“Las Enfermedades Metabólicas Hereditarias constituyen un grupo de enfermedades genéticas con mas de 500 patologías diferentes, caracterizadas por la disfunción de una enzima u otra proteína implicada en el metabolismo celular” Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www3.ncbi.nlm.nih.gov:80/omim Cromosoma gen mRNA Proteína Cofactor (vitamina) SUSTRATO PRODUCTO CONCEPTO DE EIM (1908) OH CH2- COOH Ácido homogentísico Alcaptonuria 1941 Beadle UN GEN Tatum UN ENZIMA DNA Proteína Nature Reviews Genetics 7 (2006) Metaboloma T1 T2 Diagnóstico S1 S2 S3 metabólico y enzimático Sustrato 1 E2/E3 E1 Enzima S3 P E4 Interactoma Proteoma Modificadores genéticos Factores splicing NMD Chaperonas moleculares Proteosoma funcional Gen FENOTIPO-GENOTIPO Diagnóstico Genético RNA DNA Nucleo Transcriptoma Genoma FRECUENCIA DE ALGUNAS EMH Y TIPO DE HERENCIA Autosómica dominante Autosómica recesiva Ligados al X Hipercolesterolemia familiar Huntington Síndrome de Marfan 1:500 1:5.000 1:20.000 Fibrosis quística Enfermedad de Tay-Sachs Deficiencia de acil-CoA Deshidrogenasa de cadena media Fenilcetonuria Enfermedad de Canavan Mucopolisacaridosis Jarabe de Arce Acidemia Metilmalónica Glucogenosis (todos los tipos) Galactosemia Deficiencia en Biotinidasa 1:2.500 (p. caucasiana) 1:3.000 (Judíos Ashkenazi) 1:10.000 (p. caucasiana) 1:50.000 (p. española) 1:10.000 1:14.000 (J. Ashkenazi) 1:25.000 1:40.000 (p. española) 1:226.000 (p. general) 1:48.000 1:50.000 1:62.000 1:110.000 Distrofia muscular de Duchenne Adrenoleucodistrofia Síndrome de Lesch-Nyhan Enfermedad de Hunter 1:3.000 1:20.000 1:380.000 (p. canadiense) 1:111.000 PRUEBA DEL TALÓN Oviedo Santander Bilbao Santiago Pamplona Valladolid Barcelona Zaragoza Madrid Talavera Valencia Alicante Badajoz Murcia Granada Sevilla Málaga La Laguna Palma de Mallorca DETECCIÓN PRECOZ DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS Plan de Centro de Prevención de Diagnóstico de Minusvalías. Enfermedades Comunidad de Moleculares Madrid (UAM) Centro Centro de de Diagnóstico Diagnóstico de de Enfermedades Enfermedades Moleculares Moleculares (UAM) 1973-1985 DETECCIÓN NEONATAL NEONATAL MASIVA MASIVA DETECCIÓN ( Prueba del talón) AMINOACIDOPATÍAS Hiperfenilalaninemias Jarabe de Arce Tirosinemia… HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO DIAGNÓSTICO SELECTIVO DIAGNÓSTICO SELECTIVO ( A la aparición de los síntomas) AMINOACIDOPATÍAS ACIDEMIAS ORGÁNICAS DEFECTOS b-OXIDACIÓN ENFERMEDADES PEROXISOMALES DEFECTOS DE GLICOSILACIÓN E. METABOLISMO PURINAS/PIRIMIDINAS DEFECTOS EN BIOSÍNTESIS DE CREATINA DETECCIÓN PRECOZ DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS Plan de Prevención de Minusvalías. Comunidad de Madrid Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (UAM) 1985 - DETECCIÓN NEONATAL MASIVA ( Prueba del talón) HIPERFENILALANINEMIAS HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO HIPERPLASIA ADRENAL CONGÉNITA HEMOGLOBINOPATÍAS DIAGNÓSTICO SELECTIVO ( A la aparición de los síntomas) AMINOACIDOPATÍAS ACIDEMIAS ORGÁNICAS DEFECTOS b-OXIDACIÓN ENFERMEDADES PEROXISOMALES DEFECTOS DE GLICOSILACIÓN E. METABOLISMO