo linfoide...................... 51
Gráfico 6. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
grado tumoral/histológico ............................................................................. 52
Gráfico 7. Distribución de la población de estudio afecta con CM en
función de la presencia de receptores hormonales: Progesterona,
Estrógeno, HER2. ........................................................................................ 53
Gráfico 8. Distribución de la población de estudio afecta con CM en
función del tipo de cáncer en base a receptores hormonales. (TNBC:
Triple Negative Breast Cancer, o Tipo Basal) .............................................. 53
xiv
Gráfico 9. Distribución de la población de estudio afecta con CM en
función de la presencia de células cancerígenas en bordes quirúrgicos ..... 54
xv
RESUMEN
En los últimos 8 años se han reportado estudios que indican una creciente
evidencia que la quinasa AKT1 es un miembro central de una de las rutas más
frecuentes de activación y proliferación del cáncer. Sin embargo, las
mutaciones en el gen AKT1 no han sido ampliamente estudiadas. En esta
investigación, el objetivo fue analizar los polimorfismos genéticos E17K, E17S
y L357P del gen AKT1, y su asociación con características histopatológicas e
inmunohistoquímicas en la población mestiza ecuatoriana afecta con cáncer
de mama. Se llevó a cabo un estudio retrospectivo caso-control, en el que se
recolectaron muestras de tejido mamario de 100 casos y muestras de sangre
periférica de 140 controles. Se analizaron las historias clínicas de cada
paciente y se registraron las características clínicas de cada uno de ellos. En
el análisis de laboratorio, se realizó la extracción de ADN de cada muestra, la
amplificación mediante PCR y finalmente secuenciación capilar. La variante
polimórfica E17K fue detectada en (2/81) el 2.5% de la población; se
encontraron dos genotipos homocigóticos en el caso del análisis de este
polimorfismo: G/G y A/A (homocigoto raro). En cuanto a la variante L357P,
sólo se encontró un genotipo: T/T. No se verificaron casos o controles con la
variante E17S. A partir de estos datos, se generó un análisis de asociación de
las distintas características histopatológicas e inmunohistoquímicas de los
pacientes, con los genotipos encontrados, para el polimorfismo E17K; en
ningún caso, se pudo afirmar la asociación del genotipo AA con alguna de las
distintas características clínicas estudiadas (P>0.05).
PALABRAS CLAVE:
•
AKT1
•
CÁNCER
•
POLIMORFISMO GENÉTICO
•
CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS
•
CARACTERÍSTICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS
xvi
ABSTRACT
In the last eight years, different studies have reported mounting evidence that
kinase AKT1 is a central member of one of the most common pathways of
cancer activation and proliferation. However, mutations in AKT1 gene have not
been widely studied. The aim of this study was to analyze genetic
polymorphisms E17K, E17S and L357P of AKT1 gene and their association
with histopathological and immunohistochemical features in the Ecuadorian
Mestizo population affected with breast cancer. For this purpose, a
retrospective case-control study was conducted in which breast tissue
samples from 100 breast cancer patients and peripheral blood samples from
140 controls were collected. The medical records of each patient were
analyzed and clinical features were recorded. In laboratory analysis: DNA
extraction, PCR and capillary sequencing were performed. The polymorphic
variant E17K was detected in (2/81) 2.5% of affected population. In the
analysis of this polymorphism, two homozygous genotypes G/G and A/A (rare
homozygous) were found. Only one genotype (T/T) was found for the L357P
variant. No cases or controls with E17S variant were found. From these data,
an
association
analysis
for
the
different
histopathological
and
immunohistochemical features of patients and E17K genotypes, was
performed. We found no association for AA genotype and clinical picture (P>
0.05).
KEYWORDS:
•
AKT1
•
CANCER
•
GENETIC POLYMORPHISM
•
HISTOPATHOLOGIC FEATURES
•
IMMUNOHISTOCHEMICAL FEATURES
1
CAPÍTULO 1.
INTRODUCCIÓN
1.1 Formulación del problema
En el Ecuador, el cáncer tiene una incidencia creciente y es considerado
la segunda causa de mortalidad general después de las enfermedades
cardiovasculares. En América Latina y el Caribe, el cáncer causa
aproximadamente el 20% de fallecimientos por enfermedades crónicas no
transmisibles. Se prevé que para el año 2020, existan alrededor de 833 mil
defunciones en esta región como consecuencia de este grupo de
enfermedades, lo que significa un incremento del 33% en relación a 1990
(MSP, Ministerio de Salud garantiza acceso a la salud de pacientes con
cáncer, 2014).
La caracterización del genoma, ha beneficiado a diversas áreas de la
biomedicina como la oncología, ha contribuido tanto en la comprensión de los
mecanismos básicos de los procesos de transformación neoplásica, como en
el desarrollo de nuevos servicios para un mejor pronóstico y evaluación del
riesgo en pacientes oncológicos (Hidalgo & Jiménez, 2009).
Además, las investigaciones en líneas de cáncer se han multiplicado a
nivel mundial, con el fin de encontrar posibles métodos de diagnóstico en
fases tempranas del desarrollo de la enfermedad, y posibles dianas
terapéuticas para su cura.
Un método de investigación muy utilizado es el estudio de polimorfismos
genéticos. A partir de los datos generados con estos estudios en pacientes
con cáncer, se ha logrado entender parcialmente los mecanismos de
susceptibilidad a esta enfermedad y han
permitido la estimación de las
frecuencias alélicas y análisis de asociación de polimorfismos con algunos
tipos de cáncer, entre ellos el de mama (Checa, 2007).
Sin embargo, aún deben realizarse diversos estudios de este tipo, que
permitan entender el complejo mecanismo de desencadenamiento de la
2
enfermedad y cómo asociar estos conocimientos para el desarrollo de
fármacos o metodologías terapéuticas aplicativas.
1.2 Justificación del problema
El cáncer de mama es uno de los más frecuentes entre las mujeres de
nuestro país, 30 de cada 100000 personas son diagnosticadas con esta
enfermedad cada año y aproximadamente la mitad de ellas se detectan en
etapas avanzadas de la enfermedad, lo cual disminuye las posibilidades de
curación y supervivencia.
Durante el año 2011, se realizaron 448.350 consultas de detección
oportuna de cáncer de mama en el Ministerio de Salud Pública (MSP), sin
embargo, esta enfermedad sigue siendo la tercera causa de muerte por
cáncer en las mujeres del Ecuador (MSP, 2012).
Ante esta creciente situación, las diferentes investigaciones a nivel
oncológico se han incrementado; en el Ecuador a pesar de la urgencia de esta
problemática, existen pocos estudios generados en líneas de cáncer de
mama.
En
Ecuador,
hasta
el
momento
se
han
realizado
estudios
epidemiológicos multicéntricos para determinar marcadores moleculares de
cáncer (SEP, 2013); otras investigaciones han buscado determinar la
frecuencia de este cáncer en el País (Córdova & Coello, 2011) y otras, han
empezado a centrarse en el estudio de polimorfismos relacionados con la
enfermedad (Carrera, 2008).
Estas investigaciones son el inicio de nuevos estudios que deberán
llevarse a cabo, permitiendo la compresión de los mecanismos que generan
susceptibilidad a la enfermedad y consecuentemente el desarrollo de
metodologías de pronóstico y tratamiento oportunos.
3
Es fundamental iniciar con esta línea de investigación con el fin de conocer
cómo las variantes polimórficas del gen AKT1 (E17S, E17 K y L357P) se
presentan en la población mestiza ecuatoriana, comparando además sus
resultados con poblaciones extranjeras estudiadas hasta el momento.
1.3 Objetivos de la investigación
1.3.1 Objetivo General
•
Analizar los polimorfismos genéticos E17K, E17S y L357P del gen AKT1,
y
su
asociación
con
características
histopatológicas
e
inmunohistoquímicas en la población mestiza ecuatoriana afecta con
cáncer de mama.
1.3.2 Objetivos Específicos
•
Establecer frecuencias alélicas y genotípicas de la población mestiza
ecuatoriana relacionadas con los polimorfismos genéticos E17K, E17S y
L357P del gen AKT1.
•
Comparar las frecuencias alélicas y genotípicas obtenidas entre
individuos afectos y controles.
•
Asociar las características histopatológicas e inmunohistoquímicas con
las variantes genéticas estudiadas.
•
Relacionar la presencia de los polimorfismos genéticos estudiados con el
riesgo a desarrollar cáncer de mama.
4
•
Evaluar el potencial de los polimorfismos del gen AKT1, como
biomarcadores moleculares para el diagnóstico preventivo de esta
enfermedad.
5
1.4 Marco Teórico
1.4.1
1.4.1.1
Aspectos Generales: Cáncer
Concepto y origen
El cáncer se define como una enfermedad o el conjunto de ellas,
caracterizado por una proliferación continua y descontrolada de células
anormales. Puede originarse a partir de cualquier tipo de célula en cualquier
tejido corporal, y se clasifica en función del tejido y de la célula de origen
(National Cancer Institute [NCI], 2012).
Existen distintas formas del cáncer, entre las que se destacan tres
subtipos: los sarcomas, procedentes del tejido conectivo como huesos,
cartílagos, nervios, vasos sanguíneos, músculos y tejido adiposo. Los
carcinomas, que proceden de tejidos epiteliales como la piel o los epitelios
que tapizan las cavidades y órganos corporales, y de los tejidos glandulares
de la mama y de la próstata. Finalmente, en el tercer subtipo se encuentran
las leucemias y los linfomas, que incluyen los cánceres de los tejidos
formadores de las células sanguíneas, producen inflamación de los ganglios
linfáticos, invasión del bazo y de la médula ósea, y sobreproducción de células
blancas inmaduras (Instituto Nacional del Cáncer, 2011).
En general, el cáncer se produce por alteraciones celulares que se han
generado por una modificación en la clave cromosómica, causando que las
células reciban mensajes erróneos, que provocan el descontrol de su propio
desarrollo y que las células dejen de cumplir las funciones para las que fueron
inicialmente programadas (Instituto Nacional de Cancerología, 2004).
La enfermedad surge de una serie de cambios genéticos y epigenéticos,
que le otorgan a la célula cancerosa su comportamiento maligno. En el nivel
más simple, las células cancerosas se dividen en momentos inadecuados y
no responden a las señales de alto y siga, que regulan el ciclo celular
(mensajes químicos).
6
Posteriormente, cuando se transforman en células tumorales, adquieren
una variedad de características que las ayudan a sobrevivir, proliferar, invadir
y crecer, como: angiogénesis, cambios en el citoesqueleto, reducción de la
adhesión celular, aumento de la movilidad y desarrollan acciones fisiológicas
que bloquean los intentos del cuerpo de eliminar las células cancerosas
mediante respuestas inmunológicas (NCI, 2012).
1.4.1.2
Incidencia mundial
El cáncer puede ocurrir en aproximadamente uno de cada tres individuos.
Las mutaciones del ADN normalmente suceden con una frecuencia de 1 en
cada 20 millones por gen por división celular, por lo que sería lógico asumir
que las poblaciones humanas a nivel mundial muestran esta misma
frecuencia, sin embargo varios factores intervienen de manera influyente en
el incremento de la incidencia de cáncer en algunas poblaciones, ya sean
factores hereditarios o ambientales (Ion Baba, 2007). A continuación se
muestran las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer para el año 2012, en
la Tabla 1 (World Health Organization [WHO], 2012).
Tabla 1.
Incidencia y mortalidad por cáncer en población general en el año 2012
Incidencia
Cáncer
Mortalidad
Número de
personas
(%)
Número de
personas
(%)
Cavidad oral, labio
300373
2.1
145353
1.8
Nasofaringe
86691
0.6
50831
0.6
Otros cánceres ORL (no
laringe)
142387
1.0
96105
1.2
Esófago
455784
3.2
400169
4.9
Estómago
951594
6.8
723073
8.8
7
Colorrectal
1360602
9.7
693933
8.5
Hígado
782451
5.6
745533
9.1
Vesícula biliar
178101
1.3
142823
1.7
Páncreas
337872
2.4
330391
4.0
Laringe
156877
1.1
83376
1.0
Pulmón
1824701
13.0
1589925
19.4
Melanoma cutáneo
232130
1.7
55488
0.7
Sarcoma de kaposi
44247
0.3
26974
0.3
Mama
1671149
11.9
521907
6.4
Cervix uterino
527624
3.8
265672
3.2
Cuerpo uterino
319605
2.3
76160
0.9
Ovario
238719
1.7
151917
1.9
Próstata
1094916
7.8
307481
3.7
Testículo
55266
0.4
10351
0.1
Riñón
337860
2.4
143406
1.7
Vejiga
429793
3.1
165084
2.0
Cerebro, sistema nervioso
256213
1.8
189382
2.3
Tiroides
298102
2.1
39771
0.5
Linfoma de Hodgkin
65950
0.5
25469
0.3
Linfoma no-Hodgkin
385741
2.7
199670
2.4
Mieloma múltiple
114251
0.8
80019
1.0
Leucemia
351965
2.5
265471
3.2
Todos los cánceres excluidos
los cánceres de piel no
melanoma
14067894
100.0
8201575
100.0
Fuente: (WHO, 2012)
8
1.4.1.3
Tumores
El crecimiento anormal de las células puede formar, en la mayoría de los
casos,
masas de tejidos
llamados tumores (Instituto Nacional de
Cancerología, 2004).
Es esencial diferenciar tumores benignos de malignos. En general, los
tumores malignos tienen capacidad invasiva y proliferativa hacia otros tejidos,
es decir poseen habilidad para desarrollar angiogénesis y metástasis,
diferencia de
los
a
benignos, cuya mayor complicación consiste en la
posibilidad de ocasionar presión en tejidos y órganos sanos (American Cancer
Society [ACS], 2014). En el Cuadro 1 se pueden observar las diferencias entre
los tumores beningos y malignos (Agency for toxic substances and disease
registry [ATSDR], 2005).
Cuadro 1.
Diferencias entre tumores benignos y malignos
Características
Tumores benignos
Tasa de
crecimiento
Lenta; puede
interrumpirse o
retroceder
Rápida, autónoma;
generalmente no interrumpe o
retrocede
Se expande y
desplaza
Invade, destruye y reemplaza
Crecen de manera
ordenada
Crecen desordenadamente
Diferenciación
Las células tumorales
se asemejan a las
células originales
Las células tumorales tal vez
no se asemejan a las células
originales
Metástasis
No
Sí
Tipo de
crecimiento
Tumores malignos
9
Efectos en la
salud
Normalmente no
producen efectos
graves como la
muerte.
Pueden ocasionar la muerte
en caso de diagnóstico y
tratamiento tardíos.
