Cry1Ac de Bacillus thuringiensis

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-endotoxina
Cry1Ac de Bacillus thuringiensis
Tesis que Presenta
Jesús Oswaldo Medina López
Como Requisito para Obtener el Título Profesional de:
Biólogo
San Nicolás de los Garza N. L.
Marzo, 2014
Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-Endotoxina
Cry1Ac de Bacillus thuringiensis
TESIS QUE PRESENTA
JESUS OSWALDO MEDINA LOPEZ
COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE:
BIOLOGO
APROBADA
COMISION DE TESIS
_______________________
Presidente
Dr. Benito Pereyra Alférez
_______________________
Secretario
Dr. Carlos Francisco Sandoval Coronado
_______________________
Vocal
Dra. María Magdalena Iracheta Cárdenas
_______________________
Suplente
Dr. Hugo Alberto Luna Olvera
_______________________
Asesor Externo
Dr. Víctor Ricardo Moreno Medina
ii
Obtención de Helicoverpa zea (Boddie) resistente a la δ-Endotoxina
Cry1Ac de Bacillus thuringiensis
Este trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio L4 del Instituto de Biotecnología,
de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León
bajo la Dirección del Dr. Benito Pereyra Alférez
iii
INDICE
Sección
Dedicatoria
Agradecimientos
Lista de Abreviaturas
Lista de Figuras
Lista de Tablas
1.Introducción
2.Importancia
3.Hipotesis
4.Objetivos
4.1.Objetivo general
4.2. Objetivos específicos
5.Antecedentes
5.1.Características de Helicoverpa zea (Boddie)
5.2.Características de Gossypium hirsutum
5.3.Algodón GM en México
5.4.Características de B. thuringiensis
5.5.Cristales paraesporales
5.6.Modo de acción de las toxinas Cry
5.7.Receptores asociados a la resistencia a las toxinas Cry
5.7.1.APN
5.7.1.1.APN como una proteína de unión a toxinas Cry
5.7.2.Cadherinas
5.7.3.ALP
5.8.Resistencia a toxinas de B. thuringiensis.
5.8.1.Pruebas de Selección en laboratorio de otros insectos.
5.8.1.1.Pruebas de Selección en laboratorio de Helicoverpa zea.
5.8.2.Características genéticas ligadas a la resistencia.
6.MATERIALES Y METODOS
6.1.Muestreo de algodón GM
6.2.Purificación de toxinas a partir de cepas recombinantes de
B. thuringiensis
6.2.1.Obtención de proteínas Cry
6.2.2.Solubilización
6.3.Procedencia de las colonias de insectos.
6.3.1.A partir de larvas
6.3.2.En el caso de las pupas
6.3.3.Cría de insectos
6.4.Concentración letal media (LC50) de la protoxina Cry1Ac
Pág.
v
vi
vii
ix
x
1
3
4
5
5
5
6
6
8
8
10
10
12
15
15
15
16
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19
20
21
23
23
6.5.Determinación de resistencia
25
6.6.Ensayos de segregación
25
23
23
23
24
24
24
24
24
iv
6.7.Identificación de genes de los receptores asociados al mecanismo de
resistencia
6.7.1.Extracción de ADN
6.7.2.Extracción de RNA con Tripure reagent®
6.7.3.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
7.Resultados
7.1.Expresión de Toxina Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato
(CP4 EPSPS)
7.2.Obtención de proteínas Cry
7.3.Determinación de la LC50
7.4.Bioensayos de resistencia
7.5.Cruza de colonias
7.6.Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias
7.7.Segunda cruza de colonias
7.8.Genes de los receptores asociados al mecanismo de resistencia
26
8.Discusion
39
9.Conclusiones
44
10.Literatura citada
45
26
27
28
29
29
31
33
33
35
36
37
38
v
DEDICATORIA
A mis padres:
A Irma y Jesús, porque gracias a su apoyo pude realizar mis deseos de estudiar la
carrera de biología y continuar hasta la culminación con esta tesis, tal vez con
algunas quejas de por medio pero aun así permitiéndome elegir mis propias
decisiones. Todos mis éxitos de aquí en adelante estarán influenciados por ustedes.
A mi hermana
A Jessica, por su apoyo además de las bromas relacionadas acerca de mi carrera y
la suya, por todos los momentos divertidos que hemos pasado juntos a través de los
años, porque siempre serás una conexión con mi pasado, mi presente, y esperemos
también mi futuro, porque posiblemente no leas esto al menos que te lo muestre (Es
un hecho que tendré que mostrártelo para presumir mi tesis), gracias por todo.
A mis amigos
Mencionarlos a todos sería bastante problemático ya que puedo decir que cuento con
una gran cantidad de amigos de los cuales conozco desde años, otros con menos
tiempo de conocerlos pero de igual importancia, añadiendo que la mayoría de
ustedes son bastante sensibles y se molestarían por una lista en orden alfabética, lo
mejor será dejarlo con una clásica frase "Ustedes saben quiénes son", gracias por
todos los momentos, los consejos, las risas, las pláticas profundas, las pláticas sin
sentido que podemos llegar a tener, ustedes son parte de lo que soy ahora y
agradezco bastante eso, gracias a todos.
vi
AGRADECIMIENTOS
A la Ciencia
Si no conozco una cosa, la investigaré.
Louis Pasteur (1822-1895) Químico y microbiólogo francés.
A los hombres les encanta maravillarse. Esto es la semilla de la ciencia.
Emerson (1803-1882) Poeta y pensador estadounidense.
Me has entregado tanto a cambio de solo mi atención y mi tiempo, no me parece un
intercambio justo, pero prometo regresarte todo lo que mi capacidad pueda ofrecer y
un poco más, el gusto de estudiar biología es algo que tratare de inculcar a cualquier
persona que se cruce por mi camino.
Dr. Benito Pereyra Alférez
Doctor, muchas gracias por recibirme en su laboratorio. Muchas gracias por los
consejos tanto académicos como para la vida diaria, por su confianza tomando en
cuenta que llegue a este laboratorio con solo una idea para un proyecto de un
concurso y termine deseando quedarme, porque la frase "No queremos ser técnicos,
queremos ser científicos", se ha impreso en mi mente como una ley, espero seguir
trabajando con usted en el futuro. Tiene todo mi respeto y admiración.
Dra. Licet Villarreal Treviño
Doctora, muchas gracias por permitirme realizar mi servicio social en el laboratorio de
microbiología general, y además tener una estadía como becario, esos fueron mis
primeros pasos hacia donde me encuentro ahora, sus consejos siempre fueron bien
recibidos, incluso aquellos que tenían relación con mi forma de vestir, mi cabello y
presencia, tome nota de cada uno de ellos, no se preocupe, cada vez me veo más
como un profesional, le agradezco todas sus atenciones.
Gracias a la beca y los apoyos otorgados por CONACyT y CIBIOGEM
Proyecto: 164429 durante la realización de esta investigación
A todos los compañeros con los cuales pase mi estadía de servicio social y becario
en el Laboratorio de Microbiología General de la Facultad de Ciencias Biológicas,
gracias a ustedes aprendí bastante y me divertí mucho, gracias por los recuerdos.
A todos los integrantes del Laboratorio L4 del Instituto de Biotecnología, a pesar del
hecho de no verme tanto en el laboratorio siempre han procurado ayudarme en
cualquier cosa que necesite o sobre alguna duda y eso lo aprecio bastante.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
Bacillus thuringiensis
Bt
ingeniería genética
IG
Ha
Hectárea(s)
°C
Grado(s) Celsius
mm
Milimetro(s)
ml
Mililitro(s)
ADN
Acido desoxirribonucleico
GM
Genéticamente Modificado
OGM
Organismo geneticamente modificado
pH
Potencial de hidrogeno
kDa
Kilodaltones
ANP
Aminopeptidasa
ALP
Fosfatasa alcalina
Mg
Magnesio
GPI
Glicosilfosfatidilinositol
BBMV( por sus siglas en inglés)
Vesículas del intestino medio
ppm
Partes por millón
h
Hora(s)
M
Molar
mM
Milimolar
Xg
Aceleración por gravedad
TA
Temperatura ambiente
µg
Microgramo(s)
viii
g
Gramo(s)
Min
Minuto(s)
µl
Microlitro(s)
mg
Miligramo(s)
rpm
Revoluciones por minuto
nM
Nano molar
SDS
Dodecil-sulfato de sodio
PM
Peso molecular
EPA
Enviromental protection agency
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
Hz10
Helicoverpa zea resistente a 10 µg/g de
dieta
Helicoverpa zea resistente a 20 µg/ g
de dieta
Pares de bases
Hz20
pb
LC50
LC99
Concentración a la cual muere el 50%
de los organismos
Concentración a la cual muere el 99%
de los organismos
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura
1
Titulo
Pág.
Estadios de larva, pupa y adulto de H. zea.............................................
7
2
Imagen de microscopía electrónica de transmisión de una cepa de B.
thuringiensis en estado de esporangio...................................................
11
3
Mecanismo de acción de proteínas Cry en insectos lepidópteros..........
13
4
Estructura tridimensional de diferentes toxinas Crya............................
14
5
Inmunotiras Agdia® presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y
resistencia a glifosato (CP4 EPSPS)......................................................
29
6
Hojas utilizadas en el diagnóstico de expresión del algodón GM.........
30
7
Inmunotiras Agdia® presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y
resistencia a glifosato (CP4 EPSPS)......................................................
30
Desarrollo en agar nutritivo de la cepa HD73 expresante de la
protoxina Cry1Ac..................................................................................
31
Tinción en Cristal Violeta de la cepa HD73 de Bacillus thuringiensis
mostrando la proteína Cry1Ac en su forma bipiramidal........................
32
Gel de poliacrilamida-SDS al 10% de la protoxina Cry1Ac (130
KDa) presente en la cepa de Bacillus thuringiensis HD73...................
32
Placa de 24 orificios empleada en la determinación de la LC50 y los
bioensayos de resistencia.......................................................................
33
Diferencia de tamaño entre una larva control y una larva expuesta a
una concentración de 10 µg/g de protoxina Cry1Ac después de una
semana....................................................................................................
35
Determinación de sexos en H. zea del lado izquierdo se encuentra un
macho y del lado derecho una hembra...................................................
36
PCR con los iniciadores Apn1Ha, Apn2Ha y CadLHz.........................
37
8
9
10
11
12
13
14
x
LISTA DE TABLAS
Tabla
Titulo
Historial de producción máxima de algodón............................................
1
Pág.
9
2
Historial de producción de Algodón GM en México...............................
10
3
Asociaciones entre los principales tipos de cristales de B. thuringiensis,
proteínas Cry y su espectro de actividad insecticida................................
11
Iniciadores utilizados para la amplificación de genes de los receptores
involucrados en la resistencia en lepidópteros.........................................
28
5
Transcurso cronológico de los ensayos en H. zea....................................
34
6
Cruza de colonias de H. zea......................................................................
35
7
Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias..................................
36
8
Segunda cruza de colonias de H. zea........................................................
37
4
xi
RESUMEN
El algodón biotecnológico BollgardII® es un material que expresa las toxinas
Cry1Ac y Cry2Ab de Bacillus thuringiensis. Estas semillas, también llamadas algodón
Bt es el cultivo de mayor cobertura a nivel mundial. Entre las principales plagas del
algodonero y razón de este estudio se encuentra el gusano bellotero, Helicoverpa zea.
La preocupación de aparición de resistencia en campo al algodón Bt, ha generado
preocupación y motivo de estudio. El objetivo de este trabajo fue la obtención de
colonias de H. zea resistentes a la protoxina Cry1Ac y la forma de herencia de la
resistencia. Visitamos campos cultivados con BollgardII® en San Pedro de Las
Colonia, Coah., Sonoyta, Son., y el valle de Mexicali, BC., en busca de H. zea y
Pectinophora gosypiella (gusano rosado). Demostramos que las plantas de los campos
visitados expresan Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia al herbicida glifosato. Sin embargo
no encontramos adultos, huevos, larvas o pupas de ninguno de los insectos buscados. A
partir de una colonia de laboratorio iniciamos los ensayos de sensibilidad y resistencia.
