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 INDICE Presentación de la Asignatura Introducción Programa Analítico Bibliografía Programa de examen Organización de la Asignatura Docentes Características Generales Clases Teóricas Trabajos Prácticos Materiales para los Trabajos Prácticos Evaluaciones Seminarios Regularización de la asignatura Nómina de Trabajos Prácticos Nómina de Seminarios Cronograma Manejo y mantenimiento del microscopio TPNº1: Análisis de cromosomas en mitosis TPNº2: Cariotipo TPNº3: Análisis de cromosomas en meoisis TPNº4: Principios básicos de la herencia mendeliana TPNº5: Probabilidades TPNº6: Extensiones del mendelismo TPNº7: Genética del sexo y herencia en relación con el sexo TPNº8: Ligamiento, recombinación y mapeo de los genes TPNº9: Mutaciones cromosómicas estructurales TPNº10: Mutaciones cromosómicas numéricas TPNº11: Mutaciones génicas o puntuales TPNº12: Análisis genético molecular TPNº13: Genética Humana TPNº14: Herencia Cuantitativa TPNº15: Genética de Poblaciones TPNº16: Análisis Filogenético 1 1 1 4 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9 9 10 10 13 14 19 26 35 42 44 52 55 59 63 68 69 73 82 85 87 I
A. PRESENTACIÓN DE LA ASIGNATURA INTRODUCCIÓN El presente curso de Genética intenta proporcionar al estudiante de Biología, una visión esencial de los mecanismos de herencia y de los patrones de estructura, función y organización del material hereditario, el comportamiento de los genes en las poblaciones naturales y el cambio evolutivo, así como un panorama de los métodos de investigación en Genética y de las distintas aplicaciones de los conocimientos básicos del análisis genético. Se procurará que el alumno: 1) interprete los fundamentos, resultados y limitaciones de los principales métodos de análisis genéticos; 2) se instruya en el empleo de la terminología de la Genética, tanto en su expresión gráfica, como escrita y oral; 3) desarrolle un pensamiento reflexivo sobre la base del método científico; 4) desarrolle las competencias intelectuales para integrar los conceptos de la Genética así como para la resolución de problemas y 5) sea capaz de obtener, seleccionar y registrar la información genética pertinente. PROGRAMA ANALÍTICO Unidad 1: Introducción a la Genética. Definición, objetivos, métodos y relaciones con otras ciencias. El surgimiento de la Genética. Divisiones de la Genética. Organismos genéticos modelo. La Genética como eje unificador en la Biología. Aplicaciones de la Genética. Unidad 2: Mitosis y meiosis. Análisis de cromosomas en mitosis. Morfología cromosómica. El complemento cromosómico. Cariotipo. Análisis de cromosomas en meiosis. Meiosis y recombinación. El modelo de Holliday. Cromosomas politénicos y plumulados. Unidad 3: Principios básicos de la herencia mendeliana. Terminología genética. Cruzamientos monohíbridos. El principio de segregación. Predicción de los resultados de los cruzamientos genéticos. Métodos del tablero y dicotómico. Retrocruzas. Cruzamiento de prueba. Aplicación de la probabilidad a los cruzamientos genéticos. Cruzamientos dihíbridos. El principio de la segregación independiente. La prueba de X2 de bondad de ajuste. Análisis de pedigríes. Las bases cromosómicas de la herencia. Desarrollo histórico de la teoría cromosómica. Meiosis. Relación entre el principio de la segregación independiente y la meiosis. Unidad 4: Extensiones del mendelismo. Variación de la dominancia. Dominancia incompleta, codominancia y superdominancia. Alelos múltiples, concepto y notación. Pseudoalelismo. Pleiotropía. Interacción génica sin y con modificaciones de las proporciones mendelianas en F2 y retrocruza. Epístasis dominante. Epístasis recesiva. Epístasis dominante duplicado. Epístasis dominante y recesiva. Epístasis recesiva duplicada. Genes letales, semiletales y subvitales. Penetrancia y expresividad del gen. Herencia extranuclear. Efecto genético materno. Herencia citoplasmática. Unidad 5: Genética del sexo y herencia en relación con el sexo. Sistemas cromosómicos de determinación del sexo. Los cromosomas sexuales. Sistemas génicos de determinación del sexo. Factores ambientales y determinación del sexo. Herencia ligada al sexo. Características ligadas al X. Compensación de la dosis. Características ligadas al Y. Letales ligados al sexo. Características influidas o limitadas por el sexo. 1
Unidad 6: Ligamiento, recombinación y mapeo de los genes. El descubrimiento del ligamiento. Recombinación. Notación. Ligamiento parcial y completo. Comparación entre el ligamiento completo y la segregación independiente. Entrecruzamiento con genes ligados. Cálculo de la frecuencia de recombinación. Acoplamiento y repulsión. Demostración citológica del sobrecruzamiento. Frecuencia de quiasmas. Mapas de ligamiento. Concepto. Orden lineal de los genes. Mapeo de genes con frecuencias de recombinación. Construcción de un mapa genético mediante el cruzamiento de prueba. Determinación del orden y distancia de los genes. Aplicación de prueba de tres puntos. Interferencia y coincidencia. Sintenia. Unidad 7: Sistemas genéticos bacterianos y virales. Genomas bacterianos y víricos. Recombinación en bacterias y virus. Transferencia génica en bacterias. Transferencia génica natural y resistencia a antibióticos. Transformación en bacterias. Transducción por fagos. Genética de los bacteriófagos. Virus con ARN. Virus de la inmunodeficiencia humana y sida. Unidad 8: Mutaciones cromosómicas estructurales. Mutación somática versus mutación germinal. Tipos de mutaciones cromosómicas. Cambios en la estructura de los cromosomas. Deleciones. Duplicaciones. Inversiones. Translocaciones. Efectos citológicos y genéticos de los cambios en la estructura de los cromosomas. Importancia en la evolución. Unidad 9: Mutaciones cromosómicas numéricas. Aneuploidía. Mecanismos de origen de aneuploides. Tipos de aneuploidía. Efectos de la aneuploidía. Euploidía. Poliploidía. Mecanismos de poliploidización. Tipos de poliploides. Fórmulas genómicas. Importancia evolutiva y práctica de la poliploidía. Unidad 10: Mutaciones génicas. Importancia de las mutaciones. Tipos de mutaciones génicas. Efectos fenotípicos de las mutaciones. Mutaciones supresoras. Tasas de mutación. Bases moleculares de la mutación. Errores espontáneos de replicación. Cambios químicos espontáneos. Mutaciones inducidas. Agentes mutagénicos: físicos y químicos; luz ultravioleta, radiaciones ionizantes, sustancias químicas. Unidad 11: Elementos genéticos transponibles o móviles. Inestabilidad genética y el descubrimiento de los elementos transponibles. Trabajos de Barbara McClintock. Características generales de los elementos transponibles. Transposones en bacterias. Transposones en eucariontes. Importancia genética y evolutiva de los transposones. Unidad 12: Estructura del gen y regulación de la acción génica. Concepto y organización del gen procariota y eucariota. Organización policistrónica y monocistrónica. Intrones y Exones. Promotores. Potenciadores. La regulación en procariontes. El modelo del operón. Metabolismo de la lactosa en E. coli. Operones inducibles y reprimibles. Regulación génica en eucariotas. Elementos reguladores y genes eucarióticos. Alteraciones genómicas y expresión génica. Metilación del ADN y amplificación génica. Factores de transcripción y proteínas activadoras de la transcripción. Regulación génica mediante el procesamiento y la degradación del ARN. Interferencia del ARN y regulación génica. Regulación génica postranscripcional. Control hormonal en la expresión génica. Epigenética. Unidad 13: Análisis genético molecular, biotecnología y genómica. Fundamento de las técnicas de biología molecular. Técnicas moleculares empleadas para aislar, 2
recombinar y amplificar genes. Técnicas moleculares para hallar genes de interés. Análisis de las secuencias de ADN. Técnicas moleculares para analizar la función de los genes. Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante. Ingeniería genética y responsabilidad social. Genómica. Organización del genoma eucariota. Mapas físicos. Bioinformática. Genómica funcional y comparada. Genomas de procariotas y eucariotas. Preoteómica. Transcriptómica. Metabolómica. Metagenómica. Unidad 14: Genética humana y médica. El genoma humano. Enfermedades mendelianas y de herencia multifactorial. Determinación sexual y cromosomas sexuales. Genes ligados al sexo. Genética e infertilidad. El cariotipo humano y cromosomopatías. Aberraciones cromosóicas estructurales. Genética del cáncer. Base genética de la respuesta inmunitaria. Aspectos éticos, sociales y legales en genética humana. Genética forense. Genética del comportamiento humano. Evolución humana. Unidad 15: Genética del desarrollo. Concepto de desarrollo. Principios básicos de la Genética del desarrollo. Transcripción diferencial en el desarrollo de procariotas y eucariotas. Genética del desarrollo embrionario. Control génico en el desarrollo. Formación de patrones complejos. Establecimiento de la información posicional. Uso de la información posicional para establecer el destino de las células. Los genes Hox. Homeobox. Homeodominio. Paralelismo entre la formación de patrones en insectos y vertebrados y entre animales y plantas. Unidad 16: Genética cuantitativa. Variación continua. Genotipos y distribución fenotípica. Tipos de características cuantitativas. Herencia poligénica. Variación transgresiva. Genes modificadores. Análisis de las características cuantitativas. Distribuciones, media y varianza. Varianza fenotípica. Heredabilidad. Cuantificación de la heredabilidad. Localización de los genes que afectan las características cuantitativas. Unidad 17: Genética poblacional. Acervo génico. Ley de Hardy‐Weinberg. Frecuencias génicas, genotípicas y fenotípicas. Cálculo de las frecuencias génicas. Factores que afectan a las frecuencias génicas. Heterocigosis. Endogamia y apareamientos preferenciales. Fuerzas evolutivas: mutación, selección natural, migración y deriva genética. Recombinación. Unidad 18: Genética evolutiva. El concepto de especie biológica. Mecanismos de aislamiento reproductivo. Modelos de especiación. Utilización de técnicas moleculares para el estudio de la evolución. Variación y divergencia entre las poblaciones. La construcción de árboles filogenéticos. Tasas de evolución molecular. La evolución del genoma. Filogeografía. Unidad 19: Genética y mejoramiento. Recursos genéticos: origen, uso y conservación de la variabilidad. Orígenes de la agricultura. Origen genético y origen geográfico. Centros de origen. Centros de variación. Bancos de germoplasma. Efecto genético de la consanguinidad. Aplicación al mejoramiento. Heterosis: concepto, efectos en plantas y animales. Aplicaciones. Métodos de selección. Selección individual, masal. Cruzamientos y manejo de poblaciones segregantes. Selección recurrente. Utilización de plantas transgénicas en la agricultura. Unidad 20: Genética de la conservación. Conservación de la biodiversidad. Importancia de la diversidad genética. Las consecuencias genéticas de la disminución del tamaño de la población. Depresión endogámica. Perdida de diversidad genética y 3
extinción. Manejo genético de especies amenazadas. Manejo genético de poblaciones fragmentadas. Aspectos genéticos del diseño de reservas. BIBLIOGRAFÍA General Burns GW (1983) The science of genetic. An introduction to heredity. 5ª ed. Ed. Macmillan. New York. USA. Gardner EJ, Simmons MJ, Snustad DP (1998) Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM (1996) An Introduction to Genetic Analysis. 6ª ed. Ed. Freeman & Co. New York. USA. Klug WS, Cummings MR (1999) Conceptos de Genética. 5a ed. Ed. Prentice Hall. Lacadena JR (1988) Genética. Ed. Agesa. Madrid, España. Levine L (1979) Biología del gen. Ed. Omega. Madrid, España. Lewin B (2001) Genes VII. Ed. Marban. Madrid, España. Mueller RF, Young ID, Emery EH (2001) Genética Médica. Ed. Marbán, Madrid España. Novitski E (1982) Human Genetics. MacMillan. New York. USA. Pierce BA (2011) Fundamentos de Genética. Conceptos y relaciones. Ed. Médica Panamericana. Madrid, España. Puertas MJ (1992) Genética: fundamentos y perspectivas. 1º ed. Ed. McGraw ‐ Hill Interamericana, Madrid. España. Sanchez‐Monge E & Jouve N (1989) Genética. Ed. Omega, Barcelona, España. Sinnott WE, Dunn LC & Dobzhansky T (1978) Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona, España. Solari AJ (2004) Genética Humana. Fundamentos y aplicaciones en medicina. 3ª ed. Ed. Medica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Srb AM, Owen RD, Edgar RS (1978) Genética general. OMEGA. Madrid, España. Srb AM, Owen RD, Edgar RS (1978) Facetas de la Genética. Selecciones de Scientific American. H. Blume Ediciones. Madrid, España. Strickberger MW (1978) Genética. 2º ed. Ed. Omega, Barcelona, España. Thompson JS, Thompson MW (1977) Genética humana. Ed. Salvat, Buenos Aires. Específica Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD (1989) Molecular biology of the cell. 2ª. ed. Ed. Garland Publ. Inc., New York. USA. Avers CJ (1991) Biología Celular. Ed. Iberoamérica, México. 4
Brawn TT (1999) Genome. Wiley‐Liss. Bath, UK. Clark MS, Wall WJ (1996) Chromosomes. Chapman & Hall. London, UK. Cooper GM (2002) La célula. Ed. Marbán. Madrid. España. Curtis H, Barnes NS Biología. (1993) 5ª ed. Ed. Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.. Darlington CD (1965) Cytology. Churchill Ltd. London, UK. De Robertis EMF, Hib J, Ponzio R (2000) Biología Celular y Molecular. 13ª ed. Ed. El Ateneo. Buenos Aires, Argentina. Dobzhansky T, Ayala FJ, Stebbins GL, Valentine JW (1980) Evolución. Ed. Omega. Barcelona, España. Heslop‐Harrison JS, Flavell RB (1993) The chromosome. Bios Scientific Publishers. Oxford, UK. Jauhar PP (1996) Methods of genome analysis in plants. CRC Press. Inc. Boca Ratón, Florida. Karp G (1996) Biología Celular y Molecular. Ed. Mcgraw‐Hill Interamericana. Lacadena JR (1996) Citogenética. 1º ed. Ed. Complutense, Madrid, España. Stebbins GL (1978) Procesos de la evolución orgánica. PHI. Madrid, España. Van Dyke F (2008) Conservation Biology. Foundations, concepts, applications. 2° ed. Springer. Revistas científicas Publicaciones disponibles en las Bibliotecas de la UNNE y en la Biblioteca Electrónica de la Secretaría General de Ciencia y Tecnología (http://www.biblioteca.secyt.gov.ar) Advances in Genetics (USA) Annual Reviews in Genetics (USA) Basic and Applied Genetics (Argentina) BMC Genetics (USA) BMC Genomics (USA) Caryologia (Italia) Chromosoma (Alemania) Chromosome Research (Gran Bretaña) Conservation Genetics (Gran Bretaña) Cytologia (Japón) Evolution (USA) Genetical Research (Gran Bretaña) 5
Genetica (Holanda) Genetics (USA) Genetics and Molecular Biology (Brasil) Hereditas (Suecia) Heredity (Gran Bretaña) International Review of Cytology (USA) Journal of Heredity (USA) Molecular Ecology (USA) Nature (Gran Bretaña) Science (USA) Theoretical and Applied Genetics (Alemania) Trends in Genetics (USA) Trends in Ecology and Evolution (USA) PROGRAMA DE EXÁMEN Bolilla 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Temas 1‐8‐20 2‐9‐19 3‐10‐18 4‐11‐17 5‐12‐16 6‐13‐14 7‐14‐15 8‐15‐13 9‐16‐12 10‐17‐11 Bolilla 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Temas 11‐2‐10 12‐3‐9 13‐4‐8 14‐5‐7 15‐6‐5 16‐4‐6 17‐8‐4 18‐5‐3 19‐10‐2 20‐7‐1 B. ORGANIZACIÓN DE LA ASIGNATURA DOCENTES: Profesora Titular: Viviana G. Solís Neffa Jefa de Trabajos Prácticos: Ivana Evelin Kovalsky Jefe de Trabajos Prácticos Adscripto: Juan Manuel Roggero Luque Ayudante Alumna Adscripta: Silvia A. Fernández 6
Ayudante Alumna Adscripta: Natalia Silvero CARACTERÍSTICAS GENERALES El curso de Genética se desarrolla durante el primer cuatrimestre del año y tiene un total de 16 semanas de duración. La asignatura está destinada a los alumnos del 3º año de las carreras de Profesorado en Biología y Licenciatura en Biología, siendo de carácter obligatorio. El cursado comprende cuatro horas semanales de clases teóricas y cuatro horas semanales de trabajos prácticos de laboratorio. Además de las consultas que los alumnos puedan realizar después de cada clase teórica o práctica, se podrán hacer consultas a los docentes del curso en los horarios establecidos a tal fin. CLASES TEÓRICAS Las clases teóricas están destinadas al conjunto de los alumnos y constituyen una actividad fundamental debido a que en estas clases se desarrollan los aspectos básicos y la orientación general de la materia. Para facilitar la comprensión de los contenidos desarrollados durante las clases teóricas, es imprescindible la lectura o estudio previo de los temas dictados. El alumno deberá estudiar y comprender las nociones que se imparten en las clases teóricas, sin lo cual no podrá desarrollar los trabajos prácticos en forma satisfactoria. Se recomienda la lectura de cada tema tratado tanto antes como después de cada clase, utilizando la bibliografía recomendada y resolviendo los problemas o ejercicios que se encuentran al final de cada capítulo en dichos textos. La lectura y ejercitación es de suma importancia puesto que la Genética es una ciencia que va desde lo teórico a lo experimental, de lo deductivo a lo inductivo. TRABAJOS PRÁCTICOS Las prácticas de laboratorio o trabajos prácticos son una actividad obligatoria para todos los alumnos inscriptos y se desarrollan dos veces por semana, guiados por uno o más auxiliares de docencia. Las bases conceptuales de los temas de los trabajos prácticos son desarrolladas previamente en las clases teóricas. Para poder integrar los conocimientos teóricos y prácticos, que conduzcan a la comprensión global de la materia, es imprescindible que los alumnos concurran a los trabajos prácticos habiendo estudiado o preparado previamente el tema a desarrollar. La Genética se ha destacado desde su nacimiento por el rigor y la precisión de su metodología, lo cual permite hacer inferencias y resolver planteos teóricos ante situaciones hipotéticas. Es por ello, que además de los prácticos experimentales, algunas clases prácticas estarán destinadas a la resolución de problemas teóricos. Las clases tendrán una duración aproximada de 2 horas, aunque ocasionalmente algunos prácticos puedan demandar mayor cantidad de tiempo. Los temas a desarrollar en los prácticos, así como los materiales necesarios y actividades, se detallan en la guía de trabajos prácticos. Al final de cada práctico, en la guía de 7