Fuente: (ATSDR, 2005)
1.4.1.4
Genética del cáncer: oncogenes y genes supresores de
tumores
Las más de 30.000 millones de células que constituyen el organismo del
ser humano nacen, crecen, se dividen y mueren bajo la estricta vigilancia del
ADN. La reproducción celular está supervisada por determinados sistemas de
control, en los que participan una gran cantidad de moléculas como proteínas,
enzimas, factores de crecimiento y genes que se activan y desactivan con
gran precisión. El más mínimo error que se presente en uno de estos sistemas
de control puede acarrear una tragedia celular (Ríos & Hernández, 2001).
Las células de un tumor descienden de una ancestral común, que en algún
momento, inició un programa de división indebido. La transformación maligna
de una célula acontece por acumulación de mutaciones en unos genes
específicos, los cuales son la clave molecular para entender las raíces del
cáncer (Ríos & Hernández, 2001).
En los últimos años se ha aceptado universalmente que los tumores
surgen debido a la acumulación de mutaciones en genes encargados de
controlar la proliferación, diferenciación o muerte celular. Estos genes pueden
clasificarse en dos grandes grupos: 1) oncogenes y 2) genes supresores de
tumores (Santos, 2013).
10
Los protooncogenes ejercen efectos de control positivo sobre la
proliferación celular, mientras que los genes supresores de tumores cumplen
un papel regulador negativo en tal proceso, lo que determina que su mutación
en procesos tumorales les confiera un carácter recesivo (Alonso, 2013).
De este modo, hoy en día, se considera que en el inicio del cáncer existe
un desequilibrio de la balanza entre la proliferación celular (oncogenes =
acelerador) y la represión de ésta (genes supresores de tumores = freno).
Además de la activación de oncogenes e inactivación de genes
supresores, las alteraciones genéticas que provocarían el cáncer pueden
tener otros orígenes como: alteración en los genes de reparación del ADN,
alteración de genes relacionados con la apoptosis, y otros mecanismos tales
como la activación de telomerasa, genes interruptores, entre otros. (Alonso,
2013).
1.4.2.
1.4.2.1
Cáncer de mama
Concepto
El cáncer de mama se considera como la proliferación de células malignas en
tejidos del seno (células epiteliales que revisten los conductos o lobulillos de
la mama). Ocurre casi por completo en las mujeres, pero los hombres también
la pueden padecer (ACS, 2014).
1.4.2.2
Epidemiología
El cáncer de mama es el cáncer más frecuente en las mujeres, tanto en
los países desarrollados como en los países en desarrollo. Los casos de
cáncer de mama han aumentado en un 20% desde el 2008, convirtiéndolo en
11
el segundo tipo de cáncer más común en el mundo y el más frecuente entre
mujeres (OMS, 2012).
Del total de casos de cáncer diagnosticados en 2012, el 25 % fueron de
mama, de los que 883.000 se registraron en países menos desarrollados y
794.000 en el mundo desarrollado, indicando grandes diferencias de atención
entre ellos (El Universo, 2013).
Esta enfermedad es una de las principales causas de muerte en los
países menos desarrollados, lo que se debe en parte a un cambio en los
estilos de vida que está ocasionando un incremento en la incidencia, y a que
los avances clínicos para combatir la enfermedad no están alcanzando a las
mujeres que viven en estas regiones (OMS, 2012).
Figura 1. Pictograma de la incidencia de cáncer de mama en el mundo.
Fuente: (WHO, 2012).
12
Figura 2. Tasas estimadas de incidencia y mortalidad del cáncer de mama
en el mundo. Fuente: (WHO, 2012).
La edad de máxima incidencia está por encima de los 50 años, pero
aproximadamente un 6% se diagnostica en mujeres menores de 35 años
(Sociedad Española de Oncología Médica [SEOM], 2013).
1.4.2.3
Aspectos preliminares y factores de riesgo
1.4.2.3.1
•
Aspectos preliminares
El seno
Consiste principalmente en lobulillos (glándulas productoras de leche),
conductos (llevan la leche desde los lobulillos al pezón) y estroma (el tejido
13
adiposo y el tejido conectivo que rodean los conductos y los lobulillos, los
vasos sanguíneos y los vasos linfáticos) (Ver Figura 3) (ACS, 2014).
Figura 3. Tejido mamario normal. Fuente: (ACS, 2014).
La mayoría de los cánceres de seno comienza en las células que recubren los
conductos. Algunos cánceres de seno se originan en las células que recubren
los lobulillos, mientras que un pequeño número se origina en otros tejidos.
•
Sistema linfático del seno
El sistema linfático forma parte del sistema de defensa del cuerpo y está
compuesto de vasos linfáticos y de ganglios linfáticos.
Los vasos linfáticos son tubos delgados que transportan glóbulos blancos
y linfa. Los vasos linfáticos conducen a órganos pequeños en forma de frijol
llamados ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos se encuentran cerca del
seno, bajo el brazo, arriba de la clavícula, en el pecho y en otras partes del
cuerpo (NCI, 2014).
Los ganglios linfáticos filtran sustancias en la linfa para ayudar a combatir
infecciones y enfermedades. Además, almacenan glóbulos blancos, llamados
linfocitos, los cuales combaten enfermedades e infecciones (NCI, 2014).
14
Figura 4. Ganglios linfáticos relacionados al seno. Fuente: (ACS, 2014).
Si las células cancerosas se han propagado a los ganglios linfáticos, existe
una probabilidad mayor de que las células también hayan alcanzado el
torrente sanguíneo y se hayan propagado (metástasis) a otros lugares del
cuerpo y por tanto, a otros órganos (ACS, 2014).
Debido a esto, si se detecta invasión de células cancerígenas en uno o
más ganglios linfáticos, el pronóstico empeora y el plan de tratamiento es poco
eficaz. Aun así, no todas las mujeres con células cancerosas en sus ganglios
linfáticos presentan metástasis, y es posible también que algunas mujeres que
no tengan células cancerosas en sus ganglios linfáticos, luego desarrollen
metástasis (ACS, 2014).
15
1.4.2.3.2
Factores de riesgo
Se han identificado algunos factores de riesgo para el desarrollo del cáncer
de mama, como los que se mencionan a continuación (SEOM, 2013).
•
Edad: el riesgo se incrementa con la edad. La mayoría de casos ocurre
en mujeres mayores de 60 años. Aproximadamente uno de ocho
cánceres de seno se detecta en mujeres menores de 45 años de edad,
mientras que aproximadamente dos de tres cánceres invasivos del
seno se encuentran en mujeres de 55 años o más.
•
Raza: más frecuente en mujeres de raza blanca. En general, se sabe
que las mujeres de raza blanca tienen una probabilidad ligeramente
mayor de padecer cáncer de seno que las mujeres de raza negra,
aunque éstas últimas tienen una mayor probabilidad de morir de este
cáncer. Sin embargo, en las mujeres menores de 45 años de edad, el
cáncer de seno es más común en las mujeres de raza negra. Las
mujeres asiáticas, hispanas e indias americanas tienen un menor
riesgo de padecer y morir de cáncer de mama.
•
Alcohol: su consumo excesivo aumenta el riesgo de padecer cáncer
de seno. El riesgo aumenta con la cantidad de alcohol consumido. En
comparación con las mujeres que no ingieren alcohol, las que
consumen una bebida alcohólica diaria tienen un aumento muy ligero
en el riesgo.
•
Aparición temprana de la primera regla y/o menopausia tardía: las
mujeres que han tenido más ciclos menstruales debido a que
comenzaron a menstruar temprano (antes de los 12 años) y/o
experimentaron tarde la menopausia (después de los 55 años) tienen
un riesgo ligeramente mayor de padecer cáncer de seno. Este aumento
en el riesgo podría deberse a una exposición más prolongada a las
hormonas estrógeno y progesterona durante la vida de la persona.
16
•
Historia familiar: aumenta el riesgo si un familiar de primer grado
(madre, hermana o hija) ha padecido la enfermedad. Si la enfermedad
apareció en familiares más lejanos, el riesgo es menor.
•
Antecedentes personales: una mujer que ha tenido cáncer de mama,
tiene más riesgo de padecer otro cáncer en la mama contralateral.
•
Enfermedades previas de la mama: algunas enfermedades de la
mama como la hiperplasia atípica o el carcinoma lobulillar in situ
pueden aumentar el riesgo.
•
Primer embarazo tardío o nuliparidad (ausencia de embarazo): Las
mujeres que no han tenido hijos o aquellas que tuvieron su primer hijo
después de los 30 años tienen en general un riesgo ligeramente mayor
de padecer cáncer de seno.
•
Terapia hormonal sustitutiva prolongada: Durante el tratamiento
hormonal sustitutivo existe un mayor riesgo de carcinoma de mama, si
bien depende de los tipos de preparados, y vuelve al riesgo habitual
una vez que cesa el tratamiento.
1.4.2.4
1.4.2.4.1
Clasificación del cáncer de mama
Clasificación histológica
Existen diversos tipos de cáncer de mama, como se muestra en la
Figura 5. En algunos casos, un solo tumor del seno puede ser una
combinación de estos tipos o ser una mezcla de cáncer in situ e invasivo (INC,
2014).
17
El tipo más común de cáncer de seno es el carcinoma ductal. Este cáncer
empieza en las células que revisten los conductos del seno. Casi 7 de cada
10 mujeres con cáncer de seno tienen carcinoma ductal.
El segundo tipo más común de cáncer de seno es el carcinoma lobulillar.
Este cáncer empieza en un lobulillo del seno. Casi 1 de cada 10 mujeres con
cáncer de seno tiene carcinoma lobulillar.
Otras mujeres tienen una mezcla de los tipos de carcinoma ductal y
lobulillar o tienen un tipo menos común de cáncer de seno (ACS, 2014).
Figura 5. Tipos de tumores en cáncer de mama. Fuente: (Kumar, Aster,
Fausto, & Abbas, 2010)
1.4.2.4.1.1
•
Carcinoma ductal
In situ
El carcinoma ductal in situ (CDIS) es el tipo más común de cáncer de
mama no invasivo. Ductal significa que el cáncer comienza dentro de los
conductos lácteos, como se observa en la Figura 6, carcinoma se refiere a
cualquier cáncer que se genera en la piel u otros tejidos (incluyendo tejido
mamario) que cubren o revisten los órganos internos, e “in situ” significa en el
lugar de origen (BreastCancer, 2014).
18
CDIS se considera un precáncer, ya que en algunos casos se puede
convertir en un cáncer invasivo. Sin embargo, actualmente, no existe una
metodología que permita conocer con certeza los casos que se convertirán en
cánceres invasivos (ACS, 2014).
Muy pocos casos de CDIS se presentan como una masa palpable; 80%
se diagnostican a través de una mamografía. El CDIS abarca un grupo
heterogéneo de lesiones histopatológicas que se clasifican en varios subtipos,
principalmente de acuerdo con su perfil arquitectónico: micropapilar, papilar,
sólido, cribiforme y comedón. Este último, se compone de células cuya
citología parece maligna, con la presencia de núcleos de grado alto,
pleomorfismo y abundante necrosis luminal central, parece ser un tumor más
dinámico, con una probabilidad mayor de desembocar en carcinoma ductal
invasivo (INC, 2014).
Figura 6. Carcinoma ductal in situ. Fuente: (ACS, 2014).
•
Invasivo o infiltrante
El carcinoma ductal invasivo (CDI), es el tipo más común de cáncer de
mama.
19
Este cáncer comienza en un conducto lácteo del seno, penetra a través
de la pared del conducto y crece en el tejido adiposo del seno (Ver Figura 7).
En este punto puede tener la capacidad de propagarse hacia otras partes del
cuerpo a través del sistema linfático y el torrente sanguíneo (ACS, 2014).
Aunque este carcinoma puede afectar a mujeres de cualquier edad,
resulta más común a medida que la mujer envejece. Según la Sociedad
Americana del Cáncer, aproximadamente dos tercios de las mujeres que son
diagnosticadas con cáncer de mama invasivo tienen aproximadamente
55 años de edad (BreastCancer, 2014).
Figura 7. Grados de carcinoma ductal hasta la generación de CDI.
Fuente: (BreastCancer, 2014).
20
1.4.2.4.1.2
•
Carcinoma lobulillar o lobular
In situ
La expresión carcinoma lobulillar in situ (CLIS) no hace referencia a un
verdadero cáncer. El término neoplasia lobulillar es más apropiado para esta
lesión, ya que no se conoce como una lesión premaligna sino, más bien, como
un marcador que identifica a mujeres con un riesgo mayor de presentar
posteriormente de cáncer invasivo de mama (INC, 2014).
En este carcinoma, las células anómalas comienzan a crecer en los
lobulillos, es decir en las glándulas productoras de leche ubicadas en los
extremos de los conductos mamarios (Ver Figura 8). El crecimiento anómalo
permanece dentro del lobulillo y no se propaga hacia los tejidos circundantes.
Las personas diagnosticadas con CLIS suelen tener más de un lobulillo
afectado (BreastCancer, 2014).
Figura 8. Carcinoma lobulillar in situ. Fuente: (ACS, 2014).
•
Invasivo o infiltrante
El carcinoma lobulillar invasivo (CLI) es el segundo tipo de cáncer de
mama más común después del carcinoma ductal invasivo. De acuerdo a la
21
Sociedad Americana del Cáncer, más de 180 000 mujeres en los Estados
Unidos descubren anualmente que padecen un cáncer de mama invasivo.
Alrededor del 10 % de estos casos de cáncer son carcinomas lobulares
invasivos (BreastCancer, 2014)
Este tipo de carcinoma comienza en las glándulas productoras de leche
(lobulillos) y se propaga hacia los tejidos mamarios que lo rodean (Ver Figura
9). Con el paso del tiempo, un carcinoma lobular invasivo puede propagarse
hacia los ganglios linfáticos y posiblemente otras zonas del cuerpo (ACS,
2014).
Los casos de CLI tienden a aparecer en edades más avanzadas que los
carcinomas ductales invasivos, alrededor de los 60 años. Algunas
investigaciones sugieren que el uso de terapias de reemplazo hormonal
durante y después de la menopausia puede incrementar el riesgo de
desarrollar este carcinoma (BreastCancer, 2014).
Figura 9. Carcinoma lobulillar invasivo. Fuente: (BreastCancer, 2014).
22
1.4.2.4.1.3
Carcinoma inflamatorio
Es un cáncer poco común (1-3% de los carcinomas en seno). Las células
tumorales infiltran los vasos linfáticos y la piel. La mama está globalmente
enrojecida y caliente, como si estuviese inflamada, porque las células
tumorales bloquean los vasos linfáticos de la piel (Ver Figura 10) (Asociación
Española contra el Cáncer [AEEC], 2013).
El seno afectado puede volverse más grande, firme, sensible, o puede
presentar picazón. En sus etapas iniciales, se lo confunde con una infección
en el seno (mastitis), y se trata como una infección administrando antibióticos.
Si los síntomas son causados por cáncer, éstos no se aliviarán, y una biopsia
encontrará células cancerosas.
Este tipo de cáncer suele tener una mayor probabilidad de propagación y
un peor pronóstico que el típico cáncer ductal invasivo o lobulillar invasivo
(ACS, 2014).
