benemerita universidad autonoma de puebla

BENEMERITA UNIVERSIDAD AUTONOMA
DE PUEBLA
FACULTAD DE MEDICINA
LICENCIATURA EN BIOMEDICINA
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA
Laboratorio de Neurofisiología Sensorial
DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA Y
ULTRAESTRUCTURA DEL SÁCULO Y MAGNITUDES
FÍSICAS FUNCIONALES DEL OTOLITO SACULAR
EN EL AJOLOTE (Ambystoma tigrinum)
Tesis para obtener el título de:
LICENCIADO EN BIOMEDICINA
Presenta:
OTTO BRAULIO GARCÍA GARIBAY
Asesores: Dr. Enrique Soto y Dra. Rosario Vega.
Puebla, Pue. a 10 de Diciembre de 2004
1
ÍNDICE
RESUMEN
4
ANTECEDENTES
6
Función del aparato vestibular
6
Estructura del oído interno
6
Neuroepitelios del oído interno
7
Órganos otolíticos
7
Canales semicirculares
9
Nervio vestibular
10
Células ciliadas
10
Fundamento biofísico
13
Modelación matemática del aparato vestibular,
de giróscopos y acelerómetros
15
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
18
HIPÓTESIS
19
OBJETIVOS GENERALES
20
OBJETIVOS PARTICULARES
21
MATERIAL Y MÉTODOS
22
Modelo biológico
22
Estructura macroscópica
22
Ultraestructura
23
Preparación de soluciones
24
Aislamiento de los otolitos
24
Preparación de los tejidos para observación en
el microscopio electrónico de barrido (MEB)
25
Mediciones
25
Estadística
27
2
RESULTADOS
28
Descripción morfológica del sáculo y mácula
sacular del ajolote
28
Dimensiones espaciales
31
Masa
32
Volumen aritmético (VA)
32
Volumen experimental (VE)
33
Densidad aritmética (DA)
33
Densidad experimental (DE)
33
Coeficiente de porosidad (VE/VA)
33
Relación de la dimensión masa del otolito sacular
respecto a la masa del espécimen
34
Magnitudes físicas del otolito sacular en la salamandra
34
Análisis comparativo de las dimensiones del otolito sacular
en el ajolote y en la salamandra
34
DISCUSIÓN
36
CONCLUSIÓN
41
BIBLIOGRAFÍA
42
3
RESUMEN
No hay reportes en la literatura de estudios precisos sobre la morfología del
sáculo del ajolote (Ambystoma tigrinum), por ello decidimos plantearnos el
objetivo de estudiar la morfología y la densidad del otolito sacular.
Por estudios anteriores realizados en nuestro laboratorio sabemos que la
mácula sacular en esta especie tiene forma elíptica; el eje mayor de la mácula
se orienta en dirección anteroposterior. Usando la microscopia electrónica de
barrido encontramos que la mácula está formada por alrededor de 1200 células
ciliadas, que son inervadas por un promedio de 446 ± 59 axones mielínicos (n =
4), mismos que presentan un diámetro de 2 a 3 µm, encontrando fibras desde
un 1 µm y hasta cerca de 15 µm en algunos casos (Méndez, 1992).
La mácula sacular es un importante neuroepitelio del aparato vestibular
en el ajolote pues el sáculo es un órgano otolítico que sensa aceleraciones
lineales y el vector de la gravedad; como anteriormente se expuso, se
encuentra altamente inervada por fibras provenientes del nervio vestibular (VIII
par craneal) y las células sensoriales que lo componen se hallan acopladas
mecánicamente al otolito que en respuesta a las aceleraciones lineales crea un
momento de inercia desplazando las estructuras especializadas de las células
sensoriales para convertir el estímulo mecánico en actividad neuronal modulada
que viaja a través de las fibras aferentes vestibulares hasta el sistema nervioso
central (SNC) y participa en la generación de respuestas reflejas para la
locomoción, estabilización de la mirada, navegación inercial y generación del
esquema corporal.
Los otolitos, como etimológicamente lo indica su nombre proveniente del
griego oto: oído; lithos: piedra, son verdaderas petrificaciones de matriz
inorgánica formada principalmente por cristales de carbonato de calcio en la
forma de calcita denominados otoconias, éstas se hallan embebidas en una
matriz de mucopolisacáridos (Soto, 1998) y envueltas por la membrana otolítica.
La dirección de una aceleración lineal define la dirección del vector de inercia y
la diferencia de densidades entre el otolito y el medio que lo rodea, además de
la magnitud de la aceleración, define la magnitud de dicho vector.
Por lo anteriormente expuesto es claro que para entender la mecánica del
aparato vestibular es básico conocer la diferencia de densidades entre el otolito
y el medio que lo rodea; por ello decidimos estudiar en nuestro modelo
experimental la morfología del sáculo y del otolito sacular, así como medir las
magnitudes físicas funcionales del mismo, en particular su volumen y su
densidad.
Encontramos que el otolito del sáculo tiene forma elipsoide cuyo diámetro
mayor es de 2.28 ± 0.2 mm y un volumen total de 2.68 ± 0.35 mm3 (n = 8). La
densidad del otolito sacular del ajolote es de 2.24 g/cm3 (n = 96).
Debido a la gran importancia que ha adquirido la modelación matemática
del sistema vestibular por el hecho de que por primera vez es factible
desarrollar análogos y eventualmente prótesis vestibulares, parece
indispensable generar modelos realistas cuyos parámetros tengan bases
4
fisiológicas. De ahí la importancia de incorporar mediciones anatómicas
específicas en dichos modelos. Por ello las mediciones realizadas en este estudio
podrán ser de gran utilidad para el desarrollo de modelos precisos del
funcionamiento vestibular.
5
ANTECEDENTES
Función del aparato vestibular
Cualquier organismo con la capacidad de moverse necesita información acerca
del movimiento y postura de su cuerpo, el sistema vestibular permite obtener
ésta información conjuntamente con otros sistemas como el visual y el
somestésico. La capacidad de un organismo para controlar las actividades
motoras y su postura en el espacio sólo fue posible usando un sistema de
referencia inercial.
Comparando con otros sistemas de referencia, como la luz, sonido, olor y
gusto, la aceleración gravitacional está caracterizada por un rasgo distintivo:
durante todo el periodo de vida del organismo en cuestión se mantiene
prácticamente constante tanto en magnitud como en dirección, por ello cuando
se aplica a una masa, es conocida como una fuerza normal, esto hace que sea
la fuerza de gravedad un sistema de referencia ideal para determinar estados de
movimiento y su dirección así como estados posturales. Otra fuerza o vector
que la naturaleza ha tomado como sistema de referencia es la masa inercial. En
los canales semicirculares, la tendencia del líquido endolinfático a seguir en el
estado inercial en que se encuentra (reposo o movimiento uniforme) permite,
mediante un acople mecánico que se describirá más adelante, determinar
cuando la cabeza del individuo abandona su estado inercial.
Estructura del oído interno
El laberinto membranoso está formado por una capa epitelial y una capa de
tejido conectivo. El epitelio en su mayor parte es simple y en algunos sectores
diferenciado, de tipo secretor, presentando dos clases de células; las células
claras y las oscuras (Anniko, 1980). Estos epitelios participan en la homeostasis
del líquido endolinfático manteniendo alto el nivel de potasio y bajo el de sodio.
Las células oscuras se encuentran localizadas en el techo de las ámpulas y en la
abertura de éstas hacia el utrículo y en el techo de la cavidad utricular. Células
similares se encuentran en la estria vascularis que constituye la pared externa
de la cóclea en los mamíferos. En el ajolote se describió un epitelio que
presenta células con características de células oscuras. Este epitelio en el ajolote
se encontró presente en las inmediaciones de la papila amphybiorum. Las
células oscuras presentan vesículas pinocíticas en la zona apical sugiriendo
movimiento hacia el interior celular. En la zona basolateral presentan pliegues
de membrana y en su interior se encuentran numerosas mitocondrias indicando
una tasa metabólica alta debida al transporte iónico (Guevara, 1992).
El laberinto membranoso está protegido por una cavidad ósea llamada
laberinto óseo o cápsula ótica que se localiza bilateralmente a la cavidad
craneana en la región temporal (Anniko, 1988).
6
Neuroepitelios del oído interno
En el laberinto membranoso están incluidas zonas de epitelio especializado en la
mecanorrecepción llamadas neuroepitelios sensoriales.
Son epitelios compuestos, especializados en la mecanorrecepción y
formados por al menos dos grupos de células, las células ciliadas y las de
soporte. Las primeras responden al movimiento mediante un sistema que
relaciona a un conjunto de cilios presentes en la superficie apical con estímulos
físicos (aceleraciones); las segundas dan sostén a las primeras y podrían ser la
base de algunos fenómenos bioeléctricos debidos a la presencia de uniones
comunicantes entre ellas (Nadol, 1984). Otro elemento presente en estos
epitelios sensoriales es el tejido neuronal representado por ramificaciones
axónicas no mielinizadas o dendritas que entretejen un complejo plexo entre las
células de soporte para hacer contacto sináptico con las células ciliadas. En los
neuroepitelios vestibulares las células sensoriales están separadas del tejido
subepitelial por una membrana basal. Las células ciliadas en su parte apical se
encuentran unidas al extremo apical de las células de soporte por un sello
anular completo de uniones cerradas, este tipo de unión impide que iones y
demás elementos del medio extracelular pasen a través de la vía paracelular
(Goldberg, 1984).