actividades prácticas se incluyen referencias bibliográficas a las que el alumno podrá recurrir para aclarar conceptos o estudiar el tema. Para cada clase práctica el alumno deberá concurrir conociendo la finalidad del trabajo y trayendo la guía de trabajos prácticos y los materiales necesarios mencionados en la misma. La realización de cada trabajo práctico implica la comprensión de los principios teóricos del fenómeno en estudio, el adiestramiento manual del alumno, la práctica en el manejo instrumental y entrenamiento en la presentación de datos e interpretación de resultados. Al finalizar cada trabajo práctico, el alumno deberá entregar en forma individual las actividades realizadas durante la clase para su evaluación (ilustraciones, respuestas del cuestionario, problemas resueltos, etc.). Si dicho informe se presenta en estado deficiente o incompleto se considerará que no ha cumplido con la clase práctica. Igualmente, cuando el alumno se encuentre ajeno al trabajo, sea por ignorar los fundamentos teóricos de la actividad o por permanecer inactivo en la práctica, se considerará que no ha cumplido esa clase práctica. MATERIALES PARA LOS TRABAJOS PRÁCTICOS Para la realización de las actividades prácticas, los alumnos deberán proveerse de los siguientes materiales: • Guía de Trabajos Prácticos • Carpeta con hojas blancas tamaño oficio • Lápiz negro • Goma de borrar • Regla milimetrada • Calculadora Los materiales que deberán llevar a cada trabajo práctico se detallan en la guía de actividades de laboratorio. SEMINARIOS Estas clases tendrán como objetivo analizar los aspectos prácticos de los conceptos teóricos y su importancia en el desarrollo de protocolos y en el análisis genético. Para el desarrollo de los seminarios, los alumnos realizarán trabajos individuales, al final de los cuales, presentarán informes escritos o exposiciones orales. Para tal fin, los alumnos emplearán bibliografía actualizada sobre los temas a tratar, recurriendo tanto a la consulta de libros como de revistas científicas especializadas disponibles en la página web de la Cátedra, las bibliotecas dependientes de la UNNE y en la biblioteca electrónica de la SGCYT. EVALUACIONES Las evaluaciones están destinadas a determinar el grado de comprensión de los diferentes temas por parte de los alumnos y estimar el grado en que los objetivos propuestos por la asignatura se cumplen. 8
a.‐ Evaluaciones de las Actividades Prácticas: tienen como objetivo determinar si el grado de comprensión de los fundamentos del tema es satisfactorio y verificar si el alumno es capaz de aplicar dichos conocimientos en la resolución de problemas hipotético‐deductivos. La evaluación de las mismas se realizará a partir de los trabajos o problemas realizados por los alumnos, que serán entregados al finalizar cada clase. El no cumplimento de las actividades previstas en cada práctico o la incorrecta elaboración de los informes implicará la desaprobación del trabajo práctico realizado. b.‐ Evaluaciones Parciales: se realizarán tres evaluaciones parciales, que comprenderán temas estrechamente relacionados, cuya comprensión es fundamental para la correcta asimilación de los temas posteriores. Los parciales serán desarrollados por escrito, y tendrán como objetivo fundamental evaluar la capacidad de análisis y de las diferentes situaciones que pudieran plantearse. Los contenidos a evaluar en las evaluaciones parciales comprenden los trabajos prácticos realizados y los fundamentos teóricos de los mismos. Se considerarán aprobados los parciales que obtuvieran una calificación de 7 (siete) o superior. Dentro de los 7 días posteriores a cada evaluación se realizarán los recuperatorios correspondientes. REGULARIZACIÓN DE LA ASIGNATURA Serán considerados alumnos regulares, los que cumplieran con las siguientes exigencias: a) Alcanzar el 75 % de asistencia en las clases prácticas. b) Aprobar el 75% de las clases prácticas. c) Aprobar el 100% de las evaluaciones parciales con calificación 7 (siete) o superior. Los alumnos que no cumplieran con los tres requisitos mencionados serán considerados alumnos libres. NÓMINA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Trabajo Práctico N° 1: Análisis de cromosomas en mitosis Trabajo Práctico N° 2: Confección del Cariotipo Trabajo Práctico N° 3: Meiosis. Trabajo Práctico N° 4: Análisis de cromosomas en meiosis. Trabajo Práctico N° 5: Leyes de la segregación y de la segregación independiente. Trabajo Práctico N° 6: Probabilidades. Trabajo Práctico N° 7: Extensiones del mendelismo: Alelos múltiples, interacción génica y genes letales. Trabajo Práctico N° 8: Determinación cromosómica del sexo y Herencia ligada al sexo . Trabajo Práctico N° 9: Ligamiento, recombinación y mapeo de genes. 9
Trabajo Práctico N° 10: Mutaciones cromosómicas estructurales. Trabajo Práctico N° 11: Mutaciones cromosómicas numéricas. Trabajo Práctico N° 12: Mutaciones génicas. Trabajo Práctico N° 13: Análisis genético molecular, biotecnología y genómica. Trabajo Práctico N° 14: El cariotipo humano. Trabajo Práctico N° 15: Herencia cuantitativa. Trabajo Práctico N° 16: Genética de poblaciones. Trabajo Práctico N° 17: Genética evolutiva. NÓMINA DE SEMINARIOS Seminario N° 1: Estructura del gen y regulación de la acción génica Seminario N° 2: Ingeniería genética Seminario N° 3: Elementos genéticos transponibles Seminario N° 4: Genética del desarrollo Seminario N° 5: Genética y mejoramiento Seminario N° 6: Genética de la conservación CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Las clases teóricas se dictarán los martes y jueves de 15:00 a 17:00 hs y las clases prácticas los martes y jueves de 17:00 a 19:00 hs. 5.1. Cronograma de clases teóricas MARZO M 12 J 14 M 19 J 21 M 26 ABRIL J M J M J M 11 16 18 23 25 30 Introducción. Mitosis Meiosis Principios básicos de la herencia mendeliana Principios básicos de la herencia mendeliana Extensiones del mendelismo Genética del Sexo y herencia en relación con el sexo Ligamiento, recombinación y mapeo de los genes Sistemas genéticos bacterianos y virales PRIMER PARCIAL Mutaciones cromosómicas estructurales Mutaciones cromosómicas numéricas – PRIMER RECUPERATORIO 10
MAYO J M J M J M J M JUNIO M J M J M M J JULIO M J 2 7 9 14 16 21 23 28 Mutaciones génicas Elementos genéticos transponibles o móviles Estructura del gen y regulación de la acción génica Análisis genético molecular, biotecnología y genómica Genética humana y médica Genética del desarrollo Genética cuantitativa SEGUNDO PARCIAL 4 6 11 13 18 25 27 Genética poblacional Genética evolutiva – SEGUNDO RECUPERATORIO Genética y mejoramiento Genética de la Conservación SEMINARIOS TERCER PARCIAL Clase de Consultas 2 4 TERCER RECUPERATORIO EXTRAORDINARIO 5.2 Cronograma de clases prácticas y seminarios MARZO J 14 M 19 J 21 M 26 ABRIL J M J M J 11 16 18 23 25 Análisis de cromosomas en mitosis / Cariotipo Análisis de cromosomas en mitosis / Cariotipo Análisis de cromosomas en meiosis Análisis de cromosomas en meiosis Principios básicos de la herencia mendeliana Principios básicos de la herencia mendeliana Extensiones del mendelismo PRIMER PARCIAL Determinación cromosómica del sexo y herencia ligada al sexo 11
M 30 PRIMER RECUPERATORIO MAYO J M J M J M J M J 2 7 9 14 16 21 23 28 30 Ligamiento, recombinación y mapeo de los genes Mutaciones cromosómicas estructurales Mutaciones cromosómicas numéricas Mutaciones génicas / Análisis de secuencias Mutaciones génicas / Análisis de secuencias SEMINARIOS Genética Humana SEGUNDO PARCIAL SEMINARIOS 4 6 11 13 18 25 27 Genética cuantitativa SEGUNDO RECUPERATORIO Genética de poblaciones Genética evolutiva SEMINARIOS TERCER PARCIAL Clase de Consultas 2 4 TERCER RECUPERATORIO EXTRAORDINARIO JUNIO M J M J M M J JULIO M J 12
MANEJO y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO 1. Conectar la luz. 2. Colocar el preparado sobre la platina y centrar, mirando exteriormente, la zona teñida sobre el eje del objetivo. 3. Abrir el diafragma del condensador y colocar éste en su posición más alta. 4. Colocar el objetivo de menor aumento (10×) lo más cerca posible del preparado, sin que llegue a tocarlo. Hacer esta operación empleando el tornillo macrométrico, observando lateralmente el microscopio. 5. Observar a través del ocular y mover el tornillo macrométrico, hasta que aparezca la imagen nítida. 6. Una vez enfocado el preparado, no volver a tocar el tornillo macrométrico. Los enfoques con los otros objetivos se realizarán únicamente con el tornillo micrométrico. 7. Para observar el preparado, mover ordenadamente la platina con los tornillos del vernier, de izquierda a derecha y de arriba abajo, procurando no pasar dos veces por el mismo punto del preparado. Tomar las coordenadas de aquellas células que resulte interesante observar con objetivos de mayor aumento. Para ello: • Situar en el centro del campo visual la célula cuyas coordenadas queremos anotar. • En el eje de abscisas (horizontal) existe una escala pequeña fija, dividida del 0 al 10 (nonius); sobre ella se desliza una escala grande, cuya numeración depende del modelo de microscopio. La parte entera de la medida, está indicada por la división de la escala grande que queda situada inmediatamente antes del 0 del nonius. Si dicho 0 llegara a coincidir exactamente con una división de la escala grande, no habría en este caso parte decimal. Esta última estará dada por la división de la escala pequeña que coincida exactamente con una división de la escala grande. • En el eje de las ordenadas (vertical) existen también dos escalas. La escala grande se desliza sobre una escala pequeña fija, que va del 0 al 10. La lectura de las coordenadas se realiza de igual manera que en el eje de abscisas. 9. Finalizada la revisión del preparado, observar con mayor aumento las células cuyas coordenadas se anotaron. Tanto con el objetivo de 40× como con el de inmersión (100×), tener la precaución de no tocar nunca el preparado. Para observar con el objetivo de 100×, colocar una gota de aceite de inmersión sobre el preparado. 10. En cada paso a objetivos de mayor aumento, rectificar el enfoque, si ello fuera necesario, utilizando exclusivamente el tornillo micrométrico. 11. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del microscopio. 12. Una vez finalizada la observación: • Poner el objetivo de 10×. • Quitar el preparado.
• Limpiar el objetivo de inmersión. • Desconectar el microscopio. • Poner la funda al microscopio. Recomendaciones ‐ Apagar el microscopio si no se está utilizando, aunque tampoco encenderlo y apagarlo a intervalos cortos de tiempo. ‐ No deslizar el microscopio sobre la mesa para evitar vibraciones. 13
Trabajo Práctico N° 1 ANÁLISIS DE CROMOSOMAS EN MITOSIS La mitosis es un proceso de división celular, Constituye un mecanismo estable que tienen las células para distribuir de forma exacta la información genética entre las células hijas. La división celular consta de dos procesos fundamentales: la mitosis o división del núcleo y la citocinesis o división del citoplasma. Ambos procesos son independientes pero deben ocurrir sincronizadamente. El resultado son dos células hijas con igual dotación cromosómica entre sí e igual a la de la célula madre. El período entre dos divisiones celulares define al ciclo celular (Fig. 1). Figura 1‐ Ciclo celular. Cuando una célula no se está dividiendo se dice que está en interfase (Fig. 2 A), lo que corresponde al lapso de tiempo que transcurre entre dos mitosis sucesivas. Durante este período la cromatina está descondensada y existe mucha actividad metabólica porque es cuando la mayor parte de los genes se expresan, aunque en cada tipo celular lo harán solo los necesarios para que desarrolle su función específica. Un suceso importante de la interfase es la replicación del ADN que ocurre en el período denominado S, tras la cual los cromosomas ya tienen dos réplicas idénticas denominadas cromátidas hermanas. Esta fase va antecedida por el período G1 y seguida del período G2 en los que hay crecimiento celular, actividad transcripcional y la célula se prepara para dividirse. A continuación se iniciaría la mitosis. Si después de una mitosis la célula no va a dividirse de nuevo, se queda en lo que llamamos fase G0. Si indicamos como M a la mitosis, el ciclo celular es una sucesión cíclica de los distintos períodos. Una vez que se inicia, el proceso mitótico transcurre de forma continua sin que haya interrupciones, pero ocurren una serie de acontecimientos que son clave para que el reparto de la información genética sea correcto y en los que nos basamos para distinguir cuatro etapas: 14
Figura 2‐ Mitosis en células de la punta de la raíz de Lilium regale. A) Interfase. B) Profase temprana. C) Profase tardía. D) Metafase. E) Anafase. F) Telofase (Extraído de Mc Leish & Noad, 1958). Profase (Fig. 2 B y C). Durante este período la fibra de cromatina, que ha ido organizándose en plegamientos cada vez más complejos, aparece como cromosomas visibles que van condensándose gradualmente. Hay 2n cromosomas en la célula y cada uno de ellos consta de dos cromátidas hermanas con igual información y morfología. Éstas aparecen unidas a nivel del centrómero y a lo largo de los brazos cromosómicos gracias a complejos proteicos. Al final de la profase se desorganizan los nucléolos y desparece la membrana nuclear cuyos componentes quedan dispersos en el núcleo. Metafase (Fig. 2 D). Los cromosomas se encuentran ahora libres en el citoplasma y los centrómeros de cada cromosoma contactan con las fibras del huso, que se organizan en el centro organizador de microtúbulos (MTOC), formado por los centríolos (en células animales), que actúan como centro de atracción de los cromosomas hacia los polos, y la masa amorfa pericentriolar. La intervención de las fibras del huso y de otras proteínas de movimiento cromosómico permite a los cromosomas organizarse en la llamada placa metafásica. Cada cromátida hermana se orienta hacia un polo distinto lo que garantiza el reparto de la información genética de cada cromosoma a las dos células hijas. Ahora los cromosomas alcanzan su máximo grado de condensación y su morfología se hace evidente (Fig. 3). 15
Figura 3‐ Morfología cromosómica. El centrómero es la constricción primaria que aparece en todos los cromosomas y donde se asocian los cinetocoros o estructura proteica a la que se unen las fibras de huso mitótico. Su posición define el número de brazos de un cromosoma. Si está situado en un extremo del cromosoma, éste tendrá un solo brazo y si está en otra posición veremos cromosomas con dos brazos. El cinetocoro funciona a modo de un “interfaz” entre el centrómero y las fibras del huso. En algunos cromosomas aparecen constricciones secundarias, normalmente asociadas a la región organizadora nucleolar (NOR) donde se encuentran los genes para ARN ribosómico. El fragmento de cromosoma que va desde la constricción secundaria al telómero se denomina satélite cromosómico. El telómero constituye el extremo cromosómico por lo que hay uno en cada brazo cromosómico y juega un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad del cromosoma. Anafase (Fig. 2 E). Esta fase es, en general, la etapa más corta de la mitosis. Cada centrómero se divide en dos y se desorganizan las proteínas que mantenían unidas a las cromátidas hermanas, lo que les permite migrar a polos opuestos. En cada polo celular veremos un grupo de cromosomas (2n) con una sola cromátida orientados hacia el polo correspondiente. Telofase (Fig. 2 F). Los cromosomas agrupados en cada polo comienzan a descondensarse y los nucleolos y la membrana nuclear vuelven a organizarse a partir de material preexistente y de nueva síntesis. La división celular se completa al final de esta etapa con la citocinesis, donde hay también un reparto de los orgánulos y componentes citoplásmicos a las dos células hijas, aunque no se realiza de forma tan precisa como durante la mitosis. El resultado final del proceso mitótico son dos células con 2n cromosomas. La caracterización cromosómica se realiza en metafase mitótica debido a que, en esta fase, los cromosomas han alcanzado su máximo grado de condensación y sus límites están perfectamente definidos. En esta fase, los cromosomas también muestran las mejores condiciones de tinción. Esto hace que podamos conocer en este momento cuántos cromosomas tiene una especie, dónde se localiza el centrómero (o constricción primaria), el número de brazos cromosómicos que presentan o la existencia de constricciones secundarias y satélites, identificar homólogos y confeccionar un cariotipo o realizar estudios comparativos entre especies y conocer la evolución cariotípica ocurrida dentro de un taxón. Para este análisis generalmente se emplean tejidos que presentan un alto índice mitótico. 16
Índice mitótico (IM)= N° de células en división / N° total de células observadas Para poder analizar la morfología cromosómica, los tejidos son pre‐tratados con diversas sustancias que inhiben la formación del huso mitótico (colchicina, 8‐
hidroxiquinoleína, paclosol, etc.) a los efectos de acumular metafases, dispersar los cromosomas en el citoplasma y producir una mayor condensación de los mismos. Los materiales se fijan y luego se tiñen con colorantes nucleares (fucsina básica, orceína, carmín, giemsa, etc.). Con estos métodos de tinción, los cromosomas metafásicos observados con un microscopio óptico aparecen uniformemente teñidos, excepto en el centrómero (constricción primaria) y en algunas constricciones menores (secundarias). Objetivos • Reconocer las distintas fases de la mitosis. • Comprender la importancia de determinar el índice mitótico para el análisis de los cromosomas en mitosis, • Analizar las diferencias entre los métodos de obtención de preparados. Materiales 9 Guía de trabajos prácticos. 9 Preparados de centeno otorgados por la cátedra. 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma de borrar, etc.). 9 Calculadora. Actividades 1) Observe detenidamente los preparados y diferencie las células en interfase y en división. Luego, complete el siguiente cuadro indicando el número de células que están en cada fase. A partir de esta información, calcule el índice mitótico (IM). Horario Interfase Profase Metafase Anafase Telofase Total IM
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2) En cada una de las microfotografías de cebolla (Allium cepa) de la Figura 4 indique la fase de la mitosis en la que se encuentra la célula y si el material fue sometido o no a pretratamiento. Cuando fuera posible, indique el número cromosómico (2n) de la especie estudiada. 17
Figura 4‐ Cromosomas mitóticos de Allium cepa con y sin pretratamiento. (Gentileza de A. Fernández). Cuestionario 1. Un individuo diploide y homocigótico AA, ¿Cuántas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuántas en metafase? 2. Un individuo diploide y heterocigótico Aa, ¿Cuántas copias del alelo A tiene en el periodo G1 de la interfase y cuántas en metafase? 3. ¿Por qué es importante determinar el índice mitótico? 4. ¿En qué fase del ciclo celular se observan los cromosomas para el análisis cariotípico? ¿Por qué? 5. ¿Cuáles son las diferencias entre los preparados realizados con pretratamiento y sin pretratamiento en plantas? 6. La cebolla, Allium cepa es una especie vegetal con 2n=16 cromosomas ¿Cuántas cromátidas tiene cada uno de los cromosomas de cebolla en telofase? 7. ¿Las cromátidas de un cromosoma son idénticas a las cromátidas de su homólogo? ¿Por qué? Bibliografía De Robertis, E.M.F., J. Hib & R. Ponzio. 1996. Biología Celular y Molecular. Ed. El Ateneo, Buenos Aires. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Mc Leish, J. & B. Noad. 1958. Looking at chromosomes. Copyrigth. Macmillan. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 18