Figura 10. Carcinoma inflamatorio. Fuente: (ACS, 2014).
1.4.2.4.1.4
•
Tipos especiales de carcinoma invasivo del seno
Carcinoma mucinoso
Es una forma poco frecuente de carcinoma ductal invasivo. Representa
cerca del 2-3 % de todos los casos de cáncer de mama
23
Es un carcinoma ductal invasor de bajo grado de malignidad que se
caracteriza por células tumorales inmersas en cúmulos de moco extracelular
(Ver Figura 11). Comúnmente, esta mucosidad recubre la mayoría de las
superficies internas del cuerpo humano, sin embargo, en el carcinoma
mucinoso, la mucosidad se convierte en una parte principal del tumor y rodea
las células del cáncer de mama (ACS, 2014).
El carcinoma mucinoso tiene menos probabilidad de propagarse a los
ganglios linfáticos que otros tipos de cáncer de mama, presentando un mejor
pronóstico (BreastCancer, 2014).
Figura 11. Células tumorales en carcinoma mucinoso. Fuente: (Moreno,
2010).
•
Carcinoma papilar
Son carcinomas poco frecuentes y representan menos del 1-2 % de los
casos de cáncer de mama invasivo. Generalmente tiene un borde bien
definido y está formado por prolongaciones pequeñas en forma de dedos,
como se muestra en la Figura 12.
Con frecuencia, es de grado 2 (grado moderado) en una escala de 1 a 3.
En la mayoría de los casos de carcinoma papilar invasivo, también está
presente un carcinoma ductal in situ (CDIS) (BreastCancer, 2014).
24
Figura 12. Células tumorales en carcinoma papilar. Fuente: (Pérez,
Mariángel, & Poblete, 2004).
1.4.2.4.2 Clasificación molecular
La investigación sobre los patrones de expresión genética ha sugerido
algunas nuevas formas de clasificar los cánceres de seno. Recientemente, se
ha generado una clasificación basada en las características moleculares, que
puede ser mejor al predecir el pronóstico y la respuesta de varios tipos de
tratamiento contra el cáncer de seno. Se han identificado cuatro tipos básicos
de cánceres de mama: Luminal A, Luminal B, Basal y Her2/neu (ACS, 2014).
1.4.2.4.2.1
Tipos luminal A, luminal B
Los tipos luminales son receptor de estrógeno positivo, usualmente de
bajo grado, que tiende a crecer lentamente. Los patrones de expresión
genética de estos tipos son similares a las células normales que recubren los
conductos y las glándulas del seno. Los cánceres luminal B, generalmente
crecen con un poco más de rapidez que los luminal A (INC, 2014).
Los tumores Luminal A tienden a ser RE+ y/o RP+ y HER2- y menos
agresivos que otros subtipos. Normalmente, se asocian con un mejor
pronóstico a corto plazo, ya que la expresión de los receptores hormonales
predice una respuesta favorable al tratamiento hormonal. Sin embargo, la
supervivencia a largo plazo es similar o incluso menor que en otros subtipos
(American Cancer Society, 2013).
25
Los tumores Luminal B, son en su mayoría RE+ y/o RP+ y se distinguen
de los demás subtipos, por la expresión de HER2. Del 10-20% de casos de
cáncer de mama, son Luminal B (American Cancer Society, 2013).
1.4.2.4.2.2
Tipo HER2
Estos cánceres tienen copias adicionales del gen HER2, que codifica una
proteína promotora del crecimiento, y de varios otros genes. Los tumores,
tienden a crecer más rápidamente y a diseminarse con mayor agresividad que
otros subtipos, por lo que se asocian con un pronóstico desfavorable a corto
plazo, en comparación con tumores con RE+ (ACS, 2014). Sin embargo, el
uso de terapias dirigidas, como el trastuzumab (Herceptin), han invertido gran
parte del impacto provocado debido al pronóstico de sobre-expresión de
HER2, permitiendo tratar exitosamente el cáncer en algunos casos (American
Cancer Society, 2013).
1.4.2.4.2.3
Tipo basal
La mayoría de estos cánceres son de los llamados tipo triple negativo, es
decir, carecen de los receptores de estrógeno o progesterona y tienen
cantidades normales de HER2. Los patrones de expresión genética de estos
cánceres son similares a células en las capas basales más profundas de los
conductos y las glándulas del seno. Este tipo es más común entre las mujeres
con mutaciones genéticas BRCA1 (ACS, 2014).
26
Cuadro 2.
Subtipos de cáncer de mama determinados por perfiles de expresión
génica.
Comportamiento
Subtipo
Inmunofenotipo
Luminal A
RE (+) y/o RP (+);
HER2/neu (-)
• Subtipo más común y menos agresivo. Buen
pronóstico.
• Bajo grado histológico. Respuesta hormonal.
• Asociado a incremento de edad.
Luminal B
RE (+) y/o RP (-);
HER2/neu (+)
• Similar al Subtipo Luminal A.
Peor resultado que el Subtipo Luminal A.
• Más frecuentemente RE (+) / RP (-).
Basal
RE (-); RP (-);
HER2/neu (-)
CK 5/6 (+) y/o
EGFR (+)
• Subtipo agresivo.
• Alto grado histológico e índice mitótico.
• Riesgo en edades menores (<40 años).
• Más frecuentemente en mujeres premenopáusicas
afroamericancas.
RE (-) y/o RP (-);
HER2/neu (+)
• Menos común. Subtipo altamente agresivo.
• Alto grado histológico.
• Riesgo en mujeres <40 años, mayor que el subtipo
luminal.
• La etnia afroamericana puede ser un factor de riesgo.
• Resultado mejorado por HER2/neu (+).
HER2/neu (+);
RE(-)
Modificada por: (Schnitt, 2009).
1.4.2.5
Tratamiento
El tratamiento integral del cáncer de mama es multidisciplinario, los
manejos más comunes son cirugía y radioterapia en cualquiera de sus
modalidades (neoadyuvante, adyuvante y paliativa). El tratamiento sistémico,
incluye quimioterapia, terapia endócrina y la terapia dirigida a blancos
moleculares (Arce, 2011).
Los tratamientos pueden ser clasificados en grupos amplios, basándose
en su funcionamiento y al tipo de pacientes a que se dirigen (ACS, 2014).
• Cirugía para el cáncer de seno
Se emplea algún tipo de cirugía en la mayoría de las mujeres con cáncer
de seno. Usualmente, se necesita cirugía para extirpar un tumor de seno. Las
27
opciones quirúrgicas son la cirugía conservadora del seno y la mastectomía.
La cirugía también se hace para verificar si el cáncer se propagó a los ganglios
linfáticos que están debajo del brazo. Las opciones para esto incluyen una
biopsia del ganglio linfático centinela y una disección de los ganglios linfáticos
axilares.
• Terapia local y terapia sistémica
La terapia local tiene como objetivo tratar un tumor en un sitio específico,
sin afectar el resto del cuerpo. Algunos ejemplos de terapias locales son la
cirugía y la radioterapia.
La terapia sistémica se refiere a medicamentos que se administran por
vía oral o directamente en el torrente sanguíneo para llegar a las células
cancerosas en cualquier lugar del cuerpo. La quimioterapia, la terapia
hormonal y la terapia dirigida son terapias sistémicas.
• Terapia adyuvante
Son tratamientos adicionales para ayudar a evitar que el cáncer regrese.
A esto se le conoce como terapia adyuvante. Los médicos creen que incluso
en las etapas tempranas de cáncer de seno, las células cancerosas se pueden
desprender del tumor primario del seno y comenzar a propagarse. Estas
células no se pueden detectar fácilmente, sin embargo pueden establecer
tumores nuevos en los tejidos adyacentes, en otros órganos y huesos. El
objetivo de la terapia adyuvante es destruir estas células ocultas. Tanto la
terapia sistémica (como quimioterapia, terapia hormonal y terapia dirigida)
como la radiación se pueden usar como terapia adyuvante.
28
1.4.2.6
Genética del cáncer de mama
La mayoría de casos en cáncer de mama no tienen una causa
identificable, pero aproximadamente del 5-10% son causados por mutaciones
genéticas (Vidal, 2008).
1.4.2.6.1 Mutaciones genéticas hereditarias
Ciertas
mutaciones
hereditarias
en
el
ADN
pueden
aumentar
dramáticamente el riesgo de padecer diversos tipos de cáncer. Los dos genes
mejor conocidos vinculados al cáncer de mama son BRCA1 y BRCA2 (ACS,
2014).
Juntas, las mutaciones en el BRCA1 y en el BRCA2 representan casi de
20 a 25% de los casos de cáncer de mama hereditarios y cerca de 5 a 10%
de todos casos de éste cáncer. Además, las mutaciones en el BRCA1 y en
el BRCA2 representan casi 15% de los casos de cáncer de ovario en general.
Los cánceres de mama asociados con las mutaciones en el BRCA1 y en
el BRCA2 tienden a presentarse a una edad más joven que los cánceres de
mama esporádicos (INC, 2014).
Hoy en día, las pruebas genéticas pueden identificar a algunas mujeres
que han heredado las mutaciones en los genes supresores de tumores
BRCA1 o BRCA2 (o con menos frecuencia en otros genes como PTEN o
TP53). Estas mujeres pueden tomar medidas preventivas para reducir su
riesgo de cáncer de mama y supervisarse continuamente a fin de detectar la
enfermedad en una etapa tratable (ACS, 2014).
Cambios en otros genes: otras mutaciones genéticas podrían también
conducir a cáncer de mama, sin embargo éstas son menos frecuentes e
indicadoras de la gravedad o riesgo de desarrollar la enfermedad. Algunos de
los genes que pueden presentar mutaciones relacionadas al cáncer de mama,
son los siguientes (ACS, 2014).
29
•
ATM: el gen ATM ayuda normalmente a reparar el ADN dañado.
Heredar dos copias anormales de este gen causa la enfermedad
ataxia-telangiectasia. Por otro lado, heredar una copia mutada de este
gen ha sido asociado con una alta tasa de cáncer de mama en algunas
familias.
•
p53: las mutaciones hereditarias del gen p53 supresor de tumores
causa el síndrome de Li-Fraumeni. Las personas con este síndrome
tienen mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama, al igual que otros
cánceres.
•
PTEN: este gen ayuda normalmente a regular el crecimiento celular.
Las mutaciones hereditarias en este gen causan el síndrome de
Cowden, un trastorno poco común en el cual las personas están en un
riesgo aumentado de tumores del seno, malignos y benignos.
•
CHEK2: mutaciones hereditarias en el gen CHEK2 pueden aumentar
el riesgo de cáncer de mama alrededor del doble del porcentaje normal.
•
CDH1: las mutaciones hereditarias en este gen causan cáncer gástrico
difuso hereditario, un síndrome en el cual las personas desarrollan un
tipo poco común de cáncer de estómago a una edad temprana. Las
mujeres con mutaciones en este gen también tienen mayor riesgo de
cáncer de mama lobulillar invasivo.
1.4.2.6.2 Mutaciones genéticas adquiridas
La mayoría de las mutaciones del ADN relacionadas con el cáncer de
mama, se generan en el transcurso de la vida de una mujer, en lugar de ser
heredadas (INC, 2014). Las mutaciones adquiridas de los oncogenes y/o de
los genes supresores de tumores pueden ser el resultado de otros factores,
tal como radiaciones u otros factores de riesgo, mencionados anteriormente.
30
Las pruebas para identificar cambios genéticos adquiridos pueden ayudar
a predecir con más precisión el pronóstico de algunas mujeres con cáncer de
mama, como las pruebas para identificación de células cancerosas con varias
copias del oncogén HER2 (ACS, 2014).
1.4.2.7
Análisis del gen AKT1: implicaciones en el cáncer de mama
1.4.2.7.1 La vía de señalización PI3K/AKT
La vía de señalización PI3K/AKT es activada por muchos estímulos, y
controla aspectos claves como el crecimiento, proliferación, supervivencia,
motilidad y metabolismo celular (Lema, 2012).
La vía de la PI3K es estimulada fisiológicamente como consecuencia de
la activación de receptores de membrana tirosin kinasa, los cuales
autofosforilan y fosforilan el sustrato del receptor de insulina (IRS); este último
fosforila la subunidad p85 de la PI3K. La fosforilación de la subunidad p85
conduce a un cambio conformacional de dicha proteína que conduce a la
unión de la subunidad catalítica (p110). La PI3K activa, fosforila el fosfatidil
inositol 3,4 difosfato (PIP2) convirtiéndolo en el segundo mensajero fosfatidil
inositol 3,4,5 trifosfato (PIP3), el cual, corriente abajo, conduce a la activación
de la proteína AKT (Ver Figura 13) (Pinzón, Serrano, & Sanabria, 2009).
La AKT tiene múltiples blancos, responsables de los efectos de la
activación de la vía. La activación anormal de esta vía conduce a una
respuesta proliferativa y anti-apoptótica que se relaciona con el desarrollo de
múltiples tipos de cáncer; por esto, su estudio es parte crucial para el
entendimiento de los procesos de carcinogénesis (Pinzón, Serrano, &
Sanabria, 2009).
31
Figura 13. Esquema de la vía de señalización PI3K/AKT. Fuente: Adaptado
por (Pinzón, Serrano, & Sanabria, 2009), de (Hennessy, Smith, Ram, Lu, &
Mills, 2005).
1.4.2.7.2 AKT1
1.4.2.7.2.1
Concepto y rol en el desarrollo del cáncer
AKT1 (también conocida como proteína quinasa B) forma parte de una
subfamilia de proteínas serina/treonina quinasas (Testa & Bellacosa, 2001).
Es una enzima, codificada por el gen AKT1.
Hay tres isoformas de AKT (AKT1, AKT2 y AKT3), y cada miembro de
AKT contiene un dominio de homología pleckstrina N-terminal (PH), un
32
conector corto-α helicoidal y un dominio de quinasa C-terminal (Testa &
Bellacosa, 2001)
Todas las isoformas de AKT constituyen los principales blancos aguas
abajo de los receptores de factores de crecimiento que se señalizan a través
de fosfatidilinositol 3-quinasa (Testa & Bellacosa, 2001). Existe evidencia
creciente de que la activación de las proteínas AKT es importante en el
desarrollo del cáncer (Muise-Helmericks, et al., 1998; Dimmeler, et al., 1999;
Ozes, et al.,1999; Mende, et al., 2001; Wei, et al., 2001).
En la activación de la vía PI3K/AKT, se enfatiza la importancia de los
dominios PH en AKT, que tienen gran afinidad por el PIP3 en la membrana,
ya que normalmente, en su configuración inactiva, AKT está plegada sobre sí
misma. Al unirse a PIP3 se estira y es activada por la fosforilación de la
Tirosina 308 por la PDK1 y su Serina 473 por la mTORC2 (Lema, 2012).