Los neuroepitelios presentes en el sistema vestibular de vertebrados
superiores son la mácula del sáculo, la del utrículo y las crestas de los canales
semicirculares; en vertebrados inferiores, como los reptiles, aves, peces y
anfibios también se incluyen la mácula de la lagena, las papilas basilar, neglecta
y amphybiorum (Anniko, 1988).
Órganos otolíticos
El utrículo es una estructura tubular con forma irregular, suspendido de las
paredes óseas por trabéculas de tejido conectivo. La mácula tiene forma de
riñón y se encuentra en un plano aproximadamente paralelo al plano del canal
semicircular lateral u horizontal; esto es en el plano horizontal de la cabeza.
El sáculo es un saco de forma ovoide que se encuentra firmemente
anclado a la pared medial del laberinto óseo por el subepitelio de la mácula. Se
ubica cerca del plano parasagital y por ello es ortogonal a la mácula utricular
(Goldberg, 1984).
Ambas máculas están divididas en dos partes por la estriola, una región
distintiva que en mamíferos presenta células ciliadas tipo I más voluminosas y
numerosas que las tipo II en relación 1:2. En contraste, la región fuera de la
estriola se caracteriza por una proporción igual de ambas células. Las células
ciliadas de cada lado de la estriola tienen polarización morfológica opuesta. En
la mácula sacular del humano, el kinocilio se orienta en dirección opuesta a la
estriola, mientras que en la mácula utricular se observa lo contrario (Goldberg
1984). En la mácula sacular del ajolote las células presentan una polarización
funcional también divergente, la mayor parte de los kinocilios apuntan en
7
dirección dorsal y el resto en dirección ventral, en tanto que la polarización
funcional de la mácula utricular es convergente (Hinojosa, 1984).
Una estructura delgada y fibrosa, la membrana otolítica, cubre cada
mácula. La superficie de esta membrana presenta perforaciones poco
profundas, probablemente receptáculos de los manojos ciliares (Figura 1). Se ha
reportado un espacio subotolítico por algunos autores, sin embargo, otros
argumentan que este espacio puede ser artefacto de fijación (Goldberg, 1984;
Lewis, 1981; Young, 1984). Sobre ambas membranas otolíticas existen cristales
de carbonato de calcio en forma de calcita embebidos en una matriz gelatinosa
rodeada por el resto de la membrana otolítica; a todo el sistema se le denomina
otoconia (Goldberg, 1984; Pote, 1993).
A
B
Figura 1: En A, esquema de una mácula otolítica. Se observan las células ciliadas que
forman el epitelio sensorial. Sobre ellas la cápsula otolítica y el conjunto de otoconias que
forman el otolito. Una aceleración lineal de la cabeza produce un desplazamiento inercial del
otolito en sentido contrario (flecha). En B, microfotografia electrónica que muestra el haz de
cilios y el punto de acoplamiento entre el kinocilio y la membrana otolítica, la cual en la región
donde se encuentra el haz de cilios tiene una invaginación. Microfotografia tomada de Kachar,
2000.
En virtud de que la otoconia tanto en el sáculo como en el utrículo
presenta una densidad mayor que la endolinfa que le rodea, cuando el sistema
es sometido a una fuerza lineal que coincide con el plano de cada mácula, se
produce un deslizamiento entre la mácula y la membrana otolítica. Este
desplazamiento flexiona los cilios de las células sensoriales, lo que constituye el
estímulo efectivo para estas células.
La lagena es un órgano otolítico presente en vertebrados inferiores, se
encuentra en la mayoría de los peces óseos, en todos los anfibios y en las aves
tiene una estructura peculiar o puede no estar presente. En cambio, en las aves
se encuentra una estructura llamada papila basilar o conducto coclear. En
algunas especies la lagena está en la región terminal de ésta papila. En los
anfibios la lagena generalmente se presenta como un receso ovoidal situado
ventrocaudalmente a la mácula del sáculo, se comunica por una abertura con la
cavidad sacular (Anniko, 1984).
8
Canales semicirculares
Los canales semicirculares son conductos cilíndricos que al igual que la mayor
parte del laberinto membranoso están formados por una capa de epitelio simple
pavimentoso. Los canales semicirculares, como su nombre lo indica, forman una
semicircunferencia equivalente a alrededor de tres cuartas partes de un círculo
completo. Se encuentran en número de tres y se denominan según su posición
como canal semicircular anterior o superior, posterior o inferior y lateral u
horizontal. El extremo anterior del canal semicircular lateral desemboca en el
saco utricular, mientras que los canales anterior y posterior presentan sus
extremos fusionados dando origen a la cruz común, que a su vez desemboca
también en la parte posterior del utrículo.
El ámpula es un alargamiento bulboso localizado al extremo de cada
canal y contiene el epitelio sensorial llamado cresta ampular. Esta estructura es
una saliente redondeada y está situada en la parte media del ámpula, orientada
a la luz del conducto y con su eje longitudinal perpendicular a la dirección del
ducto semicircular tocando con sus extremos ligeramente ensanchados ambas
paredes ampulares; estos extremos reciben el nombre de plano semilunar. Las
células ciliadas se localizan en la parte superior de la cresta exponiendo el
aparato ciliar a la luz del ámpula. Sobre la cresta existe una estructura
extracelular gelatinosa llamada cúpula que sella la cresta con las paredes y
techo del ámpula a manera de diafragma. El acople mecánico en las crestas es
distinto al que presentan otros órganos como el sáculo y el utrículo. En éste
caso los cilios de las células sensoriales están embebidos en la cúpula y son
significativamente más largos que en el resto de los neuroepitelios vestibulares
llegando a medir hasta 70 µm (Anniko, 1988). El desplazamiento inercial de la
endolinfa flexiona la cúpula y secundariamente los cilios en ella embebidos.
Cada canal es aproximadamente ortogonal con respecto de los planos
descritos por los demás y prácticamente coplanar con el canal sinérgico del
vestíbulo del lado opuesto (Figura 2).
A
B
Figura 2: En A, esquema del oído interno en un vertebrado superior,
destacan los tres canales semicirculares en planos ortogonales, el utrículo, el sáculo, y
la cóclea. En B, esquema de la ubicación de los canales semicirculares en tres planos
ortogonales entre si. Cada canal detecta un tipo específico de movimiento. El canal
posterior sensa el Cabeceo (pitch), el anterior el balanceo (tilt) y el lateral las
rotaciones (roll) de la cabeza.
9
Estas estructuras tienen como función detectar aceleraciones angulares y
la respuesta de cada canal está determinada por el componente de la
aceleración angular de la cabeza que coincide con el plano del canal semicircular
respectivo (Anniko, 1979; Anniko, 1988; Lewis, 1981).
Nervio vestibular
La información proveniente del oído interno es conducida por las fibras
aferentes del octavo par craneal hasta los núcleos vestibulares en el tallo
cerebral, de ahí es relevada a otros centros que regulan la postura, el equilibrio
y los movimientos oculares (Anniko, 1988).
El nervio vestibular entra en el orificio auditivo o meato auditivo interno
asociado con los nervios coclear y facial. El nervio vestibular se divide en dos
porciones. La porción anterior provee de inervación a las crestas de los canales
semicirculares anterior y lateral, así como a la mácula utricular. Las fibras
nerviosas maculares están localizadas posteriormente a la separación de las
ramas que van a las dos crestas. La porción posterior inerva al canal
semicircular posterior y a la mácula del sáculo y en las especies que las
presentan, la lagena y las máculas de las papilas basilar, amphybiorum y
neglecta (Anniko, 1988; Desmadryl, 1992). Estudios cuantitativos del nervio
vestibular en varias especies han demostrado que el número de fibras nerviosas
aumenta en series comparativas que comprenden aves, cuyos, gatos, monos y
humanos; hay por ejemplo, 8000 fibras en el en el cuyo comparado con 20 000
fibras en el del humano (Fritzsch, 1989). Una situación similar se encuentra en
el número de células ciliadas vestibulares. Las fibras aferentes son todas
mielinizadas. En aves y mamíferos la distribución de diámetros de fibras es
unimodal con una media cercana a las 3 µm y un rango que va de 1 a 10 µm, y
el diámetro promedio de las fibras ampulares es algo mayor que el de las fibras
que inervan a las máculas .
Células ciliadas
Las células ciliadas son los mecanorreceptores en los órganos auditivos,
vestibulares y de la línea lateral. De la superficie apical de las células ciliadas
emerge un conjunto de 60 a 100 cilios de los cuales uno, el kinocilio, se localiza
en un extremo. El kinocilio es un cilio verdadero ya que presenta un patrón de
nueve microtúbulos dobles que corren en toda su longitud y tienen su origen en
la célula ciliada en el cuerpo basal. Los nueve pares de microtúbulos se
encuentran rodeando un décimo par central. Los estereocilios son digitaciones
de membrana citoplasmática y están arreglados en series generalmente más
cortas que el kinocilio y siguen un patrón hexagonal sobre la superficie celular.
El kinocilio se encuentra en un extremo del haz de estereocilios (Figura 3A);
esto determina la polarización funcional de las células ciliadas tanto de las
crestas ampulares como de las máculas. Cada zona presenta el kinocilio con
diferente posición dentro del hato ciliar, esta disposición puede ser concéntrica o
excéntrica (Anniko, 1988); además Lewis reportó la existencia de seis tipos de
10
células ciliadas que se distribuyen de manera característica en las distintas
regiones de los neuroepitelios del aparato vestibular en la rana toro (Lewis,
1975).