El resultado de los bioensayos con protoxina de Cry1Ac, mostró una LC50 de 1.309
g/gramo de dieta. La búsqueda de los posibles receptores indicó la presencia de genes
que codifican para dos alelos de aminopeptiodasa N y uno de cadherina. Cuando larvas
neonatas fueron expuestas a la protoxina Cry1Ac a dos concentraciones altas, 10 y 20
µg/g dieta, el número de sobrevivientes en los bioensayos, sugiere que la resistencia
podría estar asociada a un alelo parcialmente dominante. Las larvas resistentes son, en
su mayoría machos en proporción 2:1 con respecto a hembras. En las colonias se
observó bajo peso larval, bajo peso en estado de pupa, prolongación de los estadios
larvales y el estado de pupa, pupas deformes, y adultos con problemas de copula. La
búsqueda de la F2, cruza 1: hembras R x machos S; cruza 2: machos R x hembras S;
cruza 3, machos R x hembras R, demostró que: i) cruza 1, hubo oviposición, pero
ninguno fértil; ii) cruza 2, oviposición fértil, pero muy reducida con respecto a lo
esperado; iii) cruza 3, oviposición infértil. El costo de aptitud de H. zea está
directamente relacionado con la selección de resistencia a Cry1Ac. El estudio de la
resistencia en laboratorio sirve para crear mejores estrategias de control en los cultivos
a campo abierto. Las medidas en campo abierto como lo es la expresión de altas dosis
de toxina y refugios es un método efectivo para evitar que las poblaciones de plagas
puedan generar una resistencia.
1. INTRODUCCION
El algodón representa alrededor del 40% de la fibra natural a nivel mundial y es
cultivado comercialmente en 78 países. Sin embargo, éste puede ser el blanco de
>1300 especies de insectos, entre los que destacan más de 30 especies de lepidópteros,
principalmente Helicoverpa zea and Heliothis sp., Pectinophora gossypiella, y Earias
sp. (Benedict y Ring. 2004; Naranjo. 2011).
El control de los insectos plaga se realiza, tradicionalmente con insecticidas
químicos, como piretroides, organoclorados y organofosforados. Sin embargo, éstos
tienen la limitante de ser inespecíficos y afectan, no solo a la fauna silvestre sino
también al ser humano. Por tanto, el control de las plagas se modificó con el uso de
organismos enemigos naturales de las plagas: entomopatógenos y entomófagos. Entre
los agentes de mayor uso se encuentra Bacillus thuringiensis (Bt). Bt es un organismo
esporulado que sintetiza un cristal de naturaleza proteica (δ-endotoxinas) con actividad
tóxica hacia ciertos organismos, especialmente insectos Lepidópteros, Dípteros y
Coleópteros (Ferré et al., 2008; Iracheta et al., 2000; Marroquín. 2006).
Los productos comerciales a base de Bt se aplican en forma de polvos
humectables sobre el área foliar de los cultivos, con la desventaja de la inactivación por
radiación solar y lavado por lluvia. La clonación y expresión de genes de δ-endotoxina
en otras bacterias y en plantas ha incrementado el uso de Bt como el insecticida
biológico de mayor uso (Tabashnik et al., 2009). El cultivo de plantas modificadas por
ingeniería genética (IG), entre 1996 y 2009 representaron cerca de mil millones de Ha
en varios países alrededor del mundo, con un incremento constante de 10 millones de
Ha/año desde 1996 (James. 2009; Naranjo. 2011).
En el 2009, plantas modificadas por ingeniería genética (IG) fueron sembradas
en más de 134 millones de Has en 25 países, representando alrededor de 63% del total.
Entre las plantas de mayor cultivo se encuentran las tolerantes a herbicidas como
glifosato o glufosinato (James. 2009). Mientras que las resistentes a insectos
produciendo las toxinas de Bt comprenden el resto, pero comparten el 57% con las
tolerantes a herbicidas (Benedict y Ring. 2004; Naranjo. 2011).
Entre los principales productos biotecnológicos del algodonero, se encuentran
Bollgard® y Bollgard II®. Bollgard sintetiza solo la toxina Cry1Ac, pero el Bollgard
II® produce dos; Cry1Ac y Cry2Ab (Moar y Anilkumar. 2007).
En los Estados Unidos la patente de Bollgard® finalizó en el 2009, por lo que
ha sido reemplazado por el Bollgard II® y el Widestrike®. Con éste último, se obtiene
el plus de la tolerancia a herbicidas (Naranjo. 2011). A pesar de todos estos desarrollos
biotecnológicos, se ha reportado la aparición de resistencia a las toxinas de Bt en varios
insectos plaga, entre los que se encuentra Pectinophora gossypiella "el gusano rosado",
la principal plaga del algodonero (Tabashnik et al., 2009; Soberón et al., 2007; Ferré et
al., 2008), además de otros insectos plaga como Helicoverpa zea (Sivasupramaniam et
1
al., 2008; Anilkumar et al., 2009; Jackson et al., 2006 ) y Heliothis virescens ( Jurat et
al., 2003, 2004, 2006).
Una solución, parcial, al problema de resistencia ha sido la obtención de
semillas que generen plantas que sinteticen dos toxinas, como el Bollgard II®, las dos
proteínas actúan independientemente, uniéndose a receptores distintos en el intestino
del insecto (Moar y Anilkumar. 2007). Otra posible solución podría ser la generación
de plantas con toxinas modificadas, como la Cry1Ab, donde se demostró que la αhélice 5 es la responsable de la resistencia en "el gusano rosado" (Soberón et al., 2007).
Con respecto a las plantas Bt y las combinaciones con tolerancia a herbicidas,
quedó de manifiesto que solo las plantas Bt rinden ahorros significativo. Mientras que
las plantas con tolerancia a herbicidas en la mayoría de los casos no mostraron
diferencias con las normales, al ser necesario aplicar mayor cantidad del herbicida para
eliminar a las malezas (Cataneo et al., 2006.)
En las zonas algodoneras del país como Mexicali, BC., La Laguna, Sonoyta,
Son., Delicias, Chih., y Tamaulipas, los insectos P. gossypiella, H. zea, H. virescens
y Spodoptera exigua son las principales plagas del algodón y afectan gravemente su
producción, causando cuantiosas pérdidas año con año.
En nuestro país la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca
y Alimentación (SAGARPA) en asociación con la Comisión Intersecretarial de
Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (CIBIOGEM) solicitaron
revisar el estado de la entomofauna asociada al algodón biotecnológico, especialmente
Bollgard II® (CIBIOGEM. 2011). Ante esta situación, el objetivo de nuestro trabajo
consistió en: i) revisar el estado de colonización de los cultivos biotecnológicos
Bollgard II® con los insectos mencionados; ii) establecer una colonia de H. zea en el
laboratorio, conocer la línea basal de susceptibilidad, inducir resistencia y conocer la
forma de herencia de la misma.
2
2. IMPORTANCIA
Aún y cuando previo a la comercialización del algodón Bt en EUA, Canadá y la
Unión Europea se evaluaron los potenciales riesgos ambientales de las plantas
transgénicas resistentes a insectos, se ha requerido de una enorme inversión de recursos
económicos para evaluar el impacto ambiental en cultivos a "cielo abierto" (EPA.
2007). Un primer paso es la determinación del potencial riesgo de toxicidad hacia
entomofauna benéfica o no blanco (Duan et al., 2010; Wolfenbarger et al., 2008). De
no existir daño de muerte o toxicidad, entonces se juzga como de riesgo mínimo (Rose.
2006; Romeis et al., 2006).
En 2010, Duan y cols. dirigieron un estudio para evaluar el impacto sobre
organismos no blanco, concluyendo que, aún y cuando no existe un efecto,
estadísticamente significativo, sobre los organismos no blanco es preciso realizar el
estudio ambiental (Duan et al., 2010). A pesar de la enorme importancia económica y
ecológica, poco es conocido sobre la genética de la mayoría de los lepidópteros, debido
a su gran número de cromosomas, en algunas especies un gen recesivo autosómico es
el que confiere resistencia a, por lo menos, cuatro toxinas de Bt (Heckel et al., 1999).
El conocimiento de la fisiología, bioquímica y genética para el desarrollo de
resistencia en insectos es esencial para designar estrategias efectivas para el manejo de
plagas resistentes, la investigación en esta área tiene como objetivo aportar
información sobre las características de unión implicadas principalmente, de acuerdo a
estudios realizados, en el comportamiento de la resistencia hacia la toxina Cry1Ac de
Bt sobre H. zea como insecto plaga de los algodoneros de México.
3
3. HIPOTESIS
La presión constante de la δ-endotoxina Cry1Ac en una población de H. zea podría
generar en el insecto una resistencia progresiva a dicha toxina.
4
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
 Obtener colonias de H. zea resistentes a la protoxina Cry1Ac e incrementar el
conocimiento sobre la resistencia de esta plaga a la proteína Cry presente en los
cultivos transgénicos de algodón de nuestro país.
4.2. Objetivos Específicos
1. Analizar la susceptibilidad de H. zea presente en la zona algodonera de México
hacia la protoxina Cry1Ac de Bacillus thuringiensis HD-73.
2. Determinar la LC50 de la protoxina Cry1Ac en la población de H. zea presente en
el laboratorio de cría de insectos del Instituto de Biotecnología, UANL.
3. Lograr generar una resistencia inducida en laboratorio hacia la protoxina Cry1Ac
en la población de H. zea.
4. Identificar la forma de herencia de la resistencia a Cry1Ac en H. zea.
5. Detectar el gen para cadherina, y aminopeptidasa N en las colonias resistentes y
susceptibles a Cy1Ac
5
5. ANTECEDENTES
5.1. Características de Helicoverpa zea (Boddie)
H. zea (Boddie) está registrado como polífago en hábitos alimenticios pero
parece mostrar una preferencia definida en Norteamérica por las mazorcas y espigas
jóvenes de maíz, y particularmente para cultivares de maíz dulce y palomero y también
para el sorgo. Tiene como preferencia alimenticia a las flores y frutos de la planta
hospedera. Muchos hospederos se registran dentro de la familia Poaceae, Malvaceae,
Fabaceae y Solanaceae; en total se registran más de 100 especies de plantas como
hospederos. Los cultivos más comúnmente registrados como hospederos son maíz,
sorgo, algodón, Phaseolus, chícharo, tomate, berenjena, chile, haba y, en menor grado,
Trifolium, okra, col, lechuga, fresa, tabaco, girasol, Cucurbitaceae y muchas otras
leguminosas (Smith et al., 1992).
Distribución geográfica: desde Norteamérica, hasta Sudamérica, incluyendo
Centroamérica y el Caribe.
Biología: los huevecillos son ovipositados en los pelos del jilote del maíz en
pequeños números (uno a tres), pegados a los tejidos de las plantas. Hasta 3,000
huevecillos han sido ovipositados por una sola hembra en cautiverio, pero es más usual
en forma silvestre que sea de 1000 a 1,500 por hembra. La eclosión ocurre después de
2-4 días y los huevecillos cambian de color de verde a rojo o gris. Las pequeñas larvas
grises primero se alimentan del cascarón del huevo y después de un corto descanso se
vuelven muy activas derivado de lo cual empiezan a alimentarse de la planta. El
desarrollo larval usualmente toma de 14-25 (promedio 16) días, pero bajo condiciones
frías requiere 60 días. En el instar final, usualmente el sexto, deja de alimentarse y la
larva completamente desarrollada abandona la planta y desciende al suelo. Esta se
entierra en el suelo a unos 10-12 cm y forma una celda cubierta de tierra, donde
descansa en un estado prepupal por 1-2 días, antes de que pupe finalmente. Los adultos
son de hábitos nocturnos y emergen en las tardes. Los campos de maíz de EUA
regularmente producen 40,000 a 50,000 palomillas adulto/Ha. El vuelo de los adultos
responde a las radiaciones de luz nocturna y son atraídos por trampas de luz
(Hardwick. 1968), especialmente el tipo ultravioleta, en compañía de muchos otros
noctuidos locales. La longevidad del adulto es registrada por ser cercana a 17 días en
cautiverio; éstos beben agua y se alimentan de néctar de nectarios florales y
extraflorales. Las palomillas vuelan fuertemente y son migrantes estacionales
regulares, vuelan cientos de kilómetros de EUA a Canadá. El ciclo biológico puede ser
completado en 28-30 días a 25°C y en los trópicos puede haber hasta 10-11
generaciones por año. Todos los estados del insecto son encontrados a lo largo del año
si el alimento está disponible, pero el desarrollo disminuye o se detiene por sequía o el
frío.