La fosfo-AKT, se encarga de la fosforilación de decenas de targets
importantes para el metabolismo (FOXO, IRS1, GSK3 y las enzimas
glucolíticas, entre otros), traducción (mTOR, TSC1/2, FOXO, PRAS40, S6K),
proliferación (FOXO, p21, p27), supervivencia (BAD, Procaspasa 9, CREB,
p21, p27, MDM2, GSK3) y angiogénesis (eNOS) y motilidad. Al final, tiene
efectos
metabólicos
importantes
en
diabetes
y
enfermedades
cardiovasculares, y mitogénicos importantes en cáncer; entre otros procesos
celulares (Lema, 2012).
1.4.2.7.2.2
•
Mutaciones en AKT1
Conceptos preliminares: Polimorfismos genéticos y asociación
con características clínicas
Un polimorfismo genético (single nucleotide polymorphism o SNP), se
define como una variación genética, que hace referencia a la existencia en
una población de múltiples alelos de un gen. Su estudio tiene diversas
aplicaciones en el campo de la medicina así como en el desarrollo de
33
investigaciones biológicas (Checa, 2007). Numerosas publicaciones sobre el
tema permiten vislumbrar su entrada en la práctica clínica. Se han reportado
estudios que indican el uso de SNPs como marcadores moleculares en la
genotipificación étnica, la expresión génica de enfermedades y como
potenciales blancos farmacológicos (Spalvieri & Rotenberg, 2004).
De este modo, se han desarrollado estudios en base al análisis de
polimorfismos en enfermedades de índole genética, como el cáncer. Los
principales blancos de estudio, han sido oncogenes, que podrían estar
alterados, en rutas metabólicas de importancia en el desarrollo de la
enfermedad. Las investigaciones sobre polimorfismos en el estudio del
cáncer, se han enfocado en la búsqueda de relaciones entre los cambios en
la secuencia de nucleótidos y el efecto sobre la función de las respectivas
proteínas, con los distintos estadíos, tipos de cáncer y otras características
clínicas (histológicas e inmunishistoquímicas) de importancia, con el fin de
hallar blancos moleculares que puedan emplearse posteriormente como
dianas terapéuticas (Cancer Research UK, 2013).
•
Polimorfismos en AKT1
Recientemente,
varios
grupos
de
investigación
han
descubierto
mutaciones somáticas recurrentes del gen AKT1 en casos de cáncer de
mama, cáncer colorectal y de ovario (Carpten, et al., 2007).
Entre estas mutaciones, se destaca el polimorfismo E17K, el cual en un
estudio se encontró en 5 de los 61 (8,2%) casos de cáncer de mama, 3 de
cada 51 (5,9%) casos de cáncer colorrectal y 1 de cada 50 (2,0%) casos de
cáncer de ovario. La mutación E17K era mutuamente excluyente con respecto
a la mutación PIK3CA y a la pérdida de expresión de PTEN (Carpten, et al.,
2007).
En otros estudios, esta variante fue reportada en el 4.3% (Kim, Jeong,
Yoo, & Lee, 2008) y 6% (Bleeker, et al., 2008) de las poblaciones de estudio
respectivas, de pacientes con cáncer de mama.
34
E17K resulta en un cambio de aminoácido en la posición 17 en AKT1, de
un ácido glutámico (E) por una lisina (K). Esta mutación se produce dentro del
dominio de homología a pleckstrina (PHD) de AKT1 y resulta en la activación
de la ruta fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K).
Otras investigaciones realizadas han sugerido, mediante modelos
computacionales, una variedad de SNP´s que podrían ser patogénicos y por
tanto de gran utilidad en el diagnóstico molecular de enfermedades
relacionadas con este gen, entre ellas, el cáncer de mama (Shanthi,
Rajasekaran, & Ramanathan, 2014). Dentro de las variantes identificadas
(E17K, E17S, E319G, L357P, y P388T) se encuentran las que han sido
seleccionadas para este estudio: E17K, E17S y L357P, siendo E17K la única
reportada en otros estudios.
35
CAPÍTULO 2:
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Revisión Bibliográfica
Se realizó inicialmente la revisión bibliográfica del tema, en lo referente al
cáncer de mama, su clasificación en base a características histopatológicas y
moleculares. Además, se investigó sobre los polimorfismos del gen AKT1 que
se han relacionado hasta el momento con una posible susceptibilidad a la
enfermedad, específicamente los SNPs: L357P, E17S y E17K.
2.2 Muestreo
Se recolectaron bloques de tejido mamario embebido en parafina,
donados por la Unidad de Patología del Hospital de SOLCA y del Hospital de
Especialidades Eugenio Espejo.
En el caso de las muestras control, se utilizaron muestras de sangre
periférica de pacientes del Hospital de Machachi, y del Banco de Muestras de
ADN del Instituto de Investigaciones Biomédicas (UDLA), provenientes de
mujeres sanas de entre 30 y 80 años.
Los criterios empleados para la selección de casos y controles para este
estudio, se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2.
Criterios de selección empleados en el estudio
Criterios de Selección
Criterios de Inclusión
CASOS
•
Mujeres
diagnosticadas
con
cáncer de mama
Criterios de Exclusión
•
Ausencia de diagnóstico
positivo para cáncer de
mama.
36
•
Mujeres sanas: sin
registro
de
carcinomas de mama.
•
Rango de edad de 30
a 80 años
Etnia mestiza
CONTROLES
CASOS Y
CONTROLES
•
•
Mujeres diagnosticadas con
cáncer de mama o que
registren
haberlo
presentado.
•
Rango de edad menor a 30
años y mayor a 80 años.
Etnia distinta a la mestiza.
•
Para la realización del estudio, se contó con la aprobación del Comité de
Bioética de la Universidad de las Américas y se llevaron a cabo los respectivos
consentimientos informados.
2.3 Diseño de Primers
Se diseñaron diferentes pares de primers, luego de localizar las variantes:
rs34409589,
rs121434592, rs11555432 en el gen AKT1, mediante
herramientas proporcionadas por el NCBI: dbSNP y Primer-BLAST,
respectivamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term).
Para las variantes: rs34409589, rs121434592, los primers seleccionados
fueron:
Primers
Secuencia
Tm
Fw
5’-GGCCAAGGGGATACTTACGC- 3’
60.53
Rv
5’-AGGGTCTGACGGGTAGAGTG- 3’
60.35
Para el rs11555432:
Primers
Secuencia
Tm
Fw
5’-CCTTCTTGAGCAGCCCTGAA- 3’
59.96
Rv
5’-TACGAGATGATGTGCGGTCG - 3’
59.97
37
2.4 Análisis de historias clínicas
En este estudio se seleccionaron pacientes que fueron diagnosticadas
entre los años 2010 y 2013.
Se analizaron las historias clínicas de las pacientes afectas con cáncer de
mama, las mismas que contaban con la información necesaria respecto a las
características histopatológicas e inmunohistoquímicas de los tumores de
cada paciente. Estos datos, se emplearon como variables para el presente
estudio (Tabla 3).
Tabla 3.
Descripción de las variables de estudio.
Variables de
estudio
Edad
Tipos de
carcinoma de
mama
Definición
Tiempo transcurrido
desde el nacimiento
hasta el momento
del estudio.
Indica la forma del
carcinoma según su
origen:
los
conductos,
los
lobulillos
o,
en
algunos casos, el
tejido intermedio.
Dimensión
Indicador
•
•
<35 años
35-49 años
•
•
•
50-80 años
•
•
Ductal
•
•
Lobulillar
•
Papilar
•
Mucinoso
•
•
•
Pre-menopausia
Período
de
menopausia
Post- menopausia
El
cáncer
comienza dentro
de los conductos
lácteos.
Las
células
anómalas
comienzan
a
crecer
en
los
lobulillos.
Carcinoma
con
borde
bien
definido
y
formado
por
prolongaciones
pequeñas
en
forma de dedos.
Células tumorales
inmersas
en
cúmulos de moco
extracelular.
38
Receptores
hormonales
Invasión a
ganglios linfáticos
Lateralidad
Grado
Tumoral/Histológi
co
Estadío de la
Enfermedad
(Estadío Tumoral)
Indica si las células
del cáncer de mama
tienen
o
no
receptores para las
hormonas
estrógeno
y
progesterona, que
son proteínas que
reciben las señales
que ordenan a las
células
multiplicarse.
Indica si el cáncer
se ha propagado o
no
hasta
los
ganglios linfáticos
cercanos
Indica la mama que
es afectada por el
desarrollo de un
tumor maligno.
Hace referencia al
nivel diferenciación
tumoral
del
paciente.
Estado actual del
tumor o de la
enfermedad.
•
•
Receptores
Estrógeno
Progesterona
Receptor
HER2/neu
de
y
•
•
Presencia (RE+,
RP+, Her2/neu +),
o
Ausencia
(RE-,
RP-, Her2/neu -)
•
Presencia
de
células
cancerosas, o
•
Ausencia
células
cancerosas
de
•
Presencia
tumor, o
Ausencia
tumor
del
•
Positivo
•
Negativo
•
•
•
Mama derecha.
Mama Izquierda.
Ambas mamas.
•
SBRI
•
SBRII
•
SBRIII
•
0
•
•
I
•
•
II
•
del
•
Grado tumoral I o
bien diferenciado
•
Grado tumoral II o
moderadamente
diferenciado
Grado tumoral III o
pobremente
diferenciado
•
•
Carcinoma in situ,
afección
no
invasiva.
Cáncer formado,
tumor
no
se
disemina.
El tumor mide más
de 2 cm, pero no
más de 5 cm, y el
cáncer
se
encuentra entre 1
a
3
ganglios
linfáticos; o el
tumor mide más
de 5 cm, pero no
se ha diseminado
hasta los ganglios
linfáticos.
39
•
III
•
El tumor supera
los 5 cm. El cáncer
se diseminó hasta
más de 3 ganglios
linfáticos axilares
e incluso piel de la
mama.
Puede
tornarse
inoperable.
2.5 Análisis de laboratorio. Procesamiento de muestras
2.5.1 Extracción de ADN
La extracción de ADN de las muestras (sangre periférica y tumores), se
llevó a cabo mediante la utilización del kit PureLink Genomic DNA de
Invitrogen, según el protocolo indicado en el manual, con las modificaciones
mencionadas a continuación.
2.5.1.1
Extracción de ADN a partir de sangre periférica
En el caso de las muestras de sangre periférica, inicialmente se
precalentó el bloque térmico AccuBlockTM Digital Cry Block (Labnet, NJ,
USA) a 55ºC.
En un volumen de 200 µL de sangre (de cada muestra), se añadió 20 µL
de Proteinasa K y 20 µL de RNasa A. Luego de homogenizar la mezcla, se
incubó a temperatura ambiente por 2 minutos. A continuación, se añadió 200
µL del buffer de lisis celular y se incubó la mezcla a 55ºC para promover la
digestión proteica.
Luego de 10 minutos, se retiraron los tubos del bloque térmico, y se añadió
200 µL del etanol 100% al lisado. Con la finalidad de obtener una solución
homogénea, se mezcló por vórtex y el volumen total generado,
aproximadamente 640 µL, se traspasó a una columna de extracción provista
por el kit.
40
Luego de centrifugar las columnas a 10.000 x g, por 1 minuto a
temperatura ambiente, se descartaron los tubos de colección y se colocaron
las columnas en nuevos tubos. Entonces, se adicionaron 500 µL del buffer de
lavado 1, y se centrifugaron los tubos nuevamente, a 10.000 x g, por 1 minuto.
Lo mismo se realizó para adicionar el buffer de lavado 2, pero se centrifugó a
13500 rpm por 3 minutos.
Después de descartar los tubos de colección, se colocaron las columnas
en tubos estériles de 1.5 mL y se añadió 50 µL del buffer de elución, en el
centro de la membrana de las columnas. Cada muestra se incubo por 1 minuto
a temperatura ambiente.
Finalmente, se centrifugaron los tubos a 13500 rpm por 3 minutos y luego
se desecharon las columnas. Los tubos con ADN, fueron rotulados y
conservados -20ºC.
El ADN obtenido se cuantificó con Nanodrop 2000 y se realizó una corrida
electroforética en gel de agarosa al 2% para constatar la calidad de ADN
obtenido.
2.5.1.2
Extracción de ADN a partir de tumores embebidos en parafina
Previamente, se realizó el marcaje de la zona tumoral en los bloques de
parafina, utilizando una aguja estéril.
A continuación, se realizaron de 5 a 10 cortes longitudinales de 5 µm de
espesor con el uso de un micrótomo (SLEE 6062, Mainz, Alemania). Los
cortes se colocaron en tubos estériles de 1.5 mL, los que fueron rotulados y
almacenados a temperatura ambiente, para formar un banco de muestras
tumorales.
Para realizar la extracción de ADN, se precalentó un bloque térmico
(Labnet, NJ, USA) a 55ºC. Se tomaron 3 o 4 cortes de cada muestra y se
colocaron en tubos estériles. A cada tubo se añadió 1 mL de xilol y se mezcló
41
por vórtex durante 2 minutos. Luego se centrifugaron los tubos a 1600 rpm y
se desechó el sobrenadante. El lavado con xilol se repitió hasta este punto.
Después, se añadió 1 mL de etanol 100%, se mezcló por vórtex durante
30 segundos y se centrifugó por 3 minutos a temperatura ambiente. Se retiró
el sobrenadante y se conservó el pellet conteniendo el tejido tumoral. El lavado
con etanol se realizó por duplicado.
Luego, a fin de evaporar todo el alcohol, se colocaron las muestras con la
tapa abierta durante 15 minutos, en la estufa a 37ºC. Concluido el tiempo, a
cada tubo se añadió 180 μL de buffer de digestión y 40 μL de Proteinasa K
(Quiagen, Hilden, Alemania). Se mezcló adecuadamente por vórtex y se
colocó los tubos en el bloque térmico a 55ºC por un lapso de 12 a 24 horas,
en dependencia del grado de digestión y lisado del tejido tumoral.
Una vez transcurrido este tiempo, se centrifugaron las muestras a 13500
rpm, por 3 minutos a temperatura ambiente; se transfirió alrededor de 200 μL
del sobrenadante a un microtubo estéril de 1,5 mL y se añadió 20 μL de
RNasa. Luego de incubar las muestras por 2 minutos, se añadió 200 μL del
buffer de lisis y de unión a la membrana y 200 μL de etanol 100%, y se mezcló
por vórtex durante 5 segundos hasta formar una solución homogénea.
Se obtuvo un volumen aproximado de 640 μL por muestra, el que se
colocó en una columna de extracción provista por el kit. Las columnas se
centrifugaron a 10.000 x g, por 1 minuto a temperatura ambiente. El tubo
colector se descartó y se colocó la columna en un nuevo tubo de colección.
Posteriormente se añadió 500 μL de buffer de lavado 1 a cada columna
de extracción y se centrifugo a 10.000 x g, por 1 minuto a temperatura
ambiente. Se descartó el tubo colector y se colocó la columna en un nuevo
tubo recolector. Luego, se añadió 500 μL de buffer de lavado 2 y se
centrifugaron los tubos a 13500 rpm por 3 minutos a temperatura ambiente.