A
B
Figura 3: En A, Microscopía electrónica de barrido de células ciliadas típicas. Se observa
un conjunto de estereocilios cuyo tamaño crece en dirección al kinocilio de gran tamaño y con un
bulbo. La línea que une al kinocilio de menor tamaño con el kinocilio define el eje de polarización
funcional. En B, unión de punta en una célula ciliada. Se observa que el ápice del estereocilio de
menor tamaño se une a la cara lateral del cilio siguiente. Tomadas de Díaz , 1995 y Kachar, 2000.
Se han descrito uniones cruzadas al parecer de naturaleza proteica,
también llamadas uniones de punta (tip links), entre estereocilios cocleares (en
mamíferos); entre los estereocilios más largos y el kinocilio (Figura 3B), Pickles
en 1984 demostró que en las células ciliadas cocleares existen estas ligaduras y
ahora se sabe que son determinantes en el fenómeno de polarización funcional
de la respuesta de las células ciliadas . La importancia de la polarización
funcional radica en que al flexionarse el haz de cilios, si la flexión es en la
dirección al kinocilio se produce una despolarización de la célula ciliada, por el
contrario, una flexión contra el kinocilio producirá una hiperpolarización de la
célula ciliada (Pickles, 1984).
La sinapsis aferente en las células ciliadas tipo I se caracteriza por
presentar en la porción presináptica un cuerpo electrodenso de unos 200 nm de
diámetro llamado cuerpo sináptico, rodeado de vesículas claras de entre 20 y 50
nm. En la terminal postsináptica (dendrita) existe un engrosamiento de la
membrana en la zona involucrada. La sinapsis eferente en ambos tipos de
células presenta un cúmulo de vesículas en la terminal presináptica (dendrita) y
en la postsináptica existe una estructura alargada llamada cisterna subsináptica.
Las fibras eferentes forman conexiones dendrosomáticas tipo botón en las
células tipo II, mientras que en las tipo I el contacto es sobre el cáliz aferente
(Wersall, 1965; Lewis, 1974).
Cada eferente puede hacer contacto sobre una sola célula ciliada o sobre
un grupo de ellas. Este complicado patrón de inervación puede ser en parte
responsable de diferentes patrones de descarga espontáneos, que se han
observado en fibras aferentes vestibulares primarias (Anniko, 1979).
11
Las aceleraciones lineales o angulares, luego de un complejo proceso de
acoplamiento mecánico producen una deflexión del haz de cilios en las células
sensoriales, con la subsecuente alteración del potencial eléctrico de la célula. El
desplazamiento del haz de cilios de una célula determina que se dispare una
cascada de eventos que, finalmente, en función del estado previo del sistema y
de la actividad del conjunto de las células sensoriales que componen una unidad
funcional, determina que se active o inhiba una vía nerviosa. Las células ciliadas
detectan las deflexiones del haz de cilios por un proceso conocido como
transducción mecanoeléctrica: convierten el desplazamiento de sus pelos
sensorios en un cambio de su potencial eléctrico debido a los cambios de una
conductancia de potasio a través de canales mecanotransductores inespecíficos.
Desde el movimiento de los cilios hasta la transmisión del mensaje a la neurona
aferente ocurren una serie de procesos que son: movimiento de los cilios,
transducción mecanoeléctrica, generación del potencial receptorial en la célula
sensorial, liberación de un transmisor químico y potenciación o inhibición de la
frecuencia de descarga de las aferentes vestibulares (potencial generador)
(Figura 4).
Figura 4: Esquema de la
cascada de eventos que median la
detección de aceleraciones en el
sistema auditivo y vestibular. El
proceso de acoplamiento mecánico
convierte las aceleraciones en
desplazamientos de los cilios, los
cuales, determinan la activación
del proceso de transducción
mecanoeléctrica y, en interacción
con canales iónicos, el potencial
receptor. En función de este último
se modifica la concentración de
Ca++ intracelular, regulando la
liberación de neurotransmisor y la
subsiguiente activación de la vía
aferente.
12
Fundamento biofísico
Para entender el funcionamiento del vestíbulo, es necesario en primera instancia
aclarar algunos conceptos físicos como son: momento de inercia, momento
vector o torque, velocidad y aceleración angulares y lineales, conceptos de
viscosidad, densidad y elasticidad (Sears, 1990).
Cuando una fuerza actúa sobre nuestro cuerpo, provoca un movimiento
de la cabeza (el origen de esta fuerza puede ser voluntaria o exógena) y funge
como un vector normal (sobre el centro de masa) o bien como un vector
tangencial; en el primer caso originaría un movimiento rectilíneo y en el
segundo un movimiento de rotación o angular.
El movimiento rectilíneo es aquel donde el vector de fuerza es aplicado
sobre el centro de masa, o bien, aunque no sea aplicado sobre éste, no origina
rotación pues es equilibrado por otras fuerzas de modo que el movimiento
resultante no tiene un eje rotatorio sino velocidad o aceleración lineal (m/s), a
este tipo de vector se le denomina normal.
En el caso de que el vector sea tangencial al centro de masa, se originará
un momento vector o torque de lo que resultará un movimiento rotatorio de
velocidad o aceleración angular (radianes/s).
La viscosidad es la propiedad de un material de oponer resistencia al
flujo, hay materiales que fluyen rápidamente como el helio, cuya viscosidad es
cercana a cero y decimos que es un “superfluído”; la viscosidad se mide en
poise (DINA seg/cm2).
La densidad es la razón de la masa de un material sobre unidad de
volumen; como ejemplo podemos referirnos a la densidad del plomo (11.35
g/cm3) o a la densidad del agua (1 g/cm3); aunque la densidad de manera
dependiente a la temperatura (Figura 5).
Densidad del agua
Densidad (g/cm3)
1.0005
1
0.9995
0.999
0.9985
0.998
0.9975
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Temperatura (grados centígrados)
Figura 5: Curva de la densidad del agua a diferentes temperaturas en grados centígrados.
13
Elasticidad es la propiedad de los cuerpos para recuperar su forma
después de haber sido deformados por efecto de una fuerza.
La respuesta fisiológica de las células ciliadas es una consecuencia de
vectores tangenciales o normales o bien una combinación de ambos que actúan
sobre el sistema cúpula - endolinfa en los canales semicirculares y sobre el
sistema otolito - endolinfa en los gravirreceptores; ejemplos de esta respuesta
fisiológica son la sensación inmediata y mediata que experimentamos cuando
nos subimos a algunos juegos mecánicos, a algún vehículo motorizado o a un
barco.
La endolinfa tiene un coeficiente de viscosidad aproximadamente igual al
del agua; esto le da una baja resistencia al flujo, por ello cuando el sistema
vestibular recibe un estímulo mecánico que genera un momento de inercia, los
elementos sólidos del sistema se desplazan y la endolinfa tiende a permanecer
en su sitio sirviendo como un referente del lugar espacial que ocupaba todo el
sistema antes del fenómeno mecánico (Figura 6).
Figura 6: Esquema que representa el desplazamiento virtual que tienen
tanto la cúpula en un canal semicircular, como el otolito en un órgano otolítico en
respuesta a un movimiento angular del órgano en el sentido de las manecillas del
reloj dentro de un plano bidimensional ideal.
Tanto la membrana de los otolitos como la cúpula de los canales
semicirculares poseen determinada elasticidad, por lo tanto la deformación que
hayan tenido como resultado del estímulo mecánico es transitoria y recuperan
su disposición original, recordando el modo en que los cilios del neuroepitelio
sensorial se acoplan con estos sustratos entenderemos que el desplazamiento
de los cilios también será transitorio (Yardley, 1994).
14
Modelación matemática del aparato vestibular, de giróscopos y
de acelerómetros
La historia de la descripción matemática del funcionamiento del sistema
vestibular inicia en el año 1933, cuando Steinhausen (Figura 7) empleó el
modelo matemático lineal del péndulo de torsión para describir la dinámica de la
cúpula del canal semicircular en respuesta a la aceleración angular. Su modelo
tiene un parámetro de viscosidad cuya magnitud es grande motivo por el cual
no hay oscilaciones del sistema, y usa dos constantes del tiempo para describir
desviaciones relativas de la posición normal de la cúpula. Después, en el año
1949, Van Egmond y colaboradores propusieron un método para calcular este
parámetro de viscosidad con ayuda de resultados experimentales estudiando el
nistagmo vestibular. En el año 1950, De Vries propuso un modelo matemático
lineal para el desplazamiento de la membrana otolítica cuando existe
aceleración lineal en un eje de sensibilidad. Este modelo puede tener
oscilaciones.
Figura 7: Esquema del modelo de
Steinhausen donde una dona
representa la endolinfa sostenida
por un resorte (de torción) cuya
flexibilidad ejerce una acción
semejante a la de la elasticidad de
la cúpula y el sistema yace sobre
un medio acuoso que representa la
viscosidad del sistema y todo se
halla dentro de una vasija que
funge como el análogo del
laberinto membranoso.