PURINAS/PIRIMIDINAS DEFECTOS EN BIOSÍNTESIS DE CREATINA SÍNTOMAS CLÍNICOS HOSPITAL Rechazo de la alimentación Hipotonía, hipertonía Acidosis metabólica Olor especial Hipoglucemia Ataques de cetoacidosis Letargia, coma Vómitos con cetonuria Anión GAP elevado Hiperamonemia Leuco, trombo o pancitopenia Antecedentes de muertes neonatales PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS RADIOLOGÍA HEMATOLOGÍA MICROBIOLOGÍA PRUEBAS DE FUNCIÓN HEPÁTICA Y RENAL DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS EN SANGRE Y ORINA Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM) I. ESTUDIO de METABOLITOS § § § § § § Aminoácidos Ácidos orgánicos Lactato, piruvato, cuerpos cetónicos Purinas y pirimidinas Carnitina, pterinas Ácidos grasos de cadena muy larga, etc... II. ESTUDIO ENZIMÁTICO § Actividades enzimáticas § Vía metabólica de leucina, propionato, etc... III. ESTUDIO GENÉTICO § Mutaciones § Polimorfismos DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS Seguimiento clínico Tratamiento dietético Seguimiento bioquímico Servicios de Pediatría y Genética Consejo genético Sospecha de EMH basados en los síntomas clínicos SÍNTOMAS ALTERACIÓN METABÓLICA POSIBLE DEFECTO Intoxicación aguda Intervalos libres de síntomas Relación con ingesta e intercurrencias Acumulación de metabolitos tóxicos Hipotonía generalizada; Miopatía; Cardiomiopatía Miopatía; Cardiomiopatía Hipoglucemia; PDH) Defecto en la producción o utilización de energía Def. b-oxidación de ácidos grasos Glucogenosis Acidosis Láctica ALC (PC, Def. Cadena respiratoria Progresivos Independientes de ingesta e intercurrencias Síntesis y/o degradación moléculas complejas Enf. Lisosomales Enf. Peroxisomales Síndrome CDG DISMORFIAS Aminoacidopatías Enf. ciclo de la urea Acidemias orgánicas Galactosemia PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS SÍNTOMAS CLÍNICOS Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía, Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales RADIOLOGIA HEMATOLOGIA MICROBIOLOGIA PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN SANGRE Y ORINA Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM) PERFIL METABÓLICO PERFIL METABÓLICO ESTUDIO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO • Aminoácidos • Ácidos orgánicos • Lactato, piruvato, cuerpos cetónicos • Purinas y pirimidinas • Carnitina, pterinas • Acidos grasos de cadena larga, etc.. • Localización del defecto enzimático § Identificación de mutaciones y SNPs DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS MEDICINA PREVENTIVA: Screening neonatal (NBS) Espectrometría de Masas en Tándem (ESI-MS/MS) Un análisis-varios metabolitos-varias enfermedades • Aprox. 