Trabajo Práctico N° 2 CARIOTIPO La caracterización cromosómica de especies o variedades se inicia con la descripción del cariotipo a través del análisis del número, el tamaño y la forma de los cromosomas que presentan (complemento cromosómico). Mediante la observación microscópica se determina el número cromosómico somático (2n) y, a través del análisis de microfotografías o dibujos de metafases con cromosomas bien definidos y separados, se establecen los cariotipos. Para ello, se analiza la morfología de los cromosomas determinando la posición del centrómero y la longitud de los brazos corto (bc) y largo (bl), así como la longitud total (lt) de cada cromosoma. A partir de estas medidas, se calcula el índice centromérico [IC = (bc / lt) × 100], según el cual los cromosomas se clasifican en cuatro tipos morfológicos: metacéntricos (m, IC = 50 ‐ 37,5, centrómero equidistante de los extremos, brazos de igual longitud), submetacéntricos (sm, IC = 37,5 – 25, centrómero muy próximo al centro), subtelocéntricos (st, IC = 25‐12,5), acrocéntricos (t, IC = 12,5 – 0, centrómero muy próximo a un extremo) y telocéntricos (T, IC = 0, centrómero terminal, no se puede hablar propiamente de constricción, ni de brazos, sólo existe un brazo). Figura 5‐ Tipos de cromosomas según su morfología. Otro aspecto a considerar para caracterizar morfológicamente a los cromosomas es la presencia y la posición de las constricciones secundarias, así como la presencia y el tipo de satélites. En general, las primeras corresponden a regiones organizadoras de los nucleolos (NORs) y los últimos a las porciones cromosómicas distales delimitadas por la constricción secundaria y el telómero de los brazos que los portan. Los cromosomas que presentan satélites se denominan cromosomas SAT. Para la confección del cariotipo los cromosomas del complemento se ordenan según su morfología (de metacéntricos a submetacéntricos, subtelocéntricos, acrocéntricos y telocéntricos) y, dentro de cada tipo, según su tamaño (de mayor a menor) ubicando los centrómeros alineados a una misma altura y los brazos cortos hacia arriba. El orden que ocupa en el cariotipo cada par de cromosomas se indica mediante un número y, mediante una letra, el tipo cromosómico al que pertenece de 19
acuerdo a su morfología. La representación gráfica del cariotipo se denomina idiograma. La composición de un complemento cromosómico también se puede expresar mediante una fórmula cariotípica, en la que se indica el número de cada tipo morfológico de cromosomas que presenta el material analizado (ej. 16 m + 10 sm + 2 st + 2 t). En muchas especies, la identificación de los diferentes pares de homólogos del cariotipo puede resultar engorrosa debido a que presentan cromosomas con morfología muy similar. En estos casos, la aplicación de determinados tratamientos en combinación con diferentes tipos de tinción, puede revelar regiones cromosómicas con condensación o composición cromatínica diferencial (bandas), generando marcadores cromosómicos adicionales. Así, el tratamiento de los cromosomas con un álcali y la posterior tinción con Giemsa revela regiones de heterocromatina constitutiva, mientras que la impregnación argéntica (bandeo Ag‐NOR) revela las NORs activas. Además, pueden utilizarse diversos fluorocromos que tienen la capacidad de intercalarse preferentemente en regiones del ADN con una composición de bases particular. Por ejemplo, las regiones ricas en adenina y timina son reveladas con DAPI o quinacrina, mientras que las ricas en guanina y citosina lo son con CMA3 (cromomicina A3). Las bandas pueden ser de tamaño e intensidad diferentes y presentar una distribución particular sobre los cromosomas (se localizan, por lo general, en las regiones pericentroméricas y teloméricas ) de un complemento generando un patrón de bandeo característico. Estas técnicas de bandeo cromosómico han permitido, en muchos casos, la identificación inequívoca de cromosomas homólogos, la caracterización de genomas así como el seguimiento de cromosomas o bloques cromosómicos en híbridos y líneas de introgresión. La información obtenida a partir del análisis de los cariotipos permite identificar cromosomas, clasificar los cariotipos, realizar análisis comparativos entre grupos de especies más o menos relacionadas e inferir sus tendencias evolutivas. Asimismo, permite detectar las anomalías numéricas y estructurales en los complementos cromosómicos de células o individuos. Objetivos • Adquirir destreza en la confección de cariotipos. • Comprender la importancia del análisis cariotípico en los estudios taxonómicos y evolutivos. Materiales 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma de borrar, etc.) Actividades 1) En las siguientes microfotografías, realice el recuento de cromosomas y determine el número cromosómico somático de las diferentes especies: 20
Figura 6– Cromosomas somáticos de Turnera sidoides. 1) subsp. carnea, 2n=.......... 2) subsp. holosericea, 2n=..........3) subsp. integrifolia, 2n=.......... 4 y 5. subsp. pinnatifida. 4) Población 1, 2n=......... 5) población 2, 2n=.........Escala = 5 μm (Extraído de Solís Neffa & Fernández 2002). 21
Figura 7‐ Cromosomas somáticos de Lathyrus. 1) L. cabrerianus, 2n=………. 2) L. crassipes, 2n=……….. 3) L. hasslerianus, 2n=……….. 4) L. macropus, 2n=……….. 5) L. macrostathys, 2n=……….. 6) L. magellanicus var. magellanicus, 2n=……….. 7) L. magellanicus var. tucumanensis, 2n=……….. 8) L. multiceps, 2n=……….. 9) L. pubescens, 2n=……….. 10) L. nervosus, 2n=………. 11) L. tomentosus, 2n=………...Escala= 5 μm (Extraído de Seijo & Fernández 2003). 2) Realice el cariotipo de Lathyrus sp. a partir de la siguiente microfotografía de una placa metafásica: 22
Figura 8‐ Metafase mitótica de Lathyrus sp. Escala= 5 μm. Para confeccionar el cariotipo: a) Numere cada uno de los cromosomas. b) En cada uno de los cromosomas, con una regla milimetrada tome las medidas del brazo corto y del brazo largo. Luego calcule su longitud total y el índice centromérico: Cromosoma Brazo corto Brazo largo Longitud total Indice centromérico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 c) Forme los pares de cromosomas teniendo en cuenta el índice centromérico y la longitud total de cada cromosoma. Para cada par cromosómico calcule los valores promedio de de las variables analizadas y complete el siguiente cuadro: 23
Par 1 2 3 4 5 6 7 Brazo corto Brazo largo Longitud total Indice centromérico d) A partir de los valores de la tabla anterior escriba la fórmula cariotípica de Lathyrus sp. y calcule los siguientes parámetros cariotípicos: ‐ Fórmula cariotípica: ‐ Longitud total del complemento: ‐ Longitud cromosómica media: ‐ Indice centromérico promedio: 3) Analice los idiogramas de la siguiente figura y escriba las fórmulas cariotípicas de las especies. Figura 9‐ Idiogramas de Turnera sidoides A) subsp. carnea, 2n=…………………... B) subsp. holosericea, 2n=…………………... C) subsp. integrifolia, 2n=…………………... D) y E). subsp. pinnatifida. D) Población 1, 2n=…………………..E) Población 2= 2n=…………………... Population from Uruguay (S57). F) subsp. sidoides, 2n=…………………... Escala=5 μm. 24
Figura 10‐ Idiogramas de Lathyrus. 17) L. cabrerianus, 2n=………………….. 18) L. crassipes, 2n=…………………... 19) L. hasslerianus, 2n=…………………... 20) L. macropus, 2n=…………………... 21) L.macrostathys, 2n=…………………... 22) L. magellanicus var. magellanicus, 2n=…………………... 23) L. magellanicus var. tucumanensis, 2n=…………………... 24) L. multiceps, 2n=…………………... 25) L. pubescens, 2n=…………………... 26) L. nervosus, 2n=………………….. 27) L. tomentosus, 2n=…………………... 28) L. annuus, 2n=…………………... 29) L. latifolius, 2n=…………………... 30) L. odoratus, 2n=…………………... 31) L. sylvestris, 2n=…………………... 32) L. japonicus, 2n=…………………..Escala= 5 μm. Cuestionario 1) Analizando las Figuras 6 y 9 ¿Qué conclusiones puede extraer sobre Turnera? 2) Analizando las Figuras 7 y 10 ¿Qué conclusiones puede extraer sobre Lathyrus? Bibliografía Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Seijo, J.G. & A. Fernández. 2003. Karyotype analysis and chromosome evolution in South American species of Lathyrus (Leguminosae). Amer. J. Bot. 90(7): 980–987. Solís Neffa, V.G. & A. Fernández. 2002. Karyotypic studies in Turnera sidoides complex (Turneraceae, Leiocarpae). Amer. J. Bot. 89(4): 551–558. 25
Trabajo Práctico Nº 3 ANÁLISIS DE CROMOSOMAS EN MEOISIS La meiosis es un tipo especial de división celular que ocurre durante la gametogénesis. Consiste en dos divisiones nucleares pero sólo una vuelta de replicación del ADN. Como resultado las cuatro células hijas resultantes son haploides, es decir que contienen sólo un cromosoma de cada par. En la reproducción sexual, mediante la fertilización se reconstituye el complemento diploide encontrado en las células somáticas. La meiosis difiere de la mitosis en aspectos genéticos y citológicos. En primer lugar, los cromosomas homólogos se aparean durante la profase de la Meiosis I. En segundo lugar, se producen intercambios regulares entre los cromosomas homólogos (crossing over). Esto genera cromosomas con segmentos tanto de origen materno como paterno, dando lugar a combinaciones nuevas, lo que se conoce como recombinación genética. En tercer lugar, el juego cromosómico se reduce a la mitad en la Meiosis I, por lo tanto se forman células haploides. Fases de la meiosis La meiosis es un proceso celular y bioquímico complejo. El curso observable de la misma en términos citológicos y las consecuencias genéticas no tienen una correspondencia temporal exacta, sim embargo para su mejor estudio se divide en dos etapas. En la primera división meiótica ocurre una serie de intercambios de material genético entre los cromosomas homólogos. Este fenómeno es un proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y comprensión, se distinguen los estadíos: Profase I Leptotene. El comienzo de la Profase I de la célula se caracteriza porque los cromosomas que se encuentran completamente desenrollados en el núcleo, debido a los procesos de síntesis de los momentos premeióticos, comienzan a estructurarse según un doble modelo de espiralización, que conduce en definitiva a un aumento del volumen nuclear. Cigotene. La célula diploide presenta en estos momentos 2n cromosomas homólogos completamente espiralizados (contraídos), los cuales se aparean cada uno con su homólogo. Es una sinapsis perfecta, cromómero a cromómero, formando por tanto n bivalentes. Paquitene. En este estadío se terminaliza el apareamiento de los cromosomas homólogos. Los n‐bivalentes se visualizan engrosados y cada uno de los cromosomas están compuestos de dos cromátidas, esto hace que el bivalente se presente como una tétrada. Diplotene. Las dobles parejas de cromátidas homólogas comienzan a separarse, permaneciendo unidas por ciertos puntos que son los quiasmas, los cuales constituyen la manifestación citológica del mecanismo de intercambio de material genético denominado sobrecruzamiento (crossing‐over). 26
Figura 11‐ Meiosis y formación de granos de polen en Lillium regale. a) Leptotene. b) Cigotene. c) Paquitene. d) Diplotene. e) Diacinesis. f) Metafase I. g) Anafase I temprana. h) Anafase I tardía. (Extraído de Mc Leish & Noad, 1958). 27
Figura 11 (continuación)‐‐ i) Telofase I. j) Interfase. l) Metafase II. m) Anafase II. n) Telofase II. o) Una tétrada. p) Granos de polen jóvenes. (Extraído de Mc Leish & Noad, 1958). 28
Figura 12‐ Arriba. Microfotografía de un bivalente de espermatocito de salamandra en diplotene. Abajo. Interpretación esquemática de la microfotografía. Se observan los dos quiasmas y la posición de los centrómeros. Los centrómeros hermanos están uno al lado del otro. Diacinesis. En este estadío las tétradas aparecen muy condensadas con bucles unidos por los quiasmas; al mismo tiempo que se terminalizan hacia los extremos de la tétrada. Figura 13 ‐ Configuraciones de los bivalentes de Schistocerca gregaria en diacinesis. El univalente señalado con la flecha es el cromosomas sexual. (i) Bivalente con tres quiasmas. (ii) Bivalente en anillo con dos quiasmas. (iii) Bivalente con un quiasma terminal. (iv) Bivalente en forma de cruz con dos quiasmas. (Extraído de Clarck & Wall, 1996). 29
Metafase I. A lo largo de la Profase I, los centríolos duplicados (en células animales) se orientan dos a dos, hacia cada uno de los polos de la célula, visualizándose ya en la Metafase I el aparato meiótico, al mismo tiempo que las tétradas se disponen en la placa ecuatorial. Anafase I. En este estadío ocurre la rotura y desaparición de la membrana nuclear y la migración de n cromosomas a cada polo. Es importante señalar en primer lugar que la repartición de n cromosomas homólogos a cada polo ocurre al azar, y en segundo lugar que, a diferencia de la mitosis, en esta primera división meiótica no hay división longitudinal del centrómero, y por lo tanto separación de las cromátidas, sino que éstas permanecen unidas por sus respectivos centrómeros. Por lo tanto, esta división meiótica I es una división reduccional. Figura 14‐ Diagrama donde se muestra el comportamiento de bivalentes de diferentes tipos en Anafase I. A) Bivalente abierto con un solo quiasma. B)‐ D) Bivalentes con dos quiasmas. (Extraído de Darlington, 1965). Telofase I. Ocurre la individualización de las dos células de la división meiótica I, con la aparición de la membrana plasmática que las separa, y la reaparición de la membrana nuclear. División meiótica II Entre la Telofase I y el comienzo de la segunda división meiótica, a diferencia de la mitosis, no hay un período de síntesis y duplicación del ADN, por lo demás la división meiótica II, tiene lugar como la mitosis normal en cada una de las células haploides, resultantes de la división meiótica I. Profase II. En este estadío los centríolos (en células animales) aparecen duplicados y migran dos a dos hacia los polos, constituyendo el huso mitótico. 30
Metafase II. Los n cromosomas de cada una de las células hijas, se disponen en la placa ecuatorial del huso, al mismo tiempo que desaparece la membrana nuclear. Anafase II. Ocurre la división longitudinal del centrómero y repartición al azar de n cromátidas a cada uno de los polos, de modo que las cromátidas hermanas (que no serán idénticas por el sobrecruzamiento) van siempre a lados opuestos. Telofase II. En esta fase tiene lugar la individualización de las cuatro células hijas, con aparición de las membranas plasmática y nuclear. Ahora bien, a diferencia de la mitosis, las dos células resultantes de cada meiocito de segundo orden son diferentes, porque sus cromátidas han intercambiado material genético previamente en la Profase I. A continuación, ocurre la desespiralización de las cromátidas y el período de síntesis y duplicación del ADN. No obstante, se presentan numerosas excepciones a este esquema general de la meiosis, según sean los ciclos haplontes, diplontes o diplohaplontes de las especies, o en una misma especie en la espermatogénesis y ovogénesis. Objetivos • Reconocer las distintas fases de la división meiótica. • Observar el apareamiento de los cromosomas homólogos. • Visualizar la forma que adoptan los cromosomas meióticos. • Esquematizar todas las etapas de la división meiótica. Materiales 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Observe detenidamente los preparados. Localice, analice y esquematice cada una de las etapas de la división meiótica. Paquitene Diplotene Diacinesis 31
Metafase I Anafase I Telofase I Profase II Metafase II Anafase II Telofase II Tétrada Granos de polen 2) A partir del análisis de las fases de la meiosis en el punto anterior, conteste el siguiente cuestionario. En el material estudiado: a‐ ¿Cuántos bivalentes observó durante diacinesis y metafase I? b‐ ¿Cuál es el número promedio de quiasmas que pudo observar en una célula? c‐ ¿Cuantas células y con cuántos cromosomas se obtienen al final de la meiosis? d‐ ¿Cuáles son las diferencias entre la mitosis y la meiosis? Considere las diferencias tanto en el mecanismo como en los productos finales. e‐ ¿Cuántas cromátidas componen un cromosoma en los siguientes estadios celulares?: ‐ G1 ‐ Anafase I ‐ Metafase II ‐ G2 ‐ Metafase mitótica ‐ Telofase II ‐ Profase mitótica ‐ Interfase 32
3) Analice la siguiente microfotografía y luego represente gráficamente las configuraciones de los bivalentes. Figura 15‐ Microfotografía de bivalentes de Schistocerca gregaria en Metafase I. (Extraído de Clarck & Wall, 1996). 4) Marcar con una cruz las respuestas correctas: a‐ Una célula humana tiene 46 cromosomas en total o 23 pares de cromosomas. A continuación de la mitosis, las células hijas tendrán cada una un total de ______ cromosomas. Después de la meiosis I, las dos células hijas tendrán _____cromosomas, y después de la meiosis II ______ cromosomas. A. 46, 46, 46 B. 46, 23, 23 C. 23, 23, 23 D. 46, 12, 12 b‐ El proceso de meiosis produce cuatro células con cromosomas no idénticos. Esta diversificación ocurre durante: A. B. C. D. Telofase I Profase I Metafase II Profase II c‐ Algunos organismos son capaces de reproducirse asexual o sexualmente. Bajo condiciones favorables, la reproducción procede asexualmente. Cuándo las condiciones se vuelven más estresantes la reproducción cambia al modo sexual. ¿Por qué? A. La reproducción sexual es simple y más rápida permitiendo producir un número mayor de descendientes. B. La reproducción sexual requiere dos individuos separados, quienes pueden mutuamente proveer apoyo nutritivo durante el estrés. C. La reproducción asexual requiere más energía. D. La reproducción sexual produce individuos con nuevas combinaciones de cromosomas recombinados incrementando la diversidad. 33
d‐ El estado de meiosis dónde las células se vuelven haploides es: A. Profase I B. Profase II C. Anafase I D. Anafase II e‐ Uno de los más tempranos eventos que distingue la meiosis ocurre en Profase I e involucra: A. Condensación de los cromosomas B. Pérdida de la membrana nuclear C. Movimiento de los cromosomas hacia la placa metafásica
D. Apareamiento de los cromosomas homólogos (sinapsis) f‐ El coral en el océano crece por gemación, donde el nuevo organismo crece a partir del viejo por mitosis. Esta forma de replicación es un ejemplo de: A. Meiosis para producir un cigoto
B. Reproducción asexual C. Reproducción sexual D. Formación de gametos Bibliografía Clarck, M.S. & W.J. Wall. 1996. Chromosomes. The complex code. Ed. Chapman & Hall. London. Darlington, C.D. 1965 Recent advances in cytology. J. and A. Churchill Ltd. London. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. 34