El segundo periodo de esta historia comenzó en los años sesenta del siglo
pasado. En 1965, Meiry, en su tesis doctoral, presentó un modelo matemático
no lineal de la respuesta del utrículo al estímulo mecánico. En 1971 Goldberg y
Fernández publicaron tres artículos fundamentales en los que presentaron un
modelo matemático lineal de la reacción del canal semicircular al estímulo
mecánico. La salida de este modelo es la frecuencia de los impulsos aferentes.
Por fin, en el año 1982, Bernard N. Segal y John S. Outerbridge publicaron el
modelo no lineal del funcionamiento del canal semicircular. Pero todos estos
modelos del segundo periodo corresponden a situaciones en las que existen
15
impulsos regulares, la frecuencia de los cuales depende casi linealmente del
estímulo mecánico. Con estos modelos es imposible analizar las situaciones
extremas, cuando existen bifurcaciones de los parámetros principales, como por
ejemplo la conductancia de la corriente de transducción (Ospek, 2001).
El tercer periodo de modelación de la respuesta del aparato vestibular
empezó en los años ochenta del siglo pasado: Hudspeth y Lewis, en 1988,
aportan la demostración experimental de la existencia de oscilaciones en las
corrientes iónicas de las células ciliadas del sáculo; Rabbit y Damiano, en 1992,
proponen por primera vez el modelo integro diferencial de la dinámica del
sistema cúpulo-endolinfático del canal semicircular; Astakhova, en 1989,
Sadonichii y cols., en 2001 y Soto y cols., en el mismo año, proponen un
modelo aproximado del sistema cúpulo-endolínfatico para diferentes modelos
mecánicos de la cúpula. Tal modelo aproximado es de tipo Shteinhausen, pero
todos los coeficientes del modelo son funciones de los parámetros fisiológicos y
por ello se pueden identificar todos los coeficientes con ayuda de resultados
experimentales.
Kondrachuk y Ross, en los años 1996-1997, desarrollaron el modelo
matemático de la dinámica de la membrana otolítica en forma de ecuaciones
con derivadas parciales.
Con base en todos estos antecedentes, el Laboratorio de Neurofisiología
Sensorial de la BUAP en colaboración con el Laboratorio de Mecánica Aplicada y
Control de la Universidad Estatal de Moscú, han propuesto un modelo que
ayude a comprender el procesamiento, por parte del vestíbulo, de la
información originada por los cambios de postura y movimiento del espécimen.
El modelo sugerido consta de tres bloques matemáticos que funcionan de
manera aislada para emular fenómenos fisiológicos distintos que finalmente
serán interdependientes los unos de los otros y lograrán integrarse para obtener
un resultado semejante al que obtienen los sistemas biológicos cuando reciben
la información proveniente de los órganos vestibulares; los fenómenos
fisiológicos aislados e interdependientes que se modelaron son: el acoplamiento
mecánico del sistema cúpula endolinfa en los canales semicirculares y el
acoplamiento de las otoconias con la membrana otolítica y las células ciliadas; la
transducción mecanoeléctrica dependiente de las características funcionales
intrínsecas de las células ciliadas y por último los complicados patrones de
descarga de las fibras aferentes vestibulares que estimulan de manera particular
el nervio vestibular.
Estos fenómenos son los mismos que podemos observar en la figura 8 y
si meditamos detenidamente su relevancia podremos darnos cuenta que fungen
como puntos críticos para el procesamiento de la información de la postura y del
movimiento, pues la mayoría de los trastornos vestibulares ocurren afectando
alguno de éstos fenómenos y además cada uno de ellos participa en la
autorregulación del sistema compensando los cambios de aceleración para
evitar una sobrecarga del sistema mediante mecanismos de retroalimentación
negativa.
16
Figura 8: Esquema general del funcionamiento de los canales semicirculares
(detectores de aceleraciones angulares) y de los órganos otolíticos (detectores de
aceleraciones lineales); observamos claramente que para ambos órganos existen tres
momentos en el procesamiento de la información que son: Acoplamiento mecánico,
transducción mecanoeléctrica y cambios en las corrientes y el voltaje de las células.
17
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Debido a la gran importancia que ha adquirido la modelación matemática del
sistema vestibular por el hecho de que por primera vez es factible desarrollar
análogos y eventualmente prótesis vestibulares, parece indispensable generar
modelos realistas cuyos parámetros tengan bases fisiológicas. De ahí la
importancia de incorporar mediciones anatómicas específicas en dichos
modelos. En el caso del modelo propuesto es indispensable determinar las
características morfológicas del otolito del sáculo y determinar su densidad a fin
de incorporar dichos valores en el modelo.
En este trabajo se determinarán los siguientes parámetros del modelo:
ρ 0 densidad del otolito ( mg / mm 3 )
vot volumen del otolito ( mm 3 )
18
HIPÓTESIS
Es factible definir la morfología y la densidad del otolito del sáculo usando como
modelo el ajolote, mediante técnicas morfológicas y mediante el desplazamiento
de volumen por el principio de Arquímedes.
19
OBJETIVOS GENERALES:
Determinar en el Ambystoma tigrinum, la anatomía del sáculo y de su otolito,
analizando parámetros morfológicos que puedan servir como base a la
modelación matemática de dichos órganos.
20
OBJETIVOS PARTICULARES
A.- Determinar la anatomía del sáculo mediante microscopía óptica así como la
ultraestructura macular usando microscopia electrónica.
B.- Determinar la anatomía del otolito sacular con microscopía óptica
C.- Realizar un estudio morfométrico del otolito sacular.
D.- Determinar la densidad del otolito sacular.
21
MATERIAL Y MÉTODOS
Modelo biológico
El modelo biológico utilizado para este estudio fue el estado neoténico de la
salamandra, de la clase de los urodelos: el ajolote (Ambystoma tigrinum). Se
usaron animales cuyo peso tuvo un valor medio de 31.45 g con una desviación
estándar de 2.09 g, sin distinción de sexo.
Para la disección de los órganos del oído interno, una vez preparado el
material se procede a sacrificar el animal por decapitación, ésta se efectúa
rápidamente sujetando con unas pinzas la región cervical y cortando delante de
ellas con unas tijeras quirúrgicas, enseguida se separa el maxilar inferior del
cráneo. Las cápsulas óticas se localizan fácilmente desde la vista ventral del
paladar como estructuras redondas y blancas en posición bilateral y en el
extremo caudal del cráneo, (ver figura 10).
Figura 10: Radiografía del
cráneo de un ajolote. En la parte anterior
se observa la mandíbula, y es claramente
visible el hueso iomandibular que une el
oído
interno
con
la
mandíbula.
Inmediatamente por delante de la unión
de la columna vertebral al cráneo se
observan las cápsulas óticas a ambos
lados (flecha) En ambas cápsulas óticas,
el otolito del sáculo se distingue como
una estructura radio opaca ovoide. Se
puede observar también claramente el
saco peri linfático intracraneal.
Se implementaron tres tipos de experimentos ó protocolos de trabajo con
algunas variantes según el caso:
a) Determinación de la estructura macroscópica.
b) Determinación de la estructura microscópica.
c) Determinación de la ultraestructura.
Estructura macroscópica
Estos experimentos se realizaron para obtener medidas relacionadas con la
estructura general del sáculo y para determinar su ubicación relativa. Se usaron
métodos de microscopía óptica con inclusión en parafina, microscopía óptica con
inclusión de la cápsula ótica completa y descalcificada en resina sintética e
inclusión en parafina del cráneo descalcificado íntegro.
22
Tras la inclusión en parafina, el sistema vestibular fue seccionado usando
un microtomo manual de marca R. Jung Ag Heidielberg, y se obtuvieron cortes
de 10 a 20µm, los cortes se estiraron en agua a 37°C y se montaron en
portaobjetos gelatinizados, posteriormente se tiñeron con azul de metileno y se
fotografiaron con el microscopio óptico a bajo aumento.
Para la inclusión de las cápsulas óticas se obtuvo el cráneo completo del
ajolote libre de tejido muscular, se abrió por la cara ventrolateral de ambas
cápsulas y enseguida se inició la fijación en paraformaldehido al 1 % por
inmersión durante 12 hrs. Previo lavado con buffer de fosfatos se disecaron las
cápsulas óticas. Se realizó la descalcificación con en una solución que contiene
óxido nítrico (NO) al 1.5 % y paraformaldehído al 0.1 %, durante 24 hrs y se
hizo un cambio de solución cada 8 hrs. Después se hizo un lavado con buffer de
fosfatos durante 3 hrs con cambios cada 30 min. Se procedió a la postfijación,
usando una solución de tetróxido de osmio al 2 % durante 2 hrs. Se lavó con
buffer y se inició la deshidratación con cambios de alcohol en concentración
creciente (2 hrs c/uno). Las muestras se mantuvieron 1 hr en óxido de propileno
que es el solvente de la resina de inclusión Poli-Bed. Se hizo una infiltración con
resina en relación 1:1 con su solvente, esto durante 12 hrs, con la relación 3:1 6
hrs y con resina pura durante 2 hrs. Se indujo la polimerización de la resina a
60°C durante 12 hrs usando cápsulas de gelatina como moldes. La infiltración
fue a temperatura ambiente y siempre con el catalizador incluido. Se hicieron
los cortes histológicos con un grosor de 5 µm con el ultramicrótomo marca
Porter-Blum, modelo MT1.