30 enfermedades simultáneamente partiendo de la misma muestra • rapidez y automatización: 500 muestras/ día, 2 min/ análisis • seguridad: alta sensibilidad, especificidad y precisión Técnicas tradicionales Un análisis- un metabolito- una enfermedad • • • • Fenilcetonuria Hipotiroidismo congénito Hiperplasia adrenal Galactosemia Acilcarnitinas (LC/MS/MS) • Enfermedades de localización mitocondrial • degradación de aminoácidos ramificados • b-oxidación mitocondrial de los ác. grasos • algunas enfermedades con AO normales > 30 acilcarnitinas > 30 enfermedades ENFERMEDADES DETECTABLES POR MS/MS AA: Aminoacidopatías • • • • • • • • • • Def. CPS Def. OTC Citrulinemia Argininsuccínico aciduria Argininemia PKU/HFA Tirosinemia tipo I-tipo II MSUD Hiperglicinemia no cetósica Homocistinuria AO: Acidemias orgánicas • • • • • • • • • • Ac. propiónica Ac. metilmalónica Defectos de cobalaminas Ac. glutárica tipo I Ac. isovalérica Def. HMGCoA liasa Def. Holocarboxilasa sintetasa Metilcrotonilglicinuria Ac. Metilglutacónica Def. Cetotiolasa FAO: Defectos en la b-oxidación de ácidos grasos y ciclo de la carnitina. • • • • • • • • LCHAD/Proteína Trifuncional VLCAD MCAD SCAD MADD Def. transportador de carnitina CPT I CPT II/ carnitina-acilcarnitina traslocasa NUEVO METODO DE CRIBADO NEONATAL EN ESPAÑA MCAD desde el año 2007 desde el Galicia año 2000 Pais Vasco Murcia desde Andalucia desde el año 2008 el año 2007 PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS SÍNTOMAS CLÍNICOS Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía, Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales RADIOLOGIA HEMATOLOGIA MICROBIOLOGIA PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN SANGRE Y ORINA Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM) PERFIL METABÓLICO PERFIL METABÓLICO ESTUDIO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO • Aminoácidos • Ácidos orgánicos • Lactato, piruvato, cuerpos cetónicos • Purinas y pirimidinas • Carnitina, pterinas • Acidos grasos de cadena larga, etc.. • Localización del defecto enzimático § Identificación de mutaciones y SNPs DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS Canada Estados Unidos 3 Alemania 11 Eslovaquia 1 Portugal 2 Arabia Saudi 1 Kingdon of Bahrain 1 Israel 1 La India 1 Qatar 1 20 Austria 2 Grecia 4 Reino Unido 4 México 2 Bélgica 3 Holanda 2 Suecia 2 Argentina 2 Bulgaria 1 Hungria 3 Suiza 2 Brasil 4 Croacia 1 Italia 11 Turquia 3 Chile 2 Francia 4 Malta 1 Colombia 2 España 229 Macedonia 1 Ecuador 1 Venezuela 2 Australia 3 Cuba 1 Nueva Zelanda 1 Marruecos 1 Tunez 2 PERFIL METABÓLICO • AUTOANALIZADOR DE AMINOÁCIDOS • CROMATÓGRAFO DE GASES-ESPECTRÓMETRO DE MASAS • ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TANDEM • CROMATÓGRAFO LÍQUIDO DE ALTA RESOLUCIÓN • ESPECTROFOTOMETRÍA PERFIL METABÓLICO DE FENILCETONURIA Fenilalanina Ác. Fenilpirúvico Ác.2-OH-Fenilacético Ác. Fenilláctico Ác. Fenilpirúvico Ác. 2-OHFenilacético Ác. Mandélico Tirosina Patrón Interno Ác. Fenilláctico Ác. Fenilacético Ác. Fenilacético DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO Y DIFERENCIAL HPLC Guanosina trifosfato (GTP) PI GTP-CH Neopterina Dihidroneopterina trifosfato PTPS NEOPTERINA BIOPTERINA 6-Piruvoil- tetrahidropterina PRIMAPTERINA SR Phe Tetrahidrobiopterina (BH4) DHPR PI NEOPTERINA q-Dihidrobiopterina PCD Deficiencia de PAH Pterinas en orina Pterina-4aBIOPTERINA Carbinolamina Oxidación PACIENTE previa al CONTROL análisis Biopterina PAH Tyr Trp Tyr TH L-DOPA Dopamina HVA Primapterina Arg TPH NOS Deficiencia 5-OH-Trp en DHPR Citrulina + Deficiencia NO Serotonina en