Se desechó el tubo colector y se colocó la columna a un tubo estéril de 1,5
mL para la elución final.
42
Finalmente, en cada columna se colocó 50 μL de buffer de elución, y se
esperó 2 minutos como tiempo de incubación. Se centrifugaron los tubos a
13500 rpm por 2 minutos, y se desecharon las columnas de extracción. Los
tubos con ADN fueron rotulados adecuadamente y almacenados a -20ºC.
2.5.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Una vez obtenido el ADN de las muestras de casos y controles, se
amplificaron los fragmentos de interés, para lo cual se estandarizó la Reacción
de PCR (para cada par de primers, dirigidos a los SNPs de estudio) y se
determinaron las condiciones necesarias de temperatura, concentración de
ADN y MgCl2.
2.5.2.1
Estandarización de PCR
Previamente a la estandarización de la PCR, los cebadores diseñados
fueron verificados mediante un ensayo de PCR in sílico para confirmar la
amplificación de la zona de interés y la generación de una sola zona de
amplificación, para lo cual se empleó la herramienta proporcionada por el
grupo de Bioinformática Genómica de la Universidad de California en Santa
Cruz en base al genoma humano actualizado hasta diciembre del 2010
(https://genome.ucsc.edu).
Luego de ello, se efectuó la estandarización de PCR, llegando a las
siguientes condiciones y volúmenes: el volumen final de reacción se ajustó a
50 μL por cada muestra, la cual estuvo compuesta por 34 μL de H2O grado
PCR, 5 μL de buffer (MgCl2)10X, 1.5 μL de MgCl2 (10mM), 1 μL de dNTPs (10
mM cada uno), 2 μL de cada primer (10 μM), 0.5 μL de Platinum® Taq DNA
Polimerasa (5 U/μL, Invitrogen) y 4 μL de templado de ADN (200 ng). La
reacción fue llevada a cabo en un termociclador SureCycler8800 (Agilent,
Santa Clara, CA), bajo las siguientes condiciones, ver Tabla 4:
43
Tabla 4.
Condiciones estandarizadas para la PCR
Nº ciclos
T (ºC)
Tiempo (min)
1
95
5
94
1
35
1
E17:
L357P:
60
56.4
1
72
1
72
5
4
∞
Finalmente, se realizó una corrida electroforética de cada muestra, en gel
de agarosa al 2% para constatar la calidad de producto PCR obtenido.
2.5.3 Secuenciación
Con el producto de PCR previamente obtenido, se llevó a cabo la
secuenciación de los fragmentos, para lo cual se realizó una purificación
previa y posterior a la reacción de secuencia, como se describe a
continuación.
2.5.3.1
Purificación del producto PCR mediante columnas
Se realizó la purificación, con el fin de separar el producto de PCR de
interés de subproductos contaminantes, primers y dNTPs.
Para ello, se empleó el kit de Invitrogen PureLink® PCR Purification,
según el cual, inicialmente, se colocaron 15 µL del producto de PCR en un
tubo estéril de 0.2 mL, al que se añadió 60 µL de buffer de unión a la
membrana (HC) y se homogenizó mediante vórtex.
44
A continuación, se transfirió la mezcla a una columna colocada en el tubo
colector, y se centrifugó a 10.000 x g, por 1 minuto a temperatura ambiente.
Luego, se añadió 130 µL de Buffer de lavado y se centrifugó la columna a
10.000 x g, por 1 minuto, y luego a 13500 rpm por 3 minutos, para garantizar
la remoción total del buffer.
Para la elución, se descartó el tubo colector y se colocó la columna en un
tubo estéril de 1.5 mL, luego se añadió 20 µL de buffer de elución, que se
dejó incubar por 2 minutos y finalmente, se centrifugó a 13500 rpm por 2
minutos.
Los tubos con producto de PCR purificado se rotularon adecuadamente y
conservaron a -20ºC. La calidad y cantidad de PCR, pudo verificarse
empleando el instrumento Nanodrop 2000 y realizando una corrida
electroforética en gel de agarosa al 2%, respectivamente.
2.5.3.2
Reacción de secuencia
Se estandarizó la PCR de secuenciación, de modo que: el volumen final
de reacción se ajustó a 4.4 μL por cada muestra, la cual estuvo compuesta
por 1.4 μL de H2O grado PCR, 0.9 μL de buffer de secuenciación (BigDye
Terminator) 5X, 0.5 μL de BigDye® Terminator v1.1, 1.6 μL del primer
seleccionado (1 μM) y 1.5 μL del producto de PCR purificado. La reacción fue
llevada a cabo en un termociclador SureCycler8800 (Agilent, Santa Clara,
CA), bajo las siguientes condiciones, en 25 ciclos (Ver Tabla 5).
45
Tabla 5.
Condiciones estandarizadas para la reacción de secuencia
2.5.3.3
T (ºC)
Tiempo
96
3 min
96
10 s
50.5
5s
60
4 min
4
1 min
4
∞
Purificación de la reacción de secuenciación
Luego de la reacción de secuenciación, se realizó una nueva purificación,
para remover principalmente los ddNTPs no incorporados.
Se utilizó un kit de Applied Biosystems: kit de purificación BigDye®
XTerminator™. Según el manual, se adicionaron 5 μL de Big Dye Xterminator
Solution y 22.5 μL de SAM Solution a ≈5 μL de la PCR de secuenciación.
Luego se mezcló por vórtex durante 30 min y se centrifugó, para emplear el
sobrenadante en la secuenciación.
A continuación se cargaron estas muestras en las placas del secuenciador
ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Austin, TX) y
finalmente se realizó el análisis de secuencias, a través del Sequencing
Analysis Software 5.3.1 (Applied Biosystems, Austin, TX), para determinar los
genotipos de cada una de las muestras.
46
2.6 Análisis estadístico
Luego de determinar los genotipos de las muestras (casos y controles),
se procedió a tabular los resultados, para asociarlos con las características
histopatológicas e inmunohistoquímicas tumorales, registradas anteriormente
para cada paciente.
Adicionalmente, se analizaron las frecuencias alélicas y genotípicas del
gen AKT1 (polimorfismo E17K), y se calculó el equilibrio Hardy-Weinberg
utilizando
una
herramienta
disponible
en
internet
(http://www.genes.org.uk/software/hardy-weinberg.shtml).
Mediante el programa estadístico IBM SPSS Statistics 22 (SPSS Inc,
Chicago, IL), se aplicaron las pruebas estadísticas chi-square (χ2) y P value,
para determinar la asociación entre la presencia de los SNPs estudiados, y
las características histopatológicas e inmunohistoquímicas tumorales.
Las características histopatológicas analizadas en los pacientes se
dividieron en 3 rangos de edad (<35, 35-49, 50-80 años) y fueron las
siguientes: tipo de carcinoma (Ductal, lobulillar, papilar, mucinoso), lateralidad
(mama derecha, mama izquierda), grado tumoral/histológico (SBRI, SBRII,
SBRIII), márgenes quirúrgicos (presencia vs ausencia), nódulo linfoide
(presencia vs ausencia de células cancerosas) y estadío de la enfermedad (0,
I, II, III). En cuanto a las características inmunohistoquímicas analizadas,
fueron: receptores hormonales de estrógeno, progesterona y HER2neu
(presencia vs ausencia).
47
CAPÍTULO 3:
RESULTADOS
3.1 Recolección de muestras
En total se recolectaron 100 bloques de tejido mamario embebidos en
parafina (casos) de la Unidad de Patología del Hospital de SOLCA (86) y del
Hospital de Especialidades Eugenio Espejo (14) y se utilizaron 140 muestras
de sangre periférica de mujeres sanas (controles), recolectadas previamente
de pacientes del Hospital de Machachi y del banco de muestras de ADN del
Instituto de Investigaciones Biomédicas (UDLA).
3.2 Clasificación de muestras tumorales
Con el acceso a las respectivas historias clínicas, se tabularon y
analizaron los datos de los pacientes afectos con cáncer de mama, como:
nombres y apellidos, lateralidad, grado de diferenciación tumoral, bordes
quirúrgicos, receptores hormonales, entre otros (Ver Anexo 1).
3.2.1 Tipo de carcinoma de mama
El principal tipo de carcinoma encontrado en la población de estudio,
corresponde al Ductal invasor, con un porcentaje de 74.07%. Seguido, está el
carcinoma de tipo ductal in situ, con 7.41%.
A continuación, se encuentra el carcinoma ductal mixto, que corresponde
a un tipo de carcinoma ductal con componente de otro tipo, con 6.17%. Y
finalmente, se identificaron otros tipos de carcinoma, con menor frecuencia:
lobulillar invasor (3.70%), mucinoso in situ (3.70%), papilar invasor (2.47%),
mucinoso invasor (1.23%) y medular (1.23%) (Ver Gráfico 1).
48
Tipos de carcinomas
Medular
1,23
Mucinoso invasor
1,23
Mucinoso in situ
Papilar invasor
Lobulillar invasor
3,70
2,47
3,70
Ca ductal mixto
6,17
Ductal invasor
Ductal in situ
74,07
7,41
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
Casos (%)
Gráfico 1. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
tipo de carcinoma.
3.2.2 Edad del paciente
Se clasificó a la población de estudio en tres grupos de edad, que
buscaron abarcar los períodos de pre-menopausia, menopausia y postmenopausia, debido a la asociación de este factor con el desarrollo del cáncer
de mama.
Se encontró que la mayor parte de las mujeres afectas (56.79%) estaban
en un rango de 50-80 años de edad, el 40.74% de ellas estuvieron entre los
35 y 49 años y el resto de ellas (2.47%) fueron menores a 35 años (Ver Gráfico
2).
49
Edad del paciente
2,47%
40,74%
56,79%
<35
35-49
50-80
Gráfico 2. Distribución de la población de estudio afecta con CM según la
edad del paciente
3.2.3 Lateralidad
La mama afectada en la mayor parte de los casos de estudio fue la mama
derecha, con un 58.02%, como se muestra en el Gráfico 3.
De este modo, el 41.98% restante de casos mostró afectación en la mama
izquierda. Además, no se presentó en ningún caso, afectación en ambas
mamas.
Lateralidad
70
% Casos
60
58,02 %
50
41,98 %
40
30
20
10
0
Derecha
Izquierda
Gráfico 3. Distribución de la población de estudio afecta con CM en base a
la lateralidad
50
3.2.4 Estadío tumoral
El estadío tumoral de los casos fue clasificado en cuatro grupos: To, T1T2, T3-T4 y No determinado.
El análisis de esta variable, determinada por el Médico Patólogo, mostró
que la mayoría de pacientes con cáncer de mama, diagnosticados entre los
años 2010-2013, presentaron un estadío tumoral T1 o T2 (55%), como se
observa en el Gráfico 4.
En menor porcentaje, se encontraron casos en estadío tumoral T3-T4
(13%) y To (4%).
El grupo de casos en la categoría “No determinado”, corresponde a
aquellos en los que el patólogo no ha determinado el estadío tumoral en que
se encuentran.
Estadío tumoral
80
67,9
70
% Casos
60
50
40
30
16,05
20
10
11,11
4,94
0
To-Tx
T1-T2
T3-T4
No
determinado
Gráfico 4. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
estadío tumoral
51
3.2.5 Invasión a nódulo linfoide
Esta variable fue clasificada en dos grupos: invasión presente (+) o
ausente (-).
Se encontró que el 48% de los casos presentaron invasión a nódulo
linfoide y el 38% de ellos, ausencia.
En el 14% de los casos, esta variable no fue determinada por el Patólogo
(Ver Gráfico 5).
Nódulo linfoide
+
-
No determinado
14%
48%
38%
Gráfico 5. Distribución de la población de estudio afecta con CM en función
de la invasión de células tumorales a nódulo linfoide
3.2.6 Grado tumoral/Histológico
El grado tumoral/histológico, que indica los niveles de diferenciación
tumoral, se clasificó en tres grupos.
La mayor parte de casos (40.74%) se asignaron al grado II o SBRII
(moderadamente diferenciado), el 19.75% pertenecieron a la categoría SBRI
(bien diferenciado) y 18.52%, al grado SBRIII (pobremente diferenciado).
52
Los casos sin determinación de grado tumoral representaron el 20.99%
del total (Ver Gráfico 6).
% Casos
Grado tumoral/histológico
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
40,74
19,75
SBRI
18,52
SBRII
SBRIII
20,99
No
determinado
Gráfico 6. Distribución de la población de estudio afecta con CM según el
grado tumoral/histológico
3.2.7 Receptores hormonales
El registro de la presencia o ausencia de receptores hormonales, de
fundamental importancia en el diagnóstico y tratamiento de cáncer de mama,
mostró los siguientes resultados: el 62.96% de los casos presentaron receptor
de estrógeno positivo (o RE+), el 54.32% receptor de estrógeno positivo (o
RP+) y sólo el 30.86% de los casos presentaron receptor 2 de factor de
crecimiento epidérmico humano positivo (o HER2+).
De este modo, se encontró ausencia de receptores de estrógeno,
progesterona y HER2 en el 37.04%, 45.68% y 69.14% de los casos de estudio,
respectivamente, como se muestra en el Gráfico 7.
53
% Casos
Receptores hormonales
80
70
60
50
40
30
20
10
0
69,14
62,96
54,32
45,68
37,04
+
Estrógeno
-
30,86
+
-
Progesterona
+
Her2 neu
Gráfico 7. Distribución de la población de estudio afecta con CM en función
de la presencia de receptores hormonales: Progesterona, Estrógeno, HER2.
3.2.8 Tipo de cáncer en base a receptores hormonales
Se encontró que la mayoría de casos pertenecían al tipo Luminal A con el
43.21% del total de pacientes con CM. A continuación, el 24.69% de los casos
presentaron el tipo Basal o TNBC, el 19.75% se diagnosticó con cáncer de
tipo Luminal B, y el 12.35% con el de tipo HER2 (neu) (Ver Gráfico 8).
Clasificación molecular de pacientes
con CM
TNBC
Her2 neu
Luminal B
luminal A
24,69%
12,35%
19,75%
43,21%
Gráfico 8. Distribución de la población de estudio afecta con CM en función
del tipo de cáncer en base a receptores hormonales. (TNBC: Triple Negative
Breast Cancer, o Tipo Basal)
54
3.2.9 Márgenes quirúrgicos
El análisis de márgenes quirúrgicos, realizado por el Patólogo a partir de
las biopsias y registrado en las historias clínicas, mostró que en el 35% de los
casos, el margen quirúrgico no contenía células cancerígenas (bordes libres),
el 33% de ellos indicaron un resultado positivo y en el 32% de casos no se
determinó esta variable, como se muestra en el Gráfico 9.