Ultraestructura
Para el análisis ultraestructural utilizamos técnicas de microscopía óptica y
electrónica. Para esto, el vestíbulo, después de ser fijado y disecado en su
totalidad, fue postfijado por inmersión. Posteriormente se separaron los órganos
de interés, se sometieron al proceso de deshidratación e inclusión en resina
(Spurr, L. R. White o Poli-Bed). Los cortes para microscopía óptica fueron
realizados con el ultramicrótomo con un grosor de 1 µm, se contrastaron con
azul de toludina 1 %, calentando a temperaturas cercanas a los 80°C durante 5
ó 10 minutos.
Para la microscopía electrónica los cortes fueron de 60 a 90 nm de
grosor, fueron montados en rejillas de cobre y contrastados usando soluciones
de metales pesados.
Las rejillas se lavaron con agua bidestilada-desionizada (hasta 18 MΩ) y
se contrastaron en una solución de acetato de uranilo (pH = 4) al 2 % durante
el tiempo indicado. Lavadas las rejillas, se contrastaron con una solución de
citrato de plomo al 1 %. Finalmente las rejillas se lavaron y se dejaron secar en
papel filtro.
23
Preparación de las soluciones
1. Se preparó una solución concentrada de paraformaldehído al
12.5% en relación masa/masa. A partir de paraformaldehído con agua
desionizada, se mantuvo con agitación constante a una temperatura de
entre 60 °C y 70 °C y agregando 3 a 6 gotas de solución de NaOH hasta
que la solución se aclaró.
2. Solución A: Se tomaron 25 ml de solución concentrada y se agregaron 5
ml de glutaraldehído al 50 %. Con un buffer de cacodilato 0.2 M se diluyó
hasta 50 ml. El pH se ajustó a 7.4.
3. Solución B: Se tomaron 10 ml de la solución A y se diluyó en 40 ml de
buffer de cacodilato 0.1 M pH 7.4.
4. Solución de cacodilato para lavado: Se tomaron 100 ml de solución
de cacodilato de sodio, y se agregaron 10 mg de CaCl2 (solución de 1
mg/ml) y 5 grs de sacarosa (5 %), el pH se ajusta a 7.4.
5. Solución diluida: Se tomaron 10 ml de solución de fijación y se diluyen
en 40 ml de buffer de cacodilato 0.1 M a pH 7.4.
6. Solución de glutaraldehido: Se preparó a partir de una ampolleta que
contiene una concentración inicial al 70 % (Electron Microscopy Sciences,
Cat. 01635). Esta solución se disolvió en buffer de fosfatos con pH de
7.42 (Hayat, 1989). La solución se mantuvo a 4°C.
7. Las soluciones de tetróxido de osmio se prepararon disolviendo una
ampolleta con 0.5 g de la sal (Electron Microscopy Science), en agua
bidestilada-desionizada. Se dejó disolver toda la noche en refrigeración o
se sonicaron las soluciones por espacio de 15 minutos.
(Hayat, 1986; Hayat, 1989)
Aislamiento de los otolitos
Los otolitos fueron aislados del sistema vestibular de cada uno de los órganos
otolíticos por disección individual. Los otilitos fueron obtenidos alternativamente
de tejidos que fueron fijados previamente con paraformalheído al 4% durante
un día, con tetróxido de osmio al 2% durante tres horas ó de tejidos sin fijar.
Una vez aislados los tejidos, se pasan a una cámara de disección en agua
destilada para obtener en forma única y sin contaminación los cristales del
sáculo, lagena, saco endolinfático y utrículo. Los cristales se succionan con una
micropipeta de vidrio adaptada a una jeringa y se lavan abundantemente para
eliminar toda la materia orgánica que los rodea. Los cristales entonces se
24
depositan en diferentes portamuestras. Dependiendo del análisis al que se
sometieron, para el caso de la microscopía electrónica de barrido se utilizaron
portamuestras donde los cristales se depositaron directamente. Los cristales se
dejaron secar durante un día en una cámara para evitar el polvo y se
observaron en un microscopio JEOL-JSV 5400 LV a 20 KV.
En otros de los casos los cristales fueron cubiertos con plata nanométrica
para facilitar la toma de las fotografías. Las muestras provenientes de animales
fijados y sin fijar se observaron alternativamente en la versión de bajo vacío al
mismo voltaje de 20 KV.
Preparación de los tejidos para observación en el microscopio
electrónico de barrido (MEB)
Para los experimentos donde se observaron los especímenes con MEB.
Utilizamos una fijación con aldheídos, específicamente, con la técnica de
Karnowski modificada. La fijación se realizó en dos etapas: la primera, se
efectuó durante la disección y la segunda, cuando se aisló totalmente el tejido
de interés.
El procedimiento para la preparación de especimenes para microscopía
electrónica de barrido se describe a continuación:
•
Disección en fijador karnowski (diluido) 30 min.
•
Pasar a solución de fijador Karnoski (solución de fijación) 4 hrs.
•
Pasar a buffer de cacodilatos 0.1 M y dejar 12 hrs en refrigeración.
•
Pasar a OsO4 2 % con 0.2 M de buffer de cacodilato pH 7.4 (en
refrigeración por 4 hrs).
•
Lavar en cacodilatos 0.1 M durante 1 hr
•
Pasar a OsO4 1 % con 0.1 M de buffer de cacodilato pH 7.4 (en
refrigeración por 2 hrs).
•
Lavar en cacodilatos 0.1 M durante 1 hr
•
Pasar a OsO4 1 % con 0.1 M de buffer de cacodilato pH 7.4 (en
refrigeración por 2 hrs).
•
Pasar a alcohol frío al 70 %, en esta condición se termina la disección.
•
Pasar a alcohol al 70 % y se deja en refrigeración durante 12 hrs.
•
Deshidratación en secuencia de alcoholes.
•
Deshidratación por punto crítico con CO2.
•
Una vez deshidratados los especímenes por punto crítico, se colocan en
portamuestras con un adhesivo de plata. Se recubrieron con plata
nanométrica y se observan en un microscopio electrónico de barrido
JEOL-JSV 5400 LV con un voltaje de aceleración de 20KV para ser
fotografiados.
Mediciones
Para medir los ejes de los otolitos los colocamos después de haber sido fijados
en el microscopio óptico sobre un papel milimétrico y utilizamos un ocular
especial que presenta una escala de sesenta unidades a lo largo de su diámetro;
25
para poder realizar la medición con mayor precisión ajustamos la escala para
que cada diez unidades del ocular sean encerradas por un milímetro del papel
estando bien enfocado.
A continuación colocamos el otolito y lo enfocamos de modo que se
distingan sus bordes y procedemos a medir su largo (x), ancho (y) y espesor
(z). Aplicamos la fórmula del volumen de un elipsoide (V=*x*y*z*π/6) y
obtenemos el volumen aritmético (VA); posteriormente procedemos a pesar el
otolito en una balanza de precisión (Mettler Toledo AB204-S).
Para la medición del volumen por desplazamiento de líquido o volumen
experimental (VE) utilizamos un dispositivo que diseñamos dentro del
laboratorio (Figura 11), y realizamos la medición con la estructura deshidratada.
Figura 11: Medición del volumen del otolito del sáculo: 1) Representación del
dispositivo para realizar la medición; 2) Con el émbolo de la jeringa hasta el fondo se llena el
tubo ependorf con agua colorada, 3) Se succiona líquido con la jeringa observando que el
nivel cubra la aguja de la jeringa; 4) Ahora se llena nuevamente el tubo ependorf; 5)
Cerramos el tubo ependorf y llevamos el émbolo hasta el fondo para marcar sobre el tubo
capilar el nivel del líquido; 6) Se succiona líquido con el émbolo, se abre la caja y se coloca el
otolito; 7) Cerramos el tubo ependorf y nuevamente llevamos el émbolo hasta el fondo para
marcar nuevamente el nivel del líquido en el capilar.
Posteriormente dividimos la masa pesada sobre el volumen aritmético y
obtuvimos la densidad aritmética (DA) y de igual manera dividimos la masa
pesada sobre el volumen experimental para obtener la densidad experimental
(DE).
Para corroborar la medición de densidad juntamos otolitos hasta alcanzar
una masa de alrededor de 100mg de otolito y formamos tres grupos de masa
26
otolítica dividiendo de manera aleatoria los otolitos, los pesamos y medimos su
volumen observando el desplazamiento de líquido para obtener una medida de
densidad homogeneizada.
Estadística
Todos los resultados cuantitativos que presentamos son la media aritmética de
una muestra (n=8) con su respectiva desviación estándar.
En el caso de los experimentos que logramos realizar con las salamandras
el tamaño de la muestra fue de dos especimenes. Sin embargo realizamos todas
las mediciones.
27
RESULTADOS
Descripción morfológica de sáculo y mácula sacular del ajolote
El sáculo está en contacto con la lagena por medio de la apertura sáculo
lagenar; un orificio en la pared vertical entre ambas cavidades. Dicho orificio es
circular y mide aproximadamente 160 µm de diámetro (Figura 12). La lagena se
ubica en la región ventral y caudal del sáculo. Recibe su inervación por su parte
dorsal. La papila basilar se encuentra en su porción dorsal. El eje longitudinal de
ambas estructuras, lagena y papila basilar, es vertical. En dirección
anteroposterior se encuentra la mácula del sáculo con su superficie macular
hacia la zona lateral en un plano vertical.