PAH 5HIAA DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO Cromosoma gen mRNA DIAGNOSTICO GENÉTICO Proteína DIAGNOSTICO ENZIMATICO Cofactor (vitamina) Perfil metabólico SUSTRATO PRODUCTO PERFIL METABÓLICO DE ACIDEMIA PROPIÓNICA Y ACIDEMIA METILMALÓNICA Ác. Metilcítrico Propionil-CoA Tiglilglicina Patrón Interno Propionilglicina Ác. 3-OHPropiónico PCC (2 picos) Metilmalonil-CoA Succinil-CoA Ác. 3-OHPropiónico MCM Patrón Interno Ác. Metilmalónico Ác. Metilcítrico (2 picos) IDENTIFICACIÓN DEL DEFECTO ENZIMÁTICO ACIDEMIA METILMALóNICA Plasma membrane cblF OH-Cbl(III) Cbl(III) Lysosome cblC Cbl(II) Cbl(II?) cblD Restablecimiento via oxidación del [1-14C] propionato mediante fusión celular somática cblH? cblA Propionyl-CoA MMAA Cbl(II) PCC D-Methylmalonyl-CoA MMAB Adocbl L-Methylmalonyl-CoA Cbl(I) cblB Succinyl-CoA Mut (MCM) Cytosol Mitochondria 2 ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS Gen Grupo MUT mut 0 mut- COMPLEMENTACIÓN CELULAR 1 MMAA MMAB cblA cblB Act. MCM (+AdoCbl) - - + + Resp. B12 in vitro - + ++ -/+ Síntesis AdoCbl + + - Resp. B12 in vivo - - 90% 40% SÍNTOMAS CLÍNICOS Rechazo de la alimentación, Hipotonía, Hipertonía, Acidosis metabólica, Olor especial, Hipoglucemia Ataques de cetoacidosis, Letargia,Coma, Vómitos con cetonuria, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales, Anión GAP elevado, Hiperamonemia, Leuco, trombo o pancitopenia, Antecedentes de muertes neonatales PRUEBAS CLÍNICAS Y BIOQUÍMICAS RADIOLOGIA HEMATOLOGIA MICROBIOLOGIA PRUEBAS DE FUNCION HEPATICA Y RENAL DETERMINACIONES BIOQUIMICAS EN SANGRE Y ORINA Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (CEDEM) PERFIL METABÓLICO • Aminoácidos • Ácidos orgánicos • Lactato, piruvato, cuerpos cetónicos • Purinas y pirimidinas • Carnitina, pterinas • Acidos grasos de cadena larga, etc.. ESTUDIO ESTUDIOENZIMÁTICO-GENÉTICO ENZIMÁTICO Y GENÉTICO • Localización del defecto enzimático • Identificación de mutaciones Identificación de y SNPs mutaciones y SNPs DIAGNÓSTICO DEENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARIAS IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES CAUSANTES DE EMH SECUENCIACIÓN MLPA C C C 7 C 8 1 C2 9 C 10 3 C 4 11 C 5 12 C 13 6 C C C EXON 5 MICROSATELITES GENE SCANNING (HRM) GENOTIPADO MUTACIONES/SNP FENILCETONURIA (PKU) Missense Deleción Splicing Silenciosas Nonsense Inserciones 62% 13% 11% 6% 5% 2% > DE 500 MUTACIONES 800 PACIENTES GENOTIPADOS Cromosoma 12 q22-q24.1 http//:www.pahdb.mcgill.ca ACIDEMIA PROPIÓNICA Valina Isoleucina Treonina Metionina AG de cadena impar Colesterol PCCA PROPIONILCoA Cr 13,q32 PCC BIOTINA MISSENSE 145 PACIENTES GENOTIPADOS SPLICING NONSENSE INS Y DEL D-METILMALONILCoA L-Metillmalonil-CoA PCCB Succinil-CoA Ciclo de Krebs Cr. 3, q13.3-q22 ISOLATE METHYLMALONIC ACIDURIA (MMAuria) NM_000255 MUT MMADCHC Cr 4, q31.1-2 NM_172250 MMAA L-METHYLMALONYL-CoA Cbl(II) Cr 12, q24 65 PACIENTES GENOTIPADOS MMAA ATR Adocbl MCM Adocbl NM_052845 MMAB Succinyl-CoA c.349-1g>a c.290G>A Cr 6, p21 NM_015702.1 MMADHC gDNA kb Cr 2 1 3 2 0.51 4.8 ATG 4 2.5 6 5 2.9 0.6 7 4.5 8 0.9 JARABE DE ARCE AA RAMIFICADOS Valina Isoleucina Leucina