Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la

PROYECTO FIN DE CARRERA
Título
Comparación del método HPLC y método de infrarrojos
para la determinación de azúcares en la miel
Autor/es
Pablo Contreras Ruiz
Director/es
Susana Sanz Cervera
Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Titulación
Proyecto Fin de Carrera
Departamento
Agricultura y Alimentación
Curso Académico
2013-2014
Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la determinación
de azúcares en la miel, proyecto fin de carrera
de Pablo Contreras Ruiz, dirigido por Susana Sanz Cervera (publicado por la Universidad
de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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titulares del copyright.
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El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
COMPARACIÓN
DELMÉTODO
HPLCYMÉTODO
DEINFRARROJOS
PARALA
DETERMINACIÓN
DEAZÚCARESEN
LAMIEL.
TRABAJO FIN DE CARRERA
PABLO CONTRERAS RUIZ
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INDICE DE CONTENIDO
0.-ANTECEDENTES...................................................................................................................... 5 1.-RESUMEN ............................................................................................................................... 9 2.-INTRODUCCION .................................................................................................................. 13 2.1. Características generales, propiedades, origen y tipos de miel ........................................ 15 2.2. Datos económicos ............................................................................................................ 21 2.2.1 A nivel mundial.......................................................................................................... 21
2.2.2 La miel en España ...................................................................................................... 24
2.3. Composición de la miel.................................................................................................... 27 2.3.1 Composición media de la miel ................................................................................... 27
2.3.2. Viscosidad de la miel ................................................................................................ 28
2.3.3. Cristalización de la miel ............................................................................................ 29
2.3.4 Azúcares en la miel .................................................................................................... 30
2.4. Métodos de determinación de azúcares en la miel ........................................................... 32 2.4.1. Refractometría........................................................................................................... 32
2.4.2 Determinación química de azúcares totales ............................................................... 32
2.4.3. Métodos enzimáticos................................................................................................. 33
2.4.4. Métodos cromatográficos (HPLC) ............................................................................ 34
2.4.5. Espectroscopía infrarroja (IR) ................................................................................... 35
2.4.6. Comparación de HPLC con espectroscopía IR ......................................................... 36
3.-OBJETIVOS ........................................................................................................................... 37 4.-MATERIALES Y METODOS ............................................................................................... 41 4.1. Muestras ........................................................................................................................... 43 4.2. Método analítico mediante HPLC.................................................................................... 44 4.3 Milkoscan / FOSS ............................................................................................................. 47 4.4 Análisis estadístico............................................................................................................ 47 5.-RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................ 49 5.1. Composición de azúcares obtenida mediante HPLC........................................................ 51 3
5.1.1. Calibración del equipo .............................................................................................. 51
5.1.2. Análisis de muestras de miel ..................................................................................... 52
5.2. Composición de azúcares obtenidos mediante Milkoscan/Foss....................................... 60 5.3. Comparación de los resultados obtenidos mediante HPLC y Milkoscan......................... 63 6.-CONCLUSIONES .................................................................................................................. 69 7.-REFERENCIAS...................................................................................................................... 73 8.-ANEJO I ................................................................................................................................. 79 9.-ANEJO II ................................................................................................................................ 89 4
ANTECEDENTES
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0.-ANTECEDENTES
He llevado a cabo esta investigación a lo largo del 2013 en el país vecino, en Portugal,
en el Centro de Apoyo Tecnológico Agroalimentario, también llamado CATAA, situado en la
localidad de Castelo Branco, capital del distrito de Castelo Branco, en la región de Beira Interior
Sur o Beira Baixa como se conocía antiguamente.
Estuve el año anterior realizando una estancia Erasmus y surgió la posibilidad de
realizar una investigación durante tres meses en la Escuela Superior Agraria de Castelo Branco
gracias a la profesora Drra. Ofelia Anjos. Al principio no resulto fácil, debido al idioma, ya que
aunque sea similar no es lo mismo y más si se emplean términos técnicos, así que debo dar las
gracias por su paciencia tanto a Ofelia como al químico al mando en el centro, Dr. Paulo
Antunes.