S
L
M
100µm
Figura 12: Estructura de la cavidad sacular. Se observa claramente la comunicación
entre la cavidad de la lagena (L) y la cavidad sacular (S). En la lagena se aprecia el
neuroepitelio sensorial que la abarca en toda su extensión. En el caso del sáculo, la
mácula (M) ocupa una pequeña porción de la gran cavidad sacular. En la parte inferior
de la mácula del sáculo se observan conjuntos de axones mielínicos y algunos vasos
sanguíneos.
El estudio con microscopía electrónica del sáculo nos ha permitido
determinar que la mácula sacular constituye la mayor estructura sensorial en el
vestíbulo del ajolote. Presenta una gran masa otolítica que permite identificarla
claramente. La mácula del sáculo esta inervada por fibras provenientes de la
rama posterior del nervio vestibular. En el ajolote el sáculo esta formado por
una cavidad con forma elipsoide, el diámetro mayor está orientado
anteroposteriormente. La mácula sacular tiene una forma elíptica, mide
aproximadamente 500 µm de longitud (n = 4, Figura 13B). Esta compuesta por
una capa epitelial de células de sostén de 20 µm de altura y una capa de
células sensoriales (células ciliadas) de alrededor de 40-50 µm. En la región
sensorial se distinguen claramente las células ciliadas, las cuales son fácilmente
identificables por sus características morfológicas peculiares (Figura 13A).
28
Los axones mielínicos (en principio axones de las neuronas aferentes),
pierden la mielina al pasar la membrana basolateral del neuroepitelio sensorial.
Suponiendo que el punto donde convergen varias dendritas es el más probable
para ubicar el inicio del potencial de acción en las neuronas aferentes. Con base
en mediciones realizadas usando tinciones con peroxidasa de rábano y
estimaciones del trayecto que recorren las dendritas desde la región sináptica a
este sitio encontramos para los canales semicirculares un rango de 62.5 a
175µM, para el utrículo de 27 a 45 µM y para el sáculo de 45 a 90µM.
La microscopía electrónica de barrido de la mácula del sáculo del ajolote,
nos han permitido determinar que está compuesta por alrededor de 1200
células ciliadas (Figura 13C). En la mácula se encuentran además de las células
sensoriales células de sostén, las cuales están rodeando a las células ciliadas.
Las regiones no sensoriales del sáculo muestran distintos tipos de tejidos
epiteliales; incluyendo epitelios simples monoestratificados de células cuboides,
epitelios de tipo secretor con células que muestran una gran cantidad de
vellosidades en su membrana basolateral y epitelios secretores con
microvellosidades e inclusiones intracitoplasmáticas relacionados con la masa
otoconial. Las paredes del órgano están cubiertas de un estrato epitelial y una
capa de tejido conectivo en la cual se encuentran gran número de fibroblastos
bien definidos con prolongaciones claras y que han sido encontradas por
microscopía electrónica de transmisión.
Figura 13: Estructura de
la
mácula
sacular.
En
A,
microscopia
óptica
del
neuroepitelio del sáculo. La mácula
se distingue claramente como un
engrosamiento del epitelio de la
pared sacular. Esta formada por
células ciliadas (CC) y células de
soporte (CS). En la parte inferior
de la mácula se pueden distinguir
claramente grupos de axones
mielínicos (AM), algunos vasos
sanguíneos (VS) y fibroblastos
(Fb). En B y C, microscopía
electrónica de barrido de la mácula
del sáculo. Puede verse que la
mácula
tiene
una
forma
redondeada, mide en su eje mayor
cerca de 500 µm. Con base en este
tipo de imágenes se puede
establecer el número total de
células que componen la mácula y
observando a mayor aumento su
polarización funcional.
A
B
C
29
La mácula del sáculo en el ajolote, está constituida únicamente por
células ciliadas de tipo II (según la clasificación de las células ciliadas como tipo
I y II (Wersall, 1956). Las células sensoriales son de tipo cilíndrico, ligeramente
engrosadas en su parte media, con el núcleo en la parte media o inferior,
muestran numerosas mitocondrias en su parte basal, y se caracterizan por la
presencia de un engrosamiento electrodenso en su parte apical (cutícula) de la
cual se originan los cilios. Como puede observarse los cilios son prolongaciones
citoplasmáticas, y sólo uno, el kinocilio, es un cilio verdadero (Figura 14A). Las
dimensiones de estas células son aproximadamente de 40-50 µm de altura por
10-20 µm de ancho.
En el caso del sáculo, órgano que presenta el mayor número de otolitos,
observables a simple vista, se encuentran embebidos en una membrana otolítica
rodeada de una matriz gelatinosa (Figura 14B), donde se puede observar que
los conjuntos ciliares de las células ciliadas se agrupan en pequeñas
invaginaciones en una forma específica, dentro de esta membrana otolítica, sitio
por el cual se les permite al conjunto ciliar alcanzar a la masa otolítica. Esta
membrana otolítica presenta forma que asemeja una malla que contiene por la
parte de abajo a los conjuntos ciliares y por la parte superior a la masa otolítica,
que en su conjunto esta formada por grupos de otoconias adheridos por una
matriz gelatinosa. Todos los estereocilios en las células ciliadas del sáculo
presentan un patrón común, es decir, los estereocilios más pequeños se
encuentran a la periferia y su tamaño aumenta en dirección del kinocilio que se
encuentra polarizado, aún cuando evidentemente existen diferentes patrones
poblacionales.
A
B
Figura 14: En A, microscopia electrónica de barrido de
una célula típica del sáculo. Se pueden observar los cilios que van
de menor a mayor hasta el kinocilio. La longitud máxima de los
cilios es cercana a las 30 µm. El epitelio de soporte presenta
múltiples vellosidades. En B, la membrana otolítica muestra un
conjunto de cavidades donde aparentemente se inserta el haz de
cilios.
30
La MEB mostró como el otolito del sáculo es una estructura ovoide con
una forma elipsoidal, en la figura 15A mostramos la medición de uno de sus
ejes; las figuras 15B y C muestran a un mayor aumento que el otolito se halla
conformado por cristales elipsoidales denominados otoconias, estos cristales
tienen longitudes que son sumamente variables pues algunas miden 1 micra y
encontramos otoconias que llegan a medir hasta 100 micras.
B
A
Figura
15:
La
ultraestructura del otolito
sacular. En A, microscopia
electrónica e barrido del
otolito del sáculo. Se puede
observar que se trata de una
estructura
redondeada
u
ovoidea. En B, a mayor
aumento se observa que el
otolito está a su vez formado
por
múltiples
cristales
denominados otoconias. En C,
aún a mayor aumento. Se
observa que los cristales
otoconiales del sáculo tienen
una forma elipsoide con
tamaños sumamente variables
que van desde una micras
hasta cerca de 100 micras.
1240 µm
C
En el caso de la mácula del sáculo las células ciliadas se hallan
polarizadas (Méndez, 1992) de manera divergente como se observa en el dibujo
de la figura 16, esto significa que su kinocilio apunta hacia el exterior de la
mácula; esto nos habla de la importancia de este neuroepitelio pues parece no
solo sensar el vector del eje gravitacional sino también puede sensar
aceleraciones lineales sobre el plano sagital del espécimen.
Dimensiones espaciales del otolito sacular
Los otolitos de ajolote presentan una morfología característica que no es muy
variable entre uno y otro espécimen; la tabla 1 representa una medición de los
tres ejes correspondiente cada uno a una dimensión del espacio (n = 8).
El eje mayor (eje X) corresponde aproximadamente en el cráneo del animal al
eje antero - posterior, el eje mediano (eje Y) al eje medio - lateral y el eje
menor (eje Z) al eje rostro – caudal (Figura 17, Tabla I).
31
Masa del otolito sacular
La masa del otolito sacular fue determinada pesando el otolito fijado, libre de
anexos laberínticos y secado en una báscula de precisión y el resultado obtenido
fue de: 6.01 ± 0.9 mg (n = 8).
OS
1
2
3
4
5
6
7
8
Promedio
Desviación
Estándar
Eje X
0.232
0.212
0.252
0.21
0.211
0.2
0.28
0.22
0.2282
0.026
Eje Y
0.189
.0195
0.201
0.154
0.198
0.173
0.19
0.2
0.1875
0.016
Eje Z
0.126
0.163
0.153
0.142
0.175
0.117
0.12
0.141
0.1421
0.021
Tabla I. Medición de los ejes
espaciales del otolito sacular del
ajolote (cm).
Volumen aritmético (VA)
Pudimos medir el volumen del otolito del sáculo del ajolote de manera
aritmética asumiendo su morfología elipsoidal, el resultado promedio que
obtuvimos es de: 3.1 ± 0.42 mm3 (n = 8)
U
M
CA
S
CL
Medial
Anterior
Posterior
Distal
Figura 17: Microfotografía del oído interno del ajolote abierto ventralmente.
Se observa el otolito del sáculo (S). Rostralmente se observan en un tono
oscuro, las fibras nerviosas que inervan a los canales anterior (CA), lateral
(CL) y el utrículo (U). Hacia la parte medial se observa la mácula sacular y su
inervación (M).
32
Volumen experimental (VE)
El Volumen experimental fue medido sumergiendo el otolito aislado, libre de
anexos del laberinto membranoso y fijado en agua teñida con azul de metileno
tal como lo describimos anteriormente; de este modo el volumen; los resultados
obtenidos fueron: 2.68 ± 0.35 mm3 (n = 8).