cetoglutarato glutamato BCKDHA Aminotransferasa (BCAT) a-CETO-ACIDOS RAMIFICADOS CoA-SH CO2 BCKDHB Forma activa E2 E1 E3 Fosfatasa Cinasa BCKD Complejo Forma inactiva E2 E1 45 PACIENTES GENOTIPADOS DBT DELECION NONSENSE INS Y DEL Duplicación No identificadas E3 Fosforilado ACIL-CoA DERIVADOS MISSENSE CENTRO DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES MOLECULARES Laboratorio de Bioquímica Molecular Laboratorio de Genética Molecular HPLC Real-Time PCR y High resolution melting DGGE Genotipado de SNP´s CCI GC/MS MS-MS ESPECTROFOMETRÍA SECUENCIACIÓN IEF, SDS-PAGE MLPA Cultivo celular Perfil transcriptómico Técnicas enzimáticas (RT-PCR y qRT-PCR) radiactivas www.cbm.uam.es/cedem/ Investigación Nuevas tecnologías diagnósticas Bases moleculares de EMH Aproximaciones terapéuticas específicas de mutación APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS EN EMH BASADAS EN EL FENOTIPO CORRECCIÓN METABÓLICA BASADAS EN EL GENOTIPO CORRECCIÓN GENÉTICA Y FARMACOLÓGICA MEDICINA GENÓMICA PREVENTIVA Y PREDICTIVA CORRECCIÓN METABÓLICA BASADA EN EL FENOTIPO Chr 13 Cromosoma DNA Restricción del sustrato (DIETA) cDNA Terapia enzimática Proteína Suplemento del Cofactor Transplante de órganos Cofactor (vitamina) q32.3 Antioxidantes (Estres oxidativo) SUSTRATO PRODUCTO TRATAMIENTO DIETÉTICO APLICABLE A TODAS LAS EMH DONDE EL SUSTRATO SEA EXÓGENO • AMINOACIDOPATÍAS • ACIDEMIAS ORGÁNICAS • DEFECTOS HIDRATOS DE CARBONO • DEFECTOS DE b-OXIDACIÓN… Restricción del sustrato (DIETA) DIETA Restricción Phe de la dieta FUENTES ENDÓGENAS Inhibición de la Síntesis FENILALANINA Eliminación del Sustrato Sustitución del Enzima PAH COENZIMA (BH4) APOENZIMA MUTANTE Suplementación Farmacológica Trasplante de Organos TIROSINA Suplemento del Producto TRATAMIENTO DIETÉTICO EN FENILCETONURIA NH2 HOOC +O2 L-Fenilalanina • RESTRICCIÓN DE LA PHE DE FORMA INDIVIDUALIZADA y SUPLEMENTACIÓN con TIROSINA. • Componentes de la dieta en cantidades normales, según edad • Requerimientos proteicos (ESPGAN en neonatos: 2.8g proteinas/100Kcal • Comprobación del equilibrio calórico de la dieta: 100-120 Kcal/Kg/día ( de las que el 10% las aportan las proteinas; 50-60% los carbohidratos y 30-40% las grasas) • Suplementar con vitaminas y minerales. (Con carnitina solo en caso se deficiencia) (BH4) Fenilalanina Hidroxilasa (PAH) NH2 SEGUIMIENTO BIOQUÍMICO Y CLÍNICO DEL TRATAMIENTO OH • Control Phe plasmática (Niveles de phe terapeúticos < 6mg%). • Revisiones clínicas periódicas (control estatuponderales, Evaluación desarrollo psicomotor, test de IQ). HOOC L-Tirosina Tratamiento para toda la vida Restricción del sustrato (DIETA) PROGRAMA DE DETECCIÓN PRECOZ EN ESPAÑA FENILCETONURIA AÑO DE INICIO NIÑOS ANALIZADOS CASOS DETECTADOS INCIDENCIA HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO 1969 1978 11.219.602 10.660.863 1258 4563 1 : 9237 1 : 2336 Datos hasta Diciembre 2009. Cobertura del programa 99.9% TRATAMIENTO DIETÉTICO Nº de pacientes (n= 165) 40 < 1 mes PKU 35 > 2 años PKU 30 > 10 años PKU 25 HPA 20 15 10 5 0 >120 110-120 90-109 80-89 50-79 Cociente inteligencia Anales de la Real Academia de Farmacia (1999) 