Trabajo Práctico Nº 4 PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA HERENCIA MENDELIANA La ley de la segregación. Al cruzar entre sí dos variedades o razas puras de una misma especie que difieren en un único par de caracteres, la primera generación o filial 1 (F1) es uniforme en cuanto a su genotipo y fenotipo. La segunda generación o F2 no es uniforme, sino que se observan 2 o 3 fenotipos diferentes, según se trate de caracteres con dominancia completa o con codominancia. Desde el punto de vista genético, cada individuo tiene estructura doble, debido a que lleva en sus células dos series de factores: una aportada por la madre por medio del gameto femenino y otra por el padre por medio del gameto masculino. Entonces para cada par de factores que se considere, los gametos llevan uno solo de ellos (dosis simple o n) y las células somáticas dos (dosis doble o 2n). En la arveja (Pisum sativum) por ejemplo, un individuo puro para el carácter de flor roja se habría originado seguramente de un gameto femenino con un factor para rojo. Análogamente, un individuo de flor blanca habrá sido originado por un gameto femenino fecundado por un gameto masculino llevando ambos un factor para el color blanco. Si se cruza una planta de flores blancas por otra de flor roja pura, la descendencia inmediata será de flores rojas. Se deduce que el factor para rojo es dominante con respecto al factor para color blanco, siendo éste recesivo con respecto a aquel. Los genes dominantes se representan con la letra correspondiente mayúscula y los recesivos con la misma letra pero minúscula. Un individuo puro para el carácter de flor roja (homocigota) lleva en sus células somáticas dos factores R (RR), pues proviene de un gameto femenino R fecundada por un masculino R. Análogamente, un individuo de flores blancas tendrá la constitución rr. La constitución genética de un individuo para un carácter o característica en estudio (Ej.: RR, Rr, rr) se llama genotipo, en tanto que las características apreciables por los sentidos que distinguen a los individuos, se llama fenotipo (genotipo + ambiente). La segregación independiente. Cuando se efectúa el cruzamiento entre individuos que difieren en dos pares de factores, partiendo de líneas homocigotas dominantes y recesivas respectivamente, la F1 obtenida será homogénea en cuanto a su fenotipo y genotipo. Sin embargo, al realizar el cruzamiento F1 x F1, se obtiene una F2 en la que segregan los diferentes factores, obteniéndose una proporción fenotípica de 9:3:3:1. Si consideramos el cruzamiento de una planta pura homocigota para los caracteres semilla lisa (L) y cotiledones amarillos (A), por otra de semilla rugosa (l) y cotiledones verdes (a), se obtiene: P: AALL X aall Genotipo: Heterocigota. Fenotipo: Lisa y Amarilla. G: AL al F1: AaLl 35
Los gametos de la madre que intervienen en éste cruzamiento son de una sola clase AL, ya que el individuo es homocigota (AALL). Si hubiésemos tomado éstos genes por separado, por ejemplo AA, los gametos serían A, por lo tanto, el gameto debe llevar la mitad de cada par de factores existentes en el padre. Siendo el genotipo de la F1, AaLl, para obtener los gametos empleamos el método corto o dicotómico. Los genes citados se hallan en cromosomas diferentes, por lo cual cada gen de un par puede combinarse para formar gametos con cada uno del segundo par, es decir: Par Aa Par Ll Gametos L = AL A l = Al L = aL a l = al Para la obtención de la F2 hacemos uso de métodos que nos ayudan a obtener las combinaciones posibles entre los factores que actúan en forma independiente: 1. Método del cuadrado de Punnett o tablero de ajedrez. 2. Método algebraico 3. Método corto o dicotómico. 1. Método del cuadrado de Punnett Cada uno de los individuos de la F1 da los cuatro gametos (G) detalladas anteriormente. G AL Al aL al AL AALL AALl AaLL AaLl Al AALl AAll AaLl Aall aL AaLL AaLl aaLL aaLl al AaLl Aall aaLl aall 36
2. Método algebraico Este fue el método utilizado por Mendel en sus experimentos. Por ejemplo, si cruzamos Aa x Ll, para hallar el fenotipo se tiene en cuenta la frecuencia de los fenotipos de la F2 para monohíbridos (3:1). 1º par: 3 A_ : 1 aa 2º par: 3 L_ : 1 ll 9 A_L_ : 3 A_ll : 3 aaL_ : 1 aall Para hallar el genotipo se tienen en cuenta las frecuencias de los genotipos en la F2 para monohíbridos (1:2:1). 1º par: 1 AA : 2 Aa : 1 aa 2º par: 1 LL : 2 Ll : 1 ll 1AALL : 2AaLL : 1aaLL : 2AA Ll : 4AaLl : 2aaLl : 1AAll : 2Aall : 1aall 3. Método dicotómico Para hallar el fenotipo hay que recordar las frecuencias de fenotipos en F2 para monohíbridos (3:1). Par Aa Par Ll Frecuencias Genotipos 3 L_ = 9 A_L_ 3 A_ 1 ll = 3 A_ll 3 L_ = 3 aaL_ 1 aa 1 ll = 1 aall 37
Para hallar el genotipo hay que basarse en la frecuencia de genotipos en F2 para monohíbridos (1:2:1). Par Aa Par Ll Frecuencias Genotipos 1 LL = 1 AALL 1 AA 2 Ll = 2 AALl 1 ll = 1 AAll 1 LL = 2 AaLL 2 Aa 2 Ll = 4 AaLl 1 ll = 2 Aall 1 LL = 1 aaLL 1 aa 2 Ll = 2 aaLl 1 ll = 1 aall Retrocruza. La retrocruza es el cruzamiento de uno de los descendientes con alguno de los progenitores. Retrocruza por el padre dominante: (método dicotómico) Cruzamiento: AaLl × AALL Par Ll Genotipos Fenotipos Par Aa 1 LL = 1 AALL = amarillo‐lisa 1 AA 1 Ll = 1 AALl = amarillo‐lisa 1 LL = 1 AaLL = amarillo‐lisa 1 Aa 1 Ll = 1AaLl = amarillo‐lisa 38
Retrocruza por el padre recesivo (cruza de prueba): Cruzamiento: AaLl × aall Par Aa Par Ll Genotipos Fenotipos 1 Ll = 1 AaLl = amarillo‐lisa 1 Aa 1 ll = 1 Aall = amarillo‐rugosa 1 Ll = 1 aaLl = verde‐lisa 1 aa 1 ll = 1 aall = verde rugosa Segregación en polihíbridos. Cuando se efectúa el cruzamiento entre individuos que difieren en tres o más pares de genes, partiendo de líneas homocigotas dominantes y recesivas respectivamente, la F1 obtenida será homogénea en cuanto a su fenotipo y genotipo. Al realizar el cruzamiento F1 x F1, se obtiene una F2 en la que segregan los diferentes factores, obteniéndose las siguientes proporciones fenotípicas: siguiendo con la arveja, cruzaremos individuos homocigotas para tallo alto (T), cotiledones amarillos (A) y semillas lisas (L), por tallo enano (t), cotiledones verdes (a) y semillas rugosas (l). P: TTAALL × ttaall G: TAL tal TtAaLl Genotipo: heterocigota F1: Fenotipo: alta, amarilla y lisa. F2 Fenotipos 3 L_ = 27 T_ A_ L_ 3 A_ 1 ll = 9 T_ A_ ll 3 T_ 3 L_ = 9 T_ aa L_ 1 aa 1 ll = 3 T_ aa ll 39
1 tt F2 1 TT 2 Tt 3 A_ 3 L_ = 9 tt A_ L_ 1 ll = 3 tt A_ ll 1 aa 3 L_ = 3 tt aa L_ 1 ll = 1 tt aa ll Total = 64 individuos Genotipos 1 AA 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 1 2 1 TT AA LL TT AA Ll TT AA ll 2 Aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 2 4 2 TT Aa LL TT Aa Ll TT Aa ll 1 aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 1 2 1 TT aa LL TT aa Ll TT aa ll 1 AA 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 2 4 2 Tt AA LL Tt AA Ll Tt AA ll 2 Aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 4 8 4 Tt Aa LL Tt Aa Ll Tt Aa ll 1 aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 2 4 2 Tt aa LL Tt aa Ll Tt aa ll 40
1 tt 1 AA 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 1 2 1 tt AA LL tt AA Ll tt AA ll 2 Aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 2 4 2 tt Aa LL tt Aa Ll tt Aa ll 1 aa 1 LL 2 Ll 1 ll = = = 1 2 1 tt aa LL tt aa Ll tt aa ll 64 individuos Total = Objetivos •
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Diferenciar los términos fenotipo y genotipo. Comprender el mecanismo de transmisión de los caracteres. Entender la forma de obtención de los gametos y de la descendencia. Comprender el mecanismo de segregación independiente de los genes. Adquirir destreza en el cálculo de frecuencias fenotípicas y genotípicas de la descendencia de individuos que difieren en tres o más pares de genes. • Conocer y aplicar los diferentes métodos para obtener los fenotipos y genotipos de la descendencia. Materiales 9 Calculadora científica. 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Sinnott, E.W., Dunn, L.C. & T. Dobzhansky. 1961. Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona. Stansfield, W.D. 1971. Teoría y problemas de Genética. Ed. McGraw‐Hill. México. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 41
Trabajo Práctico Nº 5 PROBABILIDADES La probabilidad se refiere a la posibilidad de que un resultado específico de un evento ocurra en una situación particular (con respecto a todos los resultados posibles del suceso) y se calcula como el cociente del resultado del suceso entre el número total de maneras en las que todos los resultados del suceso pueden ocurrir. Los límites de probabilidad van de 0 (si el evento nunca ocurre) a 1 (si siempre ocurre). Si dos o mas eventos son independientes, la probabilidad de que ocurran juntos es igual al producto de sus probabilidades por separado. Cuando se trabaja con probabilidades, los resultados se someten a pruebas de significancia estadística, siendo una de las más usadas la prueba de ji cuadrado (X2). Esta prueba es un mecanismo por el cual las desviaciones a partir de una proporción hipotética se reducen a un solo valor con base en el tamaño de la muestra. Esto permite determinar la probabilidad de que una suma determinada de desviaciones suceda al azar. Esta prueba toma en cuenta el tamaño de la muestra y las desviaciones con respecto a la proporción esperada y se calcula mediante la fórmula: X2 = (O ‐ E)2 O: valor observado E E: valor esperado Donde (O‐E) es la desviación entre cada valor de clase observado y cada valor de clase esperado. Una vez obtenido el valor de X2, se observa el grado de significancia en una tabla de doble entrada: Tabla de Ji cuadrado. R.A:Fisher y F. Yates.1943
Grados
de
Libertad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
15
20
25
30
p = 0,99
p = 0,95
p = 0,80
p = 0,50 p = 0,20
0,000157
0,02
0,115
0,297
0,554
0,872
0,00393
0,103
0,325
0,711
1,145
1,635
0,0642
0,446
1,005
1,649
2,343
3,07
0,455
1,386
2,366
3,357
4,351
5,348
1,239
1,646
2,088
2,558
5,229
8,26
11,524
14,953
2,167
2,733
3,325
3,94
7,261
10,851
14,611
18,493
3,822
4,594
5,38
6,179
10,307
14,578
18,94
23,364
6,346
7,344
8,343
9,342
14,339
19,337
24,337
29,336
p = 0,05
p = 0,01
1,642
3,219
4,642
5,989
7,289
8,558
3,841
5,991
7,815
9,488
11,07
12,592
6,635
9,21
11,345
13,277
15,086
16,812
9,803
11,03
12,242
13,442
19,311
25,038
30,675
36,25
14,067
15,507
16,919
18,307
24,996
31,41
37,652
43,773
18,475
20,09
21,666
23,209
30,578
37,566
44,314
50,892
42
Los grados de libertad se calculan por medio de la fórmula: GL = n – 1 Siendo n el número de clases con que se ha trabajado. El valor p es el valor de probabilidad por debajo del cual las diferencias entre observado y calculado se dan al azar. En biología por lo general se trabaja con un p ≥0.05. Si el valor de X2 cae por debajo del valor de P para un determinado grado de libertad, quiere decir que las diferencias no son significativas y que por lo tanto, esas pequeñas diferencias se dan por puro azar. En general, cuanto más elevado es el valor de X2, menor es la posibilidad de que las diferencias se deban al azar. Cuando el resultado de X2 es significativo, la diferencia no se dio al azar, sino por otros factores debido a un error experimental o a que hay una correlación entre las clases como por ejemplo el caso de los genes ligados. Objetivos • Comprender el cálculo de probabilidades. • Comprender la importancia del método de X2. • Adquirir destreza en el cálculo de frecuencias, probabilidades y su significancia estadística Materiales 9 Calculadora científica 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Sinnott, E.W., Dunn, L.C. & T. Dobzhansky. 1961. Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona. Stansfield, W.D. 1971. Teoría y problemas de Genética. Ed. McGraw‐Hill. México. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 43
Trabajo Práctico N° 6 EXTENSIONES DEL MENDELISMO Hasta ahora se consideraron los fenómenos genéticos basados en los experimentos de Mendel. En este trabajo práctico se estudiarán las extensiones del mendelismo (o mendelismo complejo), es decir, los sistemas genéticos que no cumplen o que enmascaran los conceptos de la genética mendeliana. Alelos múltiples. La mayoría de los sistemas génicos analizados hasta ahora consisten en dos alelos. Por ejemplo, en los guisantes de Mendel un alelo codifica semillas lisas y el otro alelo codifica semillas rugosas. Pero como se sabe, los genes pueden mutar a formas distintas dentro del mismo locus. Cada cambio tiene el potencial de dar lugar a un alelo diferente. Por consiguiente, para cualquier gen, el número de alelos presentes en los individuos de una población no tiene por qué estar limitado a dos. Cuando un mismo gen presenta más de dos estados alternativos, es decir más de dos alelos, el modo de herencia se denomina alelismo múltiple. Los alelos múltiples pueden también denominarse series alélicas, simbolizando cada alelo como A1, A2, A3,.... An , por ejemplo. En los organismos diploides, generalmente, cada gen tiene solamente dos alelos, dado que los cromosomas se encuentran de a pares y cada cromosoma homólogo lleva un alelo. Estos sistemas también se pueden presentar en los organismos haploides, pero en lugar de tener dos alelos a la vez como en los diploides, hay solo una copia de cada gen. La herencia de las características codificadas por alelos múltiples no difiere de la herencia de las codificadas por dos alelos, salvo que es posible una mayor variedad de genotipos y fenotipos. Uno de los casos más conocidos de alelos múltiples es el color del pelaje de los conejos, para los cuales se conocen varios genes: agutí, chinchilla, himalaya y albino. Estos genes pueden combinarse dando diferentes genotipos y fenotipos con respecto al color de pelo. El orden de dominancia de un alelo sobre el otro es el siguiente: C: agutí > cch: chinchilla > ch: himalaya > c: albino Esquema extraído de Oliver (1977). El primer sistema de alelos múltiples que se encontró en el hombre fue el sistema ABO, el cual consiste en tres alelos diferentes: IA, IB e i. Los alelos IA e IB son codominantes entre sí, pero dominantes con respecto al alelo i. Estos tres alelos se pueden combinar para formar cuatro fenotipos diferentes. El grupo sanguíneo A se presenta cuando un individuo es homocigota para el gen IA (IAIA) o bien cuando es heterocigota combinado con i (IAi), el grupo B se produce en presencia homocigota del 44
gen IB (IBIB) o bien cuando es heterocigota combinado con i (IBi), mientras que el fenotipo AB se presenta cuando un individuo es heterocigota para los alelos IAIB. El fenotipo restante, el grupo O, se produce por la presencia del alelo i en homocigosis (ii). Las personas que presentan un determinado antígeno sanguíneo tienen anticuerpos contra los restantes antígenos. Debido a ello se producen reacciones al realizar una transfusión de sangre a una persona. Grupo Antígeno Anticuerpo Genotipo Reacción con suero A B AB O A A anti B IAIA o IAi – + ± – B B anti A IBIB o IBi + – ± – AB AB – IAIB – – – – O – anti A y anti B ii + + + – Por las reacciones que se producen, a las personas con grupo sanguíneo O (ausencia de antígenos A y B) se las denomina dadores universales, mientras que a las personas con sangre AB (ausencia de anticuerpos A y B) se las llama receptores universales. Actualmente se sabe que los antígenos sanguíneos son glucolípidos ubicados en la membrana plasmática de los eritrocitos. Los grupos A y B difieren en las cadenas de oligosacáridos de los glucolípidos, mientras que las personas con sangre del grupo O carecen de este glucolípido. Interacción génica. Se denomina interacción génica a la influencia mutua entre genes no alélicos en la producción de un fenotipo determinado. Debido a tal interacción, las proporciones mendelianas típicas, tales como 3:1 o 9:3:3:1, no se presentan en todos los cruzamientos. En base a esto, las interacciones pueden clasificarse en dos categorías: sin modificación de las proporciones mendelianas y con modificación de las proporciones. El concepto de interacción génica no significa que dos o más genes, o sus productos, necesariamente interactúen directamente para dar lugar a un fenotipo concreto; sino que implica que la función celular de numerosos productos génicos está relacionada con el desarrollo de un fenotipo común. 1. Sin variación de las proporciones mendelianas. Se obtiene en la F2 una proporción 9:3:3:1, pero con la aparición de nuevos fenotipos que no estaban en los parentales ni en la F1. El ejemplo más conocido es la herencia del tipo de cresta en las gallinas, en las cuales existen cuatro tipos diferentes de crestas llamados: arveja, roseta, sencilla y nuez. P: arveja × roseta RR pp rr PP roseta
arveja
nuez
sencilla
45
F1: F2: nuez Rr Pp 9 nuez : 3 arveja : 3 roseta : 1 sencilla R_ P_ R_ pp rr P_ rr pp Estos dos pares actúan en la manifestación de un solo carácter. La cresta nuez depende de la presencia de los genes R y P, uno solo de éstos genes R produce cresta arveja y P produce roseta, los dos alelos recesivos en conjunto producen sencilla. Hay interacción de factores cuando 2 o más pares de genes actúan en la manifestación de un solo carácter. 2. Con modificación de las proporciones mendelianas. La modificación de las proporciones ocurre cuando un gen enmascara o suprime la manifestación del otro. Este tipo de interacción no es recíproca y se denomina epistasis. Las epistasis se pueden clasificar como sigue: a) Epistasis simple dominante. Es cuando el alelo dominante de un par de genes suprime o enmascara la manifestación del otro par. Aquí las proporciones fenotípicas observadas en la F2 son 12:3:1. Por ejemplo, en el sorgo el color de la semilla está determinado por un par de genes que interactúan de tal forma que: B produce color pardo y R produce color amarillo; pero B es epistático dominante, dando: P BB RR x bb rr pardo blanco F1 Bb Rr pardo F2: 9 B_R_Pardos : 3 B_rr Pardos : 3 bbR_ Amarillos : 1 bbrr Blanco 12 Pardos 3 Amarillos 1 Blanco b) Epistasis simple recesiva. Esto ocurre cuando un doble recesivo de un par de genes es capaz de enmascarar la manifestación fenotípica del otro par. Las frecuencias observadas en la F2 son 9:3:4. Uno de los ejemplos más conocidos es el pelaje de muchos animales como las ratas. En las ratas la presencia de color es determinada por el alelo C, en tanto que el alelo recesivo c causa la ausencia de color y por lo tanto las ratas son albinas. El color es determinado por otro par de genes, el alelo R produce pelaje negro, mientras que r causa pelaje color crema. Al cruzar dos individuos homocigotas se obtiene una F1 en donde todas las ratas son negras, pero en la F2 se obtienen 9 negros, 3 crema y 4 albinos. En este caso, la presencia del alelo c en homocigosis enmascara la presencia de los alelos R y r que determinan el color negro o crema, respectivamente. 46
P F1 F2 negro CC RR 9 C_ A_ negros x cc rr albino Cc Aa negro 3 C_ aa crema 3 cc A_ albinos 1 cc aa albino c) Interacción con inhibidor o epistasis doble dominante‐recesiva. En este caso, la epistasis dominante y la epistasis recesiva se presentan en un mismo cruzamiento, obteniéndose en la F2 una proporción fenotípica de 13:3. El alelo dominante de un par de genes y el recesivo de la otra suprimen la acción de los otros miembros. Se llama inhibidor a todo factor dominante que, por su presencia, impide la manifestación de otro factor dominante. Por ejemplo en las gallinas la raza Leghorn el color blanco se debe a la presencia del gen inhibidor I, que es dominante e inhibe la expresión de los genes del color. Las razas Wyandotte y Plymounth Rock son blancas por la presencia de un gen recesivo que condiciona la ausencia del cromógeno necesario para color. Las aves homocigotas recesivas cc son blancas aunque lleven genes para color, porque estos genes no pueden expresarse en ausencia del cromógeno. Si cruzamos una Leghorn blanca por una Wyandotte blanca toda la F1 será blanca porque heredan el gen I del progenitor Leghorn. En la F2, sin embargo, aparecerán individuos con color en una proporción característica. P F1 F2 3 I_ 1 ii Leghorn II CC blanca x Ii Cc blancas 3 C_ 9 II C_ blancas (por I) 1 cc 3 I_ cc blancas (por I) 3 C_ 3 ii C_ coloreadas (por C) 1 cc 1 ii cc blancas (por la presencia de cc) ii cc Wyandotte blanca En la F2 se puede ver que doce de las 16 heredan el gen dominante I y por lo tanto serán blancas. Las otras cuatro no lo tienen pero una de ellas será blanca debido a la condición homocigótica del gen recesivo epistático c. Solamente tres de las 16 aves tienen el genotipo necesario para la producción de color (iiCC). d) Genes recesivos duplicados o epistasis doble recesiva. En la epistasis doble recesiva cada uno de los pares de genes contiene un gen epistático recesivo. Se los llama genes recesivos duplicados porque cualquiera de los dos pares en estado recesivo, separados o juntos, manifiestan el mismo carácter produciendo una 47