Densidad aritmética (DA)
Se determinó la densidad del otolito del sáculo dividiendo la masa entre el
volumen aritmético y el resultado obtenido fue de: 1.615 ± 0.092 g/cm3 (n
= 8).
Densidad experimental (DE)
Para la obtención de este dato realizamos dos pruebas; la primera consistió en
dividir la masa entre el volumen obtenido de manera experimental, siguiendo
este método obtuvimos una densidad de: 2.24 ± 0.04 g/cm3 (n = 8).
El otro método para realizar esta medición fue la colección de una gran
cantidad de otolitos para pesarlos y medir su volumen en conjunto considerando
que tenemos un cúmulo de otolitos cuya composición es homogénea; por este
método obtuvimos un valor de densidad de: 2.241 g/cm3 para un conjunto
de 32 otolitos.
Posteriormente formamos tres conjuntos escogiendo otolitos de la
colección de manera aleatoria para encontrar posibles variaciones en la
densidad de los otolitos obteniendo los siguientes resultados:
Grupo 1: 2.25 g/cm3 para un conjunto de 28 otolitos.
Grupo 2: 2.23 g/cm3 para un conjunto de 40 otolitos.
Grupo 3: 2.25 g/cm3 para un conjunto de 28 otolitos.
Coeficiente de porosidad (VE/VA)
Puesto que encontramos una variación entre la medición del volumen aritmético
(VA) y el volumen experimental (VE) y considerando el hecho de que los
cristales del otolito sacular se hallan embebidos en una matriz orgánica
concluimos que al realizarse la medición por el desplazamiento de líquido, con la
estructura deshidratada, se medía el volumen exclusivo del componente
inorgánico del otolito y decidimos definir su coeficiente de porosidad
dividiendo la media del VE sobre la media del VA (n = 8) y multiplicando por
100; el resultado obtenido de esta operación resultó:0.719
Este valor lo podemos expresar también en porcentaje y nos hace
suponer que bajo nuestras condiciones experimentales el OS del ajolote tiene
un 71.9 % de componente inorgánico y un 28.1 % de componente orgánico
extraíble con el fijador.
33
Relación de la dimensión masa del otolito sacular respecto a la
masa del espécimen
La figura 18 representa la relación entre la masa del OS y la del ajolote;
dividimos el valor de masa otolítica sobre la masa del ajolote multiplicado por
100 (n = 8) y el resultado considerado como porcentaje de la masa del ajolote
que representa la masa del otolito fue de: 0.019 ± 0.0018 %
0.0075
Masa del otolito sacular (g)
0.0070
Figura 18: Los puntos de
esta gráfica muestran la relación
del peso del ajolote y el peso de su
otolito (n=8), los últimos dos datos
se hallan encimados por ello
observamos sólo siete puntos; la
línea azul es un ajuste a una
función tipo Boltzmann.
0.0065
0.0060
0.0055
0.0050
0.0045
29
30
31
32
33
34
35
Masa del ajolote (g)
Magnitudes físicas del otolito sacular en la salamandra
Decidimos también realizar un estudio con los otolitos de salamandra y
presentamos los valores de sus dimensiones en la tabla 2.
Salamandra MS (g)
MOS (g) X (mm)
Y (mm)
Z (mm)
1
2
Promedio
Desv. Est.
4.2
4.9
4.425
1.07
1.82
1.56
1.69
0.18
1.11
1.33
1.22
0.15
10.5
15.6
13.05
3.6
1.98
2.11
2.45
0.01
VA
(µl)
2
2.3
2.15
0.1
VE
(µl)
1.8
2.1
1.95
0.1
DA
(g/ml)
2
2.13
2.07
0.01
DE
(g/ml)
2.33
2.33
2.33
0
Tabla 2: Mediciones realizadas con 2 salamandras de la masa de la salamandra (MS)
(g), la masa del otolito (MOS) (g), ejes X, Y y Z; volumen aritmético (VA) (cm3), volumen
experimental (VE) (cm3), densidad aritmética (DA) (g/cm3) y densidad experimental (DE)
(g/cm3) del otolito del sáculo.
Análisis comparativo de las dimensiones del otolito sacular en el
ajolote y en la salamandra
Observamos tras realizar estos experimentos que hay un cambio en la
morfología del otolito sacular en la salamandra con respecto al del ajolote, en la
Discusión hablaremos de las posibles causas de estos cambios morfológicos; la
figura 19 muestra las diferencias de su morfología.
34
No podemos conocer la razón de estos cambios y no conocemos la
cinética de los mismos pues la edad exacta de los especimenes y el tiempo que
llevaban las salamandras desde su metamorfosis hasta el día del experimento.
Proporción comparada de los tres ejes del otolito
sacular del ajolote y la salamandra
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
X/X
X/X
Y/X
Y/X
Z/X
Z/X
Figura 19: Las barras azul oscuro y azul claro representan la proporción entre los
ejes X, Y y Z de la elipsoide que forma el otolito sacular en el ajolote y en la salamandra
respectivamente.
35
DISCUSIÓN
El objetivo principal de este trabajo fue conocer el valor mediante métodos
experimentales de las magnitudes físicas del otolito sacular del ajolote
(Ambystoma tigrinum), principalmente volumen y densidad. Estos valores son
importantes para el desarrollo del modelo matemático que mencionamos en el
apartado de Antecedentes, este modelo matemático es la interfase que nos
ayudará a comprender la fisiología de la mecanotransducción y de la integración
de señales en el aparato vestibular, para poder realizar análogos del mismo
utilizando dispositivos como microvibrogiróscopos y acelerómetros, con el
propósito de crear prótesis cibernéticas que suplan la función vestibular, incluso
en condiciones de navegación extrema como es el caso del manejo de
aeronaves, el viaje en órbita que realizan los astronautas, etc.
Por las razones expuestas en el párrafo anterior, la presente discusión
hace hincapié en analizar los resultados obtenidos respecto a la medición de la
densidad y el volumen del otolito sacular, pues éstas aportan los datos
necesarios para comprender la acción de la estructura otolítica en la generación
de los momentos de inercia que inician la mecanotransducción en los órganos
otolíticos.
Hablaremos someramente sobre los experimentos morfológicos e
histológicos pues como mencionamos en el apartado de antecedentes de este
trabajo, ya se ha estudiado la disposición de las células y de los órganos dentro
del laberinto óseo anteriormente.
Existen numerosos estudios sobre la morfología de aparato vestibular en
los vertebrados (Lowenstein, 1970; Ramprashad, 1986) y en ellos se ha
observado una relación directa entre las características morfológicas del órgano
y las características del ambiente en el que se desarrolla el espécimen y las
características de su sistema de locomoción. Por ejemplo, Ramprashad comparó
constantes del modelo de Steinhausen de la mecánica de los canales
semicirculares obtenidas de manera experimental en diferentes reptiles y,
observo que los canales semicirculares de la tortuga son menos sensibles a las
aceleraciones angulares que los de las lagartijas y los de las serpientes; sin
embargo dentro de la misma serpiente el canal semicircular lateral es más
sensible que los otros canales; por otra parte al comparar las dimensiones de
los órganos otolíticos en anfibios como ranas y salamandras, observó que el
sáculo es proporcionalmente más voluminoso en la rana; otro estudio en
tortugas (Brichta, 1988) afirma que la papila neglecta en las tortugas funciona
como un sensor de vibraciones del suelo. Los resultados de este tipo de
estudios marcan una clara relación entre el tipo de movimientos que realizan los
animales y las características morfológicas del sistema vestibular: la locomoción
de las tortugas no se caracteriza por ser muy dinámica, sin embargo siempre
están muy cerca del suelo y su concha no amortigua las vibraciones, por lo
tanto éstas se transmiten hasta su cabeza; es obvio que las serpientes someten
sus cabezas a aceleraciones angulares en el plano horizontal más que los otros
36
reptiles; por último recordemos que las ranas suelen saltar, por lo tanto siempre
someten sus cabezas a aceleraciones lineales en el eje de la gravedad.
Los hallazgos que obtuvimos tras el desarrollo experimental del presente
trabajo también nos aportan algunos datos que sugieren una relación entre la
morfología del sáculo, la mácula del sáculo y el otolito sacular en el ajolote
(Ambystoma tigrinum) y su manera de interactuar con su entorno físico.
Además obtuvimos datos comparativos de las mediciones con salamandras y
los resultados indican diferencias interesantes de la morofología del otolito
sacular entre el estado larvario y el estado adulto de Ambystoma tigrinum.
El estudio morfológico del sáculo muestra que este gravirreceptor tiene
una forma elipsoidal que coincide con la morfología de la estructura otolítica,
también es posible observar la presencia de un orificio que comunica al sáculo
con la lagena.
El análisis microscópico de la mácula permite apreciar como el
neuroepitelio propio del órgano tiene una disposición vertical pues el sáculo es
el principal gravirreceptor, orientado en la dirección normal (perpendicular al
plano horizontal), y la mayoría de las aceleraciones que percibe coinciden con el
plano sagital del cráneo del animal; afirmación que pudimos sustentar con el
estudio de la mácula sacular o neuroepitelio del sáculo, pues las células ciliadas
se hallan polarizadas sobre este plano y principalmente sobre el eje vertical que
coincide con el vector de la gravedad.
