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Σ=96 tests
#1901
MICROWELL ELISA
HUMAN GROWTH HORMONE (HGH)
ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT
Enzyme Immunoassay for the Quantitative Determination of Human Growth
Hormone (HGH) Concentration in Human Serum
Introducción
La hormona de crecimiento humana (HGH, somatotropina) es un polipéptido secretado
por la pituitaria anterior. Tiene una longitud de 191 amino ácidos y tiene un peso
molecular de aproximadamente 22,000 daltones. Sus efectos metabólicos son
principalmente anabólicos. HCG promueve la conservación de proteínas y está
comprometida con en un amplio rango de mecanismos para la síntesis de proteínas.
También mejora el transporte de glucosa y facilita el almacenamiento de glucógeno. Su
cascada de acciones de promoción del crecimiento es mediada por otra familia de
hormonas péptidicas, las somatomedinas. La importancia de la medición de HGH radica
principalmente en el diagnóstico y tratamiento de diversas formas de secreción anormal
de la hormona de crecimiento. Desordenes causados por hiposecreción incluyen
enanismo y crecimiento potencial no alcanzado, y la hipersecreción esta asociada con el
gigantismo y la acromegalia. Las interpretaciones clínicas del nivel de la hormona de
crecimiento deben ser realizadas con mucha precaución. Éstas varían a lo largo del día,
haciendo difícil de definir un rango normal o juzgar el status de un individuo basados en
una sola determinación. Muchos factores se conocen que influyen en la tasa de
secreción de la hormona de crecimiento, incluyendo los periodos de sueño y los
periodos cuando se está despierto, ejercicios, estrés, hipoglucemia, estrógeno,
corticosesteroides y L-dopa. Por su similitud a la prolactina y al lactógeno de la
placenta, previos al inmunoanálisis de la hormona de crecimiento estaban a menudo
plagados de valores falsamente altos en mujeres embarazadas y lactantes. Debido a que
no todos los individuos acromegalicos tienen elevados niveles basales de hormona de
crecimiento, tests de supresión basados en la carga de glucosa son valiosos en este
contexto. A pesar de la hiperglicemia inducida, muy raramente hay un descenso en los
niveles basales en la acromegalia. Los individuos con niveles deficientes de la hormona
de crecimiento tienen niveles durante el ayuno y reposo similares a aquellos hallados en
individuos normales. Varios “challenge tests” han sido por lo tanto ideados para
diferenciarlos. Por ejemplo, con la primera etapa del sueño profundo o luego de 15 o 20
minutos de ejercicio vigoroso, los niveles normales de la hormona de crecimiento
usualmente aumentan. La sensibilidad de otros tests para la determinación de la
hormona del crecimiento están basados en la administración de L-dopa, arginina e
insulina. El propanolol o estrógeno a veces son dados en conjunto con el primer
estimulo para acentuar la respuesta. Un pequeño número de casos de enanismo han sido
documentados en los que tanto el nivel basal de HGH y la respuesta a pruebas
“challenge tests” fueron normales. Tales casos pueden involucrar insensibilidad del
tejido a la hormona de crecimiento, a las somatomedinas, o a la hormona de crecimiento
inmunoreactiva pero biológicamente inactiva. El Human Growth Hormone Enzyme
Immunoassay provee un rápido, sensible y confiable test. Sin reactividad cruzada con
HCG, TSH, LH, HGH y prolactina.
Principios del test
El kit del test HGH Quantitative está basado en un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas en una fase sólida. El sistema de análisis utiliza un anticuerpo policlonal antiHGH inmovilizado en una fase sólida (pozos microtitulación), un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-ferritin y en un anticuerpo unido a una enzima (peroxidasa de
rábano picante) en la solución conjugada. Se deja que la muestra del test reaccione
simultáneamente con los anticuerpos, dando como resultado que las moléculas HGH
queden en sandwich entre la fase sólida y los anticuerpos unidos enzimáticamente.
Luego de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, se lavan los pozos con
agua para remover los anticuerpos marcados no unidos. Se agrega una solución de
(TMB) y se incuba por 20 minutos, dando como resultado el desarrollo de un color azul.
El desarrollo del color es detenido al agregar HCl2N, cambiando el color a amarillo y
finalmente se mide espectrofotométricamente a 450 nm. La concentración de HGH es
directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra del test.
Uso
Para la determinación cuantitativa de las concentraciones de la hormona del crecimiento
humano (HGH) en suero humano.
Materiales y componentes
Materiales suministrados con el kit de test:
• 96 Pozos cubiertos de anticuerpo.
• Set de Referencia Estándar 0, 1.0, 2.5, 7.5, 15, y 30 ng/ml (WHO, 1st IRP, 66/217)
HGH, líquido, listo para usar.
• Reactivo de Conjugada Enzimático, 12 ml.
• Reactivo de Color A, 12 ml.
• Reactivo de Color B, 12 ml.
• Solución de Parada (HCl 2N), 10 ml.
Materiales requeridos pero no suministrados:
• Pipetas de Precisión: 0.05, 0.1, 0.2, y 1.0 ml.
• Puntas desechables para pipeta
• Agua destilada.
• Tubos de vidrio o matraces para mezclar el Reactivo de Color A y el Reactivo de
Color B.