Márgenes quirúrgicos
+
-
No determinado
32%
33%
35%
Gráfico 9. Distribución de la población de estudio afecta con CM en función
de la presencia de células cancerígenas en bordes quirúrgicos
3.3 Determinación de Genotipos
3.3.1 Extracción de ADN
Se realizó la extracción de ADN de casos y controles, utilizando el kit
PureLink Genomic DNA de Invitrogen.
55
La calidad del ADN proveniente de tumores embebidos en parafina, se
mostró inferior respecto al ADN obtenido de tejido fresco (sangre periférica),
lo que sugiere degradación del material genético de los casos, debido a
procesos propios del pre tratamiento y fijación del tejido tumoral (Ver Figura
14).
A
CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 CM9 CM10
B
TM1 TM2 T M3 TM4 TM5 TM6 TM7 TM8 TM9 TM10
Figura 14.Electroforesis de muestras de ADN extraído, de la población de
estudio en geles de agarosa al 2%. A) Muestras de ADN proveniente de
sangre periférica. B) Muestras de ADN proveniente de tumores embebidos
en parafina.
3.3.2 Reacción en cadena de polimerasa (PCR)
Se amplificaron los fragmentos de interés con los primers diseñados y las
condiciones de estandarización adecuadamente establecidas.
56
3.3.2.1
Polimorfismos AKT1-E17
Luego de la PCR, se obtuvieron los fragmentos de interés, que contenían
las regiones de ubicación de los polimorfismos: E17K y E17S. El fragmento
obtenido fue de aproximadamente 198 pb, como se observa en la Figura 15.
A
198
pb
B
198
pb
Figura 15. Electroforesis del fragmento de ADN de interés para el análisis
del SNP E17, de 198 pb, en un gel de agarosa al 2%. A) Muestras control. B)
Muestras de casos.
3.3.2.2
Polimorfismo AKT1-L357P
Se amplificó correctamente un fragmento de 142pb de la zona del gen
AKT1 que contiene el polimorfismo L357P, como se muestra la Figura 16.
57
A
MM
(-)
CM1 CM2 CM3 CM4 CM5 CM6 CM7 CM8 CM9
142
pb
B
MM
(-)
TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 TM8
142
pb
Figura 16. Electroforesis del fragmento de ADN de interés para el análisis
del SNP L357P, de 142 pb, en un gel de agarosa al 2%. A) Muestras control.
B) Muestras de casos.
3.3.3 Secuenciación capilar
Se realizó la secuenciación de los fragmentos obtenidos en PCR, para el
análisis de los polimorfismos: E17K, E17S y L357P.
En el caso de las variantes polimórficas E17K y E17S, estas se presentan
cuando se ha producido el cambio de un Ac. Glutámico por Lisina o Serina,
respectivamente, en la posición 17. De modo que, en los casos que
presentaron la variante E17K, no se encontró la variante E17S.
En cuanto al polimorfismo L357P, se presenta en aquellos casos en los
que se ha producido un cambio de Leucina por Prolina, en la posición 357.
58
Como se muestra en la Figura 17, sólo se encontró el genotipo salvaje:
T/T en el caso del análisis de la variante L357P. En cuanto al polimorfismo
E17K, se encontraron dos genotipos homocigóticos: G/G y A/A (Figura 18).
No se verificaron casos o controles con la variante E17S. Los resultados en
cuanto al porcentaje de casos y controles para cada genotipo, se muestran a
continuación.
En la Figura 17, se muestra el genotipo T/T, representado por la curva
señalada, correspondiente a la base A (adenina), es decir su base
complementaria, lo que se debe al uso del primer reverse en la reacción de
secuenciación.
T/T
100 %
100 %
Casos
Controles
100
80
60
40
20
0
Figura 17. Identificación del polimorfismo L357P por secuenciación capilar y
distribución en población total de estudio. A) Secuencia para homocigotos
T/T. B) Cuadro de distribución porcentual del genotipo T/T.
59
En la sección A de la Figura 18, se muestra el genotipo G/G, representado
por la curva señalada, correspondiente a la base C, es decir citosina. De igual
manera, en la sección B, se observa el genotipo A/A, representado por la
curva correspondiente a la base T (timina).
A.
B.
C.
D.
G/G
100
85
70
55
40
25
10
97,5 %
casos
A/A
100 %
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
controles
2,5 %
0%
casos
controles
Figura 18. Identificación del polimorfismo E17K por secuenciación capilar y
distribución en población total de estudio. A) Secuencia para homocigotos
G/G. B) Secuencia para homocigotos A/A. C) Cuadro de distribución
porcentual del genotipo G/G en la población total de estudio. D) Cuadro de
distribución porcentual del genotipo A/A en la población total de estudio.
60
3.3.4 Análisis estadístico
3.3.4.1
Frecuencias genotípicas y alélicas
Los genotipos observados se ordenaron adecuadamente y se calcularon
las frecuencias genotípicas y alélicas, como se muestra en la Tabla 6.
Este análisis fue realizado únicamente en el caso del polimorfismo E17K,
ya que solamente se halló un genotipo distinto al silvestre (homocigoto raro)
en los casos analizados para esta variante.
De este modo, a través de la prueba chi-cuadrado realizada, se obtuvo un
valor de P mayor a 0.05, mostrando que ambos grupos (casos y controles)
están en equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) y que no existen diferencias
significativas entre ellos.
El HWE se calculó aproximado a 1, es decir que se consideró no
significativo en relación a diferencias entre poblaciones, un dato fundamental
en el análisis estadístico en modelos de estudio caso-control.
Tabla 6.
Distribución de frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo
E17K.
Frecuencia Genotípica
Gen/ SNP
AKT1 /
E17K
Frecuencia Alélica
Genotipo
Casos
Controles
Todo
Casos
Controles
Todo
G/G
0,98
1,00
0,99
0,98
1,00
0,99
G/A
0,00
0,00
0,00
A/A
0,03
0,00
0,01
HWE,
Chicuadr
ado
1
0,03
0,00
0,01
Valor
P
0,3
61
3.3.4.2
Análisis de características clínicas en pacientes con cáncer de
mama y asociación con el tipo de cáncer
La distribución de características clínicas en los pacientes con cáncer de
mama, en función del tipo de cáncer (clasificación molecular), se muestra en
la Tabla 7.
En cuanto a la edad, se encontró que la mayoría de mujeres de entre 35
y 80 años (44.30%) padecían cáncer del tipo Luminal A y en menores
porcentajes padecían los demás tipos: TNBC, Luminal B y HER2.
En el análisis de la lateralidad, se encontró gran diferencia porcentual en
el caso de los pacientes con cáncer de tipo Luminal A y Luminal B, que
presentaron afectación principalmente en la mama derecha.
En lo referente al estadío tumoral, es importante señalar que en todos los
tipos de cáncer, predominó el grupo T1-T2, respecto a los demás.
Adicionalmente, en los tipos de cáncer Luminal A y HER2, se encontró
que la mayoría de los casos presentaron invasión a nódulo linfoide, un factor
fundamental en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. De manera
similar, se encontró que la mayor parte de casos con cáncer de tipo Luminal
A y TNBC, presentaron márgenes quirúrgicos con presencia de células
cancerígenas.
En el análisis del grado tumoral/histológico, se encontró que el grado II o
SBRII predominó en los casos con cáncer de tipo Luminal A y Luminal B, no
así con los de tipo HER2 y TNBC, en los que predominó el grado SBRIII.
En cuanto a las variantes polimórficas encontradas, de genotipo AA, uno
de los casos presentó cáncer de tipo Luminal A y el otro, el tipo TNBC.
62
Tabla 7.
Distribución de características clínicas en pacientes con CM en función
del tipo de cáncer (clasificación molecular).
Luminal A
Luminal B
HER
TNBC
Total
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
<35
0
0
0
0
1
10
1
5,00
2
2,47
35-49
14
40
6
37,5
5
50
8
40,00
33
40,74
50-80
21
60
10
62,5
4
40
11
55,00
46
56,79
Derecha
21
60,00
11
68,75
5
50,00
10
50,00
47
58,02
Izquierda
14
40,00
5
31,25
5
50,00
10
50,00
34
97,14
Estadío
tumoral
T1-T2
28
80,00
7
43,75
5
50,00
15
75,00
55
67,90
T3-T4
4
11,43
4
25,00
3
30,00
2
10,00
13
16,05
To-Tx
No
determinado
Nódulo
linfoide
+
2
5,71
1
6,25
0
0,00
1
5,00
4
4,94
1
2,86
4
25,00
2
20,00
2
10,00
9
11,11
20
57,14
5
31,25
5
50,00
9
45,00
39
48,15
14
40,00
6
37,50
2
20,00
9
45,00
31
38,27
1
2,86
5
31,25
3
30,00
2
10,00
11
13,58
+
35
100,0
0
16
100,0
0
0
0,00
0
0,00
51
62,96
-
0
0,00
0
0,00
10
100,0
0
20
100,00
30
37,04
Edad
Lateralidad
No
determinado
Estrógeno
Progesterona
6
37,50
1
10,00
2
10,00
44
54,32
0
100,0
0
0,00
10
62,50
9
90,00
18
90,00
37
45,68
+
3
8,57
10
62,50
10
2
10,00
25
30,86
-
32
91,43
6
37,50
0
18
90,00
56
69,14
+
35
HER2
100,0
0
0,00
63
Márgenes
quirúrgicos
+
15
42,86
2
12,50
2
20,00
8
40,00
27
33,33
No
determinado
13
37,14
6
37,50
3
30,00
6
30,00
28
34,57
7
20,00
8
50,00
5
50,00
6
30,00
26
32,10
Grado
tumoral hist.
SBRI
13
37,14
1
6,25
1
10,00
1
5,00
16
19,75
SBRII
17
48,57
7
43,75
3
30,00
6
30,00
33
40,74
SBRIII
No
determinado
1
2,86
2
12,50
4
40,00
8
40,00
15
18,52
4
11,43
6
37,50
2
20,00
5
25,00
17
20,99
GG
34
97,14
16
100
10
100
19
95,00
79
97,53
AA
1
2,86
0
0,00
0
0,00
1
5,00
2
2,47
E17K
3.3.4.3
Asociación del polimorfismo E17K con características clínicas
de pacientes con cáncer de mama
Se tabularon los datos clínicos de los pacientes con cáncer de mama y se
asociaron con los genotipos encontrados, para el polimorfismo E17K, como
se muestra en la Tabla 8.
En ningún caso, se puede afirmar la asociación del genotipo AA
(Homocigoto raro) con alguna de las distintas características clínicas, debido
al bajo de número de casos encontrados con este genotipo, que
consecuentemente genera valores no significativos (P>0.05).
64
Tabla 8.
Distribución
de
características
clínicas,
histopatológicas
e
inmunohistoquímicas en pacientes con CM en función del genotipo
presentado, para la variante polimórfica E17K.
AKT1 E17K
rs121434592
GG
AA
n
%
n
%
Derecha
46
58,23
1
50,00
Izquierda
33
41,77
1
50,00
Lateralidad
Xi2
0.054
Valor P
1
Estadío tumoral
To
3
3,80
1
50
T1-T2
54
68,35
1
50
T3-T4
13
16,46
0
0
No determinado
9
11,39
0
0
Xi2
Grupos
Xi2 y Valor P
Valor P
To / T1-T2
6.1
0.297
To / T3-T4
3.5
0.52
T1-T2 / T3-T4
0.24
1
Nódulo linfoide
+
38
48,10
1
50,00
-
31
39,24
0
0,00
No determinado
10
12,66
1
50,00
Xi2
0.8
Valor P
1
Estrógeno
+
50
63,29
1
50,00
-
29
36,71
1
50,00
Xi2
0.148
Valor P
1
Progesterona
+
43
54,43
1
50,00
-
36
45,57
1
50,00
Xi2
0.015
Valor P
1
65
HER2
+
25
31,65
0
0,00
-
54
68,35
2
100,00
Xi2
0.915
Valor P
0.856
Márgenes quirúrgicos
+
27
34,18
0
0,00
-
27
34,18
1
50,00
No determinado
25
31,65
1
50,00
Xi2
0.982
Valor P
1
66
CAPÍTULO 4:
DISCUSIÓN
La presente investigación, se llevó a cabo en base a la creciente
necesidad de investigación en temas relacionados al cáncer de mama, para
el desarrollo de metodologías de detección temprana aplicativas.
Según Checa en el 2007, el estudio de polimorfismos comprende un
método investigativo empleado para la comprensión parcial de los
mecanismos de susceptibilidad a esta enfermedad, al asociar la presencia de
una variante polimórfica con el riesgo a desarrollarla.
El estudio del gen AKT1 es un blanco de gran interés, su importancia
radica en los efectos metabólicos que se producen tras la activación de la vía
PI3K/AKT, debido a la fosforilación de decenas de targets importantes para el
metabolismo, traducción, proliferación, supervivencia, angiogénesis y
motilidad (Lema, 2012).
En base a esto, la presente investigación llevó a cabo el análisis de las
variantes polimórficas: E17K, E17S y L357P del gen AKT1 y su asociación
con características histopatológicas e inmunohistoquímicas en población
mestiza ecuatoriana afecta con cáncer de mama, generando un estudio
retrospectivo caso-control.
En el análisis de la población estudiada, se encontró que el tipo de
carcinoma más común, fue el Ductal invasivo (CDI) con un porcentaje total de
74.07%, información que resulta coherente con los datos estadísticos
reportados a nivel mundial por la ACS (American Cancer Society) en el 2013,
en los que estimaron que la mayoría de casos en ese año fueron
diagnosticados con algún tipo de cáncer invasivo, principalmente CDI.
Además, mencionan que por cada cuatro casos diagnosticados con CDI, uno
es diagnosticado con cáncer ductal in situ (CDIS), lo que guarda similitud con
los resultados de este estudio, en el que el CDIS se presentó en el 7.41% de
la población afecta con CM.
67
Se determinó que el rango de edad más común entre las mujeres con
cáncer de mama (56.79%), correspondía a la categoría de 50-80 años, lo que
se debe a que la incidencia del CM y las tasas de mortalidad respectivas, se
incrementan con la edad. De este modo, el 69% de nuevos casos y el 88% de
las muertes por CM ocurren en mujeres de 50 años o más (American Cancer
Society, 2013).
En el análisis de la lateralidad, se verificó que la mayoría de pacientes
presentaron afectación en la mama derecha (58.02%), en comparación a la
izquierda (41.98%), lo que difiere en cuanto a estudios que han reportado que
existen más mujeres diagnosticadas con cáncer en el seno izquierdo, que en
el derecho (Senie, et al., 1980). Sin embargo, esta diferencia, se debe a que
la población de estudio pertenecía a una etnia distinta a la de los estudios
reportados (etnias: caucásica o afro-americana). Las mujeres con afectación
en la mama izquierda, tienen mayor riesgo a desarrollar complicaciones
cardiovasculares como oclusión de la arteria coronaria y trombosis cerebrovascular, como consecuencia de la aplicación de radio-terapia en el lado
izquierdo del pecho (Amer, 2014).