6
Síntomas: las plantas jóvenes tienen hoyos severos en las hojas siguiendo la
alimentación en la hoja apical. En plantas grandes las sedas son rozadas y los
huevecillos pueden ser encontrados pegados a las sedas.
Morfología: Los huevecillos son subesféricos, con surcos radiales, de 0.52 mm
de alto y 0.59 mm de diámetro, depositados en forma individual en el sustrato de la
planta, verdes cuando se ovipositan, turnándose rojos y finalmente grises antes de la
eclosión. Las larvas recién emergidas son pequeñas, grises, tienen una cápsula cefálica
negruzca; pasan usualmente por seis instares, pero cinco o siete no son comunes, el
tamaño final del cuerpo es de aprox. 40 mm de largo. En el tercer instar se pueden
desarrollar dos fases de color: café (la fase predominante) y verde (menos frecuente).
Están presentes líneas longitudinales de color blanco, crema o amarillo, y la
banda espiracular es la más distintiva. Conforme la larva se desarrolla, el patrón se
define mejor, pero en el instar final (sexto) la coloración cambia abruptamente en un
patrón brillante, frecuentemente rosado y con estriaciones extra.
Pupa: una pupa típica de un noctuido, de color café rojiza brillante, de aprox. 16
mm de largo, y con dos espinas cremaster distintivas.
Adulto: palomilla de coloración café con expansión alar de 35-40 mm; ala
anterior café pálido a verdosa con marcas oscuras transversales, alas posteriores pálidas
con una banda marginal ancha oscura. Los adultos son muy similares en apariencia y
ambos son indistinguibles morfológicamente de Helicoverpa armígera, pero difieren
en varios detalles de su genitalia (Hardwick. 1965).
Figura 1. Estadios de larva, pupa y adulto de H. zea.
7
5.2. Características de Gossypium hirsutum
El algodón pertenece al género Gossypium, familia Malvaceae, el cual
comprende un amplio número de especies. Citológicamente las especies de este género
se pueden dividir en: diploides (n=13) y tetraploides (n=26), cuya distribución
geográfica se encuentra por todo el mundo. De las especies diploides únicamente G.
herbaceum y G. arboreum han sido cultivadas comercialmente, y aún son importantes
en áreas restringidas de la India, Asia y África. Entre las tetraploides, del Nuevo
Mundo, solamente G. hirsutum y G. barbadense se les cultiva ampliamente y son las
responsables del 98% de la producción mundial de fibra de algodón.
La especie de algodón que se cultiva comercialmente en el país es Gossypium
hirsutum L. y es originaria de México y Centro América, en donde se pueden encontrar
plantas nativas creciendo como arbustos de carácter perenne y crecimiento
indeterminado. A través del mejoramiento genético el hábito de crecimiento de esta
planta ha sido modificado para adaptarla a la producción comercial, pasando de las
plantas nativas, perennes e indeterminadas a plantas anuales y de crecimiento más o
menos determinado que producen algodón semilla más temprano que las plantas
nativas (Cadena. 2000).
Existen actualmente zonas de producción en diversos estados del norte del país.
- La Comarca Lagunera (Coahuila y Durango) es la zona en la que se cultiva la mayor
cantidad de algodón en México. Los estados en los que el algodón se cultivó con éxito
durante 2011 fueron: Sinaloa, Sonora, Baja California, Chihuahua, Tamaulipas,
Coahuila y Durango. De acuerdo con el Comité Nacional Sistema Producto Algodón,
A.C., el historial de producción máxima en México se ilustra en la tabla 1.
5.3. Algodón GM en México
Desde hace 15 años, la ingeniería genética, también llamada tecnología del
ADN recombinante, se está aplicando para obtener plantas de algodón GM
(Genéticamente Modificados) resistentes a insectos y tolerantes a herbicidas,
existiendo un gran potencial para introducir otras características deseables en la planta.
Esta nueva tecnología es considerada como un instrumento alternativo para modificar y
mejorar los cultivos; particularmente en el caso del algodón donde las pérdidas por
insectos y malezas son altamente significativas. Según la Secretaría de Agricultura,
Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), el uso de semillas
GM en los cultivos de algodón reduce significativamente el volumen del agua
requerido para el riego. Además, los cultivos son menos dañinos para el medio
ambiente debido al uso racional de pesticidas. El algodón GM puede aumentar la
productividad y la renta notablemente y, por tanto, pueden ser un motor de crecimiento
económico rural que contribuya a mejorar las condiciones de vida de los agricultores.
8
Tabla 1. Historial de producción máxima de algodón (Adaptada del Comité Nacional Sistema Producto
Algodón, A.C, 2011).
AÑO
1950-1951
1955-1956
1957-1958
1958-1959
1960-1961
1962-1963
1963-1964
1965-1966
1968-1969
1970-1971
1974-1975
1977-1978
1983-1984
1989-1990
1996-1997
2001-2001
2001-2002
2008-2009
2009-2010
2010-2011
SUPERFICIE Y PRODUCCIONES POR CICLO
MILES DE
MILES DE
RENDIMIENTO
HAS.
TON.
(TON./HA)
878.0
261.51
0.290
1,042.2
504.75
0.480
905.8
471.47
0.520
1,007.8
531.32
0.530
904.4
473.98
0.520
832.9
546.78
0.650
788.9
476.33
0.600
792.9
593.03
0.750
723.3
554.87
0.770
404.7
326.92
0.810
580.9
512.76
0.880
389.4
372.02
0.950
227.0
229.12
1.010
191.0
175.46
0.920
285.0
263.81
0.920
71.68
76.47
1.060
79.58
96.85
1.220
101.50
130.38
1.280
68.80
94.37
1.370
183.778
287.43
1.560
Hasta el año 2010 se han aprobado 182 permisos de liberación al ambiente de
algodón genéticamente modificado, es decir el 58.5% del total de permisos de OGM’s
otorgados por el gobierno mexicano.
La Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación
(FAO) afirmó que los cultivos GMs son una de las herramientas claves para permitir
que la actividad agrícola siga siendo productiva (Agro-Bio México, 2011).
9
Tabla 2. Historial de producción de Algodón GM en México (Adaptada de Medel. 2011).
AÑO
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
SUP. TOTAL Ha
314,776
214,378
249,602
149,229
80,166
91,898
40,482
62,892
110,007
129,533
117,655
111,575
104,741
72,251
Algodón GM (Ha)
897
16,677
35,629
18,677
26,760
25,211
15,195
26,058
65,230
78,550
54,750
58,794
63,347
39,729
Algodón GM (%)
0.3%
7.8%
14.3%
12.5%
33.4%
27.4%
37.5%
41.4%
59.3%
60.6%
46.5%
52.3%
60.5%
54.9%
5.4. Características de B. thuringiensis
Es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta, que durante su ciclo de vida
presenta dos fases principales: crecimiento vegetativo, donde las bacterias se duplican
por bipartición, y esporulación, un programa de diferenciación de bacteria a espora. Bt
es considerada una bacteria ubicua, ya que se ha aislado de todas partes del mundo y de
muy diversos sistemas, como suelo, agua, hojas de plantas, insectos muertos, telarañas,
etc. A Bt se le caracteriza por producir un cuerpo paraesporal conocido como cristal
durante su fase de esporulación, el cual es de naturaleza proteínica y tiene propiedades
insecticidas (Soberón y Bravo. 2007).
5.5. Cristales paraesporales
Desde el instante en el que ocurre el englobamiento de la pre-espora hasta su
maduración, en simultaneidad con la formación de la espora, tiene lugar en B.
thuringiensis la síntesis de uno o varios cristales parasporales, que pueden representar
hasta un 30% del peso seco del esporangio (Bulla et al., 1980). Estos cristales pueden
presentar distintas morfologías y pueden clasificarse en bipiramidales, cúbicos,
cuadrados aplanados, esféricos y otras formas atípicas menos frecuentes (Khetan.
2001). Se logró en muchos casos establecer asociaciones entre la morfología del cristal,
sus proteínas Cry constituyentes, el peso molecular de éstas y su espectro de actividad
insecticida (Tabla 3) (López e Ibarra. 1996).
10
Tabla 3. Asociaciones entre los principales tipos de cristales de B. thuringiensis, proteínas Cry y
su espectro de actividad insecticida (Adaptada de Sauka. 2008).
Tipo de Cristal
Grupo
Bipiramidal
Cry1
Peso
molecular
(kDa)
130.0
Cúbico
Cry2
65.0
Cuadrado
aplanado
Esférico
Cry3
72.0
Cry4A,Cry4B,
Cry10 y Cry11
135.0, 128.0,
78.0, 72.0
Toxicidad
Lepidópteros
Lepidópteros y
Dípteros
Coleópteros
Dípteros
Sin embargo, existen trabajos en los que se describieron cristales parasporales
que, a pesar de tener morfologías asociadas a una toxicidad específica, no parecen
poseer actividad insecticida alguna. Los cristales de B. thuringiensis pueden ser
degradados por la acción de los microorganismos del suelo (West. 1984) y, al igual que
sus esporas, también pueden ser inactivados por la acción de la luz ultravioleta (Pusztai
et al., 1991). El cristal parasporal se ubica en el interior del esporangio y, por lo
general, fuera del exosporio de la espora, y ambos son finalmente liberados tras la lisis
celular.
Figura 2. Imagen de microscopía electrónica
de transmisión de una cepa de B. thuringiensis
en estado de esporangio. C: cristal parasporal;
E: espora. Barra, 0,5 mm (Imagen tomada de
Sauka. 2008).
Existen algunos casos donde se describieron cristales dentro del exosporio, por
lo que estos continúan junto a las esporas tras la lisis. En otro caso muy atípico, se
pudo observar que los cristales se forman fuera del exosporio, pero ambos permanecen
11
indefinidamente dentro de un esporangio que no se lisa, preservándolos de una rápida
degradación. Cada cuerpo de inclusión cristalino puede estar constituido por proteínas
Cry de una o varias clases que se agrupan entre sí mediante puentes disulfuro
(Knowles. 1994). La estabilidad de estas uniones condiciona el pH de solubilización
particularmente en el caso de los cristales bipiramidales.
El cristal proteínico está constituido por proteínas denominadas δ-endotoxinas
también conocidas como proteínas Cry. Se han encontrado δ-endotoxinas activas
contra insectos lepidópteros (mariposas y palomillas), coleópteros (escarabajos),
dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también contra otros
invertebrados como nematodos, gusanos planos y protozoarios (Soberón y Bravo,
2007).
5.6. Modo de acción de las toxinas Cry
Los síntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles
ingieren los cristales y esporas de Bt son: cese de la ingesta, parálisis del intestino,
diarrea, parálisis total y finalmente la muerte. De manera general se acepta que las
toxinas Cry son toxinas formadoras de poro que ejercen su actividad tóxica al provocar
un desequilibrio osmótico en las células epiteliales donde se insertan en la membrana.
Soberon y Bravo ( 2007) proponen el modo de acción donde existe la formación de un
poro lítico una vez que las toxinas se insertan a la membrana.