Este centro está subvencionado por el Gobierno Portugués y tiene cooperación con
organismos españoles, dispone de varios laboratorios de ensayos químicos, microbiológicos y
físicos; aquí se desarrollan e implementan nuevas tecnologías, así como asistencias técnicas,
mejoras continuas de sistemas de gestión de calidad y prestación de servicios de análisis a
compañías agro industriales.
Sitio web CATAA : http://www.cataa.pt/
Escola Superior Agrária de Castelo Branco : http://www.ipcb.pt/ESA/
.
Imagen 1: Centro CATAA en Castelo Branco
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RESUMEN
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1.-RESUMEN
La investigación que he llevado a cabo trata de analizar la aplicación en miel de dos de
los métodos empleados en la determinación de azúcares en alimentos, comparando su eficacia y
fiabilidad: el método de cromatografía HPLC y el método de infrarrojos conocido como
Milkoscan o FOSS.
Los azúcares son los componentes mayoritarios de la miel y determinan sus principales
características. Por tanto debemos establecer la cantidad de cada uno de los tipos de azúcares
presentes en la miel utilizando los métodos más adecuados para su determinación. Para ello
hemos realizado analíticas mediante el empleo del método de infrarrojos con el equipo
“Milkoscan/Foss” para comprobar si los resultados obtenidos eran fiables respecto a los
obtenidos mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
1.-RESUMO
Os açucares são o maior componente nas méis , por isso, precisamos de conhecer os
métodos de determinação, A investigação que eu fiz foi analisar a aplicação na mel em dois
grupos de métodos utilizados na determinação de açúcares em alimentos, comparando sua
eficiência e confiabilidade: o método de HPLC e o método conhecido como MilkoScan
infravermelho ou FOSS, para assim comprobar si os resultados obtidos são fiáveis como o
respeito nos obtidos na cromatografia liquida de alta resolução.
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INTRODUCCION
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2.-INTRODUCCIÓN
2.1. Características generales, propiedades, origen y tipos de miel
La miel es un fluido dulce y viscoso producido por las abejas a partir del néctar de las
flores o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores de
plantas. Las abejas lo recogen, transforman y combinan con la enzima invertasa que contiene la
saliva de las abejas y lo almacenan en los panales donde madura.
La miel tiene cualidades reconocidas y utilizadas por los seres humanos desde tiempos
remotos, como alimento y para endulzar naturalmente. Existen diversas referencias históricas a
esta sustancia. Además de las citas bíblicas, muchos otros pueblos, como los antiguos egipcios o
los griegos, por ejemplo, se referían a la miel como un producto sagrado, llegando a servir como
forma de pagar los impuestos. En excavaciones egipcias con más de 3.000 años fueron
encontradas muestras de miel perfectamente conservadas en vasijas ligeramente tapadas.
También existen registros prehistóricos en pinturas rupestres de la utilización de la miel.
Son conocidas diversas variedades de miel que dependen de la flor utilizada como
fuente de néctar y del tipo de abeja que la produjo, pero como éstas la fabrican en cantidad cerca
de tres veces superior de lo que necesitan para sobrevivir, siempre fue posible, primeramente,
recoger el exceso de ésta para el ser humano y más tarde realizar la domesticación de las abejas
para el fin específico de obtener su miel, técnica conocida como apicultura.
Además, la miel presenta propiedades antibacterianas y farmacológicas que aumentan
su valor y su utilización a otros usos añadidos a su innegable valor nutritivo.
Efectos antibacteriales
En 1919, ya Sackett observó que algunas bacterias mueren rápidamente en miel no
esterilizada por calor, dando mejores resultados las mieles diluidas. En 1937, Dold, Du y Dzio
fueron los primeros en examinar las propiedades antibacteriales de la miel, que se atribuyó a
una sustancia llamada en aquellos entonces, "inhibina". Esta era susceptible al calor y a la luz.