65, 271-304 Premio Científico 1998 Restricción del sustrato (DIETA) <50 Suplemento del Cofactor BIOTINA DE LA DIETA Unida a proteínas Libre BIOTINIDASA Lisina o Lisilpéptidos BIOTINIDASA BIOTINA CICLO DE LA BIOCITINA HOLOCARBOXILASA SINTETASA SINTETASA APOCARBOXILASAS (PCC, MCC, PC, ACC) BIOTINA Degradación proteolítica HOLOCARBOXILASAS PROTEÍNAS LÍPIDOS CARBOHIDRATOS Catabolismo de aminoácidos Síntesis de ác. grasos Gluconeogénesis ENFERMEDAD DE JARABE DE ARCEDE ARCE TRANSPLANTE HEPÁTICO : JARABE Val Leu Ile DIAGNÓSTICO BIOQUÍMICO DE MSUD L-transporter Cytosol Val Leu Ile BCAT-1 Aminoacidos BCKAs Leucina BCAT-2 Val Leu Ile BCAT-2 orina sangre BCKA transporter MCF Isoleucina BCKAs Valina BCKAD L-Aloisoleucina Acetoacetic acid Succinyl-CoA Acetyl-CoA patognomonico de MSUD Transplante de órganos Evolución del transplante hepático en pacientes con MSUD LEUCINA plasmática 1400 PRE (4 g PAVB) (µ mol/L) POST(60 g PAVB) 1200 1000 800 600 400 200 0 1 2 3 4 5 6 ALOISOLEUCINA plasmática (µ mol/L) PRE (4 g PAVB) POST(60 g PAVB) 600 500 400 300 200 100 0 1 Dra Martínez-Pardo 2 3 4 Transplante de órganos 5 6 ESTRES OXIDATIVO Y APOPTOSIS PROTEÍNAS IDENTIFICADAS DE EXPRESIÓN DIFERENCIAL MÁS INTERESANTES ESTÁN IMPLICADAS EN: ESTRES OXIDATIVO ACIDEMIA METILMALONICA Plasma membrane cblF mGPDH MnSOD OH-Cbl(III) Lysosome Cbl(III) cblC Cbl(II) Cbl(II?) cblD cblH? MMAA cblA Propionyl-CoA APOPTOSIS Cbl(II) PCC D-Methylmalonyl-CoA MMAB Citocromo c MUERTE CELULAR L-Methylmalonyl-CoA cblB Adocbl Succinyl-CoA Mut (MCM) NEUROPATOLOGÍA Cytosol Cbl(I) Mitochondria E. Richard et al. Journal of Pathology,2007 (in press) EVALUACIÓN DEL PROCESO DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO EN PACIENTES CON MMA % annexin V-positive apoptotic cells ANÁLISIS DE ANEXINA V 250 Annexin V fluorescence Pt 13 Pt 11 200 150 Pt 9 100 Control 50 0 control patient 9 patient 11 patient 13 Cell lines ANTIOXIDANTES ? caspase 3 activity (% control) ANÁLISIS DE CASPASA 3 ANÁLISIS DE CASPASA 9 Control 250 200 150 100 50 0 Pt 11 Caspase 9 fluorescence Pt 13 Pt 9 control patient 9 patient 11 patient 13 Cell lines Los pacientes con MMA tienen un porcentaje de células apoptóticas más elevado que los controles. El proceso de apoptosis tiene lugar mediante la vía mitocondrial ANTIOXIDANTES (ESTRES OXIDATIVO) TERAPIAS ESPECIFICAS DE MUTACION BASADO EN LOS MECANISMOS MOLECULARES DE CADA VARIANTE ALÉLICA DIANA TERAPEÚTICA 1 MUTACIONES MISSENSE APROXIMACION TERAPEÚTICA • Terapia con chaperonas químicas o moleculares • Cofactores y vitaminas • Estimulación de la expresión génica (estatinas, bezafibrato) 2 MUTACIONES PTC 3 MUTACIONES SPLICING • Read-through de mutaciones PTC (tratamiento con aminoglucosidos) • Terapia génica antisentido • Factores splicing factors, proteinas SR, drogas. MMAA MMAA NM_172250 4.9 B12 in vivo effect p.Q133X/p.Q133X 4X + p.R145X/p.R145X 3X + p.R145X/p.R145X 6,7X + p.R145X/p.R145X 5X - p.R22X/pR145X 4X + p.E199fs/p.E199fs 4X oral B12 p.Q120X/p.L272fs 3X oral B12 p.P151fs/p.S189fs 2X + 1.0 MMAA qRT-PCR C logRQ B12 in vitro effect Genotype 2.8 Normal levels of MMAA mRNA READ-THROUGH OF PTC: TREATMENT