Las proteínas Cry son producidas como protoxinas que requieren ser
procesadas proteolíticamente por proteasas presentes en el intestino de insectos
susceptibles. Este procesamiento proteolítico libera fragmentos tóxicos de 55 a 65 kDa
que interaccionan con proteínas receptoras presentes en la microvellosidad de las
células intestinales de los insectos blanco. Posteriormente, las toxinas se insertan en la
membrana formando un poro lítico. A la fecha se han resuelto las estructuras
tridimensionales de varias toxinas Cry activas contra insectos coleópteros,
lepidópteros, dípteros y una con actividad dual.
A pesar que la identidad entre estas toxinas es baja (en algunos casos menores
al 25 %), muestran una estructura similar compuesta por tres dominios. El dominio I
está constituido por siete hélices a antiparalelas y anfipáticas. Seis de éstas forman un
ramillete que rodea a la hélice α 5. Éste es el dominio que forma el poro iónico
12
Bacillus thuringiensis
(Bt)
Solubilizacion
Activacion
1
Maiz Bt
Algodón BT
Unión con el
receptor
Células del
intestino medio
4
Cadherina
Monomero
Toxico
2
3
Septicemia
Muerte de la
larva
Inserción en
membrana
Muerte Celular
Activación de
la vía de
muerte celular
Figura 3. Posterior a la ingesta, solubilización y activación en el intestino medio, el modo de acción celular
es: 1) Unión de la toxina a cadherina y corte desde su extremo C-terminal para generar la forma
monomérica activa; 2) inicio de la cascada de señalización dependiente de Mg2+, estimulación de exocitosis
de cadherina desde vesículas intracelulares hacia la membrana apical y consiguiente muerte celular; 3)
formación de la estructura oligomérica pre-poro; 4) unión del oligómero a la aminopeptidasa N (APN) y/o
fosfatasa alcalina (ALP) y migración a zonas específicas de la membrana, formación del poro y, finalmente
desequilibrio osmótico y consiguiente muerte celular (Imagen tomada de Jurat-Fuentes) (Bravo et al., 1998;
Zhang et al., 2006).
El dominio menos conservado en secuencia y estructura terciaria entre las
toxinas Cry es el dominio II. Este dominio está formado por tres láminas plegadas b y
por tres asas. En las asas de estas láminas β se observa la mayor diferencia estructural.
El dominio II juega un papel fundamental en la especificidad de la toxina, donde las
asas interaccionan con el receptor localizado en las microvellosidades de las células
epiteliales del intestino medio. El dominio III está formado por dos láminas plegadas β
antiparalelas formando un sándwich. El dominio III también está involucrado en la
interacción con receptores.
13
Figura 4. Estructura tridimensional
de diferentes toxinas Cry, el
dominio I, dominio II y dominio III
están mostrados en rojo, verde y
azul respectivamente. El dominio
de la protoxina N-terminal de
Cry2Aa esta mostrado en amarillo
(Imagen tomada de Piggot y Ellar.
2007).
Las proteínas que se han propuesto como posibles receptores de las toxinas
Cry1A en insectos lepidópteros son la aminopeptidasa N (APN) y una proteína de la
familia de las cadherinas (BtR). La APN es una proteína con masa aparente de 120 kDa
que se encuentra anclada a la membrana a través de un grupo glicosilfosfatidilinositol
(GPI), mientras BtR tiene una masa de entre 175 a 210 kDa dependiendo del insecto
lepidóptero.
La interacción de la toxina con el receptor cadherina promueve un corte
adicional del extremo amino terminal, facilitando la formación de un oligómero o
preporo formado por cuatro monómeros que es el responsable de la inserción a la
membrana y la formación del poro. Para que el pre-poro se inserte a la membrana, se
requiere que interaccione con el receptor APN. Las proteínas ancladas a la membrana
por GPI se distribuyen de manera preferencial en regiones específicas de la membrana,
conocidas como balsas lipídicas, que tienen características particulares debido a su alto
contenido de colesterol y glucolípidos. La interacción del pre-poro de la toxina Cry con
la APN facilita la inserción del oligómero en las balsas lipídicas membranales, lo que
resulta en la formación del poro (Soberón y Bravo. 2007).
14
5.7. Receptores asociados a la resistencia a las toxinas Cry
La unión de las toxinas Cry en los receptores epiteliales del intestino medio de
insectos es un importante factor determinante de la especificidad. La correlación entre
los unión y la toxicidad se demostró primero en las vesículas del intestino medio
(BBMV por sus siglas en inglés) preparado a partir de microvellosidades mediante el
uso de una técnica desarrollada por Wolfersberger (1984).
Después de haber sido demostrado la alta afinidad y la toxicidad en los sitios de
unión presentes en el intestino medio del insecto, los esfuerzos para identificar y clonar
los receptores se intensificaron. Muchos posibles receptores de las toxinas Cry ya se
han informado, de los cuales el mejor caracterizado es el receptor aminopeptidasa N
(APN) ( Knight et al., 1994; Rajagopal et. al., 2003) y los receptores de cadherina
(Gahal et al., 2001; Nagamatsu et al., 1998) identificados en lepidópteros.
Recientemente se ha estudiado otro posible receptor, la fosfatasa alcalina (ALP)
(Jurat-Fuentes; 2004, 2006; Caccia et al., 2012) y se ha asociado a la resistencia
adquirida hacia las toxinas Cry. En las siguientes secciones, cada clase de receptores se
ser discutido con un enfoque particular en las interacciones de unión del receptor de la
toxina y la capacidad de los receptores para conferir susceptibilidad a la toxina.
5.7.1. APN
La familia APN es una clase de enzimas que desdoblan aminoácidos neutros
desde el extremo N-terminal de los polipéptidos. Tienen una variedad de funciones en
una amplia gama de especies, pero en la intestino medio de larvas de lepidópteros,
trabajan en cooperación con endopeptidasas y carboxipeptidasas para digerir proteínas
derivadas de la dieta del insecto (Wang et al., 2005).
5.7.1.1. APN como una proteína de unión a toxinas Cry
Las proteínas Cry son tóxicas para los lepidópteros, y varias toxinas diferentes,
incluyendo, Cry1Aa Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ba, Cry1C, ay Cry1Fa, han demostrado
que se unen a la APN (Piggot y Ellar. 2007). Sobre la base de los experimentos
llevados a cabo hasta el momento, APN y proteínas dentro de estas familias muestran
diferentes patrones de unión. Algunas APN se unen a múltiples toxinas Cry y algunas
toxinas Cry se unen a múltiples APN, y en otros casos, los pares únicos de APNToxinas han sido reportados. Mientras que muchas combinaciones de unión a la
toxina-APN aún no se han probado, los datos preliminares están proporcionando una
idea de los factores determinantes de la unión al receptor.
La importancia biológica de la interacción entre las APN y las toxinas Cry
demuestra la importancia en el proceso de resistencia. Hasta la fecha, diecisiete
diferentes APN han sido reportadas para unirse a las toxinas Cry y, sin embargo, sólo 2
15
han demostrado mediar en la susceptibilidad de la toxina. Doce de las diecisiete APNs
no se han estudiado para identificar la funcionalidad por cualquier método. Los
métodos in vivo para probar la funcionalidad de las APN han mostrado una promesa
considerable, y el uso de estos métodos para estudiar las APNs restantes puede
conducir a una mejor comprensión de la importancia global de esta clase de receptor de
la toxina Cry (Piggot y Ellar. 2007).
5.7.2. Cadherinas
La superfamilia de proteínas cadherina es muy diversa y sirve en una variedad
de funciones, incluyendo la adhesión celular, la migración, la organización del
citoesqueleto, y la morfogénesis (Angs et al., 2001). La expresión de cadherinas está
muy regulada, tanto espacial como temporalmente, y es a menudo única para un tipo de
célula particular. La proteínas se definen por la presencia de repetidos dominios de
unión de calcio o repeticiones de cadherina de aproximadamente 110 aminoácidos de
longitud.
La proteína receptora para CryIAb (BT-R,), fue el primer receptor que se clonó
y expresó a partir de un cDNA de Manduca sexta, este receptor mostró un 30 - 60% de
similitud y un 20- 40% de identidad a los miembros de la familia de las cadherinas, que
son glicoproteínas transmembranales encargadas de mediar la agregación celular,
dependiente de calcio; pueden estar involucradas en el transporte membranal,
posiblemente esta función es similar al transporte de péptidos en las proteínas tipo
cadherinas de humanos (Vadlamudi et al., 1995).
En H. virescens se rebeló la identificación de una cadherina como proteína de
unión a la toxina Cry esto se logró por Gahan y cols. (2001), donde se estudió una cepa
de laboratorio de H. virescens, YHD2, con un máximo nivel de resistencia recesiva a
Cry1Ac (relación de resistencia, 10,128X). Los estudios genéticos revelaron que un
solo gen fue el mayor responsable de 40 a 80% de la resistencia. Con el conocimiento
que en algunos insectos, la resistencia va acompañada de una pérdida en la unión de la
toxina, los investigadores analizaron los genes de las conocidas proteínas de unión a la
toxina Cry para ver si se asignan a la región que confiere resistencia. Dos genes de
codificación de APNs (clase 1 y clase 3) se les realizaron pruebas de la vinculación,
pero dieron un resultado en el cual se unían a diferentes regiones del genoma. Se sabía
que era una cadherina la encargada de la unión a la toxina Cry pero aún no se podía
aislar en H. virescens. Por esta razón, los investigadores buscaron y encontraron un
homólogo BtR175 en una cepa susceptible. El gen era 70% idéntica a BtR175 y fue
nombrado HevCaLP. Posteriormente, el gen fue cartografiado en resistente insectos y
se han encontrado a residir en el locus de resistencia (Gahan et al., 2001).
A la fecha, todos los genes clonados y expresados de cadherina en cultivos
celulares, han demostrado que se unen a la toxina. El éxito de este enfoque puede ser
debido en parte al hecho de que la glicosilación hace parecer no ser esenciales para la
16
unión a la toxina, y por lo tanto las diferencias en la glicosilación entre las proteínas
expresadas en el intestino medio y proteínas expresadas en las células cultivadas
pueden ser irrelevantes. Por lo tanto, la validación de las proteínas cadherina como
receptores de la toxina comparativamente más fácil que la validación de APN, donde
glicosilación, en algunos casos, es crítico para la unión. Aunque las proteínas cadherina
como mediadores son claramente importantes de la susceptibilidad de las toxinas Cry,
parece poco probable que sean receptores de la toxina Cry universales. Por ejemplo, en
la cepa de H. virescens YHD2 expresa una forma truncada de HevCaLP y es altamente
resistente a las toxinas Cry1A pero muestra poca resistencia cruzada a Cry2Aa,
Cry1Ca, o Cry1Ba (Gould et al., 1995).
5.7.3. ALP
Las ALP (alcalino fosfatasas) también han sido identificadas como receptores
de la toxina Cry. Sin embargo, el trabajo es muy limitado en comparación con la
investigación sobre la APN y los receptores de cadherina, no obstante, los resultados
preliminares sugieren que la ALP puede actuar como un receptor de Cry1Ac en M.
sexta (McNall y Adang, 2003) y H. virescens (English y Readdy. 1989, Caccia et al.,
2012) y como un receptor Cry11Aa en Aedes aegypti. En H. virescens, ALP es una
glicoproteína GPI anclada en la membrana de 68-kDa (Jurat-Fuente y Adang. 2004).
La unión a Cry1Ac se demostró por análisis de transferencia de ligando de BBMV y
parece ser dependiente la presencia de un oligosacárido enlazado a la sección Nterminal que contiene un residuos de GalNAc. Curiosamente, los niveles de expresión
de fosfatasa alcalina se redujeron en una cepa resistente de H. virescens, lo que sugiere
una papel funcional en la toxicidad. La presencia de un anclaje de GPI y la importancia
de GalNAc en la unión de la toxina muestra un claro paralelismo a la APN y su
interacción con Cry1Ac (Knight et al., 1994).
