Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Acta Otorrinolaringol Esp 2005; 55: 143-146 INVESTIGACIÓN BÁSICA Estudio por inmunohistoquímica de la expresión de EGFR en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello X. Altuna Mariezkurrena1, J. Algaba Guimerá1, J. Wang Rodríguez2, R. Weisman3, W. Ongkeko3 1 Servicio de Otorrinolaringología, Hospital Donostia, San Sebastián, España. 2Department of Pathology, University of California, San Diego y VA San Diego Healhcare System, San Diego, California, USA. 3Department of Surgery, Head and Neck division, University of California, San Diego, San Diego, California, USA. Resumen: EGFR es un receptor transmembrana miembro de la familia de tirosín-kinasas que traduce señales tanto del exterior como del interior de la célula y juega un papel importante en numerosos procesos que afectan a la evolución del tumor, crecimiento, progresión, diferenciación, inhibición de apoptosis y al desarrollo de metástasis. Su expresión mediante inmunohistoquímica en carcinoma de células escamosas varía entre el 40-80% y se le ha adjudicado un valor pronóstico independiente en estos carcinomas. El objetivo del presente estudio es el de analizar por inmunohistoquímica la expresión de esta proteína en una serie de carcinomas epidermoides de cabeza y cuello y correlacionarlo con parámetros clínico-patológicos y supervivencia. Se realiza inmunohistoquímica de 44 muestras en las que el 41% es positivo. A pesar de no haber encontrado relación con el pronóstico de estos pacientes, la presencia de EGFR es muy importante por el hecho de que existen fármacos y agentes químicos capaces de inhibir su actividad. Palabras clave: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. EGFR. Inmunohistoquímica. Immunohistochemistry study of EGFR expression in head and neck squamous cell carcinoma Abstract: EGFR is an important transmembrane receptor member of the family of tyrosine kinases, that translates signals from both outside and inside the cell and plays a key role in numerous proceses that affect tumour development, growth, progresion, differentiation, inhibition of apoptosis and metastasis. Immunohistochemistry studies have shown that 40-80% of head and neck squamous cell carcinomas express EGFR and it has been suggested as a Correspondencia: X. Altuna Mariezkurrena Servicio de ORL. Hospital Donostia. C/ Dr. Beguiristain, s/n. San Sebastián (Guipúzcoa) Fecha de recepción: 26-10-2004 Fecha de aceptación: 8-2-2005 potential independent prognostic parameter. The objective of this study is to evaluate by immunohistochemistry the expresión of EGFR in a series of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma and correlate it to clinico-pathological features and prognostic significance. We investigated expression of EGFR in 44 samples. There was a high expression in 41% of the cases. Even if we have not found that the expression of EGFR correlated with the prognosis of these patients the presence of EGFR is very important because there are chemical agents or drugs that can inhibit its activity. Key words: Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. EGFR. Immunohistochemistry. INTRODUCCIÓN El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) es el sexto tumor sólido más frecuente en el mundo y el tumor maligno más frecuente del tracto aéreo-digestivo superior. Las opciones terapéuticas son limitadas y alrededor de la mitad de los pacientes diagnosticados de un carcinoma de cabeza y cuello muere antes de los 5 años a pesar de estos tratamientos1,2. Hasta la fecha el pronóstico de estos pacientes sólo podía preverse según la clasificación TNM del tumor3. En los últimos años se han descrito muchos marcadores biológicos en los tumores de cabeza y cuello. No obstante, en estudios recientes se ha sugerido valor pronóstico en los siguientes marcadores: mutaciones del p534, sobre-expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR: epidermal growth factor receptor)5, sobre-expresión de la ciclina D16 y del factor de crecimiento tumoral-α (TGF-α: tumor growth factor-α)5. EGFR es un receptor transmembrana miembro de la familia de tirosín-kinasas (TK). Al igual que otros receptores TK, traduce señales tanto del exterior como del interior de la célula y juega un papel importante en numerosos procesos que afectan a la evolución tumoral, crecimiento, progresión, diferenciación, inhibición de apoptosis y desarrollo de metástasis7. 