El principal grupo en el estadío tumoral, fue el grupo de los estadíos T1 y
T2, que son casos que han superado la fase inicial del cáncer (To), o
carcinoma in situ. Es decir que, en la mayor parte de los casos, el cáncer se
ha formado y ha empezado a crecer y en algunos de ellos, a diseminarse (INC,
2014). Sin embargo, estos estadíos aun presentan altos porcentajes de
supervivencia a 5 años y la posibilidad de aplicar distintas terapias curativas
o cirugías para la remoción del cáncer de mama (American Cancer Society,
2013).
Adicionalmente, el pronóstico de un paciente con cáncer de mama,
depende de la invasión de células cancerígenas a nódulo linfoide, variable que
en este estudio se encontró positiva para la mayoría de los casos (48%), lo
que indica un riesgo mayor de propagación de la enfermedad o metástasis
(Rubio, et al., 2009).
68
En el análisis del grado tumoral, se evidenció que en la mayoría de casos,
los tumores estaban moderadamente diferenciados (SBRII), es decir que
presentaban células cancerígenas con cierta semejanza a las células
normales, pero con mayor velocidad de multiplicación y división que ellas
(BreastCancer, 2013).
Además, se realizó el análisis de los receptores hormonales:
Progesterona, estrógeno y HER2, de gran importancia ya que a través de él,
se conoce la posibilidad de aplicar terapias hormonales. Más del 50% de los
casos, presentaron expresión de los receptores hormonales (RE y RP), lo que
se correlaciona con tumores de bajo grado histológico que responden a
tratamiento
hormonal
sobretodo
en
pacientes
post-menopaúsicas;
aproximadamente 77% de las pacientes con tumores RE y RP positivos
responden a terapia hormonal, un 27% responden cuando son RE positivos y
RP negativos, y 46% responden cuando son RE negativos y RP positivos
(Mohammed, Lakatua, & Haus, 1986) . Por otro lado, la mayor parte de las
pacientes, no presentaron expresión de HER-2, lo que es favorable, ya que
cuando hay sobreexpresión, ésta puede ser predictiva de resistencia a terapia
hormonal (Wright, Nicholson, & Angus, 1992).
Adicionalmente, a partir del análisis de los receptores hormonales
mencionados, el Médico Patólogo, estableció el tipo de Cáncer de mama, ya
sea Luminal A, Luminal B, Basal o HER2. En este estudio, se determinó que
el 43.21% de ellos pertenecían al tipo Luminal A, información coherente con
las estadísticas actuales, que indican que alrededor del 40% de los casos
corresponden a Luminal A, siendo el subtipo más común entre los afectos con
cáncer de mama (Perou & Borresen-Dale, 2011).
Del 10-20% de los casos son del tipo Luminal B, del 10-20% del tipo Basal
y alrededor del 10% son de tipo HER2 (neu) (Voduc KD et al., 2010). Estos
datos son similares a los encontrados en este estudio: 24.69% fueron casos
de tipo Basal, 19.75% de tipo Luminal B, y 12.35% de tipo HER2 (neu).
69
En cuanto al análisis de los datos clínicos registrados, finalmente está el
de márgenes quirúrgicos, el mismo que indicó que el 33% de la población de
estudio presentaba células cancerígenas en los bordes quirúrgicos de las
biopsias, de modo que en estos casos, se requerirá una cirugía adicional para
extirpar las células cancerígenas restantes (BreastCancer, 2013).
Para el análisis molecular de las muestras, inicialmente se llevó a cabo el
proceso de extracción de ADN, en el que se observaron inconvenientes en
cuanto a la baja calidad del ADN extraído a partir de tumores embebidos en
parafina, lo que se debe al proceso de fijación que ha sufrido el tejido de
interés.
En general, la recuperación de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), a partir
de muestras que han sido fijadas y embebidas en parafina, se considera un
reto, lo que se debe a una serie de motivos, como el uso de formaldehído,
utilizado comúnmente en este proceso, que si bien no degrada físicamente los
ácidos nucleicos, conduce a la generación de entrecruzamientos de los
componentes proteicos del tejido, lo que dificulta los procesos de extracción.
Además, los ácidos nucleicos se fragmentan en situaciones donde la solución
que contiene el fijador, ha perdido gran cantidad de buffer, ya que el pH tiende
a ser extremadamente bajo (Gilbert, et al., 2007).
Debido a esto, se realizaron modificaciones en el proceso de extracción
de ADN a partir de tumores, con el fin de optimizar el proceso y obtener
mejores resultados en cuanto a la calidad y cantidad de ADN. De este modo,
se incrementó el uso de Proteinasa K de 20 μL a 40 μL y se extendió el
proceso de incubación del tejido con el buffer de digestión, hasta 24 h.
Es importante señalar que algunas muestras de biopsias contenían poca
cantidad de tejido, lo que se manifestó en las bajas concentraciones de ADN
obtenidas.
Según Gilbert y Cols en el 2007, los inconvenientes en la recuperación de
ADN a partir de muestras embebidas en parafina, generan serios desafíos en
70
estudios genéticos desarrollados en torno a la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), debido a la poca cantidad y calidad del ADN extraído.
Esto se reflejó en la presente investigación, debido a que a partir de 100
muestras de tumores, sólo en 81 de ellas se obtuvieron amplicones-PCR
óptimos para la secuenciación del fragmento.
Luego del análisis de secuencias de los fragmentos amplificados, se
encontró un sólo genotipo distinto al salvaje, para la variante E17K. Este
polimorfismo, ha sido reportado en distintos estudios a nivel mundial, en los
que se lo ha encontrado en el 4.3% (Kim, Jeong, Yoo, & Lee, 2008), 6%
(Bleeker, et al., 2008) y 8% (Carpten, et al., 2007) de las poblaciones de
estudio respectivas, en pacientes con cáncer de mama.
En este estudio, la variante polimórfica E17K fue detectada sólo en (2/81),
es decir el 2.5% de la población afecta, siendo ésta la primera investigación
realizada en la población ecuatoriana en cuanto al análisis del gen AKT1. La
diferencia respecto a las frecuencias anteriormente reportadas, en otras
poblaciones, se relaciona estrechamente a las distintitas condiciones
etnológicas entre ellas. Según las estadísticas actuales de la Sociedad
Americana de Cáncer en el 2013, las tasas de incidencia de cáncer de mama
son mayores en la población blanca (no hispánica), a la que corresponderían
los estudios de Bleeker y Cols (2008) (Italia) y Carpten y Cols (2007) (USA),
que en la población hispánica o latina, a la que corresponde el presente
estudio.
Es notable además, que la mutación E17K ha sido encontrada únicamente
en casos con cáncer de mama ductal y lobular (Bleeker, et al., 2008), lo que
se corrobora en esta investigación, debido a que los casos encontrados con
el genotipo perteneciente al homocigoto raro A/A, padecían de cáncer ductal
invasivo.
En cuanto a los polimorfismos E17S y L3757P, no se encontraron casos
o controles que presentaran un genotipo distinto al salvaje, por lo tanto no se
71
determinó ninguna de estas variantes. Esto contrasta con un estudio realizado
por Shanthi, y Cols (2014), en el que a través de un modelo computacional se
identificaron las variantes mencionadas como mutaciones potencialmente
patogénicas del gen AKT1 y por tanto de posible utilidad en el diagnóstico
molecular de enfermedades relacionadas; este hecho evidencia que si existe
una diferencia al realizar un análisis a nivel computacional, en relación a uno
a nivel de laboratorio.
Hasta el día de hoy, todas las investigaciones realizadas, han verificado
una sola mutación en el gen AKT1, que corresponde al polimorfismo E17K
(Bleeker, et al., 2008).
Posteriormente, en el análisis de las frecuencias genotípicas y alélicas, no
se encontraron diferencias significativas entre grupos (p>0.05), ya que ambos
estaban en equilibrio HWE. Esto se debe al bajo número de casos
encontrados con un genotipo distinto al salvaje y a la ausencia de
heterocigotos G/A en casos y controles.
De este modo, en ningún caso, se pudo afirmar la asociación del genotipo
AA
(homocigoto
raro)
con
alguna
de
las
características
clínicas,
histopatológicas e inmunohistoquímicas de los pacientes, por el bajo de
número de casos encontrados con este genotipo, que consecuentemente
generó valores no significativos (p>0.05), en cada uno de los análisis de
asociación.
No se pudo llevar a cabo el análisis estadístico del Odds ratio, debido a la
ausencia de controles que presentaran un genotipo distinto al salvaje, dato de
suma importancia en el cálculo del riesgo relativo que representaría la
presencia del polimorfismo E17K en cuanto al desarrollo de cáncer de mama.
Así mismo, no se pudo establecer una asociación entre la variante y la
incidencia de la enfermedad en la población mestiza ecuatoriana.
72
CAPÍTULO 5:
CONCLUSIONES
La presente investigación se llevó a cabo en base a la creciente evidencia
que indica que las alteraciones en la vía de señalización del gen AKT,
desempeñan un papel importante en el desarrollo del cáncer.
En el análisis de los polimorfismos: E17K, E17S y L357P del gen AKT1,
en la población mestiza ecuatoriana afecta con cáncer de mama, se verificó
únicamente la presencia del SNP E17K.
El polimorfismo E17K, se encontró presente en un 2.5% de la población
afecta de estudio, bajo el genotipo A/A (homocigoto raro).
Las variantes analizadas E17S y L357P, no han sido verificadas en otros
estudios, pero han sido señaladas como posibles mutaciones patogénicas
relacionadas al cáncer de mama. En esta investigación, la primera respecto
al análisis del gen AKT1 en el Ecuador, no se pudo verificar la asociación de
los polimorfismos mencionados, por su ausencia en la población de estudio.
Estos resultados, que contrastan con el estudio de un modelo
computacional que determinaba a las variantes E17S y L357P como
marcadores potencialmente útiles en el cáncer de mama, muestran la
importancia de la precisión en el uso de herramientas bioestadísticas
predictivas, y la vulnerabilidad de tales estudios.
El establecimiento de las frecuencias alélicas y genotípicas para E17K,
evidenció que no habían diferencias significativas entre los individuos afectos
y controles, encontrándose ambos grupos en equilibrio HWE.
Debido al bajo número de casos encontrados con la mutación E17K, no
se pudo establecer una asociación significativa con el riesgo a desarrollar
cáncer de mama (Odds ratio) o con las distintas características
histopatológicas e inmunohistoquímicas de los pacientes enfermos, por lo que
no se puede corroborar el potencial de los polimorfismos del gen AKT1 en
73
estudio, como biomarcadores moleculares para el diagnóstico preventivo del
cáncer de mama.
CAPÍTULO 6:
RECOMENDACIONES
En los procesos de extracción de ADN a partir de muestras provenientes
de tumores o biopsias embebidas en parafina, es recomendable la utilización
de kits específicos o a su vez el uso de las modificaciones realizadas para el
protocolo utilizado en este estudio.
Además, en los procesos previos al análisis de la secuencia se sugiere
purificar el producto de la PCR mediante columnas, y emplear un kit de
purificación BigDye XTerminator para la purificación de la reacción de
secuencia, como se realizó en esta investigación.
Es necesario llevar a cabo nuevos estudios que analicen distintos
polimorfismos del gen AKT1, debido a la importancia que tiene la ruta
PI3K/AKT en el desarrollo del cáncer, donde se incluya un mayor número de
casos y controles, de la población mestiza ecuatoriana.
Es importante, llevar a cabo estudios de expresión génica con respecto al
polimorfismo E17K y a nuevas variantes que puedan verse relacionadas con
el desarrollo del cáncer de mama, con el fin de elucidar los resultados de este
estudio o hallar posibles biomarcadores moleculares para la enfermedad.
También, se recomienda estudiar la asociación del polimorfismo E17K con
el tipo de cáncer Ductal, relacionado en todos los estudios anteriores y en esta
investigación, con la presencia de la variante.
74
CAPÍTULO 7.
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80
CAPÍTULO 8.