proporción fenotípica de 9: 7 en la F2. Por ejemplo, en la margarita común, las flores pueden presentar el centro amarillo o púrpura. El color púrpura se produce debido a la acción complementaria de los alelos dominantes de dos pares de genes; al faltar alguno de éstos alelos, se altera el proceso normal de síntesis del pigmento y se producen flores amarillas. P PP rr x pp RR amarillo amarillo F1 PpRr púrpura F2 3 R_ 9 P_ R_ púrpura 3 P_ 1 rr 3 P_ rr amarillo 3 R_ 3 pp R_ amarillo 1 pp 1 rr 1 pp rr amarillo e) Genes dominantes duplicados o epistasis doble dominante. En la epistasis doble dominante cada par de genes tiene un alelo epistático dominante. En este caso, se los llama duplicados porque cualquiera de los dos dominantes o los dos juntos, son capaces de producir un fenotipo determinante. Por ejemplo, en las gallinas existen razas con patas emplumadas y razas con patas sin plumas. La raza Black Langshans tiene plumas en las patas, mientras que la raza Buff Rock carece de ellas. Un cruzamiento entre ambas razas produce una F1 con patas emplumadas y al cruzar la F1 entre si se obtiene una F2 con una proporción fenotípica de 15 emplumadas y 1 sin plumas. P FF SS x ff ss emplumadas sin plumas F1 Ff Ss emplumadas F2 3 S_ 9 F_S_ emplumadas 3 F_ 1 ss 3 F_ss emplumadas 3 S_ 3 ffS_ emplumadas 1 ff 1 ss 1 ffss sin plumas 48
f) Genes duplicados con efecto acumulativo. Son genes que producen un efecto individual semejante, pero diferente al de los dos conjuntos. Por ejemplo, los cerdos Duroc Jersey generalmente tienen el pelaje de color rojo, pero existe una mutación de color arena que es recesiva con respecto al rojo, y un color blanco o albino producido por el doble homocigota recesivo. Al cruzar dos cerdos color arena, la F1 es roja, pero en la F2 se obtiene una descendencia de 9 rojo, 6 arena y 1 blanco. P F1 F2 3 R_ 1 rr rr SS arena x RR ss arena Rr Ss rojo 3 S_ 9 R_ S_ rojo 1 ss 3 R_ ss arena 3 S_ 3 rr S_ arena 1 ss 1 rr ss blanco Genes letales. Los genes que porta un organismo determinan no solo los caracteres visibles sino, además, otras características como la viabilidad. Los numerosos estudios realizados en genética de la transmisión han demostrado que los organismos que portan ciertos genes o combinaciones de genes tienen una posición desventajosa con respecto a otros que no los poseen. Por ejemplo, en Drosophila se sabe que las moscas con ojos blancos y alas vestigiales tienen una menor viabilidad que el fenotipo salvaje. Estos efectos fisiológicos perjudiciales están asociados con los genes que intervienen, en este caso w y vg. Muchos genes no tienen efectos en la apariencia de los organismos pero influyen en la viabilidad del organismo de algún modo. Otros genes tienen efectos tan graves que hacen imposible la vida del organismo, en este caso se habla de genes letales. Cuando se descubrió la forma en que se heredan los caracteres era difícil de concebir que existieran genes capaces de causarle la muerte a un organismo. Sin embargo, en 1905, el genetista francés Cuenot informó sobre la herencia del gen que determina el color Amarillo de las ratas que no se ajustaba a las proporciones mendelianas típicas. El gen Amarillo parecía tener un efecto dominante, pero sin embargo no se comportaba como una cepa pura. Al cruzar dos ratas amarillas entre sí siempre se producen individuos amarillos y salvajes o agutí. Al retrocruzar los individuos amarillos con los parentales amarillos, Cuenot encontró que todas las ratas eran heterocigotas para el gen Amarillo y que no podían encontrarse amarillos homocigotas. En un principio Cuenot supuso que los espermatozoides portadores de Amarillo no podían penetrar los óvulos de otros portadores del gen amarillo. Sin embargo, tiempo después Castle y Little demostraron que los homocigotas amarillos se formaban pero que morían en el útero durante el embarazo. Según ellos, el gen 49
amarillo se comportaba como dominante, pero a la vez era un letal recesivo, de manera que los cruzamientos entre ratas amarillas siempre producían 2/3 amarillo y 1/3 agutí en lugar de ¾ amarillo y ¼ agutí como cabría esperar. La progenie amarilla faltante eran los homocigotas amarillos inviables. Desde entonces se han encontrado numerosos casos y ejemplos de genes letales que tienen un efecto fenotípico dominante en el heterocigota pero que son letales en condición homocigota. El gen Dexter del ganado vacuno produce terneros con patas cortas llamados bulldog en condición heterocigota pero es letal en homocigosis y los terneros generalmente mueren antes de nacer. En el hombre, la aparición de gran número de lunares es causada por el gen de Xeroderma pigmentosum y también es letal cuando el gen está en condición homocigota. Sin embargo, la letalidad no está limitada a genes con efecto fenotípico dominante sino que también puede ser causada por genes recesivos. En estos casos, en condición heterocigótica no afectan la viabilidad del organismo y no producen un efecto fenotípico observable, pero en homocigosis producen cambios notables y muerte. En ambos casos, ya sea si el gen tiene efecto fenotípico dominante o bien recesivo, se lo denomina letal recesivo debido a que su letalidad depende de la presencia en combinación homocigótica. Los genes letales dominantes son genes cuyo efecto letal se presenta también en los individuos heterocigotas. El caso mejor conocido es el gen Epiloia en el hombre, que en una sola dosis determina defectos mentales, anormalidades corporales y tumores, de manera que los individuos mueren jóvenes. Una característica de los genes letales es que pueden presentar variación en cuanto a su penetración, de modo que no todos los individuos genotípicamente afectados sean fenotípicamente letales. Algunos letales tienen un alto grado de penetración y expresión de manera que muy pocos individuos o más generalmente ninguno pasa el estado embrionario o infantil. En otros casos en cambio, algunos genes permiten la supervivencia de una mayor proporción de genotipos afectados. Según el grado de penetración de los genes letales, se pueden clasificar en: • letales: producen la muerte de todos los individuos que llevan ese gen. • semiletales: cuando producen la muerte de más del 50% de los individuos. • subvitales: producen una proporción de muertes entre el 10% y el 50%. Los genes letales actúan, generalmente, en un estado temprano del desarrollo (cigóticos), pero también pueden producir la muerte en los gametos (gaméticos). Los genes letales pueden tener un efecto fenotípico dominante o recesivo. Si bien el tipo recesivo es el más común en las poblaciones naturales, se conocen algunos casos de dominantes. Un ejemplo de letales dominantes se da en las gallinas de la raza creeper, que se caracterizan por tener alas y patas cortas. Cuando las creeper se cruzan con gallinas normales, se obtiene siempre igual proporción de normales y creeper, pero cuando se cruzan dos creeper, las proporciones obtenidas son diferentes: 50
P: F1: creeper Cc x creeper Cc 1 CC : 2 Cc : 1 cc muere creeper normal Los casos de genes letales recesivos son bastantes numerosos. Uno de los más típicos es el albinismo en las plantas. En este caso mueren los individuos homocigotas, pero los heterocigotas son completamente normales. P: Aa x Aa normal normal F1: 1AA : 2 Aa : 1aa normal normal muere Objetivos • Reconocer la presencia de alelos múltiples en la determinación de un carácter determinado y comprender su forma de herencia. • Reconocer los distintos tipos de interacciones génicas e identificar las diferentes desviaciones fenotípicas que se presentan en la F2 • Reconocer los tipos de genes letales y observar las desviaciones respecto a las proporciones mendelianas clásicas. Materiales 9 Calculadora científica. 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resolver los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Klug, W.S. & M.R. Cummings. 2006. Conceptos de Genética, 8ª ed. Pearson Educación. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Pierce, B.A. 2010. Genética. Un enfoque conceptual. 3ª edición. Editorial Médica Panamericana. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona.
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Trabajo Práctico Nº 7 GENÉTICA DEL SEXO Y HERENCIA EN RELACIÓN CON EL SEXO Los organismos con sexos separados tienen dos tipos de cromosomas: los autosomas y los cromosomas sexuales o alosomas. Según la cantidad de cromosomas implicados en la determinación del sexo y en cual sexo se encuentran presentes, existen diversos tipos de sistemas. Sistemas simples: presentan solamente un par de cromosomas sexuales. Sistema XX/XY: está presente en el hombre, en la mayoría de los mamíferos y en Drosophila. El hombre tiene 2n=46 cromosomas, de los cuales 44 son autosomas y 2 son sexuales. Aquí las hembras son homogaméticas (XX) y los machos heterogaméticos (XY). Sistema XX/XO: se halla presente en algunos insectos como las langostas (ortópteros) y las chinches (hemípteros). En éstos la hembra tiene XX (sexo homogamético) mientras que el macho posee un solo cromosoma X (sexo heterogamético). Sistema ZZ/ZW: se observa en las aves y algunas mariposas (lepidópteros). La hembra es heterogamética ZW y el macho es homogamético ZZ. Sistema ZZ/ZO: se encuentra en algunas mariposas y otros insectos. La hembra es heterogamética ZO y el macho es homogamético ZZ. Sistemas múltiples: presentan 3 o más cromosomas sexuales presentes. Sistema X1X1X2X2/X1X2Y: está presente en algunos mamíferos, las hembras son homogaméticas (X1X1X2X2) y los machos heterogaméticos (X1X2Y). Sistema X1X1X2X2/X1X2O: se halla presente en algunas arañas. En éstos la hembra tiene X1X1X2X2 (sexo homogamético) mientras que el macho posee X1X2O (sexo heterogamético). Sistema ZW1W2/ZZ: se observa en las serpientes; la hembra es heterogamética ZW1W2 y el macho es homogamético ZZ. Sistema Z1Z2W/Z1Z1Z2Z2: aquí la hembra es heterogamética Z1Z2W y el macho es homogamético Z1Z1Z2Z2. Sistema haplodiploide: en abejas, avispas y hormigas (himenópteros). En el caso de las abejas, la hembra tiene 2n=32 (diploide) y el macho 2n=16 (haploide). 52
Herencia ligada al sexo. La relación entre la determinación del sexo y la presencia de otros caracteres no sexuales fue establecida por primera vez por Morgan en Drosophila melanogaster. Cualquier gen localizado en el cromosoma X o en su análogo Z (en las aves) se dice que está ligado al sexo. El primer gen ligado al sexo encontrado fue un mutante recesivo que determina el color blanco de ojos (w). En un cultivo de Drosophila apareció espontáneamente un macho mutante con ojos blancos y se realizaron los siguientes cruzamientos: P: ♀ ojos rojos x ♂ ojos blancos ♀ y ♂ ojos rojos F1: F2: ♂ ojos rojos : ♂ ojos blancos : ♀ ojos rojos En la F2 se encontraban ausentes las hembras con ojos blancos que deberían aparecer. Sin embargo, si se realizaba una retrocruza entre las hembras de ojos rojos de la F1 con los machos parentales de ojos blancos se obtenían ojos blancos en las hembras. Debido a que el macho de Drosophila tiene un solo cromosoma X, el carácter ojos blancos (w) se expresa a pesar de ser recesivo (el Y no tiene ningún gen para el color de ojos). Considerando los genotipos, los resultados obtenidos por Morgan se pueden explicar de la siguiente manera: P: ♀ WW x ♂ wY rojo blanco F1: ♂ WY : ♀ Ww rojo rojo ♂ WY : ♂ wY : ♀ WW : ♀ Ww F2: rojo blanco rojo rojo Objetivos • Comprender los sistemas de determinación cromosómica del sexo. • Comprender el mecanismo de herencia de un carácter ligado al sexo. • Observar y determinar las diferencias en la segregación de un gen ligado al sexo respecto a un gen autosómico. Materiales 9 Calculadora científica 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. 53
Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1988. Genética. 4º edición. Ed. Agesa, Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Sinnott, E.W., Dunn, L.C. & T. Dobzhansky. 1961. Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona. Stansfield, W.D. 1971. Teoría y problemas de Genética. Ed. McGraw‐Hill. México. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 54
Trabajo Práctico Nº 8 LIGAMIENTO, RECOMBINACIÓN Y MAPEO DE LOS GENES Cuando Sutton en 1903 relacionó por primera vez los factores mendelianos con los cromosomas, supuso que probablemente el número de cromosomas de todos los organismos sería inferior a la cantidad de factores mendelianos. Por lo tanto cabría esperar que los genes situados en un mismo cromosoma tendieran a transmitirse en grupo o sea como si estuvieran ligados en una sola unidad. Las primeras pruebas de la ocurrencia de ligamiento fueron encontradas comparando las proporciones fenotípicas esperadas para la transmisión independiente con las frecuencias observadas. Como sabemos cuando hay transmisión independiente de genes, en la F2 se espera una proporción fenotípica de 9 A_B_: 3A_bb; 3 aaB_: 1 aabb. El primer ejemplo de una desviación de estas proporciones fue encontrado por Bateson y Punnett en 1906 cruzando diferentes variedades de guisantes. Ellos encontraron que al cruzar variedades con diferente color de flor y distinta forma de fruto (AABB x aabb), en la F2 se obtenía una proporción muy alta de individuos con los fenotipos parentales (A_B_ y aabb) y una cantidad disminuida de combinaciones nuevas (A_bb y aaB_). Parecía como si las variedades paternas originales AABB y aabb produjesen gametos en los cuales los genes AB y ab permanecían asociados en forma permanente a lo largo de las generaciones. La posibilidad de éstos genes de ir a gametos separados, está dada por la frecuencia de recombinación que exista entre los genes, y esta depende a su vez de la distancia física a la que se encuentren. Para detectar la diferencia entre la transmisión independiente y el ligamiento de dos pares de genes el método más sencillo consiste en comparar las cantidades de individuos de cada clase fenotípica observada con las cantidades esperadas según la transmisión independiente. La diferencia entre ambas cantidades se puede comprobar mediante una prueba de X2. Por ejemplo, el apareamiento de un heterocigota AaBb con una homocigota recesivo aabb daría cuatro tipos de descendientes: AaBb, Aabb, aaBb y aabb. Si la transmisión de los genes a y b fuera independiente, se esperaría ¼ o 25% de cada clase y cualquier distorsión con respecto a estas proporciones se pueden detectar con una prueba de X2. Por ejemplo se cruzan dos individuos AABB x aabb y a la F1 heterocigota se le hace una cruza prueba dando estos resultados: AaBb Aabb aaBb aabb total Observado 140 38 32 150 360 Esperado 90 90 90 90 360 La prueba de X2 para tres grados de libertad da un total de 135,19 lo cual indica que las desviaciones observadas son significativamente diferentes a las esperadas. Para descartar una distribución distorsionada de los genes a y b individuales se puede calcular la X2 de cada uno de ellos. Mapas genéticos. Cuando en 1911 Morgan descubrió el ligamiento en Drosophila supuso que probablemente existía alguna relación entre la frecuencia de recombinación de los genes ligados y la distancia lineal existente entre los genes en el 55
cromosoma. Numerosos experimentos, principalmente en Drosophila demostraron que esto realmente es así. El grado de separación entre los genes puede establecerse en forma relativa a través de su frecuencia de recombinación. Mediante esta técnica puede determinarse el orden y la distancia relativa entre los genes y construirse un mapa de ligamiento o mapa genético. Si el orden de tres genes es A‐B‐C y se utiliza la frecuencia de recombinación para estimar las distancias, la suma de las distancias entre A‐B y B‐C será igual a la distancia entre A‐C. Esto se debe a que la frecuencia de recombinación es una función de la distancia entre los genes. Si dos genes se encuentran muy separados en el cromosoma, la probabilidad de recombinación será mayor que si estos genes se encuentran ubicados cerca. Este hecho conduce a la posibilidad de confeccionar mapas genéticos, que son diagramas que muestran la posición relativa de los genes en los cromosomas. Diagrama teórico de una experiencia para mapas genéticos Se utilizan dos cepas de D. melanogaster, una salvaje y otra mutante para tres genes recesivos: white (ojos blancos), cut (alas cortadas) y forked (quetas retorcidas). a b c + + + Padres X a b c F1 Cruza + + + a b c Prueba X a b c Suponiendo que el orden de los genes en el cromosoma es a ‐ b ‐ c, se pueden distinguir dos regiones. a b c Región I II + + + Tipos progenitores Hembras Machos a b c a b c a b c 56
a b c + + + + + + Crossing‐over en Región I (SI) a b c a + + a + + a b c + b c + b c Crossing‐over en Región II (SII) a b c a b + a b + a b c + + c + + c Crossing‐over en Región I‐II (DI‐II) a b c + b + + b + a b c a + c a + c Si el orden de los loci en el cromosoma es a ‐ b ‐ c, el ligamiento entre los loci a y b puede determinarse dividiendo la suma de clases que recombinan en la región I (SI + D1 ‐ II) por el número total de individuos analizados. De la misma manera la distancia 57
entre b y c se determina sumando SII + DI ‐II y dividiendo por el número total de individuos analizados. La distancia entre a y c será: SI + SII + 2 DI ‐ II = TOTAL Para determinar el orden de los tres loci se debe tener en cuenta lo siguiente: 1) Las clases progenitoras difieren de las clases con doble "cross‐over" por el gen que está en el centro. 2) Las clases que no han experimentado "cross‐over" son siempre muy numerosas, mientras que las que tienen doble "cross‐over" son las menos numerosas. Objetivos •
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Comprender el fenómeno de ligamiento. Determinar la frecuencia de recombinación entre dos genes determinados. Establecer el grado de ligamiento entre genes. Comprender la utilidad de la construcción de mapas genéticos Establecer el orden de ligamiento de los genes Determinar las distancias relativas entre tres genes a través de su frecuencia de recombinación Materiales 9 Calculadora científica 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Bridges, C. B. & K. S Brehne. 1944. The mutants of Drosophila melanogaster. Carnegie Institution, Washington. Publ. 552. Demerec, M. & B.P. Kaufmann. 1964. Drosophila guide, introduction to the genetics and cytology of Drosophila melanogaster. Carnegie Institution, Washington. 44 pp. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1981. Genética. 3º edición. Ed. AGESA. Madrid. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Strickberger, M.W. 1962. Experiments in genetics with Drosophila. John Wiley and Sons, New York. 144 pp.
Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 58
Trabajo Práctico N° 9 MUTACIONES CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES Las mutaciones son cambios producidos en la constitución genética de un individuo, que son heredables y se transmiten a las generaciones futuras. Las mutaciones pueden ocurrir en células somáticas, en cuyo caso solo afectan al individuo en que ocurren y solamente en forma parcial, produciendo un mosaico genético. Una mutación somática no se transmite a la descendencia y desaparece con la muerte del propio individuo. En las especies con reproducción sexual, las mutaciones que afectan la línea germinal sí se transmiten a la descendencia, originando individuos que llevan la mutación tanto en la línea somática como en la germinal. Las mutaciones, en general, se pueden clasificar de la siguiente manera: 1‐ Cromosómicas a) Numéricas aneuploidía euploidía b) Estructurales deleción duplicación inversión translocación 2‐ Génicas o puntuales En los rearreglos estructurales de los cromosomas, el número de cromosomas en la mayoría de los casos permanece constante pero se produce pérdida, ganancia o reordenación del material hereditario. Según el número de rupturas, su localización y la forma de unión de los extremos rotos se pueden producir varios cambios estructurales diferentes. A estos se los puede clasificar en dos grandes grupos: Cambios en el número de genes ‐ Deficiencias o deleciones ‐ Duplicaciones Cambios en el ordenamiento o disposición de los genes ‐ Inversiones ‐ Translocaciones Deficiencias o deleciones. Las deleciones constituyen una pérdida de material cromosómico. Si ocurre una sola ruptura cerca del extremo del cromosoma se pierde el segmento restante del cromosoma generándose una deficiencia terminal. También pueden producirse dos roturas y posterior pérdida del segmento con lo que se produce una deficiencia intersticial. Las deleciones terminales parecen ser más simples y por lo tanto más factibles de ocurrir ya que implican solamente una rotura. Sin embargo, la gran mayoría de las deficiencias detectadas hasta ahora son de tipo intersticial o sea intercalado en el cromosoma. Al producirse una deleción el segmento se pierde ya que carece de centrómero y no puede migrar a los polos en la anafase. Al perderse este fragmento, uno de los cromosomas del individuo carecerá de los genes ubicados en 59
esa región. Debido a ello, cualquier alelo recesivo que presente el cromosoma homólogo en esa región se va a manifestar. Duplicaciones. Las duplicaciones son cambios estructurales donde se produce la repetición de un segmento cromosómico. Las duplicaciones constituyen adiciones de partes de un cromosoma, produciéndose la presencia en exceso de una sección de un cromosoma con respecto a lo normal. Desde el punto de vista funcional, la ocurrencia de duplicaciones permite que no se produzcan desequilibrios funcionales en caso de que ocurra una mutación en una de las copias del gen. Desde el punto de vista evolutivo las duplicaciones han tenido un rol preponderante en el origen de las familias multigénicas o sea varios genes relacionados que han derivado de un único gen, como es el caso de las hemoglobinas. Al producirse la duplicación de un gen, una de las copias puede con el tiempo cambiar su función sin alterar el funcionamiento normal del individuo pudiendo originar nuevos genes con funciones similares o diferentes. Inversiones. Los cambios estructurales que vimos hasta ahora producen cambios en el número de genes. Sin embargo, en muchos rearreglos la cantidad de material hereditario permanece constante pero la disposición de dicho material puede variar dando lugar a efectos nuevos. Uno de estos rearreglos implica a las inversiones, en las que un segmento del cromosoma cambia de sentido dentro del propio cromosoma. Es decir se producen dos roturas seguidas de un giro de 180º del segmento, invirtiéndose el orden de los genes que comprende esa región. Según la región de los cromosomas que comprendan, las inversiones pueden ser pericéntricas si la región invertida incluye al centrómero, o paracéntricas si no incluye al centrómero. Una de las mayores modificaciones o alteraciones que causan las inversiones es el apareamiento de los cromosomas durante la meiosis y la recombinación de los cromosomas. En los individuos heterocigotas para una inversión el cromosoma no invertido forma una especie de bucle o lazo dentro del cual se dispone el cromosoma invertido formando un asa pero en orden inverso o contrario. A través de esta asa de inversión los cromosomas homólogos se pueden aparear en toda su longitud, a pesar de la inversión de un segmento de uno de ellos. En individuos heterocigotas para una inversión paracéntrica, si ocurre un solo entrecruzamiento dentro del asa de inversión se formará un fragmento acéntrico y un cromosoma dicéntrico entre las cromátidas involucradas. El fragmento acéntrico se pierde ya que no puede migrar a los polos, mientras que el dicéntrico formará un puente en Anafase I que se puede romper en cualquier parte. Como consecuencia de ello, las dos cromátidas recombinantes serán inviables mientras que las otras dos que no sufrieron entrecruzamiento darán gametos viables. O sea se produce una reducción de la fertilidad del 50% y los cromosomas resultantes son de tipo parental, es decir sin recombinación. En los heterocigotas para una inversión pericéntrica también se formará el asa de inversión, pero la ocurrencia de un entrecruzamiento traerá como consecuencia la formación de cromátidas recombinantes anormales, una con duplicaciones y la otra con deleciones. Al igual que en las inversiones paracéntricas solamente las dos cromátidas parentales darán origen a gametos normales. Las inversiones son en si mismas un mecanismo supresor de la recombinación, ya sea porque no se produce recombinación dentro del asa de inversión o porque si se 60
producen todos los productos recombinantes resultan inviables. Los únicos gametos viables serán los que presentan cromosomas parentales sin recombinación. La ocurrencia de doble entrecruzamiento es poco probable, por lo cual las inversiones en general tienen un efecto supresor de la recombinación y por lo tanto los genes ubicados en la región invertida tenderán a transmitirse como una unidad. En muchos casos puede formarse lo que Darlington denomina un supergén, es decir un grupo de genes ligados que son transmitidos o tienden a ser transmitidos como una unidad hereditaria y se mantienen juntos en el cromosoma. Translocaciones. Las translocaciones son cambios estructurales en que se produce la transferencia de una porción de un cromosoma a otro cromosoma no homólogo. Es decir, un segmento de cromosoma cambia su posición dentro del complemento cromosómico modificando los grupos de ligamiento. A las translocaciones se las puede clasificar de varias maneras diferentes y existen numerosas clasificaciones. Pero según el número de cortes y cromosomas implicados las podemos clasificar simplemente en: • Translocaciones simples: implican una sola ruptura en el cromosoma y la transferencia del fragmento resultante al telómero de otro cromosoma. • Translocaciones recíprocas o intercambios: estas translocaciones ocurren cuando se producen rupturas en dos cromosomas no homólogos y los fragmentos resultantes se intercambian. En los individuos homocigotas para las translocaciones la meiosis será normal, formándose la misma cantidad de bivalentes que en los individuos sin translocación y produciéndose gametos viables. Sin embargo, el apareamiento y los productos meióticos son bastante distintos en el caso de un individuo heterocigota para una translocación recíproca. En este individuo en la meiosis se aparearán los dos cromosomas translocados y los dos homólogos correspondientes formándose un tetravalente. En la anafase I los cromosomas pueden segregar de dos maneras diferentes. En la orientación alterna o en zig‐zag los cromosomas no translocados se dirigen a un polo y los cromosomas translocados van al otro, de manera que cada gameto tendrá un complemento cromosómico equilibrado y los gametos serán viables. En la orientación adyacente se forma un anillo en metafase y se dirigen a cada polo un cromosoma translocado y uno no translocado, dando lugar a gametos no equilibrados con duplicaciones y deleciones. La orientación adyacente puede producirse de dos maneras diferentes, una cuando migran los centrómeros homólogos a los mismos polos y la otra si migran centrómeros no homólogos al mismo polo. En cualquier caso, la consecuencia de la orientación adyacente será la producción de gametos desequilibrados y la orientación alterna dará gametos balanceados. Cuando las translocaciones implican a más de dos pares de cromosomas en la meiosis pueden encontrarse anillos con seis, ocho o más cromosomas. En estos casos se habla de translocaciones múltiples. En algunas especies, se ha producido la acumulación de translocaciones recíprocas a lo largo de la evolución, pudiendo en algunos casos llegar a formar complejos en que están implicados todos los cromosomas del complemento. Las translocaciones múltiples son frecuentes 61
principalmente en plantas, dónde los casos más conocidos pertenecen a los géneros y Rhoeo. En Oenothera existen numerosas especies que se caracterizan por presentar diferentes combinaciones de translocaciones, por lo que en la meiosis se encuentran desde siete bivalentes individuales hasta anillos de 14 cromosomas. Objetivos • Diferenciar los distintos tipo de rearreglos cromosómicos estructurales • Analizar el comportamiento meiótico de cromosomas con rearreglos estructurales • Comprender las consecuencias evolutivas de los cambios estructurales Actividades 1) Analice las consecuencias citológicas de las inversiones en preparados de Oziroë argentinensis. Para ello: a‐ Observe y esquematice los cromosomas en Anafase I en las que se observe puentes anafásicos y fragmentos acéntricos. b‐ Calcule la frecuencia de los puentes y fragmentos contando no menos de 200 células en Anafase I. c‐ Explique el origen de los puentes y fragmentos mediante un diagrama marcando con letras los segmentos cromosómicos. d‐ Determine el tipo de inversión que se ha producido en este individuo. 2) Analice las consecuencias citológicas de las translocaciones en preparados de Rhoeo discolor, una especie heterocigota para translocaciones. a‐ Analice las configuraciones de los cromosomas meióticos de Rhoeo discolor. b‐ Observe y esquematice las distintas orientaciones que pueden presentar los cromosomas en Metafase I y Anafase I. c‐ Explique las consecuencias que traerán aparejadas las orientaciones observadas. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1981. Genética. 3º edición. Ed. AGESA. Madrid. Lacadena, J.R. 1996. Citogenética. 1º edición. Ed. Complutense. Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 62
Trabajo Práctico N° 10 MUTACIONES CROMOSÓMICAS NUMÉRICAS Las mutaciones numéricas pueden ser de dos tipos euploidía que implica dotaciones completas de cromosomas y la aneuploidía que son variaciones que involucran cromosomas aislados o individuales de una dotación cromosómica. En este trabajo veremos el primer caso, la poliploidía. Las variaciones en juegos completos de cromosomas son altamente frecuentes en las plantas, aunque también se han encontrado poliploides en algunos grupos de animales. En la euploidía todo el complemento cromosómico se encuentra duplicado una o varias veces, de manera que un individuo puede tener tres cuatro o más cromosomas de cada clase. A los individuos que presentan duplicaciones del juego haploide de cromosomas se los denomina poliploides. Cuando hay tres cromosomas de cada clase, o sea tres juegos haploides completos se los llama triploides, si hay cuatro tetraploide, si hay seis hexaploides y así sucesivamente. Un individuo diploide tiene una dotación cromosómica normal con dos juegos idénticos de x cromosomas cada uno, de manera que tales x son diferentes entre sí. A cada uno de dichos juegos de cromosomas (x) se lo denomina genomio, y al conjunto de cromosomas que forman un genomio se lo llama número básico. Por lo tanto, un triploide tendrá 3x o tres juegos de cromosomas, un tetraploide 4x o cuatro juegos de cromosomas, y así sucesivamente. Dentro de los poliploides, se pueden distinguir dos tipos diferentes: ‐ Autopoliploides: se originan por duplicación de cromosomas de la misma especie, por ejemplo si denominamos a una especie A, un diploide tendrá dos jegos de cromosomas (AA), pero un autopoliploide tendrá juegos adicionales (AAA, AAAA, etc.). ‐ Alopoliploides: son producto de hibridación entre las especies y subsiguiente duplicación de cada complemento cromosómico. En este caso se produce la hibridación de una especie A con una B y el híbrido resultante (AB) sufre duplicación de los cromosomas de manera que tendrá dos juegos de cromosomas de la especie A y dos juegos de la especie B (AABB) en el caso de un tetraploide. Debido al diferente origen de estos dos tipos de poliploides, el comportamiento de los cromosomas en la meiosis es significativamente diferente en los autopoliploides y en los alopoliploides. En los autopoliploides habrá varios cromosomas idénticos por lo cual se formarán multivalentes en la meiosis y en muchos casos habrá segregación anormal de los cromosomas. Por ejemplo un autotetraploide (AAAA) tiene cuatro cromosomas del mismo tipo y por lo tanto en lugar de formarse bivalentes tenderá a formar tetravalentes que frecuentemente tienen un comportamiento irregular en la anafase. En la anafase, pueden migrar dos cromosomas hacia cada polo, pero también pueden segregar en forma desbalanceada yendo tres a un polo y uno solo al otro. De esta manera, algunos gametos tendrán cromosomas de más y otros tendrán cromosomas de menos, reduciendo la fertilidad del individuo. En los alopoliploides, la situación es generalmente diferente. Por ejemplo en un alotetraploide habrá dos juegos cromosómicos de cada especie parental (AABB) y por lo tanto en la meiosis se producirán bivalentes que migrarán en forma normal a los polos sin producirse gametos desbalanceados y reducción de la fertilidad del individuo. 63
Los alopoliploides se producen por hibridación entre dos especies y posterior duplicación de los cromosomas. Al cruzarse entre sí dos especies diploides, el híbrido producido (AB) será estéril debido a que tiene 1 solo cromosoma de cada clase que se comportarán en forma irregular en la meiosis. Sin embargo, ocasionalmente el híbrido puede formar gametos sin reducir, es decir diploides. Si se unen dos de estos gametos, el individuo resultante será un tetraploide (AABB) en que cada cromosoma tendrá otro idéntico, con lo cual se formarán bivalentes y se producirán gametos normales. 64
Objetivos • Reconocer los distintos tipos de poliploidía • Analizar el comportamiento meiótico de autopoliploides • Analizar las consecuencias de la poliploidía. • Comprender los mecanismos de origen de los poliploides Materiales 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.). Actividades 1) A partir del recuento de números cromosómicos, estime el nivel de ploidía de los siguientes taxones. Figura 16‐ Cromosomas somáticos de Turnera. A) T. grandiflora, 2n = .....x = ...... B) T. grandidentata, 2n = .....x = ...... C) T. ulmifolia, 2n = .....x = ...... D) T. aurelii, 2n = .....x = ...... E) T. sidoides subsp. pinnatifida, 2n = .....x = ...... F) T. sidoides subsp. integrifolia, 2n = .....x= ...... G) T. opifera, 2n = .....x = ...... (Extraído de Solís Neffa & Fernández 2000). 2) Analice las microfotografías y los histogramas de citometría de flujo de la siguiente figura e indique: a‐ Número básico de la especie. b‐ Nivel de ploidía de las tres poblaciones. c‐ Fase de la meiosis en la que se encuentran las células. 65
d‐ Configuraciones meióticas observadas en las microfotografías c y e. Figura 17‐ Cromosomas meióticos e histogramas de citometría de flujo de poblaciones diploides y poliploides de Turnera sidoides subsp. carnea (Extraído de Kovalsky & Solís Neffa & Fernández 2012). 3) En los preparados que le proveerá la cátedra, analice el comportamiento meiótico de los taxones observando no menos de 30 células en diacinesis o metafase I. A partir de las observaciones realizadas deberá realizar las siguientes actividades: a‐ Observe si se encuentra multivalentes. En caso positivo indique la cantidad. b‐ Determine qué tipo de poliploide es la especie en estudio. Fundamente su respuesta. c‐ Establezca cuál es el número básico y estime el nivel de ploidía de la especie. d‐ En base a las observaciones anteriores establezca la formula genómica de esta especie. e‐ Determine la frecuencia de cromosomas rezagados en Anafase I (contando no menos de 100 células). 4) Estime la viabilidad de un diploide y de diferentes poliploides. Para ello, observe los preparados al microscopio (40×) y contabilice los granos fértiles (totalmente coloreados) y los estériles. Es necesario, como término medio, efectuar un recuento de 66
al menos 300 granos de polen en total. Luego, compare los valores observados en autopoliploides, alopoliploides y poliploides impares respecto del diploide. Especie Nivel de Tipo de Granos Granos % de granos ploidía poliploide
fértiles estériles fértiles 5) Estime la frecuencia esperada de polen x, 2x y 4x a partir de los porcentajes de tríadas, díadas y mónadas observadas, considerando que las tétradas forman cuatro gametos n, las díadas dos gametos 2n, las tríadas dos gametos n y uno 2n, mientras que las mónadas originan gametos 4n. Población Tétradas Tríadas Díadas Mónadas S215 Nº de esporadas 2663 2645 6 0 2 Polen esperado x 2x 4x S156 5446 5436 1 1 0 S159 1066 1052 0 3 0 S224 3348 3106 4 2 1 S182 3245 3103 1 0 0 S187 4793 4651 13 2 1 S188 6792 2935 6464 2930 18 5 0 0 0 0 S212 6415 6141 6 2 1 Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Kovalsky, I.E. & V.G. Solís Neffa. 2012. Evidence of 2n microspore production in a natural diploid population of Turnera sidoides subsp. carnea and its relevance in the evolution of the T. sidoides (Turneraceae) autopolyploid complex. Journal of Plant Research. DOI 10.1007/s10265‐012‐0493‐7. Solís Neffa, V.G. & A. Fernández. Chromosome studies in Turnera (Turneraceae). 2000. Genetics and Molecular Biology 23 (4): 925‐930. 67
Trabajo Práctico Nº 11 MUTACIONES GÉNICAS O PUNTUALES Las mutaciones génicas o puntuales, son cambios que se producen a nivel de un gen, como puede ser la sustitución de una base, un error en la reparación del ADN o un daño causado por agentes mutágenos. Tipos de mutaciones génicas I Sustituciones (sustitución de una base nucleotídica por otra). A‐ Transiciones 1. Sustitución de una purina por otra purina A G 2. Sustitución de una pirimidina por otra pirimidina C T B‐ Transversiones (sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa) A, G C, T II Inserción / deleción Objetivos • Asimilar el significado del término mutación • Reconocer los tipos de mutaciones posibles y el nivel a los que pueden ocurrir • Comprender la importancia evolutiva de las mutaciones Materiales 9 Calculadora científica. 9 Elementos de dibujo (hojas blancas, lápiz negro, goma, etc.) Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1981. Genética. 3º edición. Ed. AGESA. Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 68