143 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. X. ALTUNA ET AL. Porta con muestras 1 4 7 10 2 5 8 11 3 6 9 12 12 muestras por porta 1 Muestras fijadas en formalina 4 2 5 3 6 Bloque de parafina Figura 1. Diagrama de un bloque y porta multi-muestra. La presencia de EGFR es muy importante no sólo por su valor pronóstico sino también por el hecho de que existen fármacos y agentes químicos capaces de inhibir su actividad7-9. En este estudio hemos querido investigar la expresión de EGFR en los CCECC así como observar si existe en nuestra muestra alguna relación entre su expresión y la localización del tumor, el grado histológico y la supervivencia. MATERIAL Y MÉTODOS Muestras estudiadas Se han estudiado 44 casos de pacientes con diagnóstico de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) operados durante los años 1999-2003 en el Hospital Veterans Affair (VA) de San Diego, California, Estados Unidos. Todas las muestras fueron procesadas en el Departamento de Anatomía Patológica y Servicio de Laboratorio del VA de San Diego. El tiempo de seguimiento medio ha sido de 18 meses (rango 1-72 meses). Las secciones teñidas con hematoxilina-eosina fueron revisadas por uno de los autores (JWR) y se realizaron bloques con seis tejidos para facilitar la eficacia de las inmuno-tinciones (Figura 1). Los casos incluyeron 23 carcinomas faríngeos, 18 laríngeos y 3 casos fueron metástasis ganglionares sin primario conocido. Los carcinomas faríngeos incluían base de lengua14, suelo de boca8 y paladar blando1. Los datos clínicos y de seguimiento fueron revisados a partir de las historias clínicas de los pacientes y se prestó especial interés a la edad, estadio tumoral, localización del tumor primario, grado de diferenciación histológica, tratamiento adyuvante post-cirugía así como supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global del paciente. Para poder realizar el estudio con los tejidos y con las historias clínicas se solicitó la aprobación de la Institución para la revisión de datos humanos (021076X). Figura 2. Fotografía en la que se observa una muestra de carcinoma epidermoide laríngeo positivo para EGFR. El anticuerpo se usó diluido 1:100 en PBS. Como controles positivos se emplearon muestras de carcinomas de mama. Los controles negativos se realizaron con el mismo tejido de CCECC pero sin anticuerpo. Como controles normales se usaron tejido amigdalar, tejido de úvula y de mucosa laríngea. Inmunohistoquímica (IHQ) Las muestras de tejido se fijaron en solución de formaldehído tamponado al 4% y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 5 micras a partir de los bloques y se montaron en portaobjetos de 3-aminopropyltriethoxysilane especialmente preparados para tinción IHQ. Se incubaron durante una hora a 60º, se desparafinizaron en xileno y rehidrataron con etanol de diferentes grados sucesivamente. Se realizó la amplificación antigénica incubando las muestras en una olla a la máxima presión con la solución de DAKO Target Retrieval. La peroxidasa endógena se retiró con H2O2 al 3%. Con el fin de evitar uniones no específicas se incubaron las muestras en una solución para bloquear la unión no específica de biotina-avidina durante 30 minutos (Protein Block Serum-Free, DAKO, Carpinteria, CA, USA). La tinción de fondo se redujo incubándolo con suero de cabra (1:20) durante 60 minutos. Se colocó el anticuerpo primario y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiental. Posteriormente se usó el anticuerpo secundario conjugado con Strptadivine/HRP (LSAB2, DAKO, Carpinteria, CA, USA). La contratinción se realizó con hematoxilina de Gill II. Evaluación de la tinción Anticuerpos Los estudios inmunohistoquímicos se realizaron usando el anticuerpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA) IgG de conejo contra EGFR. 144 Los casos se consideraron como positivos si la tinción era al menos 2 veces más (2+) en una escala de 1 al 4 + y si el 10% o más de las células tumorales estaban teñidas sobre el trasfondo sano o sobre el control negativo. Se evaluaron Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. EGFR EN CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS DE CABEZA Y CUELLO Tabla 1: Datos demográficos de los pacientes Pacientes (n = 44) Edad media Localización Estadio Tabla 2: Expresión del receptor EGFR según la localización del tumor N (%) 64,6 (rango 64-85) Faringe Laringe Primario desconocido In situ I II III IV G1 G2 G3 23 (52%) 18 (41%) 3 (7%) 1 (2,2%) 5 (11,4%) 3 (6,9%) 14 (31,8%) 21 (47,7%) 14 (31,8%) 17 (38,6%) 13 (29,5%) EGFR (+) Faringe (n=21) Laringe (n=16) Valor de p 9 (43%) 6 (37%) No significativo Todos los análisis estadísticos se hicieron con el programa Stat View v.5.0.