En M. sexta, una proteína de 65 kDa en las BBMV se identificó como un
proteína de unión a Cry1Ac por electroforesis en gel de dos dimensiones seguido por
un análisis de transferencia de ligando (McNall y Adang. 2003). Se identificó como
ALP por las búsquedas de bases de datos de huellas dactilares de masas de péptidos y
detección con un anticuerpo ALP-específico. La proteína se predijo para ser una GPI
anclada, pero no estaba presente en las proteínas liberadas de las BBMV por
tratamiento con PI-PLC. El papel de las ALP en M. sexta como mediadora de la
susceptibilidad a Cry1Ac tiene todavía que ser establecido, al igual que la importancia
de la glicosilación de ALP en la unión a la toxina, sin embargo, la proteína se ha
demostrado que acopla con las toxinas Cry1A en las microvellosidades de las celulares
epiteliales del intestino medio de M. sexta (Chen et al., 2005).
17
5.8. Resistencia a toxinas de B. thuringiensis.
Debido al gran uso de formulaciones de Bt, los insectos han estado expuestos
en continuas generaciones a las toxinas y por lo tanto desarrollando una condición
ideal para la resistencia. Las cepas resistentes de Filipinas (PHI), Hawai (NO-QA) y
Pensilvania (PEN) desarrollaron resistencia a tres toxinas presentes en el formulado
(Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac) y permanecen susceptibles a Cry1C y otras toxinas no
presentes en el formulado. Ballester y cols. (1999), sugirieron que Cry1Aa y Cry1F
poseen diferentes determinantes de unión pero se unen al mismo sitio, interfiriendo la
unión de Cry1Ab y Cry1Ac. Además, propone modelos de unión donde Cry1Aa,
Cry1Ab, Cry1Ac y Cry1F comparten el mismo sitio y Cry1B posee un solo sitio de
unión a lo igual que Cry1C.
Un comportamiento similar es encontrado en la cepa PHI la cual es resistente a
Cry1Ab y posee un diferente determinante de unión que puede cambiar sin afectar la
unión de otras toxinas. Esto es encontrado también en una cepa de Malasia donde se
observa una unión reducida para Cry1Ab pero no hacia Cry1Aa, Cry1Ac y Cry1C.
Algunos cambios ocurridos en el receptor han ocasionado que una toxina, por ejemplo,
posea 2 sitios de unión de alta afinidad pero no es suficiente para indicar toxicidad. Por
otro lado se ha demostrado en una muestra que una toxina no relacionada (Cry1C) es
efectiva en superar la resistencia hacia Plodia interpunctella, dado que incremento la
sensibilidad y la cantidad de receptores para Cry1C en el insecto, el cual había
mostrado una disminución en la sensibilidad a Cry1Ab.
Ferré y cols. (2008), trabajando con una cepa resistente de Plutella xylostella
encontraron que dicha población del campo es menos susceptible a Cry1Ab, debido a
la disminución en la concentración de receptores y en la unión a la toxina. Además
encontró insectos susceptibles a Cry1B y Cry1C, proteínas no presentes en el
formulado Dipel. Esto demuestra que la resistencia a Cry1Ab no causa resistencia
cruzada a toxinas no presentes en el formulado.
Los mecanismos de acción de las proteínas con actividad insecticida es un
proceso de dos pasos: 1) la unión específica y 2) el rompimiento de la membrana. Esto
podría decir que la toxicidad es solamente en parte determinada por las características
de unión. La unión específica parece esencial para la toxicidad pero quizás no es
suficiente, dado que algunas toxinas se unen a la membrana del insecto sin ser tóxicas
(Ferré et al., 2008). Aunque en muchos casos una correlación positiva entre parámetros
de unión (Kd y concentración de sitios de unión) y toxicidad fue asociada, algunos
autores han reportado excepciones en el cual esta correlación no es directa, por ejemplo
en Phthorinaea operculella se presenta una alta afinidad de unión hacia Cry1Ab y
Cry1C, pero a aun posee la misma afinidad la toxicidad para Cry1Ab es cinco veces
mayor que para Cry1C (Pigott y Ellar. 2007).
18
5.8.1. Pruebas de Selección en laboratorio de otros insectos.
El estudio de las bases moleculares de la resistencia contra toxinas
seleccionadas hacia insectos plaga merece un intensivo estudio y podría proveer un
importante indicio para el entendimiento de la resistencia y el desarrollo de apropiadas
estrategias. Es por eso que se han realizado algunos avances para el entendimiento de
las bases bioquímicas de la resistencia. La selección artificial en el laboratorio que ha
producido un número de líneas resistentes en diferentes especies: P. interpunctella, H.
virescens, Leptinotarsa decemlineata entre otras, permitirá entender la resistencia
(Gould et al., 1992).
P. interpunctella que fue el primer insecto plaga en el que se estudió la
resistencia en laboratorio hacia B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, se encontró que
al utilizar toxinas de otra cepa de Bt la resistencia disminuía. Una hipótesis atractiva es
que la cepa seleccionada es resistente solamente a toxinas Cry1A pero no a otras
toxinas.
Los insectos que han desarrollado tolerancia a toxinas de Bt, han mostrado un
mecanismo que interfiere en algún paso involucrado en el modo de acción. Este evento
fue demostrado en P. interpunctella donde la base molecular de la resistencia involucró
un cambio en el receptor y una correlación entre la reducción de la toxicidad y
disminución en la afinidad de unión. La unión al receptor ha sido caracterizada, así
como analizada la usando vesículas (BBMV) del intestino de varias larvas de
lepidópteros y de ciertas proteínas de Bt.
Los sitios de alta afinidad fueron identificados y correlacionados con la
toxicidad observada. Wolfersberger (1990) reportó una correlación cualitativa de
actividad insecticida y unión a dos toxinas de B. thuringiensis, Cry1Ac y Cr1Ab, donde
a su vez más tarde encuentra relación inversamente cuantitativa entre la actividad
insecticida de estas proteínas y la unión al receptor para Lymantria dispar.
En un ensayo con una cepa sensible de H. virescens se observó que las
proteínas Cry1Ab y Cry1Ac compiten de igual manera por el mismo sitio. En cambio
en una cepa del mismo insecto seleccionada artificialmente en laboratorio, se observó
que Cry1Ab es menos efectiva para desplazar a Cry1AC. Estos datos sugieren que la
especificidad al receptor, en el insecto resistente ha sido modificada a estas dos
proteínas.
Las cepas resistentes producidas en laboratorio poseen algunas desventajas
biológicas a las que no son sometidas como los insectos resistentes del campo, tal
como son: migración del insecto, refugios, un vasto número de insectos presentes en el
campo, además los factores estresantes en el campo son mayores (Ferré et al., 2008).
19
5.8.1.1. Pruebas de Selección en laboratorio de Helicoverpa zea.
Los pruebas de selección en laboratorio realizadas se han enfocado
principalmente hacia Pectinophora gossypiella por ser la principal plaga del algodón
cultivado, sin embargo, en términos de importancia las investigaciones en H.zea han
aumentado en años recientes por la capacidad de la especie para infectar diferentes
cultivos, el algodón entre uno de ellos.
Las toxinas Cry1Ac y Cry2Ab (Presentes en el algodón transgénico Bollgard
II®), han sido las más utilizadas en este tipo de experimentos, Sivasupramaniam y
cols. (2008) llevaron a cabo una investigación en lepidópteros plaga.
El espectro de actividad de Cry2Ab2 en dicho experimento indicó que es
complementario a la de Cry1Ac, con aumento de la toxicidad contra especies tolerantes
a Cry1Ac. H. virescens, H. zea y P. gossypiella todos tenían bajos valores de LC50 (1
ppm) para Cry1Ac. Suponiendo la expresión en las plantas, insectos con valores de
LC50 inferiores a 1 ppm en la dieta suelen ser controlado con una " alta dosis " cuando
ese mismo compuesto se expresa en las plantas (Bartlett et al., 1995; Gould. 1998). La
definición actual de dosis alta es 25 veces LC99 (EPA. 1998). Los llamados criterios
de dosis saltas son generalmente aceptados para aplicar en especies muy sensibles para
algodón Bollgard®, como H. virescens y P. gossypiella (Bartlett et al., 1995; Gould.
1998).
Las larvas de H. zea ( Boddie ) muestra cierta tolerancia a la toxina Cry1Ac de
Bt, y pueden sobrevivir sobre algodón que expresa dicha toxina, lo que debería
aumentar las preocupaciones de desarrollo de resistencia. Sin embargo, aún no se ha
observado resistencia de campo. En un estudio previo una población de H. zea fue
seleccionada para la resistencia estable a la toxina Cry1Ac.
Los resultados muestran que las poblaciones de H. zea no pueden completar el
desarrollo larval sobre algodón GM , a pesar de ser 150 veces más resistente a la toxina
Cry1Ac en laboratorio y capaz de sobrevivir hasta la pupación en concentraciones de
toxina Cry1Ac mayor que la presente en el algodón GM (Animulkar et al., 2009).
Ferré y Hernández (2005) a base de estudios de unión utilizando 125I-Cry1Ac y
toxinas Cry1Fa biotinilados indicaron la ocurrencia de un común receptor para
Cry1Ac, Cry1Fa, y Cry1Ja en Helicoverpa armigera, Helicoverpa zea, y Spodoptera
exigua. Estos resultados, junto con los datos de unión anteriores y los casos observados
de la resistencia cruzada, sugieren que este patrón parece ser generalizado entre las
especies de lepidópteros.
Medel (2007) previo a la implementación de algodón GM de manera extensiva
desarrollo un estudio para determinar la susceptibilidad a la δ-endotoxina Cry2Ab en
larvas neonatas de cinco poblaciones (una susceptible y cuatro de campo) de H. zea.
Los valores que se obtuvieron en el estudio de toxicidad a la δ-endotoxina Cry2Ab en
larvas de H. zea se consideran como respuesta inicial o punto de referencia, dado que
20
dicha toxina aún no se utilizaba en campo y sirvió para estimar la proporción de
cambio a través del tiempo una vez que el algodonero Bollgard II® se llegara a utilizar
en México.
En los últimos años se han llevado a cabo investigaciones para profundizar en
la variación genética de la resistencia a la toxinas Cry a través de cruzas entres
poblaciones susceptibles y poblaciones resistentes de H. zea críticamente importante
para la determinación de las estrategias de manejo de resistencia apropiados que
afectan la sostenibilidad del algodón GM, Gossypium hirsutum (L.) (Jackson. 2006).
A su vez, experimentos cuyo objetivo es esclarecer los receptores involucrados
y elementos complementarios (APN, ALP, Cadherinas, proteasas) han demostrado un
avance al comprender a fondo el proceso molecular de la resistencia (Caccia. 2012), a
la par de los estudios de la heredabilidad, la estabilidad, y el costo asociado a la
resistencia a dichas toxinas (Animulkar et al., 2008).
5.8.2. Características genéticas ligadas a la resistencia.
El desarrollo de resistencia en laboratorio es probable que involucre poligenes
(múltiples genes que cada uno tiene pequeño impacto en la característica seleccionada),
dado que ellos son propensos a ser seleccionados bajo condiciones donde los factores
estresantes, biológicos y ambientales son mínimos. Por otro lado, la resistencia
desarrollada en campo es más probable que involucre un simple gen, el cual puede ser
seleccionado de un amplio pool genético regido bajo más condiciones estresantes
(Ferré et al., 2008).
Los cambios observados en la resistencia se dirigen hacia cambios en la
afinidad de unión y en la concentración de sitios de unión, lo cual sugiere que los
mecanismos de resistencia son complicados y resultan de múltiples cambios genéticos.
Esta conclusión es soportada por análisis genéticos que revelan un modo de herencia
parcialmente recesivo, esto es encontrado en H. virescens seleccionada en laboratorio
(Ferré et al., 2008).
Gould y cols. (1992), al realizar cruzas genéticas con cepas resistentes de H.
virescens seleccionadas en laboratorio y sensibles, encontró al realizar la primera
cruza, que el híbrido de la F1 posee una mortalidad intermedia entre el control y la
resistente, es decir la resistencia es parcialmente recesiva en la F1, además la progenie
de la F1 con la resistente es similar a la cepa seleccionada para la resistencia, aquí la
resistencia es heredada como una característica completamente recesiva. Además se
observó que la resistencia no es ligada al sexo.