Trabajo Práctico N° 12 ANALISIS GENÉTICO MOLECULAR Secuenciación del ADN. El término secuencia designa la composición de nucleótidos de un trozo de ADN o la de aminoácidos de una proteína. Ese trozo de ADN puede corresponder a un gen, un genoma, o a una parte de ellos. Secuenciar es determinar la estructura de una secuencia de ADN, es decir, el tipo y orden de sus nucleótidos. El método Sanger (Figura 18) es, actualmente, el método de secuenciación más usado en los laboratorios. Este método se basa en la replicación. El fragmento que se va a secuenciar se usa como molde para la síntesis de una serie de nuevas moléculas de ADN. Durante el proceso, la replicación a veces (pero no siempre) se interrumpe cuando se encuentra una base específica, por lo que se generan cadenas de ADN de diferentes longitudes, cada una de las cuales termina en la misma base. En el método Sanger, las reacciones se realizan en presencia de un nucleótido especial, llamado didesoxirribonucleósido fosfato (ddNTP) o dideoxinucleótido. Éstas, son moléculas similares a los nucleótidos normales, pero carecen del grupo 3’‐OH, lo que impide que otros nucleótidos se unan a él, deteniendo la replicación del ADN. Las reacciones para secuenciar el ADN son similares a cualquier reacción de PCR (Polimerasa Chain Reaction). Las copias del ADN muestra se aíslan y se colocan en cuatro partes diferentes. La mezcla incluye una muestra de ADN, nucleótidos libres, una enzima (generalmente una variante de la Taq polimerasa) y un primer ‐o cebador‐ (una pieza pequeña –de 20 a 30 nucleótidos‐ de ADN de una sola hebra) que sea capaz de hibridar con una de las hebras de la muestra de ADN, y una péquela cantidad de unos de los cuatro tipos de dideoxinucleótido (cada uno de los cuatro tubos recibe un ddNTP diferente). Dentro de cada uno de los tubos, la ADN polimerasa sintetiza ADN. Si consideramos la reacción en uno de ellos; por ejemplo, al replicar hebras de ADN en presencia de dideoxi‐T, la mayor parte de las veces cuando se necesite una 'T' para la nueva hebra, la enzima encontrará una T correcta, y la replicación continuará añadiendo más nucleótidos. Sin embargo, un porcentaje de las veces (proporcional a la cantidad de dideoxi‐T que se haya incluido) la enzima colocará un ddTTP y el crecimiento de la hebra se detendrá. En los tubos restantes tienen lugar reacciones similares, pero la síntesis se interrumpe en nucleótidos con una base diferente en cada uno de ellos. Una vez finalizada la reacción de polimerización, todo el ADN se desnaturaliza, y los productos de cada simple de cada reacción se separan por electroforesis en gel. Los contenidos de cada uno de los cuatro tubos se separan uno al lado del otro en un gel de poliacrilamida, de modo que pueden distinguirse las cadenas de ADN que difieren en un solo nucleótido. Luego de la electroforesis, sus ubicaciones, y por lo tanto sus tamaños, se revelan mediante una autorradiografía. La secuencia puede ser leída directamente de las bandas que aparecen en la autorradiografía del gel, comenzando por la parte inferior. Debe tenerse en cuenta que la secuencia obtenida es complemento de la cadena molde original. 69
Figura 18. Método Sanger (o dideoxi) de secuenciación del ADN (Extraído de Pierce, 2010). Durante muchos años, la secuenciación de ADN se hizo a mano, y resultaba difícil y costosa. En la actualidad se la realiza con máquinas automatizadas que utilizan marcas fluorescentes y escáneres con láser para secuenciar cientos de pares de bases en unas pocas horas. En ellas también se utiliza la reacción dideoxi, pero los ddNTP usados se marcan con un pigmento fluorescente, y se utiliza un color diferente para cada tipo de dideoxinucleótido. En este caso, las cuatro reacciones de secuenciación pueden realizarse en el mismo tubo, y colocarse en la misma calle para la electroforesis. La información obtenida en la reacción de secuenciación se introduce en un ordenador para su interpretación, y los resultados se imprimen como una serie de picos en un gráfico denominado cromatograma (Figura 19). 70
Figura 19. Cromatograma que representa una secuencia de ADN. Los diferentes nucleótidos en la secuencia se representan con picos de diferentes colores. Bioinformática. Ya se han determinado vastas cantidades de secuencias de DNA; la velocidad de caracterización de nuevas secuencias está en continuo incremento. Catalogar, almacenar, buscar y analizar este enorme conjunto de datos son los principales desafíos de la Genética moderna. La Bioinformática es un nuevo campo que reúne a la Biología Molecular y la ciencia de la computación, y que se centra en el desarrollo de bases de datos, algoritmos de búsqueda en ordenadores, programas de predicción de genes y otras herramientas analíticas que se usan para entender los datos de secuencias del ADN, el ARN, y las proteínas. Las principales bases de datos son el GenBank de los Institutos Nacionales para la Salud (National Institutes of Health, NIH) en Bethesda, Maryland, y el EMBL Sequence Data Base, del Laboratorio de Biología Molecular Europeo, en Heidelberg. Estas bases de datos intercambian continuamente las secuencias recién informadas y las ponen a disposición de investigadores especializados en biología celular molecular de todo el mundo, a través de Internet. Las secuencias recién obtenidas se pueden comparar con otras determinadas con anterioridad, para buscar similitudes: las secuencias homólogas. Se traducen regiones codificadoras de proteínas a secuencias de aminoácidos, que también se comparan. Debido a la degeneración del código genético, las proteínas relacionadas a menudo exhiben mayor homología que los genes que las codifican. Las bases de datos de secuencias parciales de cDNA (base de datos EST) son de particular utilidad en el diseño de sondas para la búsqueda de las bibliotecas. Bases de datos de bioinformática Nombre Descripción URL Gen Bank Información sobre la secuencia de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/ ADN primaria mantenida por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos EMBL‐Bank Información sobre la secuencia de http://www.ebi.ac.uk/embl/ ADN primaria mantenida por investigadores europeos dbEST Base de datos de EST de muchos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ organismos MMDB Base de datos de modelos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
moleculares con estructuras MMDB/mmdb.shtml tridimensionales macromoleculares 71
FlyBase UniProt de proteínas y nucleótidos Información genética diversa sobre Drosophila melanogaster Datos de secuencias y otra información sobre proteínas de distintos organismos http://flybase.bio.indiana.edu/ http://www.ebi.ac.uk/uniprot/ Objetivos • Introducir al alumno en el conocimiento y manejo de las bases de datos de secuencias de ADN y proteínas. Actividades 1) Realice la búsqueda de secuencias de ADN propuestas por el profesor. 2) Dada una secuencia de ADN anónima, determine el tipo de secuencia de que se trata mediante rastreo de una base de datos. 3) Dada una secuencia problema de aminoácidos, busque al menos tres proteínas diferentes que presenten similitud (homología) con ella. Bibliografía Lodish, H., Berk, A., Lawrence Zipurski, S., Matsudaira, P., Baltimore, D. y Darnell, J. E. 2005. Biología Celular y Molecular. 5º edición. Editorial médica Panamericana S.A., Buenos Aires. Pierce, B.A. 2010. Genética: Un enfoque conceptual. 3ª edición. Ed. médica Panamericana S.A. Madrid. 72
Trabajo Práctico Nº 13 GENÉTICA HUMANA El cariotipo es el complemento cromosómico particular de un individuo y se define por el número y morfología de los cromosomas en la metafase mitótica. En la especie humana la dotación cromosómica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando técnicas de tinción estándar los cromosomas aparecen uniformemente teñidos en metafase y se clasifican en 7 grupos según su longitud relativa y a la posición del centrómero que define su morfología. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por tamaños decrecientes y por la posición del centrómero. Los cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto. De esta forma el cariotipo humano queda constituido así: Grupo A Pares cromosómicos 1, 2 y 3 B 4 y 5 C D E 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 13, 14 y 15 16, 17 y 18 F G 19 y 20 21 y 22 X, Y Características Cr. muy grandes casi metacéntricos (1 y 3 metacéntricos, pero 2 submetacéntrico) Cr. grandes y submetacéntricos, con dos brazos muy diferentes en tamaño Cr. medianos submetacéntricos Cr. medianos acrocéntricos con satélites Cr. pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17, 18 Cr. pequeños y metacéntricos Cr. pequeños y acrocéntricos, con satélites. El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero sin satélites. Sin embargo, para identificar inequívocamente cada par de cromosomas es necesario utilizar diferentes técnicas de bandeo cromosómico. Los distintos patrones de bandas que se encuentran son constantes y específicos de cada técnica y determinan la distribución de regiones cromosómicas que se revelan positiva o negativamente según el método utilizado. 73
Figura 20 – Cariotipos humanos normales femenino y masculino.
Cromosomopatías Las enfermedades producidas por las alteraciones del número, la estructura interna o la disposición de las partes de los cromosomas se conocen como cromosomopatías. Éstas se expresan como alteraciones fenotípicas múltiples y de acentuada gravedad, dado que cada una de ellas involucra bloques de millares de genes. Hay dos tipos fundamentales de cromosomopatías: ‐ Variaciones cromosómicas estructurales: afectan a la estructura del cromosoma en cuanto a la ordenación lineal de los genes. Aquí se incluyen deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. ‐ Variaciones cromosómicas numéricas: afectan al número de cromosomas. Incluyen la poliploidía (triploidía; tetraploidía) y los diversos tipos de aneuploidía (trisomías: 2n+1; monosomías: 2n‐1). 74
Las alteraciones cromosómicas más frecuentes en humanos son: Anomalías autosómicas: Síndrome de Down, por trisomía del cromosoma 21, translocación 21/21 o translocación 14/21. Síndrome de Patau, por trisomía del par 13. Síndrome de Edwards, por trisomía del par 18. Síndrome Cri du Chat, por deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5 (5p). Síndrome de DiGeorge, por deleción parcial del brazo largo del cromosoma 22 (22q11). Cromosoma Filadelfia, formado por una translocación entre los cromosomas 9 y 22. Anomalías de los cromosomas sexuales: Síndrome de Klinefelter, por una constitución XXY, XXXY, XXXXY. Síndrome XYY, cromosoma Y extra en varones. Síndrome de Turner, constitución X0. Síndrome XXX, cromosoma X extra en mujeres. Actualmente se ha llegado a profundizar bastante en el conocimiento del cariotipo humano y se sabe que es relativamente frecuente la aparición de anomalías cromosómicas. Las cromosomopatías se observan en el 0,5 a 1% de los recién nacidos vivos, y se encuentran en el 6% de los niños que mueren en la época perinatal y en el 39% de los abortos espontáneos. Estas alteraciones no sólo pueden producir anomalías en el propio individuo sino que, por tratarse de anomalías genéticas, pueden transmitirse a la descendencia en el caso de afectar a las células germinales. La detección anticipada de anomalías cromosómicas permite dictaminar las posibilidades de que la descendencia de una pareja portadora de una de ellas pueda presentarla o no. Para ello es preciso conocer el cariotipo de cada progenitor, lo que permite emitir un diagnóstico de su posible descendencia, con lo que el individuo será consciente de sus posibilidades. El estudio del cariotipo tiene también su aplicación en el diagnóstico prenatal. Es posible determinar la constitución cromosómica del feto antes de su nacimiento pudiendo así observarse si presenta alguna anomalía cromosómica detectable. Nomenclatura. Se ha establecido un “Sistema Internacional de Nomenclatura para Citogenética Humana” (SINCH = ISCN en inglés) por medio del cual la descripción del cariotipo normal y anormal está estandarizada. Este Sistema de Nomenclatura se creó a partir de la necesidad de categorizar los casos normales y anormales y de lograr una comunicación común entre investigadores, médicos, citogenetistas y demás profesionales relacionados con el área. El comité de soporte del ISCN recomienda que este sistema de nomenclatura sea usado en otras especies. Abreviaturas ace Fragmento acéntrico Del Deleción der Cromosoma derivativo Dic Dicéntrico 75
Dup Fra i Ins Inv mar p q qr r Trc t tr SIMBOLOS ; ( ) + ‐ : : / → Duplicación Sitio Frágil Isocromosoma Inserción Inversión o Invertido Cromosoma marcador Brazo corto Brazo largo Cuadriradial Cromosoma en anillo Tricéntrico Translocación Triradial Separa cromosomas alterados y puntos de rompimiento en rearreglos estructurales involucrando más de un cromosoma Rodea cromosomas alterados estructuralmente y rompimientos Ganancia Pérdida de material Se rompió y se reunió Separa líneas celulares en la descripción del mosaico Desde hasta Estudio genealógico en genetica humana. En los seres humanos, los rasgos con un patrón sencillo de herencia a veces se pueden localizar con la suficiente exactitud como para justificar predicciones respecto a su probabilidad de ocurrencia en futuros descendientes cuando se casan individuos emparentados o con un historial familiar relacionado con dichos rasgos. Al hacer un análisis de este tipo, el primer paso consiste en determinar si el rasgo en cuestión se comporta como dominante o recesivo. Aunque la mayor parte de las características humanas son afectadas por muchos genes, algunos han sido identificados como dominantes o recesivos en ciertos grupos familiares. Los genes recesivos son difíciles de localizar debido a que sus alelos dominantes los mantienen ocultos generación tras generación. Sus portadores en la población, por lo general, no se pueden identificar hasta que se manifiesten los genes recesivos. Unos caracteres dependientes de genes recesivos aparecen repentinamente en familias que no los habían presentado antes. Los genes recesivos se expresan con más frecuencia en familias en que el padre y la madre están estrechamente emparentados entre sí que con la población en general, ya que la probabilidad de presencia de genes similares es mayor cuando los progenitores son descendientes de un ancestro común. Ante la ausencia de datos que indiquen cuáles individuos son los portadores, el genetista puede recurrir a la probabilidad como el mejor instrumento disponible para determinar la posibilidad de que se vaya a manifestar un determinado gen recesivo en una familia dada. Cuando un rasgo nunca se manifestó en una familia, se puede usar como base de probabilidad una estimación de la frecuencia del gen que lo determina en la población en general. Si el mismo rasgo ya se manifestó en la familia, es posible 76
hacer cálculos más precisos de probabilidad basándose en la historia familiar registrada en un árbol genealógico. I 1 2 3 4 II 1 2 3 4 5 6 7 8 9 III 1 2 3 4 5 En la genealogía se indica el orden de las generaciones con números romanos. La primera generación (I) corresponde a la primera persona de la que se posean datos, por ejemplo la de los abuelos del alumno; la segunda (II) correspondería a la de los padres y tíos, y la tercera (III), a la generación del alumno. Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con círculos, y por rombos los individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se unen por una línea horizontal. Los descendientes se disponen bajo una línea horizontal desde la que parte una línea vertical por individuo, excepto en el caso de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican por líneas convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se indican rellenando el símbolo. Objetivos • Analizar el cariotipo humano • Distinguir el cariotipo normal de aquellos cariotipos que reflejan alteraciones cromosómicas. • Adquirir destreza en la confección y análisis de árboles genealógicos • Conocer la transmisión de algunos caracteres sencillos y de fácil observación. Actividades 1) Analice los siguientes cariotipos, determine a qué tipo de cromosomopatía corresponden y describa sus características. 77
Patología: Nomenclatura: Descripción de la patología: Patología: Nomenclatura: Descripción de la patología: 78
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2) Conteste el siguiente cuestionario: a.‐ ¿Qué características permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros? b.‐ ¿Qué células del organismo llevan el cariotipo diploide completo? c.‐ ¿Qué mecanismos cromosómicos producen anomalías en el cariotipo humano? d.‐ ¿Se manifiestan siempre las alteraciones cromosómicas en el fenotipo del individuo que las transmite? Justificar. 3) Reconozca las variaciones fenotípicas para cada uno de los caracteres monogénicos que se describen a continuación, deduciendo su genotipo en cada caso. Los datos se tomarán en una hoja como la que se indica. Se utilizará una hoja de datos para cada persona. a‐ Disposición del lóbulo de la oreja. Lóbulo separado de la mejilla o pegado lateralmente a la mejilla. b‐ Línea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro denominado "pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden contabilizar. c‐ Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en forma de U fuera de la boca. d‐ Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia atrás la última falange del pulgar en un ángulo de casi 90º respecto a la anterior ("dedo del autoestopista"). Esta capacidad puede manifestarse sólo en una de las manos, y la expresividad del rasgo es variable. e‐ Dedo meñique doblado. El meñique puede estar recto, o bien con la última falange doblada hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre una mesa y se observa si los dedos están paralelos o si los meñiques se doblan hacia dentro. f‐ Longitud relativa del dedo índice. Dedo índice más o menos largo que el anular. Se realiza la observación como en el caso anterior. Se trata de un carácter de expresión influenciada por el sexo. g‐ Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos en las mejillas. h‐ Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque sólo haya algo de pelo en alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo. i‐ Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser más corto o más largo que el índice adyacente. Una vez realizada la observación, proceder de la siguiente manera: 1. Tome los datos del fenotipo propio 2. Anote todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos. 3. Tome los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tíos) como sea posible. 80
4. Anote los datos de cada persona en una hoja de datos diferente. 5. Confeccione el árbol genealógico indicando el fenotipo de cada persona para, al menos, dos de los caracteres analizados. 6. Determine si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados. 7. En base al tipo de herencia, nombre los alelos adjudicados a cada carácter en la hoja de datos, usando una letra distinta para cada carácter, en mayúsculas/minúsculas para dominante/recesivo. 8. Por último, indique cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para cada carácter. Modelo de hoja de datos Parentesco Fenotipo Lóbulo de la oreja separado unido Dedo autoestopista presente ausente Pico de viuda presente ausente Lengua en U capaz incapaz Longitud del índice corto largo Dedo meñique curvado recto Hoyuelos faciales presentes ausentes Dedo gordo del pie corto largo Pelo en 2ª falanges presente ausente Bibliografía Mueller RF, Young ID, Emery EH (2001) Genética Médica. Ed. Marbán, Madrid España. Novitski E (1982) Human Genetics. MacMillan. New York. USA. Solari AJ (2004) Genética Humana. Fundamentos y aplicaciones en medicina. 3ª ed. Ed. Medica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. Thompson JS, Thompson MW (1977) Genética humana. Ed. Salvat, Buenos Aires. 81
Trabajo Práctico Nº 14 HERENCIA CUANTITATIVA Mendel en sus trabajos sobre arvejas veía caracteres perfectamente contrastantes (flores rojas o flores blancas, planta alta o enana). No obstante no todas las diferencias entre los individuos y entre las variedades o razas son de ésta clase. Existen caracteres como la estatura y el peso, y la mayoría de los caracteres económicos importantes como ser: producción de frutos, semillas, huevos, cantidad de leche, carne, etc., que no pueden ser clasificados en clases perfectamente distinguibles. Estos caracteres reciben el nombre de cuantitativos. En cambio, a los caracteres en que si pueden distinguirse clases o categorías se los llama cualitativos. Se llama herencia cuantitativa o herencia multifactorial, cuando varios juegos de alelos producen efectos más o menos iguales y acumulativos sobre el mismo carácter. Por ejemplo en el trigo algunas variedades tienen granos rojos y otras blancos, siendo el rojo dominante sobre el blanco. Cada alelo dominante aporta una parte a la generación del color rojo, pero al haber tres pares de genes implicados existían heterocigotas que son más rojos que otros. Al cruzar un individuo homocigota dominante (rojo) por otro homocigota recesivo (blanco) toda la descendencia presenta color rojo claro o rosado. Al cruzar entre sí a estos individuos, en la descendencia de obtendrá una proporción de 63 individuos con diferentes tonos de rojos y solamente 1 blanco. La distribución fenotípica resultante de la segregación de los tres pares de genes se acerca bastante a la distribución normal esperada para los caracteres cuantitativos. P: F1: F2: 1 R1R1 2 R1r1 R1R1R2R2R3R3 R1r1R2r2R3r3 1 R2R2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 1 R1R1R2R2R3R3 rojo 2 R1R1R2R2R3r3 1 R1R1R2R2r3r3 2 R2r2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 2 R1R1R2r2R3R3 4 R1R1R2r2R3r3 2 R1R1R2r2r3r3 1 r2r2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 1 R1R1r2r2R3R3 2 R1R1r2r2R3r3 1 R1R1r2r2r3r3 1 R2R2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 2 R1r1R2R2R3R3 4 R1r1R2R2R3r3 2 R1r1R2R2r3r3 2 R2r2 1 R3R3 2 R3r3 4 R1r1R2r2R3R3 8 R1r1R2r2R3r3 x r1r1r2r2r3r3 rosado 82