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). Para la comparación de variables cualitativas se empleó la prueba de chi cuadrado o el Test exacto de Fisher dependiendo del tamaño de la muestra. Para la comparación de variables numéricas cuantitativas se empleó el Test de Student. El análisis de supervivencia se hizó usando las curvas de Kaplan-Meier. La significación se determinó con el test de log-rank. Para el análisis multivariante se empleó el modelo de regresión de Cox. EGFR resultó estar sobre-expresado en el 41% de los casos, es decir, 16 de los 39 casos mostraron una inmunotinción positiva y dicha inmunotinción fue clasificada en todos los casos salvo en cuatro como "intensamente positivo" (4+). Esta positividad se repartió de la siguiente manera: 9 de los 21 casos de localización faríngea mostraron una inmunotinción positiva (42,9%), 6 de los 16 casos de localización laríngea fueron positivos (37,5%) y uno de los dos casos de localización ganglionar (Tabla 2). No existió diferencia significativa entre la expresión de EGFR y la localización del tumor (p = ns). En los casos de tinción positiva podía observarse la tinción citoplasmática con una acentuación en la membrana plasmática de las células carcinomatosas. No encontramos correlación entre la expresión de EGFR y el grado histológico ni tampoco lo hicimos con el estadio tumoral. Cuando estudiamos la correlación que pudiera existir con la supervivencia global o con la supervivencia libre de enfermedad encontramos que en nuestra muestra EGFR no se correlacionó con ninguno de los dos parámetros. El 43% de los pacientes con carcinoma faríngeo y el 33% con carcinoma laríngeo murieron por su enfermedad (p = ns) durante el período estudiado. La supervivencia media global fue de 15,4 meses para los enfermos con afectación faríngea y 16,2 para los de enfermedad laríngea (p = ns). No obstante, en el presente estudio, tampoco el grado histológico ni el estadio se correlacionaron con la supervivencia libre de enfermedad o supervivencia global. RESULTADOS DISCUSIÓN En la Tabla 1 se resumen los datos demográficos de los pacientes. Debido al tipo de hospital (Veterans Affair, Hospital de Veteranos), todos los pacientes eran varones. No había diferencias en cuanto a la distribución por edad cuando se comparaba con la localización del tumor primario. Esta cohorte tenía un mayor número de pacientes en estadios avanzados, III y IV (35/44) que estadios precoces, I y II (8/44). Esto se cumplía especialmente en el caso de tumores faríngeos en los cuales había menos casos de estadios precoces I y II (2/8) que tardíos III y IV (21/35, p = 0,05). No obstante, el grado histológico de bien diferenciado (G1) a pobremente diferenciado (G3) tenía una distribución homogénea, casi un tercio en cada grupo. En cuanto al tratamiento adyuvante, más del 80% de los pacientes recibieron radioterapia postoperatoria. Todas las muestras salvo 5 (n = 39) fueron teñidas satisfactoriamente con EGFR. Las tirosín-kinasas (TK) son proteínas entre las que se engloban receptores y no receptores. EGFR es una glicoproteína transmembrana de 170 kD cuyo gen está localizado en el brazo corto del cromosoma humano 7p1210. Tiene diferentes ligandos extracelulares entre los que se encuentra TGF-α y EGF. Una vez activado produce la fosforilación de numerosos efectores involucrados en las vías del PI3K/Akt (11), PLC-γ y la PK ras/raf-1. La activación de estas cascadas produce a su vez la transcripción de otros genes responsables de la coordinación del crecimiento celular. La sobreexpresión de EGFR se ha observado en un 40% a un 80% de cánceres de cabeza y cuello10. La naturaleza de esta sobreexpresión parece radicar en un aumento de la transcripción de EGFR12,13 aunque su amplificación también se ha observado 14. Numerosos trabajos dan a EGFR un valor pronóstico independiente negativo y hablan de una mayor probabilidad de recidiva post-tratamiento y una menor supervivencia si EGFR está presen- Grado histológico sólo las áreas alejadas de los bordes que no estuvieran cauterizadas ni artefactadas ni excesivamente arrugadas. Las tinciones negativas eran equivalentes a los controles negativos. Todos los casos positivos mostraron tinción citoplasmática con acentuación membranosa en