Aunque la resistencia a las toxinas de Bt en P. xylostella es recesiva y parece
ser controlada por uno o pocos loci y sus bases genéticas son aún desconocidas.
Tabashnik y cols. (2000) menciona sobre los refugios temporales donde el insecto no
está expuesto por muchas generaciones a las toxinas y por lo tanto conduce a la perdida
21
de resistencia, ya que encontró una población de P. xylostella que era resistente y al
dejarla de exponer al insecticida determino que de nuevo era sensible a las toxinas.
Si no ocurriera inestabilidad se pensaría que los alelos que confieren resistencia
se encuentran fijos, o si las modificaciones ocurridas en los alelos mejoran el estado de
la resistencia, es decir la resistencia podría ser estable.
El modelo de unión de Ballester et al. (1999) explica la resistencia fenotípica;
un gen puede conferir resistencia a Cry1A(a), Cry1A(b), Cry1A(c) y Cry1F, sin
embargo en algunas cepas relacionadas de P. xylostella donde se presenta resistencia a
Cry1C, la resistencia se segrega independientemente de la Cry1A. Es decir la genética
de la resistencia en base a este modelo de unión predice que un gen es el responsable
en la alteración mayor del sitio de unión y uno u otros genes confieren resistencia a
Cry1C.
Heckel y cols. (1999), realizaron cruzas con cepas resistente y sensibles, debido
a que la resistencia a Bt es recesiva, la F1 podría ser susceptible, y esperado que la
progenie de la F1 con la cepa resistente segregue en una proporción 1:1 (fenotipo
resistente y susceptible) y posteriormente se mapeo el gen que confiere resistencia a Bt,
en base a los antecedentes de los ensayos moleculares de mapeo realizados a Bombyx
mori encontrando que un locus (BtR- 1) en cual consiste de un simple gen, es el que
confiere resistencia a múltiples toxinas, dicha resistencia es reflejada en la alteración
del sitio de unión en el intestino de la larva. Si este mecanismo de resistencia tiene una
base genética común para todos los insectos plaga que desarrollen resistencia permitirá
el diseño de estrategias para el control de estos insectos.
Morin y cols. (2002) identificaron 3 alelos de la proteína cadherina
responsables de la resistencia a la toxina Cry1Ac en el gusano rosado (P. gossypiella),
la principal plaga para el algodón.
Al ser la principal plaga del algodón, la mayoría de los estudios actuales han
sido enfocados al gusano rosado (Morin et al., 2002; Tabashnik et al., 2009), y en
menor medida a las demás plagas entre ellas Helicoverpa sp., Heliothis sp. , este
proyecto está dirigido a incrementar la información acerca de la resistencia a la toxina
Cry1Ac en una población de H. zea inducida en laboratorio.
22
6. MATERIALES Y METODOS
6.1. Muestreo de algodón GM
Toma de muestras de hojas, flores, bellotas y algodón fueron obtenidas en
viajes a campo en las hectáreas donde el algodón transgénico es sembrado para
verificar la expresión de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab y resistencia a glifosato,
dicha prueba fue realizada a base de inmunotiras Agdia® y el protocolo fue seguido
de acuerdo a la instrucciones del producto.
6.2. Purificación de protoxinas a partir de cepas recombinantes de B.
thuringiensis
Microorganismos: Utilizamos la cepa de B. thuringiensis HD73, la cual
expresa solo Cry1Ac. La cepa HD-73 perteneciente a la colección del laboratorio L-4
del Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Autónoma de Nuevo León.
6.2.1. Obtención de proteínas Cry
1. Con una asada de la cepa inocular matraces conteniendo caldo nutritivo que serán
puesto a incubar a 29°C en agitación constante hasta esporulación (48-96 h).
2. Mediante centrifugación separar la mezcla esporas-cristales, eliminar el
sobrenadante y agregar al precipitado NaCI 1M, e inmediatamente centrifugar a 7
000 Xg,
3. Lavar el precipitado dos veces con NaCl 1M, EDTA 5 mM frío y resuspender en
KC1 10 mM.
6.2.2. Solubilización
1. Resuspender el precipitado resultante, en un tampón de carbonatos (Na2C03, 50
mM; NaCl, 0.1 M; DTT, 10 mM) pH 11.5 .
2. Incubar 2 h en agitación constante a TA.
3. Centrifugar a 14 000 Xg y separar el sobrenadante.
4. Determinar la concentración de proteínas del sobrenadante mediante Bradford.
5. Observar los productos de la digestión enzimática en geles de poliacrilamida-SDS
al 10%.
23
6.3. Procedencia de las colonias de insectos.
La cría fue establecida a partir de una colecta de campo y mantenidas en el
laboratorio por cinco generaciones para eliminar a organismos infectados y enfermos.
Una vez establecerá la cría en el Lab. de Cría de insectos del Instituto de
Biotecnología/FCB-UANL.
6.3.1. A partir de larvas
Fueron alimentadas en copas de 25 ml con 15 ml de dieta artificial. La dieta
fue preparada de acuerdo a la dieta preestablecida para la cría de insectos del instituto.
Las colonias fueron mantenidas en cámara bioclimática a 28°C y 70 % de humedad
relativa con fotoperiodos de 14 h luz y 10 h de oscuridad.
6.3.2. En el caso de las pupas
Las pupas fueron lavadas con una solución de hipoclorito de sodio (Cloralex)
al 2.5% por dos minutos, enjuagadas con agua corriente, secadas y colocadas en las
cámaras de emergencia.
6.3.3. Cría de insectos
Para la generación de colonias, colocamos 30-50 pupas/cámara de emergencia.
En cada cámara se colocó un trozo de algodón impregnado de solución azucarada
(azúcar de mesa al 10% en agua). En cada cámara se ingresaron papeles especiales
para la ovoposición. Los huevecillos fueron retirados e incubados por separado para la
eclosión.
6.4. Concentración letal media (LC50) de la protoxina Cry1Ac
Los bioensayos para determinar la LC50 se llevaron a cabo usando ocho
concentraciones distintas de la protoxina Cry1Ac. La protoxina fue preparada
esencialmente de acuerdo a lo reportado previamente (Iracheta et al., 2000; Marroquín
et al., 2009). Como control negativo usamos dieta normal a la cual agregamos agua
estéril en lugar de protoxina. En breve: Los experimentos fueron hechos en placas
plásticas de 24 orificios con 2 ml de dieta artificial c/u a la cual se le adicionó la
protoxina. Iniciamos con siete dosis preliminares: 01., 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 µg/g de
dieta más el testigo sin protoxina. Los bioensayos fueron realizados con 48 larvas por
dosis.
24
Las placas cubiertas con plástico delgado con pequeñas incisiones de alfiler.
Las placas fueron incubadas durante siete días en cámaras a 28ºC y 70% de humedad.
La mortalidad fue evaluada y comparada con el control.
6.5. Determinación de resistencia
Una vez establecida la colonia, fueron iniciados los bioensayos con larvas
neonatas. La protoxina Cry1Ac solubilizada, colocada por separado a dos dosis, 10 y
20 μg/g de dieta. Usamos lotes de 200-400 larvas por dosis. El control de este
experimento, fueron colonias no sujetas a presión artificial. El bioensayo se realizó de
la siguiente manera: La dieta con la protoxina incluida fue colocada en placas plásticas
de 24 orificios cada una, posteriormente una larva fue colocada en cada orificio e
incubadas 7 días bajo las condiciones señaladas. Las larvas sobrevivientes a 10 μg/g de
dieta fueron consideradas como resistentes (Tabashnik et al., 2000). Estas fueron
llevadas hasta adultos y repetimos los ensayos de resistencia por dos generaciones más
para obtener mayor cantidad de adultos para los ensayos de segregación.
6.6. Ensayos de segregación
Después de conseguir colonias resistentes de H. zea, las pupas fueron sexadas y
colocadas en camaradas de oviposicion para realizar un experimento del costo de
selección a la toxina y herencia de la resistencia en las siguientes generaciones,
siguiendo este arreglo:
♂ Susceptibles
X
♀ resistentes
♀ Susceptibles
X
♂ resistentes
♀ Resistentes
X
♂ resistentes
♀ Susceptibles
X
♂ Susceptibles
25
6.7. Identificación de genes de receptores asociados al mecanismo de resistencia
6.7.1. Extracción de ADN
Fue utilizado un protocolo modificado de extracción de ADN realizado por el
laboratorio UEG (2009) con fenol:cloroformo:alcohol Isoamilíco (24:24:1)
Tejido utilizado: Larva completa, intestino, pupa o adulto.
1. Precalentar el buffer de extracción a 55°C por 10 min en un tubo de 1,5 ml
introducir 20 g de tejido.
2. Agregar 500 µl del buffer de extracción precalentado.
3. Picar el tejido con la tijera hasta tener trozos muy pequeños.
4. Agregar 10 µl de Proteinasa K (20 mg/ml). Incubar a 55°C por una noche entera.
5. Agregar 500 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamilíco. Resuspender por inversión
cuidadosamente hasta que se forme una emulsión (unas 30 inversiones). El
fenol:cloroformo es sumamente tóxico y todo el trabajo con este reactivo debe
hacerse en campana de extracción.
6. Centrifugar a 8000 rpm durante 10 min.
7. Transferir la fase acuosa (la de arriba) con una pipeta a un tubo nuevo de 1,5 ml.
8. Repetir la limpieza con fenol:cloroformo:alcohol Isoamilíco (pasos 7-8-9).
9. Agregar un volumen de NaCl (5 M) correspondiente al 10% de la muestra, y
mezclar bien.
10. Agregar un volumen de isopropanol frío correspondiente al volumen de la muestra
resultante del punto 10. Incubar a -20°C de 2 h en adelante.
11. Centrifugar a TA, a 12000 rpm durante 5 min y descartar líquido por inversión del
tubo.
12. Agregar 400 µl de etanol frio al 70%
13. Centrifugar a TA a 12000 rpm durante 3 min y descartar el líquido por inversión
del tubo. Dejar secar el ADN a TA, con el tubo abierto.
14. Resuspender en 50 µl de T10E1 (10mM) y agregar 1 µl de RNasa (10 mg/ml). En
su defecto resuspender en agua milliQ autoclavada.
15. Incubar A 37°C por 20 min
26
6.7.2. Extracción de RNA con Tripure reagent®
1. 1 ml/tubo del reactivo TRIPURE
2. 0.1 ml/tubo de muestra. Mezclar bien con ayuda del vortex. Incubar 5 min a TA.
Centrifugar unos segundos, un pulso de centrífuga, para eliminar restos de muestra
de la tapa.
3. Añadir 0.2 ml/tubo de cloroformo. Agitar en vortex 15 min. Incubar 10 min a TA
agitando varias veces. Centrifugar a 4ºC 10000 rpm 15 por min.
4. Recoger la fase superior, con cuidado de no arrastrar interfase y pasarla a otro tubo.
5. Añadir 0.5 ml de isopropanol y mezclar bien por inversión. Incubar 10 min a TA.
6. Centrifugar a 4ºC a 13.000 rpm. 10 min.
7. Retirar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet.
8. Lavar el pellet con 500 µl de etanol 75% frío. Agitar ligeramente, invertir los tubos
para lavar las paredes.
9. Centrifugar a 4ºC a 13.000 rpm. 5 min (Poniendo los tubos en la misma orientación
que en la centrifugación anterior).
10. Retirar el sobrenadante con cuidado de no arrastrar el pellet pero tratando de
eliminar todo el etanol. Secar a TA unos 10 min. hasta que no queden restos de
etanol.
11. Resuspender en 10 µl de H2O estéril, agitar en vortex evitando dejar gotas por las
paredes. Guardar a -20ºC hasta su uso ( o a 4ºC si se va a emplear en 1-2 h desde su
obtención).