• Mezclador de vórtice o su equivalente.
• Papel absorbente o toallas de papel.
• Papel milimetrado.
• Lector de pozos microtitulación.
Recolección de muestras y preparación
El suero debería ser preparado a partir de una muestra de sangre obtenida a través de
técnicas médicas aceptables. Este kit es sólo para usarse con muestras de suero sin
aditivos.
Almacenamiento de los kits de test e instrumentación
Los kits de test sin abrir deberían ser almacenados a 2-8 °C tras la fecha recepción, y la
placa microtitulación debería ser mantenida en una bolsa sellada con desecantes para
minimizar la exposición al aire húmedo. Los kits de tests abiertos se mantendrán
estables hasta la fecha de vencimiento mostrada, y si se almacenan de la manera descrita
arriba. Un lector de placas de microtitulación con un ancho de banda de 10 nm o menor
y una densidad óptica con un rango de 0-2 DO o mayor a 450nm de longitud de onda es
aceptable para usar en la medición de la absorbancia.
Preparación del Reactivo
1. Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente (18-22 ºC) antes de
usarse.
2. Para preparar la solución TMB, haga una mezcla 1:1 del Reactivo de Color A con
Reactivo de Color B justo antes de usarse. Mezcle gentilmente para asegurar una mezcla
completa. El reactivo de substrato TMB preparado se mantiene estable a temperatura
ambiente en la oscuridad por hasta 1 hora. Descarte el exceso después de usarse.
Procedimiento del Análisis
1. Asegure el número deseado de pozos cubiertos en el mezclador.
2. Dispensar 50 μ l de estándares, muestras, y controles en los pozos apropiados.
3. Dispensar 100 μ l de Reactivo de Conjugada Enzimático en cada pozo.
4. Mezcle bien por 30 segundos. Es muy importante mezclar completamente en este
paso.
5. Incube a temperatura ambiente (18-22° C) por 60 minutos. Prepare la solución TMB
hasta una hora antes de usarse.
6. Remueva la mezcla de incubación sacudiendo el contenido de la placa en un
contenedor de desechos.
7. Enjuague y sacuda los pozos de microtitulación 5 veces con agua destilada o agua
del grifo.
8. Agite los pozos fuertemente en papel absorbente o toallas de papel para remover
todas las gotas de agua residual.
9. Dispensar 200 μ l de solución TMB en cada pozo. Mezcle gentilmente por 5
segundos.
10. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad por 20 minutos.
11. Detenga la reacción agregando 50 μ l de Solución de Parada en cada pozo.
12. Mezcle gentilmente por 5 segundos. Es importante asegurarse que todo lo de color
azul cambie a amarillo completamente.
13. Lea la absorbancia a 450nm con un lector de pozo microtitulación en 30 minutos.
Nota Importante:
El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente dará como resultado una
precisión pobre y lecturas de absorbancia falsamente elevadas.
Cálculo de los resultados
Calcular el valor medio de la absorbancia (A450) para cada set de referencias estándar,
controles y muestras de pacientes. Construya una curva de calibración trazando la media
de la absorbancia obtenida de cada estándar de referencia en contra de su concentración
en ng/ml sobre un papel milimetrado, con los valores de absorbancia en el eje vertical ó
eje de las Y y las concentraciones en el eje horizontal o eje de las X. Use la media de los
valores de absorbancia para cada muestra para determinar la concentración
correspondiente de HGH en ng/ml en la curva de calibración.
Ejemplo de Curva de Calibración
Resultados típicos de una corrida de estándar, con un lectura de densidad óptica a
450nm mostrados en el eje de las Y contra las concentraciones de HGH mostradas en el
eje de las X. Ésta curva de calibración es sólo para propósitos de ejemplificación, y no
debe ser usada para calcular valores desconocidos. Cada usuario debería obtener sus
propios datos y curva de calibración.
HGH (ng/ml)
Absorbancia (450 nm)
0.0
0.052
1.0
0.253
2.5
0.501
7.5
1.158
15.0
2.075
30.0
3.025
Valores Esperados y Sensibilidad
Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos normales basados en su población
de pacientes. Un rango normal para la hormona del crecimiento humano es difícil de
definir por las fluctuaciones normales en las concentraciones de HGH. En la mayoría de
los sujetos adultos en descanso, luego de un ayuno nocturno, los niveles de HGH en
suero son de 7 ng/ml o menos. Los cambios en los niveles de HGH en respuesta a varios
estímulos dan un evaluación más precisa de la disfunción pituitaria que requiere”
pruebas de estimulación, o de estimulación o de supresión.
La mínima sensibilidad de este test es de 0.5 ng/ml.
Referencias.
1. Van Wyk, J.J. and Underwood, L.E. Growth Hormone, Somatomedins and Growth
Failure. Hospital Practice, 13:57; 1978.
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Manual. Ed. Nicholas, A.L. and Nelson, J.C.P. 3498 Nichols Institute, 1977.
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4. Reichlin, S. et al. Hypothalamic Hormones. Annual Revieew of Medicine. 27:359;
1976.
5. Rimoin, D.L. and Horton, W.A. Short Stature. J. Pediatrics. 92:523; 1978
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Fecha de Revisión: 10/04/06
Fecha de Revisión: 10/4/06