la mayoría de los casos intensamente teñidos. Las muestras se evaluaron como positivo o negativo por la misma patóloga (JWR). Análisis estadístico 145 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 25/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. X. ALTUNA ET AL. te5,14-18. En este estudio, la expresión de EGFR es del 41%, entre los valores más bajos descritos en la literatura para los cánceres de cabeza y cuello. Asimismo, y al contrario de lo descrito anteriormente, en nuestros pacientes, la expresión de EGFR no se correlacionó con una menor supervivencia global ni una menor supervivencia libre de enfermedad. Debemos decir que en la muestra estudiada, ni el TNM ni el grado histológico se relacionaron con una peor supervivencia. Esto puede tener relación en primer lugar con el hecho de que la mayor parte de los pacientes estudiados en nuestra muestra correspondían a estadios evolutivos avanzados y no había un reparto homogéneo por grupos. En segundo lugar, creemos que éste es un grupo reducido de pacientes por lo que creemos que dichos resultados deben interpretarse con cautela. En los últimos tiempos ha existido un interés especial en esta proteína no sólo por su posible valor pronóstico sino también porque es diana de algunos agentes terapéuticos cuya eficacia ha sido demostrada en determinados tipos de cáncer. Dichos fármacos pueden ser de diferentes familias: ligandos-toxina conjugadas, anticuerpos monoclonales antiEGFR, inhibidores específicos de TKs o inhibidores del propio RNAm9. Entre los más conocidos está el Cetuximab® (anticuerpo anti-EGFR) que ha mostrado in vitro inhibir el crecimiento de CCECC19 y ha dado buenos resultados en los ensayos clínicos realizados con pacientes con CCECC en estado avanzado20. Otros ejemplos de anticuerpos que se están empleando son EMD 72000, hR3 o ABX-EGF. Entre los inhibidores específicos se encuentra el Iressa® que inhibe específicamente la fosforilación del dominio catalítico del receptor. La ventaja de este fármaco es su posibilidad de administración oral y existen numerosos ensayos clínicos al respecto21. Otros ejemplos de fármacos inhibidores de EGFR son SU5416, PKI166, OSI-744 Tarceva® o CI1033. Algunos de estos fármacos ya han sido aprobados por la agencia FDA americana para el tratamiento del cáncer de pulmón. CONCLUSIONES Este estudio muestra la expresión del receptor transmembrana TK EGFR en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. A pesar del valor pronóstico que se le ha dado en otros estudios, el presente trabajo no encuentra relación con la supervivencia y tampoco lo hace con el grado histológico; sin embargo la muestra estudiada y el tiempo de seguimiento puede ser insuficiente para extraer conclusiones de este tipo. Recientemente, se están desarrollando muchos agentes que tienen como diana la proteína EGFR y que están demostrando ser eficaces en la inhibición de la proliferación de células tumorales que expresan dicha proteína, por lo que deberían realizarse más ensayos clínicos en pacientes 146 con carcinomas en estadios avanzados donde su pronóstico, dadas las limitadas opciones terapéuticas que hay, es tan pobre. Referencias 1. Vokes EE, Weichselbaum RR, Lippman SM, Honk WK. Head and Neck Cancer. N Engl J Med 1993;328:184-94. 2. Adjuvant chemotherapy for advanced head and neck squamous cell carcinoma. Final report of the Head and Neck Contracts Program. Cancer 1987;60:301-11. 3. TNM classification of malignant tumours. En: Sobin LH, Wittewkind C, eds. (International Union Against Cancer), 5th ed. New York: Willey-Liss, 1997. 4. Overgaard J, Sorensen SB, Stausbol-Gron B, Hoyer M, Alsner J. TP53 mutation is an independent prognostic marker for poor outcome of radiotherapy in squamous cell carcinoma of the head and neck. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998;42:43. 5. Grandis JR, Melhem MF, Gooding WE. Levels of TGF-α and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival. J Natl Cancer Inst 1998;90:824-32. 6. Pignataro L, Pruneri G, Carboni N, Capaccio P, Cesana BM, Neri A, et al. Clinical relevance of cyclin D1 protein overexpression in laryngeal squamous cell carcinoma. J Clin Oncol 1998;16:3069-77 7. Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signalling. Nature 2001;28(suppl 16):67-79. 8. Levitzki A, Gazit A. Tyrosine kinase inhibition: an approach to drug development. Science 1995;267:1782-8. 9. Ford AC, Grandis JR. 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