27
6.7.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los iniciadores diseñados a partir de las secuencias nucleotídicas depositadas
en el Genbank de los receptores. Se utilizaron los iniciadores específicos cadLHz
(GenBank: AY909578.1), apn1Ha (GenBank: EU568874.1) y apn2Ha (GenBank:
AY279536.1) para amplificar las regiones específicas para la cadherina y dos
diferentes tipos de aminopetidasas a partir de 10 ng de DNA genómico con una mezcla
de reacción que incluye Tris -HCl 10 mM, pH 8.5, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 200
μM de cada dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 100 nM de cada iniciador y 0.5 U de
Taq DNA polimerasa. Los productos se observaron en geles de poliacrilamida-SDS al
10%.
Tabla 4. Iniciadores utilizados para la amplificación de genes de los receptores involucrados en la
resistencia en lepidópteros.
Iniciador
Secuencia (5'-3')
Tamaño
Clave
(pb)
CadLHzF
ATGGAGGAAACTGCGATGACCCTG
CadLHzR
CTCTGGCACTTCGAAGTCCAGCAT
Apn1HaF
AATTCCAGCCTGGCCACGCTC
Apn1HaR
GCGCTCCATGACTTCCAAGAGA
Apn2HaF
CACATGTGGTTCGGTAACCTGG
Apn2HaR
CGAGAAGATGCTCAGTCATTCTG
190
AY909578.1
346
EU568874.1
291
AY279536.1
28
7. RESULTADOS
7.1. Expresión de Toxina Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4 EPSPS)
Las inmunotiras fueron depositadas en una solución donde previamente se
había macerado hojas del algodón GM de las zonas de producción del norte del país, en
la figura 5 y la figura 7 muestran en la parte superior de la tira la línea control y la
parte inferior la línea positiva a la presencia de Cry1Ac, Cry2Ab o resistencia a
glifosato.
Línea
control
Línea
positiva
Figura 5. Inmunotiras Agdia® presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y Resistencia a herbicidas
(CP4 EPSPS), en la localidad San Pedro de las Colonias, Coah. 2013.
29
Figura 6. Hojas utilizadas en el diagnóstico de expresión del algodón GM
Figura 7. Inmunotiras Agdia® presentando positivo a Cry1Ac, Cry2Ab y resistencia a glifosato (CP4
EPSPS), en las localidades de San Rafael, Mexicali en Baja California norte y Sonoyta en Sonora, 2013
30
7.2. Obtención de proteínas Cry
La protoxina Cry1Ac fue extraída a partir del cultivo de la cepa de Bt HD73,
realizándose primeramente en placas de agar nutritivo y posteriormente
transfiriéndolas en matraces con caldo nutritivo para su extracción. Se obtuvieron
concentraciones desde 1-6 mg/ml de la proteína solubilizada la cual fue almacenada a
-20°C hasta el momento de su uso.
Figura 8. Desarrollo en agar nutritivo de la cepa HD73 de Bacillus thuringiensis.
31
Proteina Cry1Ac bipiramidal
Proteína Cry1Ac bipiramidal
Figura 9. Tinción en Cristal Violeta de la cepa HD73 de Bt mostrando la proteína Cry1Ac en su forma
bipiramidal.
Figura 10. Gel de poliacrilamida-SDS al 10% de la protoxina Cry1Ac (130 kDa) presente en la cepa de
Bt HD73. Carril 1. Marcador molecular. Carril 2-7. Albumina (BSA). Carril 8-10. Toxina Cry1Ac.
32
7.3. Determinación de la LC50
Después de tres bioensayos realizados durante la cría de H. zea sometiendo a
las larvas a diferentes concentraciones los resultados fueron ingresados al programa
BMDS (Benchmark Dose Software) proporcionado por la EPA dando la cifra
promedio de 1.309 µg/gramo de dieta como la LC50 referente para el estudio.
Figura 11. Placa de 24 orificios empleada en la determinación de la LC50 y los bioensayos de
resistencia.
7.4. Bioensayos de resistencia
Desde enero del 2013 se realizaron bioensayos de exposición progresiva de
Cry1Ac en las cuales fueron establecidas dos colonias de H. zea resistentes a 10 µg/g
y 20 µg/g. La tabla siguiente describe el transcurso cronológico de los ensayos.
Durante el desarrollo de los bioensayos se presentaron aparte de la alta mortalidad de
larvas, prolongación de los estadios larvales, prolongación del estado de pupa, pupas
deformes, una mayor producción de machos en comparación a las hembras y baja
producción de huevecillos.
33
Tabla 5. Transcurso cronológico de los ensayos en H. zea.
Fecha
Clave
21/01/13
Hz0
19/02/13
27/02/13
Hz20a (F1)
Hz20a (F1)
Hz50a (F1)
Hz20b(F1)
Hz20a (F2)
Hz20b (F2)
Hz20a (F3)
Hz10a(F1)
Hz20c(F1)
Hz20b
(Hz20b(F1) y
Hz20a(F3)
01/04/13
30/04/13
10/05/13
20/05/13
26/06/13
26/06/13
Hz20b*
Concent Larvas
ración
expuestas
0.1-100 216
µg/g
20 µg/g
20 µg/g
50 µg/g
20 µg/g
20 µg/g
20 µg/g
20 µg/g
10 µg/g
20 µg/g
Dieta
sin
protoxi
na
Dieta
sin
protoxi
na
20 µg/g
10 µg/g
Porcentaje
96
120
120
432
96
68
19
216
216
105
Larvas
sobrevivientes
Utilizadas
para
determinación
de la LC50
32
12
0
68
19
24
7
127
79
76
**
**
**
Hz20c (F2)
240
67
Hz10a (F2)
240
113
*No contabilizado
**La colonia colapso al producir huevecillos infértiles.
*
33.3%
10%
0%
15.74%
19.79%
35.29%
36.84%
58.79%
36.57%
72.38%
27.91%
47.08%
34
Figura 12. Diferencia de tamaño entre una larva control (lado izquierdo) y una larva expuesta a
una concentración de 10 µg/g de protoxina Cry1Ac (lado derecho) después de una semana.
7.5. Cruza de colonias
La cruza de colonias fue realizada el 15 de julio del 2013 entre colonias
resistentes de 20 µg/g (machos y hembras) y 10 µg/g (machos y hembras) con
colonias susceptibles pertenecientes al laboratorio de cría de insectos del Instituto de
Biotecnología.
Tabla 6. Cruza de colonias de H. zea.
Machos
Hembras
Resultado
12 machos de Hz10a (F2)
18 hembras susceptibles
10 machos susceptibles
20 hembras de Hz10a (F2)
Huevecillos viables
(F3).
Huevecillos infértiles
12 machos de Hz20c (F2)
18 hembras susceptibles
10 machos susceptibles
19 hembras de Hz20c (F2)
Huevecillos viables
(F3).
Huevecillos
infértiles.
35
Figura 13. Determinación de sexos en H. zea del lado izquierdo se encuentra un macho y del
lado derecho una hembra.
7.6. Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias
Después de la cruza de las colonias se procedió a realizar más ensayos de
resistencia a la protoxina Cry1Ac, en la tabla 7 se muestra el seguimiento en los
ensayos de resistencia a partir de los huevecillos fértiles procedentes de la cruza de
colonias.
Tabla 7. Bioensayos de resistencia con la cruza de colonias.
Fecha
Clave
30/07/13
Hz10
Hz20
04/10/13
Hz10
Hz20
*Proteína degradada.
Concentración Larvas
expuestas
10 µg/g
370
20 µg/g
370
Larvas
Porcentaje
sobrevivientes
313*
84.59%*
326*
88.1%*
10 µg/g
20 µg/g
101
93
360
360
28.05%
25.8%
36
7.7. Segunda cruza de colonias
La segunda cruza de colonias fue realizada el 6 de noviembre del 2013 entre
colonias resistentes de 20 µg/g (machos y hembras) y 10 µg/g (machos y hembras)
con colonias susceptibles pertenecientes al laboratorio de cría de insectos del Instituto
de Biotecnología.
Tabla 8. Segunda cruza de colonias de H. zea.
Machos
Hembras
Resultado
10 machos de Hz10
13 hembras susceptibles
Huevecillos viables
7 machos susceptibles
8 hembras de Hz10
Huevecillos infértiles
9 machos de Hz20
10 hembras susceptibles
Huevecillos infértiles
10 machos susceptibles
14 hembras de Hz20
Huevecillos infértiles.
37
7.8. Genes de receptores asociados al mecanismo de resistencia
Los iniciadores establecidos para los dos tipos de aminopeptidasas y una
cadherina fueron amplificados mediante PCR y observados por electroforesis en gel de
poliacrilamida al 10%, esperando un tamaño de 346 pb para Apn1Ha, 291 pb para
Apn2Ha y 190 pb para CadLHz.
M
1
L
2
P
3
A
4
5
L
6
P
7
A
Figura 14.PCR con los iniciadores Apn1Ha, Apn2Ha y CadLHz. Carril superior M-Marcador molecular.
Carril superior 1- Apn1 en larva. Carril superior 2-Apn1 en pupa. Carril superior 3-Apn1 en adulto. Carril
superior 5-Apn2 en larva. Carril superior 6-Apn2 en pupa. Carril superior 7-Apn2 en adulto. Carril inferior
1-CadLHz en larva. Carril inferior 2-CadLHz en pupa. Carril superior 3-CadLHz en adulto. Electroforesis
en gel de agarosa al 1.0% en buffer TAE.
38
8. DISCUSION
La plantación del algodón Bollgard II® el cual expresa las toxinas Cry1Ac y
Cry2Ab cada una de ellas con un sitio de unión diferente en el intestino de las larvas
maximizando la toxicidad combinada, una formación conocida como pirámide (Moar.
2010) ha generado ganancias económicas desde su implementación en México, la
preocupación constante ha sido la posibilidad de resistencia a dichas toxinas en campo.
Hay un desacuerdo considerable en la literatura científica sobre la definición de
resistencia, especialmente "resistencia de campo" (Andow. 2008; Tabashnik et al.,
2009). El Consejo Nacional de Investigación (1986) propuso que se define resistencia a
los insecticidas como un rasgo individual, que es una capacidad heredada de un insecto
de tolerar dosis de un tóxico que probarían letal para la mayoría de los individuos en la
población normal de la especies. Andow (2008) sugirió que un alelo de resistencia
importante a un cultivo Bt está presente cuando los individuos homocigotos resistentes
pueden crecer y madurar en el cultivo Bt, tener copula y producir descendencia viable.
Tales genes mayores de resistencia se han detectado en varias plagas objetivo de los
cultivos Bt (Tabashnik et al., 2008). Sin embargo, la búsqueda de los principales alelos
de resistencia en poblaciones de insectos de campo no significa que la resistencia de
campo está presente. El Comité de Acción de Resistencia a los Insecticidas (2010)
define la resistencia de campo cuando hay un "incumplimiento reiterado de un
producto para alcanzar el nivel de control cuando se utiliza de acuerdo con la
recomendación de la etiqueta para las especies de plagas”. Por lo tanto, la resistencia
de campo es una característica de una población, y depende de muchos factores, entre
ellos la frecuencia del alelo de resistencia, la aptitud de los individuos resistentes, y la
densidad de población en el campo. La diferenciación entre la resistencia "individual"
y la resistencia de campo es necesaria porque la resistencia individual no siempre se
traducirá en la resistencia de campo, la resistencia de campo se produce sólo cuando la
resistencia individual es común. En base a esta definición de la resistencia en el campo,
la resistencia a un cultivo Bt se produce cuando hay un fallo de control de campo o de
reducción de la eficacia de los cultivos Bt. Después de 15 años de uso de los cultivos
Bt en el mundo, la resistencia de campo o falta de control se ha documentado
claramente en tres casos (Huang et al., 2011) por eso conocer la susceptibilidad de H.
zea a la toxina Cry1Ac proveniente de Bt es determinante para ajustar, mejorar, o
cambiar los actuales usos del algodón GM en México.