ANEXOS
Anexo 1
Resumen de historias clínicas de los pacientes afectos con cáncer de mama
Información General del
Paciente
CARACTERISTICAS HISTOPATOLOGICAS-HISTOQUIMICAS
Código
IIB
Nº
Historial
Clínico
Edad
TM 3
ADN
163585
37
Parafina Derecho
TM 4
ADN
165358
62
Parafina Izquierdo
TM 5
ADN
154216
46
Parafina Derecho
TM 6
ADN
161868
61
Parafina Derecho
Muestra
Seno
Afectad
o
Comenta Diagnost
Bordes
rio/ %
ico
Diferencia
Quirurgi
Tumor Patológi
ción
cos
Células
co
Moderada
Ca ductal
mente
A-90%
profundo
invasivo diferencia
do SBR II
Moderada
mente
diferencia
do con
Ca ductal
libre
A-80%
invasivo diferencia
cón
neuroend
ócrina
Moderada
mente
Ca ductal
libre
A-30%
invasivo diferencia
do SBR II
Ca ductal
A-70%
SBR II
profundo
invasivo
Estadio
Estróge Progest
patológi
no
erona
co
HER2
NEU
Clasificaci
ón
Molecular
pT1c
positivo
No(sn) negativo negativo
(3+)
Mx Lo Vo
HER2u
pT2 N1a
negativo negativo negativo
Mx Lo V1
Basal
pR1 N1
Mx
positivo positivo
positivo
(2+)
Luminal A
pR1 pN1
positivo positivo negativo Luminal A
pMx
81
TM 7
ADN
149045
38
Parafina Derecho
A-70%
TM 8
ADN
165239
52
Parafina Izquierdo
A-70%
TM 9
ADN
163492
37
Parafina Izquierdo
A-30%
TM 10
ADN
126200
43
Parafina Derecho
A-60%
TM 11
ADN
164771
81
Parafina Derecho
A-60%
TM 12
ADN
99856
76
Parafina Izquierdo
A-30%
TM 13
ADN
168972
36
Parafina Izquierdo
TM 14
ADN
174230
47
Parafina Derecho
90%
Bien
Ca
pR2 N1
positivo
mucinos Diferencia profundo
Mx
do
o bifocal
Ca
papilar
grado
nuclear
pR2 N2
II con
SBR II
profundo
positivo
Mx
compon
ente
ductal
invasivo
Ca
Bajo a
pR2 No
intraduct
libre
positivo
intermedio
Mx
al
SBR II
moderada
Ca ductal
pT1 pNx
mente
libre
positivo
invasivo
pMx
diferencia
do
Bien
pT1a N1a
Ca ductal
diferencia profundo
positivo
invasivo
Mx L1 Vo
do SBR I
Ca ductal
microinv
Bien
pT1b No
asor
diferencia profundo
positivo
Mx Lo Vo
(intraduc do SBR I
tal)
pT1b
Ca dutal
pN1c
positivo
invasivo
pMx
Moderada
pT1b
Ca ductal
mente
pN2a
positivo
invasivo
diferencia
pMx
positivo negativo Luminal A
positivo negativo Luminal A
positivo negativo Luminal A
positivo
(2+)
luminal B
positivo negativo
luminal A
negativo
positivo negativo Luminal A
positivo negativo Luminal A
positivo
positivo
(2+)
Luminal A
82
TM 15
ADN
79576
45
Parafina Izquierdo
A-70%
TM 16
ADN
118745
46
Parafina Derecho
A-50%
46
Parafina Derecho
A-90%
TM 17
ADN
TM 19
ADN
161646
57
Parafina Derecho
A-40%
TM 20
ADN
165481
36
Parafina Izquierdo
A-30%
TM 22
ADN
57965
54
Parafina Derecho
A-80%
TM 26
ADN
165311
56
Parafina Derecho
A-80%
TM 27
ADN
164758
50
Parafina Izquierdo
A-20%
do SBR
7/9
pobrement
e
Ca ductal
diferencia profundo
invasivo
do SBR
8/9
Ca ductal
invasivo
acompa
ñado
SBR G II profundo
con Ca
intraduct
al
Ca
libre
medular
Moderada
mente
Ca ductal
profundo
invasivo diferencia
do SBR II
Bien
Ca ductal
diferencia
libre
invasor
do SBR I
Moderada
Ca ductal
mente
profundo
invasor difenrecia
do SBR II
bien
Ca ductal
diferencia
libre
invasor
do SBR II
Ca
intraduct
profundo
al con
necrosis
pT1b
pN2a
pMx
negativo negativo negativo
Basal
pT1b pNo
negativo negativo negativo
pMx
Basal
pT1b pNo
negativo negativo negativo
pMx
Basal
pT1C No
negativo positivo positivo
Mx
Basal
pT1c
No(sn) positivo positivo negativo Luminal A
Mx Lo Vo
pT1c
pN0/10
pMx
pT1c
pN1a
pMx
positivo positivo negativo Luminal A
positivo positivo positivo
pT1c pN2
negativo negativo negativo
pMx
Luminal B
Basal
83
166700
43
Parafina Izquierdo
A-90%
Lobulillar
infiltrant
e
pT1c pNo
positivo
positivo positivo
pMx
(1+)
165884
66
Parafina Izquierdo
C-40%
Ductal in
situ
pT1c pNo
positivo positivo negativo Luminal A
pMx
TM 30
ADN
149604
59
Parafina Izquierdo
TM 34
ADN
104281
59
Parafina Derecho
TM 35
ADN
164443
39
Parafina Izquierdo
TM 38
ADN
167234
37
Parafina Izquierdo
TM 40
ADN
166944
84
Parafina Derecho
128516
52
Parafina Izquierdo
TM 28
ADN
TM 29
ADN
TM 41
ADN
Bien
Ca ductal
diferencia
libre
invasor
do
Moderada
mente
A-60%; 2 Ca ductal
direfencia
libre
tumores invasor
do SBR G
II
Moderada
Ca ductal
mente
C-80%
libre
invasor diferencia
do SBR II
Moderada
Ca ductal
mente
A-50%
libre
invasor diferencia
do SBR II
Ca
A-30%
lobulillar
profundo
invasor
A-60%
A-40%
TM 43-1
ADN
164774
34
Parafina Derecho
A-80%
TM 44
ADN
98022
49
Parafina Derecho
A-50%
Ca ductal
invasor
SBR II
Pobrement
e
Ca ductal
diferencia
invasor
do SBR III
8/9
Ductal in
situ
Luminal B
-pT1c,
pN1,
pMx
positivo positivo negativo Luminal A
pT2 N1
Mx
positivo positivo negativo Luminal A
pT2 No
Mx
positivo positivo negativo Luminal A
pT2 No
negativo negativo negativo
Mx Lo Vo
Basal
pT2 No
negativo negativo negativo
Mx Lo Vo
Basal
profundo
pT2 No
negativo negativo negativo
Mx Lo Vo
Basal
libre
pT2 pN1
negativo negativo negativo
pMx
Basal
pT2 pN1
Luminal A
positivo positivo negativo
pMx
84
TM 45
ADN
165158
49
Parafina Izquierdo
A-5%
Ca ductal
invasor
SBR I
residual
libre
168055
42
Parafina Izquierdo
C-60%
TM 47
ADN
167023
45
Parafina Derecho
A-80%
TM 48
ADN
164122
54
Parafina Derecho
A-50%
TM 51
ADN
166820
51
Parafina Derecho
A-80%
TM 52
ADN
97504
40
Parafina Derecho
B-90%
Parafina Izquierdo
F-90%;
M-90%
(Primari
oo
Bien
metásta Ca ductal
diferencia profundo
sis?);
invasor
do Grado I
mama
izq+
ovario
der.
167262
77
Basal
Moderada
Ca ductal
mente
pT2 pN1a
profundo
positivo positivo negativo Luminal A
invasor diferencia
pMx
do SBR II
Moderada
Ca ductal
mente
pT2 pN1a
positivo
libre
negativo negativo
HER2u
invasor diferencia
pMx
(2+)
do SBR II
Moderada
Ca ductal
mente
pT2 pN1c
profundo
positivo positivo negativo Luminal A
invasor diferencia
pMx
do SBR II
Moderada
Ca ductal
mente
pT2 pN2a
positivo
libre
positivo positivo
Luminal B
invasor diferencia
pMx
(3+)
do SBR II
Ca mixto pobrement
(invasor
e
pT2 pNo
profundo
negativo negativo negativo
Basal
y papilar diferencia
pMx
invasor) do SBR III
TM 46
ADN
TM 53-1
ADN
pT2 pN1
positivo
negativo negativo
pMx
(1+)
pT2 pNo
positivo positivo negativo Luminal A
pMx
85
TM 54-1
ADN
169252
44
Parafina
Izquierd
o
A-40%
TM 55
ADN
167244
59
Parafina Derecho
C-30%
Ca
ductal
invasor
Ca
papilar
invasor
TM 56
ADN
168806
82
Parafina Derecho
A-40%
Ca
ductal
invasor
TM 57
ADN
168489
53
Parafina Derecho
A-20%
Ca
ductal
invasor
48
Parafina Derecho
A-90%
60%
TM 61
ADN
TM 63
ADN
116310
67
Parafina Derecho
TM 64
ADN
162485
52
Parafina Derecho
TM 66
ADN
162204
55
Parafina
Izquierd
o
74%
Izquierd células
o
tumorale
s
TM 69
ADN
169619
39
Parafina
TM 72
ADN
169565
78
Parafina Derecho
Ca
ductal
invasor
Ca
ductal
invasor
Ca
ductal
invasor
24%
27%
células
Ca
ductal
invasor
Ca
ductal
invasor
Ca
ductal
invasor
SBR II
profundo
pT2 pNo
negativ
positivo positivo
pMx
o
Luminal A
libre
pT2 pNo
negativ negativ
positivo
pMx
o
o
Luminal B
Grado I
bien
pT2 pNo
libre
diferencia
pMx
do
Grado I
bien
pT2 pNo
libre
diferencia
pMx
do
pT2
Bien
diferencia profundo pNo(c)
do SBR I
pMx
Bien
pT2(2)
diferencia
libre
pN1 pMx
do
Pobremen
pT2(m)
te
libre
N3a Mx
diferencia
L1 V1
do SBR III
Poco
pT2,
diferencia
profundo
pN1,
do, Grado
pMx
3
Poco
diferencia
pT2_pN1
libre
do, Grado
b_pMx
3
Moderada
profundo
mente
positivo positivo
negativ
o
Luminal A
positivo positivo
negativ
o
Luminal A
negativ
positivo
positivo
o
(3+)
positivo positivo
negativ
o
HER2u
Luminal A
negativ
o
negativ positivo
o
(2+)
HER2u
negativ
o
negativ negativ
o
o
Basal
negativ
o
negativ positivo
o
(3+)
HER2u
pT3 pN1
negativ
positivo positivo
pMx
o
Luminal A
86
tumorale
s
TM 74
ADN
171371
49
Parafina
TM 80
ADN
172194
63
Parafina Derecho
Ca
ductal
invasor
Izquierd
o
80%
TM 88
ADN
172418
71
Parafina Derecho
E-30%
TM 90
ADN
173526
57
Parafina
Izquierd
o
No hay
HQ
TM 92
ADN
173046
37
Parafina Derecho
TM 95
ADN
85056
51
Parafina
Izquierd
o
A-80%
TM 97
ADN
91910
56
Parafina Derecho
A-80%
TM 101
ADN
166598
50
Parafina Derecho
A-40%
80%
Ca
ductal
invasor
diferencia
do SBR III
Poco
diferencia
do, Grado
3
Poco
diferencia
do, Grado
3
libre
pT3_pN2 negativ
_pMx
o
R2 Nx
Mx
negativ negativ
o
o
Basal
negativ
negativ
positivo
o
o
Basal
Ca
moderada
metaplá
negativ
mente
sicoprofundo tRo No positivo positivo
o
diferencia
mucinos
do
a
Ca
negativ negativ positivo
ductal
T1N1M0
o
o
(3+)
invasor
Bien
Ca
diferencia
negativ
ductal
T3N1MO positivo positivo
do SBR
o
invasor
5/9
bien
Ca
diferencia
positivo
ductal
libre
T3N0M0 positivo positivo
do SBR
(1+)
invasor
4/3
Ca
mucinos
negativ
o
profundo T4N1M0 positivo positivo
o
intraduct
al
Moderada
Ca
mente
negativ
ductal
profundo T2N0M0 positivo positivo
diferencia
o
invasor
do
Luminal A
HER2u
Luminal A
Luminal A
Luminal A
Luminal A
87
TM 102
ADN
Parafina
Izquierd
o
174101
76
50%
TM 104
ADN
168604
88
Parafina
Izquierd
o
A-70%
TM 107
ADN
73486
52
Parafina Derecho
TM 114
ADN
173621
65
Parafina
TM 117
ADN
174733
67
Parafina Derecho
TM 118
ADN
59505
87
Parafina
Izquierd
o
A-90%
TM 119
ADN
182900
62
Parafina Derecho
A-60%
TM 122
ADN
173130
55
Parafina
Izquierd
o
C-90%
TM 130
ADN
129807
40
Parafina Derecho
C
TM 131
ADN
162235
41
Parafina Derecho
A
Izquierd
o
20%
A-80%
70%
Ca
ductal
invasor
grado III
poco
diferencia
do
TisN0M0
negativ
o
negativ negativ
o
o
Ca
negativ negativ
papilar
libre
T2N2M0 positivo
o
o
invasor
Ca
negativ positivo
intraduct Alto grado
T3N0M0 positivo
o
(3+)
al
moderada
Ca
mente
negativ
profundo T2N1M0 positivo positivo
ductal y
diferencia
o
lobulillar
do
Moderada
Ca
mente
negativ positivo
ductal
profundo T3N2M0 positivo
diferencia
o
(3+)
invasor
do SBR II
Ca
negativ negativ
mucinos
TisN0M0 positivo
o
o
o
Ca
negativ
negativ
ductal
T4N2M0
positivo
o
o
invasor
Bien
Ca
diferencia
T0N1**M
negativ
ductal
libre
positivo positivo
do SBR
0
o
invasor
5/9
Pobremen
Ca
te
negativ
ductal
libre
T2N0M0 positivo positivo
diferencia
o
invasor
do SBR III
Ca
negativ negativ positivo
ductal
SBR II
profundo T4N1M0
o
o
(3+)
invasor
Basal
Luminal B
Luminal B
Luminal A
Luminal B
Luminal B
Basal
Luminal A
Luminal A
HER2u
88
*TM100
ADN
SOLCA
41
Parafina Derecho
*TM113
ADN
SOLCA
46
Parafina
TM 146
ADN
Q13-1414
65
Parafina Derecho
TM 140
ADN
Q13-1369
46
Parafina
TM 155
ADN
745479
35
Biopsia
TM 153
ADN
779241
80
Parafina
TM 154
ADN
801632
44
Parafina
Izquierd
o
Izquierd
o
derecho
68%
Ca
ductal
SBR II
invasor
Ca
ductal
SBR III
invasor
Ca
ductal
SBR II
invasor
Ca
ductal
invasor,
SBR II
lobulillar
y
linfático
Ca
ductal
infiltrant
e
SRB 7, G
moderad
II
amente
diferenci
ado
Ca
ductal
infiltrant
SRB, G I
e bien
diferenci
ado
Ca
ductal
infiltrant SBR 6, G
e
II
moderad
amente
T2N1M0 positivo positivo
libre
negativ
o
Luminal A
T3N0M0
negativ
o
negativ
positivo
o
HER2u
T2N1M0
negativ
o
negativ negativ
o
o
Basal
T3N0M0 positivo positivo positivo
Luminal B
positivo positivo
negativ
a
Luminal A
positivo positivo
negativ
o
Luminal A
positivo positivo positivo
Luminal B
pT2,
pN2a
pMx
89
TM 148
ADN
811520
30
Parafina
TM 149
ADN
689662
50
Biopsia
TM 150
ADN
17212751
37
46
Biopsia
Izquierd
o
TM 163
ADN
810355
55
Tejido
Derecho
TM 156
ADN
800791
40
Parafina
Izquierd
o
TN 157
ADN
516818
78
Biopsia
diferenci
ado
Ca
ductal
infiltrant
e
Ca
ductal
infiltrant SBR 8, G
e poco
III
diferenci
ado
Ca
ductal
infiltrant SBR P, G
e poco
III
diferenci
ado
Ca
ductal
SBRA, G
infiltrant
III
e
Lobulilla
r
infiltrant
e
Ca
ductal
infiltrant
e
SBR, G II
moderad
(6/9)
amente
diferenci
ado
pt4
pt4
negativ
o
negativ positivo
o
(3+)
HER2u
negativ
o
negativ positivo
o
(3+)
HER2u
positivo
negativ
positivo
o
Luminal B
negativ
o
negativ negativ
o
o
Basal
negativ
negativ
positivo
o
o
Basal
positivo
negativ negativ
o
o
Luminal B
90
TM 160
ADN
17069267
79
53
Biopsia
Izquierd
o
TM 164
ADN
56014130
4
66
Biopsia
Derecho
TM 147
ADN
17096604
2
45
Biopsia
TM 151
ADN
779241
80
Parafina Derecho
80%
Ca
ductal
infiltrant
e
SBR 8, G
pobreme
III
nte
diferenci
ado
Ca
ductal
infiltrant
e
Fibroade
noma
intracani
cular
(invasor)
Ca
ductal
infiltrant
SBR, G I
e bien
diferenci
ado
profundo
pT2
pN2a
pMx
negativ
o
negativ positivo
o
(3+)
HER2u
positivo
negativ negativ
o
o
Luminal B
positivo
negativ negativ
o
o
Luminal B
positivo positivo positivo
Luminal B