1 r1r1 1 r2r2 1 r3r3 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 4 R1r1R2r2r3r3 2 R1r1r2r2R3R3 4 R1r1r2r2R3r3 2 R1r1r2r2r3r3 1 R2R2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 1 r1r1R2R2R3R3 2 r1r1R2R2R3r3 1 r1r1R2R2r3r3 2 R2r2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 2 r1r1R2r2R3R3 4 r1r1R2r2R3r3 2 r1r1R2r2r3r3 1 r2r2 1 R3R3 2 R3r3 1 r3r3 1 r1r1r2r2R3R3 2 r1r1r2r2R3r3 1 r1r1r2r2r3r3 blanco Cualquiera de los R1, R2 o R3 aportan para producir el tono rojo y su intensidad depende de cuántos de éstos genes se encuentren juntos. Es decir, los efectos de estos genes actúan en forma acumulativa y no existe codominancia. La causa de esta distribución es la segregación al azar de los tres pares de genes implicados. Aunque en la distribución de estos tres pares de genes aun existen grados o clases que pueden diferenciarse, las clases se van reduciendo al aumentar el número de genes implicados en la determinación del carácter cuantitativo. Debido que en la determinación de una carácter cuantitativo intervienen varios pares de genes a estos se los denomina factores o genes múltiples. A los factores múltiples se los denomina también poligenes. Los poligenes pueden definirse como genes que presentan un efecto fenotípico pequeño sobre un carácter determinado y que pueden complementarse entre sí para producir cambios cuantitativos observables. En muchos casos, estos efectos cuantitativos son aditivos, es decir pueden sumarse y dar fenotipos que son la suma total de los efectos positivos y negativos de los genes individuales. Determinación del número de genes. El número posible de genes puede estimarse considerando que al aumentar la cantidad de pares de genes disminuye la proporción de individuos exactamente iguales a los progenitores originales. Por ejemplo, a partir de un cruzamiento inicial entre homocigotas para una par de genes (AA x aa), una cuarta parte de la F2 será igual a cada uno de los progenitores originales (1/4 AA, 2/4 Aa, 1/4 aa). Para dos pares de genes, la proporción de la F2 con un genotipo paterno desciende a 1/16. Para tres la proporción es 1/64. Un cruzamiento entre individuos de la F1 heterocigota para n pares de genes dará lugar por lo tanto a 1/4n de descendientes con el genotipo de uno de los progenitores. Así, para 4 pares de genes se esperaría que 1/256 (1/44) individuos de la F2 presentasen el mismo genotipo que uno de los progenitores. 83
Genes modificadores. Un caso interesante de genes múltiples se presenta cuando dichos genes producen su efecto en un carácter cuya aparición depende a su vez de otro gen. Por ejemplo el pelaje manchado de muchos animales se debe a un gen recesivo que podemos designar s, de manera que los individuos de color uniforme son SS o Ss, mientras que los animales ss son manchados. Sin embargo, el grado del manchado está determinado por genes múltiples, de manera que los individuos varían considerablemente en cuanto a las manchas, oscilando entre casi sin manchas a muy manchados. Como el carácter manchado depende de un solo gen, a los genes múltiples que lo afectan se los denomina genes modificadores. Los genes modificadores actúan cambiando la magnitud del efecto de un gen principal o mayor. Los genes modificadores tienen un efecto pequeño que determinan el efecto final del gen mayor. Estos no tienen ningún efecto si no está presente el gen principal. Para el caso anterior, los genes modificadores que determinan el grado del manchado no tienen ningún efecto en individuos sin manchas. Objetivos • Interpretar la forma de transmisión de los caracteres cuantitativos. • Resolver problemas sobre caracteres determinados en forma cuantitativa. • Comprender la utilidad del conocimiento de la herencia cuantitativa. Materiales 9 Calculadora 9 Lápiz negro y goma 9 Hojas blancas Actividades 1) Resuelva los problemas teóricos. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Lacadena, J.R. 1981. Genética. 3º edición. Ed. AGESA. Madrid. Sanchez‐Monge, E. 1974. Fitogenética, Mejora de plantas. Ed. INIA. Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Sinnott, E.W., Dunn, L.C. y Dobzhansky, T. 1961. Principios de Genética. Ed. Omega. Barcelona. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 84
Trabajo Práctico Nº 15 GENÉTICA DE POBLACIONES La Genética de Poblaciones es la rama de la Genética que estudia la dotación genética de los grupos de individuos y cómo cambia con el tiempo la composición genética de un grupo. Los genetistas poblacionales generalmente enfocan su atención en una población mendeliana, que es un grupo de individuos que se cruzan entre ellos, que se reproducen sexualmente, y que poseen un conjunto de genes comunes, el conjunto génico. Una población evoluciona a través de cambios en este conjunto génico; por lo tanto, la Genética de Poblaciones es también un estudio de la evolución. Los genetistas poblacionales estudian la variación de los alelos dentro de un grupo y entre grupos, y las fuerzas evolutivas responsables de formar los patrones de variación genética que se encuentran en la naturaleza. La composición genética de una población puede describirse a partir de sus frecuencias genotípicas y génicas. La ley de Hardy‐Weinberg describe los efectos de la reproducción y de las leyes de Mendel sobre las frecuencias génica y genotípica de una población. Supone que una población es grande, con apareamiento al azar y libre de los efectos de mutación, migración y selección natural. Cuando estas condiciones se cumplen, las frecuencias génicas no cambian y las frecuencias genotípicas se estabilizan después de una generación de apareamiento al azar en las proporciones de equilibrio de Hardy‐Weinberg p2, 2pq y q2, donde p y q son la frecuencia de los genes. Si consideramos por ejemplo el grupo sanguíneo MN, hay un total de 200 genes en una población de 100 individuos. Si en la población hay 50 individuos MM, 20 MN y 30 NN, la frecuencia del gen M será: 100 (50x2) + 20: 120/200 o 0,6 y la frecuencia del gen N será: 20 + 60 (30x2): 80/200 o 0,4. Designamos como p a la frecuencia del gen M y q a la frecuencia del gen N, de manera que siempre p + q = 1. De acuerdo a la ley de Hardy‐Weinberg, las frecuencias genotípicas en equilibrio estarán dadas por: p2(MM) + 2pq(Mn) + q2(nn) = 1 Si la frecuencia de p (M) es 0,6 y la de q (N) es 0,4, las frecuencias genotípicas en equilibrio serán: p2 (MM)= (0,6)2 = 0,36 2pq (MN)= 2 . (06) . (0,4) = 0,48 q2 (NN) = (0,4)2 = 0,16 Objetivos • Calcular las frecuencias génicas y genotípicas de una población • Comprender el principio o ley de Hardy‐Weinberg y sus aplicaciones • Estimar las frecuencias genotípicas de equilibrio de una población Materiales 9 Calculadora científica 85
9 Lápiz negro, goma, etc. Actividades 1) Resolver los problemas teóricos utilizando los métodos descriptos anteriormente. Los problemas resueltos, incluyendo el desarrollo de los mismos, deberán ser entregados al finalizar el trabajo práctico. Bibliografía Gardner, E.J., M.J. Simmons & D.P. Snustad. 1998. Principios de Genética. 4ª. ed. Ed. Limusa Wiley. México. Griffiths A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin & W.M. Gerbart. 1996. An Introduction to Genetic Analysis. 6º edición. Ed. Freeman & Co., New York. Lacadena, J.R. 1981. Genética. 3º edición. Ed. AGESA. Madrid. Pierce, B.A. 2010. Genética: Un enfoque conceptual. 3ª edición. Ed. médica Panamericana S.A. Madrid. Sanchez‐Monge, E. 1974. Fitogenética, Mejora de plantas. Ed. INIA. Madrid. Sanchez‐Monge, E. & N. Jouve. 1989. Genética. Ed. Omega. Barcelona. Sinnott, E.W., Dunn, L.C. & T. Dobzhansky. 1970. Principios de Genética. 4º edición. Ed. Omega. Barcelona. Srb, A.M., Owen, R. D. & R. S. Edgar. 1978. Genética General. 4º edición. Ed. Omega. Barcelona. Strickberger, M.W. 1988. Genética. 3º edición. Ed. Omega, Barcelona. 86
Trabajo Práctico Nº 16 ANÁLISIS FILOGENÉTICO Las relaciones evolutivas entre un grupo de organismos se denominan filogenia. Dado que la mayor parte de la evolución se produce a lo largo de períodos de tiempo prolongados y no es pasible de observación directa, los biólogos deben reconstruir las filogenias mediante la inferencia de las relaciones evolutivas entre los organismos presentes en la actualidad. La filogenia molecular consiste en el estudio de las relaciones evolutivas entre organismos a partir de datos moleculares ordenados en un alineamiento múltiple de secuencias de ADN o de proteínas. En el análisis filogenético, el objetivo es la construcción de un árbol filogenético (Figura 1) que ilustre la historia evolutiva de un grupo de especies. Un árbol filogenético es un gráfico compuesto de nodos y ramas en el que una rama conecta dos nodos adyacentes. Los nodos representan a las especies y las ramas definen las relaciones entre esas especies en términos de descendencia y ascendencia. El patrón de ramificación se denomina topología del árbol. Hay que distinguir entre nodos terminales y nodos internos. Estos últimos representan a especies ancestrales hipotéticas mientras que los nodos terminales representan a especies existentes en la actualidad. Las especies que están conectadas por ramas a un mismo nodo interno, comparte ese nodo ancestral. Las ramas que conectan nodos externos con nodos internos se denominan ramas externas o terminales mientras que las que conectan nodos internos son ramas internas. Las relaciones filogenéticas entre las especies se espera que sean ramificadas, como en un árbol dicotómico, formado por bifurcaciones que representan la evolución de un linaje y se unen a otros linajes mediante nodos. En los casos en que surjan más de dos ramas (linajes) de un nodo, se habla de politomía (en oposición a la dicotomía). Figura 20. Componentes de un árbol filogenético (Modificado de Gallardo, 2011) Un clado natural o grupo monofilético consiste en un grupo de táxones (especies, géneros, familias, etc.) que derivan de un ancestral común que no es compartido con ningún otro táxon fuera del grupo. Se espera que un grupo taxonómico sea monofilético. Sin embargo, algunos grupos taxonómicos establecidos 87
actualmente pueden ser no monofiléticos: la filogenia molecular ha demostrado, en algunos casos, que un grupo taxonómico tiene un ancestral común compartido con otros táxones (grupo parafilético); un grupo polifilético está formado por dos linajes que han adquirido un mismo carácter por convergencia evolutiva (los organismos clasificados en un mismo grupo polifilético comparten homoplasias fenotípicas). (Figura 2) Figura 21. Árbol filogenético parcial de los vertebrados. Los reptiles no forman un clado monofilético debido a que los cocodrilos y las aves comparten un ancestro común más reciente que el resto de los reptiles (tortugas y serpientes). Adhiriendo al principio de monofilia, los reptiles deberían incluir a todos los linajes que descienden de un ancestro común. Como las aves no son incluidas en esta clasificación, los reptiles no constituyen un clado natural sino un grupo parafilético (Modificado de Gallardo, 2011). Un árbol puede ser un árbol con raíz cuando existe un nodo, la raíz, que de forma inequívoca es el ancestral común más reciente de todas las especies comparadas. Un árbol sin raíz es un árbol que sólo especifica las relaciones de parentesco entre las especies comparadas sin describir los pasos evolutivos que han conducido desde un ancestral común a dichas especies. Para un grupo determinado de especies existen diferentes árboles posibles y el número de estos se incrementa en relación al número de especies comparadas. Sin embargo, sólo uno de esos árboles es el árbol correcto que, dependiendo de la precisión de nuestros datos y de nuestros análisis, puede coincidir o no con el árbol inferido en nuestra reconstrucción filogenética. En cualquier caso, siempre tenemos que tener presente que en nuestro análisis lo que comparamos son secuencias homólogas de ADN obtenidas de cada una de las especies que estamos estudiando. Por tanto, para obtener un árbol de especies lo más preciso posible, es más correcto analizar la historia de diferentes genes y secuencias no génicas. La tasa de cambio de las secuencias comparadas es algo que debemos tener muy en cuenta a la hora de elegir qué tipo de secuencias vamos a utilizar en nuestro análisis filogenético. Así, si el grupo a comparar está formado por especies muy próximas filogenéticamente, se requiere una secuencia que evolucione más rápidamente y haya acumulado suficientes cambios en el proceso de diversificación del grupo comparado. Suele ser útil el uso de secuencias génicas de ADN mitocondrial que tienen una tasa de evolución más rápida que las secuencias de ADN nuclear. Cuando la comparación es entre especies de grupos taxonómicos alejados, por el 88
contrario, las secuencias no génicas pueden ser muy dispares y ser poco aconsejables para el análisis filogenético. En este caso, es más conveniente el uso de secuencias más conservadas. Métodos de reconstrucción filogenética. La mayoría de los métodos de inferencia filogenética definen un criterio de optimización determinado que persigue elegir el mejor árbol de entre todos los posibles que podrían explicar los datos de partida. Este criterio da diferentes valores a cada árbol posible. Este valor es el que se usa para comparar los diferentes árboles. Existen diferentes algoritmos que permiten computar dichos valores e identificar el mejor árbol de acuerdo al criterio de optimización. En la actualidad disponemos de los siguientes métodos de inferencia filogenética: a) métodos basados en matrices de distancias genéticas; b) método de máxima parsimonia; c) método de máxima verosimilitud; d) método bayesiano. Métodos basados en matrices de distancias. Convierten los caracteres en una matriz de distancia que representa la divergencia evolutiva entre pares de especies. Para ello se estiman las diferencias entre cada par de secuencias del alineamiento. La forma más simple de calcular la distancia genética es calculando el número de diferencias (p) entre las secuencias. Se han desarrollo un número amplio de métodos de cálculo de distancias corregidas basados en modelos probabilísticos. Los cálculos de dichas distancias son valores corregidos de p según dichos modelos. Cada modelo asume un patrón evolutivo diferente con respecto a composición nucleotídica y tasas de cambio para cada tipo de substitución nucleotídica, para cada posición nucleotídica y para cada linaje. Una matriz de distancias típica tiene esta apariencia: Especie A B C B dAB ‐ ‐ C dAC dBC ‐ D dAD dBD dCD
Cuando se calculan las distancias entre un taxón y su ancestro, la longitud del árbol es la suma de la longitud de sus ramas. Luego, el árbol se infiere usando algoritmos tales como UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean), el algoritmo de Evolución Mínima, o el algoritmo del Vecino más Cercano (Neighbor Joining). Este último es el más popular, y se basa en un algoritmo que trata de buscar el árbol más corto, es decir, aquel que minimiza la longitud total del árbol, entendida ésta como la suma de las longitudes de todas sus ramas. Primero se identifican las dos secuencias que más se parecen (menor distancia genética hay entre ellas). Es decir, de entre todos los pares de secuencias comparados, se identifican aquellas dos secuencias cuya suma de las longitudes de sus ramas es la menor. Ese par de secuencias constituyen el primer par de "vecinos", conectados a través de un nodo interno. El siguiente paso es considerar a este par como una sola secuencia computándose la distancia media aritmética entre ellas y el resto de secuencias y construyendo una nueva matriz de distancias. A continuación se elige de nuevo el par de secuencias cuya suma de las longitudes de sus ramas es la menor, procedimiento que se continúa hasta que se identifican todos los nodos internos del árbol. 89
Método de máxima parsimonia. Mediante este método de optimización, se selecciona el árbol filogenético que tenga el menor número de cambios (= pasos) en el carácter (o caracteres) elegido(s) para explicar los datos observados. También supone que cada sitio mutable lo ha hecho sólo una vez, de modo que la diferencia la comparten todos los miembros del linaje mutado. El método asume que el árbol más corto refleja las verdaderas relaciones de parentesco. Si hay más de un árbol con esas características, se puede obtener un árbol consenso, del que podemos distinguir: a) consenso estricto (strict consensus), en el que todas las ramas conflictivas se resuelven colapsándolas a un único nodo politómico; b) consenso por la regla de la mayoría (majority‐rule consensus) en el que las ramas en conflicto se resuelven mediante la selección del patrón de ramificación observado en más del 50% de los árboles obtenidos. Método de máxima verosimilitud. La verosimilitud, L, de un árbol filogenético es la probabilidad de que los datos observados en un alineamiento se puedan explicar a partir de esa filogenia construida según un modelo evolutivo de substitución nucleotídica determinado, es decir, L = P(datos|árbol+modelo). El objetivo del método de máxima verosimilitud es encontrar el árbol con el mayor valor de L, de entre todos los árboles posibles que explicarían los datos observados. Método de inferencia bayesiana. La inferencia bayesiana de una filogenia está basada en una cantidad llamada probabilidad posterior de árboles de distribución, que es la probabilidad de un árbol condicionado por las observaciones [P(árbol+modelo|datos)]. El condicionamiento se logra a través del teorema de Bayes. No es posible calcular analíticamente la probabilidad posterior de árboles de distribución. A cambio, se utiliza una técnica de simulación llamada Monte Carlo de cadena de Harkov (MCMC) para aproximar esta probabilidad. Fiabilidad de la reconstrucción filogenética. Los remuestreos aleatorios son una forma muy usada para validar los nodos de un árbol y para cuantificar el grado de apoyo (o soporte) de cada rama. Entre los ejemplos más conocidos para dar apoyo a una topología determinada, están el bootstrap y el jacknife. El método de bootstrap consiste en remuestrar aleatoriamente la matriz original mediante extracción y reemplazo de los datos, hasta tener una matriz con igual número de filas y columnas que la inicial. Como el proceso es aleatorio, algunos puntos son remuestreados varias veces y otros no lo son nunca. El bootstrapping nos da una idea de cuán probable es que una rama no se afecte si se agregaran datos con la misma distribución. Como regla general, si el valor de bootstrap de una rama interior determinada es superior al 95%, se acepta que la topología de esa rama es correcta. El método de jacknife es una metodología muy similar al bootstrap, porque elimina aleatoriamente datos puntuales (filas o columnas) en cada remuestreo de la matriz original. Después se recompita la estimación de cada rama y se proporciona un valor de jacknife. Objetivos • Comprender la metodología utilizada en el análisis filogenético. • Adquirir conocimiento en el uso de programas informáticos de análisis filogenético. 90
Actividades 1) Establezca las relaciones evolutivas entre grupos de organismos a través de un análisis filogenético. Para ello se les entregarán datos de secuencias de ADN obtenidos de las bases de datos disponibles en Internet, que deberán procesar para la construcción de árboles filogenéticos. Bibliografía Pierce, B.A. 2010. Genética: Un enfoque conceptual. 3ª edición. Ed. médica Panamericana S.A. Madrid. Gallardo, M.H. 2011. Evolución, El curso de la vida. 1º edición. Ed. médica Panamericana S.A. Buenos Aires. 91