Posteriormente, varios investigadores demostraron que mieles de diversos orígenes
tenían efecto sobre bacterias gram-positivas y gram-negativas. Este efecto no era atribuido
únicamente a la acidez, alto contenido de azúcares, compuestos nitrogenados, sino a una
sustancia bactericida que era susceptible al calor, a la luz solar y a un pH bajo. En 1944, Plachy
señaló que las mieles de altura (>1,000 m) tenían por lo menos el doble de la actividad
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antibacterial que mieles de áreas bajas (<1,000 m). Igualmente, se observó que sobre los 1,000
m la mayoría de las mieles tenían un porcentaje más alto de mielada. La mielada tiene
propiedades antibacteriales más marcadas que la miel floral. Más tarde se encontró que los
efectos de la "inhibina" eran causados por la acumulación de peróxido de hidrógeno, producido
por un sistema natural de glucosa oxidasa.
Lavie en 1960 afirmó que la miel no tiene propiedades fungistáticas como tal y que la
razón de que los mohos no pueden crecer es por la alta concentración de azúcares.
Efectos farmacológicos
La miel ha sido utilizada en la medicina desde tiempos inmemorables. En los últimos
cincuenta años se han realizado numerosos experimentos "in vitro" que demuestran los efectos
de la miel en tejidos y órganos animales. Sin embargo, estos no necesariamente son aplicables a
la fisiología humana, aunque es muy probable. Una de las áreas donde más se habla sobre los
beneficios de la miel es en la aplicación tópica en quemaduras.
La viscosidad de la miel es una barrera excelente contra microorganismos. Su alta
solubilidad en agua la hace fácil de eliminar. Y sus propiedades corrosivas leves previenen o
evitan daño adicional a tejidos. En 1970 Manjo concluye lo siguiente: “lo mejor para una herida
es dejarla sola y al descubierto, a menos que se aloje una infección y se requiera de tratamiento
antibiótico, en tal caso es probable que la miel sea tan efectiva como cualquier otra cosa”.
El alto contenido de Fructosa de la miel ha llevado a que se utilice para elevar el
metabolismo de alcohol en pacientes de alcoholismo. Por otro lado, se recomienda una gota de
miel pura en cada ojo para lavar y eliminar molestias en los mismos. En términos generales, al
utilizar miel en un paciente es menos probable que se haga daño al paciente, en comparación
con las demás substancias químicas preparadas por el ser humano. Por el contrario, en la
mayoría de los casos ha probado ser beneficiosa. El problema se presenta cuando se le
atribuyen propiedades que ésta no tiene o se utiliza en formas que no son acordes con sus
características físico/químicas. Lo que sí que no puede discutirse es que es un suplemento
alimenticio y un tonificador excelente.
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Valor Nutritivo
La miel fue un artículo alimenticio de supervivencia para los hombres primitivos. Dado
su valor endulzante, es atractiva para las personas y animales, aun cuando haya que recibir una
que otra picadura durante el proceso de cosecha. Recordemos que durante muchos siglos la miel
de abejas jugó un papel clave como endulzante ya que no se conocía el azúcar de caña o de
remolacha o el jarabe de maíz alto en Fructosa.
Según la FAO/UN, la miel presenta una cantidad energética de 3,04 cal/g , o 1,380
cal/lb.
Entre los factores nutritivos más atractivos de la miel está el hecho de que es un
alimento de alto valor calorífico fácilmente asimilable. Es un producto que en su forma natural e
inalterada está prácticamente predigerido. Muchas personas, conscientes de que mientras más
sana sea su dieta, mayores son las probabilidades de llevar una vida sin problemas de salud, han
comenzado o incrementado su consumo de miel de abejas como parte de una dieta equilibrada.