En el caso de H. zea la susceptibilidad a la protoxina Cry1Ac presento una
LC50 de 1.309 µg/gramo de dieta, este resultado fue comparado con reportes previos,
Sivasupramaniam y cols. (2008) reportaron una LC50 inferior a la nuestra de 0.870
µg/gramo de dieta para Cry1Ac, mencionando en adición que plagas susceptibles a
dosis menores a 1ppm son controladas por las "dosis altas" presentes en el algodón
GM, una dosis alta es referida por la EPA (1998) como veinticinco veces más la LC99.
El valor más alto reportado por Ali y cols. (2006) fue de 1.746 µg/gramo de dieta,
39
ambas cantidades cercanas a la nuestra por 0.4- 0.5 µg/gramo de dieta, un valor mayor
a los anteriores fue encontrado por Zenner de Polanía y cols. (2008), en cuyo estudio
la LC50 varió entre 3,42 y 6,12 µg/g dieta demostrando además como al aumentar la
dosis de la toxina disminuía el peso y obtuvo un alto porcentaje de pupas deformes. El
valor reportado por Medel y Maciel (2011) entre las nueve regiones que muestrearon
en las zonas algodoneras vario entre 13.5-23.7 µg/g dieta.
La diferencia de susceptibilidad a Cry1Ac en H. zea se ha analizado y se han
expuesto diferentes opciones al caso, por ejemplo Iracheta (1999) menciona los
siguientes puntos referentes a la susceptibilidad de la toxina;1) Condiciones en las que
se realiza el bioensayo (incorporación de la proteína en la dieta, extensión en
superficie; tiempo de incubación). 2) Fuente de las toxinas (diferentes toxinas se
expresan en cepas recombinantes de E. coli o en Bt. 3) La colonia del insecto (origen
geográfico, distribución y migración). La variabilidad geográfica de las diferentes
poblaciones de H. zea como una respuesta a los cambios en la susceptibilidad mas
allá de la resistencia asociada también es mencionado por Sivasupramaniam y cols.
(2008). Medel y cols. (2007) y Zenner de Polania y cols. (2011) concuerdan que la
implementación de una línea base de susceptibilidad de Cry1Ac como la nuestra es
importante por las diferencias entre poblaciones de diferentes regiones. De acuerdo a
los datos obtenidos, las colonias de nuestra línea base siguen siendo susceptibles a la
toxina Cry1Ac presente en el algodón Bollgard II®.
La proteína Cry1Ac utilizada durante los ensayos de resistencia mostro una
anomalía el 30/07013 en un ensayo al obtener un porcentaje de sobrevivencia mucho
mayor al esperado, corriendo un gel de poliacrilamida-SDS al 10% se encontró que la
protoxina Cry1Ac utilizada que usualmente muestra una banda de 130 kDa mostraba
dos bandas de aproximadamente 50 y 80 kDa, estudios se han realizado con
anterioridad ejemplificando las diferencias entre el uso de la proteína Cry1Ac en su
manera toxica activa o en forma de protoxina aún no procesada, (Van Frankenhyuze.
2009; Caccia et al., 2012; Tabashnik et al., 2009) y el rango de la resistencia producida
por las plagas a estas variaciones, además de los estudios realizados a proteínas Cry
modificadas ( Soberón et al., 2007; ) así como los procesos necesarios para obtener la
toxina en su forma activa (Karim et al., 2000; Bravo et al., 2011). Comparando la
literatura con nuestros resultados de los anteriores y posteriores bioensayos sugiere que
la protoxina llego separada antes del proceso de solubilizacion y activación en el
intestino de las larvas, el núcleo de la toxina Cry1Ac proviene de la mitad N terminal
de la protoxina eliminando entre 500 a 600 aminoácidos desde el extremo C terminal y
los primeros 27 a 29 aminoácidos del extremo N terminal (Lightwood et al., 2000;
Bravo et al., 2011; Piggot y Ellar. 2007) creando la forma activa de aproximadamente
60 kDa, al ingresar al intestino de las larvas productos de 50 a 80 kDa la probabilidad
para que la actividad proteolítica pueda crear regiones activas de la proteína Cry1Ac
serían muy bajas y su capacidad toxica reducida, por ende el manejo adecuado de la
40
toxina y la forma de utilizarla (Protoxina o toxina activada) interfiere
significativamente en el proceso de resistencia en laboratorio (Animulkar. 2008).
El algodón Bollgard II® expresa en complemento Cry2Ab, si llegara a
provocarse una resistencia en campo a la toxina Cry1Ac, la segunda toxina presente
entra para ejercer el grado de toxicidad necesario para mantener la eficiencia contra las
plagas, Medel y cols. (2007,2011) y Lutrell y Jackson (2012) así como Tabashnik y
cols. (2002) han realizado estudios en H. zea y Pectinophora gossypiella
respectivamente, demostrando en dichos estudios la inexistencia de la resistencia
cruzada entre las dos proteínas expresadas por el algodón GM utilizado para el control
de las plagas de lepidópteros en las zonas algodoneras.
Colonias resistentes a 100 hasta 400 µg/gramo de dieta criadas en laboratorio se
han reportado antes (Animulkar. 2008), las colonias resistentes a 10 µg/ml y 20 µg/ml
en nuestro estudio se mantuvieron de esta manera para evitar ejercer demasiada presión
y poder realizar las cruzas consecuentes para el diagnóstico de la variación genética,
heredabilidad y costo de resistencia a la toxina Cry1Ac (Jackson. 2006, Animulkar;
2008,2009).
Sin embargo, durante el desarrollo de los ensayos se presentaron aparte de la
alta mortalidad de larvas, prolongación de los estadios larvales, inhibición del
desarrollo en el tercer instar, prolongación del estado de pupa, pupas deformes, una
mayor producción de machos en comparación a las hembras y baja producción de
huevecillos. Estos resultados coinciden con estudios previos realizados por Jackson
(2006) y Animulkar (2008) en H. zea y Williams (2009) en Pectinophora gossypiella.
Jackson y cols. (2006) menciona sobre la base de estudios previos de Burd et
al. (2000,2003), la herencia de H. zea para la resistencia a Cry1Ac es dominante o
incompletamente dominante. Por lo tanto, algunos de los organismos que llevan alelos
de resistencia eran propensos a sobrevivir en una dosis discriminante de la toxina
Cry1Ac en la dieta artificial. Este tipo de herencia permite a heterocigotos sobrevivir
cuando se selecciona en la dieta. Los heterocigotos también serían los portadores más
probables de alelos de resistencia en las poblaciones en campo, los apareamientos más
probables en la población general se producirían entre los heterocigotos y homocigotos
susceptibles.
Analizando los resultados en los bioensayos de selección partimos desde la
línea base donde los alelos de resistencia son particularmente raros en poblaciones
grandes (Huang et al., 2011), nuestros resultados marcan porcentajes de sobrevivencia
promedio de 35% para colonias expuestas a 20 µg/ g dieta, y 47-58% para colonias
expuestas a 10 µg/g dieta antes de haber realizado las cruzas, después de las cruzas los
porcentajes se colocaron en un aproximado de 25%, para ambas colonias, porcentajes
menores fueron descartados por la ausencia de larvas muertas que escaparon durante
los siete días que se mantuvieron en la dieta. Basándose en genética mendeliana y
estudios anteriores (Jackson et al., 2006; Burd et al., 2003) estos porcentajes sugieren
la presencia de un alelo dominante o parcialmente dominante como el causante de la
41
resistencia en las colonias de H. zea, estudios anteriores ejemplifican a los alelos
recesivos como productores de la resistencia a diferentes especies de insectos como
Plutella xylostella ( Sayyed et al., 2000; Zhao et al., 2002; Tabashnik et al., 2003;
Ferre y Hernández. 2005) y el gusano rosado Pectinophora gossypiella ( Morín et al.,
2003, 2004; Xu et al., 2005; Tabashnik et al., 2003), sin embargo, en el caso de
poblaciones de H. zea como la nuestra, las investigaciones llevadas a cabo sugieren
que el responsable es un alelo parcialmente dominante o dominante el cual confiere la
resistencia a la toxina Cry1Ac (Tabashnik et al., 2003,2008; Jackson et al., 2006; Burd
et al., 2003; Moar et al., 2010) comparando los resultados obtenidos con las
investigaciones realizadas, nuestras colonias exhiben un comportamiento genético
emparentado a la teoría del alelo parcialmente dominante.
Animulkar (2008) en respuesta a selección con Cry1Ac, reporto valores altos de
heredabilidad para la colonia resistente en las generaciones 4 a7 y la disminución en
las generaciones 11 a 19. La colonia resistente había aumentado significativamente en
mortalidad pupal, una relación de sexo machos:hembras desproporcional, y éxito de
apareamiento menor en comparación con la colonia parental no seleccionada. Los
machos resistentes tenían más costos de apareamiento en comparación con las
hembras, mayor mortalidad de las larvas, menor peso de las larvas, período alargado de
desarrollo en las larvas, menor peso de pupa, mayor duración de pupa, y una mayor
cantidad de adultos morfológicamente anormales en comparación con la colonia
susceptible. En comparación a estos resultados la única diferencia con los nuestros fue
durante la cruza de colonias, las hembras de las dos colonias resistentes produjeron
huevecillos de manera deficiente y no viables, solo las colonias con machos resistentes
y hembras susceptibles además de las colonias con machos susceptibles y hembras
susceptibles produjeron huevecillos viables, estos resultados sugieren que durante la
selección con Cry1Ac probablemente el costo de aptitud afecto la fisiología en la
producción y fertilidad de los huevecillos en las hembras (Animulkar. 2008; Jackson.
2006).
Este estudio demostró que los costos de aptitud están estrechamente vinculados
con la selección para la resistencia a Cry1Ac en H. zea en el laboratorio, y los costos
de aptitud permanecen, y en algunos casos, incluso aumentan después de ser eliminada
la presión de selección.
Con respecto a los genes de receptores asociados se encontró la presencia de
dos aminopetidasas y una cadherina, dichos receptores han sido confirmados como
participes en el mecanismo de resistencia asociado a los lepidópteros (Piggot y Ellar.
2007; Soberón y Bravo. 2008).
La amplificación de los iniciadores deberían mostrar bandas de entre 300 y 350
pb para las aminopeptidasas y 200 pb para la cadherina, los resultados obtenidos
mostraron bandas de alrededor de 500 pb para las aminopeptidasas y 300 para la
cadherina, los iniciadores al ser preparados a partir de RNA mensajero permitió la
42
posibilidad de la presencia de intrones en el genoma de H. zea lo cual explicaría el
aumento de pb observados en el gel (Brown. 2002).
Estos resultados junto con la recopilación de Moar (2010) aunados a los
nuestros apoyan la falta de éxito de la selección, y el mantenimiento de las poblaciones
de Cry1Ac resistentes de H. zea en laboratorio, y puede ayudar a explicar por qué la
resistencia en campo aún no se ha observado en esta importante plaga del algodonero.
43
9. CONCLUSIONES
1. Se obtuvo una LC50 de 1.309 µg/g de dieta para la población de H. zea
presente en el Instituto de Biotecnología, UANL.
2. La susceptibilidad de H. zea hacia la toxina Cry1Ac es variable y puede deberse
a la región geográfica de la población, el estado de la toxina y su incorporación
en la dieta.
3. La eficacia del Bollgard II ® para contrarrestar el ataque de las plagas está
presente en la expresión de dos tipos de toxina Cry (Cry1Ac y Cry2Ab).
4. Dos colonias de H. zea resistentes a 10 y 20 µg/g de dieta fueron establecidas
en el criadero del Instituto de Biotecnología, UANL.
5. Los alelos que confieren la resistencia a las poblaciones de H. zea son
parcialmente dominantes o dominantes.
6. El costo de aptitud de H .zea está directamente relacionado con la selección de
resistencia a Cry1Ac.
7. Los genes amplificados de los receptores asociados a la resistencia
(Aminopeptidasas y Cadherinas) resultaron de mayor tamaño al esperado por la
presencia de intrones en el genoma de H. zea, estos no se presentan en el RNA
mensajero del cual fueron hechos los iniciadores para PCR.
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