WITH ATALUREN® • Read-through of PTC: treatment with ATALUREN® Supresión de paradas prematuras: Selección de mutantes susceptibles de ser tratados con agentes “read-through” Jarabe de Arce: Pacientes BCKDHB con parada prematura GENOTIPO DE PACIENTES Nº Pacientes identificados con el mismo genotipo [p.L85S] + [p.E163X] 1 [p.E163X] + [p.E163X] 3 [p.E163X] + [p.R168H] 1 [p.R168H] + [p.R324X] 1 [p.P200X] + [p.P200X] 1 [p.P200X] + [p.Q267X] 2 [p.Q267X] + [p.F35fs] 1 [p.R285X] + [p.R285X] 1 [p.Y383X] + [p.Y383X] 1 Tratamiento con antibióticos aminoglucósidos Geneticina WT p.R324X 0,25 0,50 (mg/mL) Gentamicina 5 10 (mg/mL) Sistema de transcripción-traducción “in vitro” NH2 +O2 HOOC L-Fenilalanina (BH4) L-Phe (mmol/L) TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO CON COENZIMA BH4: TESTS DE SOBRECARGA (ENSAYO CLÍNICO) 1800 BH4 12562 12528 10637 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 1 2 3 4 6 8 12 16 20 24 Tiempo (h) PAH NH2 HOOC L-Tirosina OH RESPUESTA POSITIVA A BH4 RESPUESTA NEGATIVA A BH4 RESPUESTA LENTA A BH4 Reducción de niveles de Phe > 30% ( a las 8 horas) con respecto a los niveles en el momento de la sobrecarga No hay reducción de los niveles de Phe Reducción de niveles de Phe > 30% ( a las 12-16 horas) con respecto a los niveles en el momento de la sobrecarga L.R. Desviat et al. Mol Genet Metab (2004) Tratamiento con Cofactor BH4 FENILCETONURIA: MUTACIONES ASOCIADAS A LA RESPUESTA DE BH4 Oligomerization domain Regulator domain Catalytic domain LOS PACIENTES QUE RESPONDEN SON AL MENOS PORTADORES DE UNA MUTACION MISSENSE CON ACTIVIDAD RESIDUAL GENOTYPE-SPECIFIC THERAPIES: COFACTORS AND VITAMINS TERAPIA ANTISENTIDO APLICADA A MUTACIONES INTRÓNICAS QUE ACTIVAN PSEUDOGENES U1 U2 GTΨΨAT U1 GTΨΨAT AON U2 GTΨΨAT Exon 11 A ....CA G A gtgagt c ag gt Exon 11 11 Exon AON 76 bpExonExon 12 Exon 11 76 bp Exon 11 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 GTΨΨAT Exon 12 ag 12 Exon 12 Exon 12 10 11 15 25 Exon 11 Exon 11 Días TERAPIA ANTISENTIDO 76 bp Exon 12 Exon 12 EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD Y CANTIDAD DE PROTEINA: ACIDEMIA PROPIÓNICA PROPIONYL-CoA PCC PROPIONIC ACIDEMIA Propionyl coA carboxylase Activity pmol/min/mg Val Ile Thr Met Odd-chain fatty acids Cholesterol 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 c D-METHYLMALONYL-CoA L-Methylmalonyl-CoA 0 10 20 PCCA patient 0 10 20 PCCB patient µM AON En ambos cosos la actividad es próxima al control - AMO +AMO control Succinyl-CoA MCCA PCCA Krebs cycle A. Rincón et al. Am. J. of Hum. Genet. (2007) 81:1262-1270. RESTABLECIMEINTO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: ACIDEMIA METILMALÓNICA Val Ile Thr Met Odd-chain fatty acids Cholesterol METHYLMALONIC ACIDEMIA MMA PATIENT WITH MUT MUTATIONS PCC D-Methylmalonyl-CoA L-METHYLMALONYL-CoA Cbl(II) MMAA ATR Adocbl MCM Adocbl Succinyl-CoA Krebs cycle MethylmalonylCoA mutase activity 14 nmol C propionate /mg PROPIONYL-CoA 7 6 5 100% 4 3 2 1 0 healthy control 0 10 15 20 µM AON LOS TRANSCRITOS SON EFICIENTEMENTE TRADUCIDOS EN PROTEINAS FUNCIONALMENTE ACTIVAS A. Rincón et al. Am. J. Hum. Genet. (2007) 81:1262-1270