La mácula del sáculo presenta células de soporte entre las células
sensoriales, disposición que es característica de los neuroepitelios sensoriales
basados en células ciliadas. Estas células de soporte de las máculas tienen un
papel importante en mantener la integridad estructural del sistema, y podrían
participar en algunos procesos metabólicos, pero esto aún no esta claro.
Pudimos observar también la membrana otolítica presenta fenestraciones
características que alojan a los haces ciliares de las células sensoriales; este
acople mecánico es de suma importancia para que se lleve a cabo la
mecanotransducción, como lo hemos descrito anteriormente, pues de esta
manera el momento de inercia generado por los vectores de aceleración lineal
de la masa otolítica, se transforma en un cambio en la liberación de
neurotransmisor de la célula ciliada y con ello proporcionalmente variará la
frecuencia de descarga de las fibras aferentes.
La membrana otolítica es un componente importante de la función
vestibular, sus propiedades hasta ahora no han podido ser estudiadas con
precisión, pero su participación no puede suprimirse en un modelo matemático
que pretendan emular la función vestibular. Particularmente nos referimos a un
factor de elasticidad del sistema, que en el caso de los canales semicirculares lo
determina la composición de la cúpula y en los órganos otolíticos el sistema
cilios-membrana otolítica; explicaremos brevemente la relevancia de este
parámetro de elasticidad en la mecánica otolítica.
Brevemente podemos decir al respecto que por una parte la masa de las
otoconias y por otra los vectores de inercia que éstas generan se pueden sumar
37
como un todo e imaginar un cuerpo ideal con un centro de masa y hablar de un
solo vector de inercia; sin embargo el desplazamiento de los cilios en las
máculas otolíticas, que es en última instancia el estímulo efectivo para activar el
sistema mecanotransductor, está amortiguado por este factor de elasticidad
conformado por las características de la membrana otolítica, la viscosidad de la
endolinfa, las características de la capa gelatinosa que llena el espacio que
existe entre el otolito y el neuroepitelio, y la rigidez de las estereocilias.
En el otolito sacular las otoconias son cristales de forma alargada y de
longitud y dimensiones muy variables (1 – 100µm). En otros trabajos se ha
demostrado que la otoconia no se distribuye uniformemente en el otolito de
algunas aves, quedando las más voluminosas cerca del neuroepitelio de la
mácula, las medianas en el centro del otolito y las más pequeñas cerca de la
superficie opuesta a la mácula sacular (Dickman, 2004). Nuestros resultados no
ofrecen ningún dato acerca de éste fenómeno ya que no se realizó un análisis
de la estructura interna del otolito intacto. Las mediciones realizadas sobre la
estructura del otolito nos sugieren que su morfología elipsoidal está relacionada
con la generación de un vector de inercia en un eje del espacio mejor que en
otro; por los resultados que observamos en las dimensiones del otolito sacular
del ajolote, existe un eje mayor que coincide con el vector de la gravedad y los
otros dos ejes coinciden horizontalmente con el plano sagital y horizontalmente
con el plano transversal respectivamente; sin embargo cuando observamos las
dimensiones del otolito sacular de la salamandra, obtuvimos mediciones
distintas a las que obtuvimos con el otolito sacular del ajolote, pues aunque
existen los tres ejes correspondientes a los diámetros de la elipsoide, la
diferencia de magnitud entre éstos es mayor. Los estudios realizados en
salamandra, aunque no concluyentes de forma definitiva por el restringido
número de animales que se usaron, indican que la diferencia de los ejes del
otolito sacular sea mayor en salamandra y esto nos hace presumir que existe
una adaptación en la morfología del otolito dada por los movimientos a los que
el animal se somete, pues el ajolote normalmente se mueve dentro del agua y
su movimiento es casi homogéneo en las tres dimensiones espaciales, sin
embargo la salamandra realiza una vida terrestre principalmente y bajo estas
condiciones las aceleraciones lineales son de mayor magnitud.
Por lo anterior nos atrevemos a generalizar a manera de hipótesis que la
morfología de los otolitos e incluso la composición material de ellos depende del
tipo de fuerzas mecánicas a las que se somete, de las características, dirección y
magnitud de los vectores de velocidad y aceleración a los que es sometido, y
además la polarización funcional de las células ciliadas en los neuroepitelios
tiene una disposición que evolutivamente está relacionada con las fuerzas
mecánicas que acabamos de mencionar.
Con respecto a la masa del otolito, la figura dieciocho nos muestra la
relación que existe entre la masa del animal y la de su otolito y observamos que
no es lineal como habíamos presumido, sino que sigue un comportamiento de
crecimiento exponencial; tal vez los ajolotes más pesados tengan una cantidad
38
de tejido adiposo mayor que los otros, por lo que consideramos que para saber
cual es la verdadera relación entre el tamaño del animal y el tamaño de su
otolito, lo correcto sería comparar las dimensiones del cráneo y en particular del
hueso temporal con la masa otolítica.
El vector de inercia que ocurre en respuesta a una aceleración lineal
depende de la densidad del objeto y la diferencia de esta magnitud con respecto
al medio; el presente trabajo busca determinar la densidad del otolito sacular
para poder sustentar con bases experimentales el modelaje matemático de
acelerómetros para prótesis vestibulares y, puesto que conocemos la densidad
de la endolinfa (1.08 g/cm3) (Young, 1984), es sumamente importante conocer
la densidad del otolito pues la generación de momentos de inercia depende de
la diferencia de densidades que existe entre éste y el medio en que se halla
embebido.
Como dispositivo de inercia; el valor de densidad más preciso de los que
describimos previamente es el que se realizó mediante el método de reunir un
conjunto de otolitos, pesarlos y medir su volumen todos a la vez; justificamos
esta afirmación por el hecho de que la composición mineral del otolito es
principalmente de carbonato de calcio en la forma de calcita, cuya densidad se
conoce y es de 2.4 g/cm3 y los valores que obtuvimos de manera experimental
están muy cercanos a este valor. Además a pesar de que el otolito sacular in
vivo se halla embebido por una matriz orgánica la diferencia de densidad de
esta matriz con respecto a la de la endolinfa y la de las membranas del laberinto
es despreciable.
Creemos que la diferencia en las mediciones de volumen que obtuvimos
con la medición aritmética y la medición experimental se debe a la porosidad del
otolito después de ser fijado y haber perdido el componente líquido de la matriz
orgánica, consideramos para nuestros objetivos particulares que el valor
experimental obtenido por el desplazamiento de líquido usando diferentes
colecciones de otolitos libres de materia orgánica y secos, como se describió en
el apartado de material y métodos, es válido y aporta la información que
necesitamos para poder reproducir la funcionalidad del otolito como dispositivo
generador del vector de inercia.
Hablemos ahora del modelo matemático de la función vestibular: Está
compuesto por tres bloques; el primero se refiere a la mecánica del vestíbulo, es
decir, para los canales el sistema cúpula endolinfa y para los órganos otolíticos
la interacción de la membrana otolítica con el haz ciliar. Este bloque esta basado
en trabajo realizado en colaboración entre nuestro laboratorio e investigadores
de la Universidad Estatal de Moscú. Se han publicado descripciones detalladas
del mismo (Soto, 2001: Sadovnichi, 2002). La resultante de este bloque es la
magnitud de las fuerzas mecánicas que reciben las estereocilias y que
determinan su desplazamiento; el segundo bloque es representativo de la
mecanotransducción, en él se analiza desde un punto probabilístico el proceso
de transducción. Este bloque del modelo esta basado en el trabajo desarrollado
por Markin y Hudspeth, se ha añadido a dicho modelo un módulo de
39
retroalimentación que permite dar cuenta del proceso de adaptación de la
corriente de transducción (Markin y Hudspeth, 1995); el tercer bloque define los
cambios resultantes en las corrientes y del potencial de membrana en reposo de
la célula ciliada (Vega, 2001; Alexandrov, 2001).
Al definir en este trabajo el valor de la densidad del otolito sacular se
complementan los parámetros requeridos por el modelo matemático. Cabe
destacar que este es un resultado relevante debido a que en el modelaje
matemático del sistema vestibular no existe ningún modelo completo del
vestíbulo, y los que hay no utilizan variables con sentido fisiológico preciso y
más aún, los parámetros de dichos modelos no se refieren como en nuestro
caso a un animal en particular. Es en este sentido que este trabajo adquiere
sentido y constituye la primera descripción completa del sáculo del ajolote que
puede servir de base al desarrollo de modelos matemáticos, los cuales en última
instancia permitirán una mucho más profunda comprensión del funcionamiento
del sistema vestibular y podrán contribuir al diseño y desarrollo de prótesis
vestibulares que es uno de los objetivos del grupo de investigación en
Neurofisiología Sensorial de la BUAP.
40
CONCLUSIÓN
Fue posible realizar una medición aproximada de los datos requeridos para el
modelo matemático propuesto por los investigadores de la BUAP y de la
Universidad de Moscú.
Los modelos matemáticos ayudan a comprender lo fenómenos con mayor
precisión y pueden ayudarnos a predecir el comportamiento de los elementos de
dichos fenómenos, en el caso de un modelo matemático que pretende aplicarse
para el diseño computacional de una prótesis que se acoplará a un sistema
biológico, es de suma importancia que este fundamentada en parámetros
obtenidos de manera experimental y como el modelo biológico que este grupo
de investigadores ha utilizado es el ajolote (Ambystoma tigrinum), es una
valiosa aportación obtener estos resultados utilizando el mismo modelo
biológico.
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