La miel que más aporta a la salud del ser humano es la miel cruda/no-filtrada (raw/unfiltered). Las enzimas, vitaminas, proteínas y demás componentes activos de la miel son
sumamente susceptibles al calor. Muchas mieles comerciales son pasteurizadas y filtradas a
presión o ultra-filtradas lo cual destruye muchos de los componentes beneficiosos. Motivos para
calentar la miel son:
(1) el control de la cristalización,
(2) evitar la posibilidad de fermentación,
(3) disminuir la viscosidad.
El filtrar a presión hace la miel más transparente y por lo tanto más agradable a la vista;
no obstante, se le eliminan las partículas de polen y coloides que aportan proteínas.
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Tipos de mieles
Existen tantos tipos de mieles como fuentes de néctar y mielatos existen. Cada tipo
tiene el sabor que le confiere el conjunto de la flora del territorio en el que el colmenar está
instalado; no existe prácticamente miel que provenga únicamente de un solo tipo de flor.
Sin embargo cuando hay especies dominantes suele hablarse de tipo de mieles
específicas o monoflorales, por ejemplo, miel de alfalfa, de eucaliptos, etc. Las mieles pueden
clasificarse por sus plantas de origen con los siguientes criterios básicos: cuando la proporción
de granos de polen de una sola planta presenta más del 50 % del conjunto de polen presente en
la miel, se da a la miel el nombre de esta planta.
Las características principales de algunas mieles más comunes son las que se detallan a
continuación:
-Miel de girasol (Helianthus annuus): tono amarillo oscuro, sabor agradable.
-Miel de lavanda (Lavandula spp): ámbar oro oscuro, sabor excelente, muy
apreciada; cristalización crema de color blanco para el lavandín, menos fina para la miel de
verdadera lavanda, contiene mucha glucosa.
-Miel de alfalfa (Medicago sativa L.): clara azucarada, cristaliza rápidamente en
cristales blancos.
-Miel de meliloto (Melilotus spp): blanca o amarilla verdosa clara; sabor
excelente que recuerda al de la canela o la vainilla.
-Miel de menta (Mentha spp): ámbar, aroma bien definido; cristalización fina; la
parte acuosa es particularmente rica en vitamina C (1,6 mg/Kg).
-La miel de los bosques de las coníferas que proveen de mielato es muy
apreciada. Es fácilmente reconocible por el color oscuro y verdusco que le confieren las algas
microscópicas que contiene.
-Existen mieles de frutos. Una de las más típicas es la miel de dátiles que las
abejas fabrican a partir de azúcar de dátiles puesto a secar al sol en los oasis de África del Norte
y del medio oriente. Esta miel es pardo oscura (casi negra) y de muy buena calidad.
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Clasificación
Por su origen botánico, las mieles se clasifican en miel de flores y miel de mielada:
-La Miel de Flores es la obtenida principalmente de los néctares de las flores.
Se diferencian en Mieles Monoflorales, que es cuando el producto obtenido proviene
principalmente de flores de una misma especie y posee características sensoriales,
físico/químicas y microscópicas propias, y las Mieles Poliflorales o Milflores.
-Las Mieles de Mielada son las obtenidas primordialmente a partir de
secreciones de las partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos succionadores de
plantas que se encuentran sobre ellas.
Según el método de obtención, las mieles se clasifican en
-Miel escurrida, es la miel obtenida por el escurrimiento de los panales
desoperculados, sin larvas.
-Miel prensada, es la miel obtenida por el prensado de los panales sin larvas.
-Miel centrifugada, es la miel obtenida por centrifugación de los panales
desoperculados, sin larvas.
-Miel filtrada, es la que ha sido sometida a un proceso de filtración sin alterar su
valor nutritivo.
Según su presentación, las mieles pueden ser:
-Miel en panales o en sección, es la miel almacenada por las abejas en las celdas
operculadas de panales nuevos, construido por ellas mismas que no contengan larvas y
comercializada en panales enteros o secciones de tales panales.
-Mieles con trozos de panales, es la miel que contiene uno o más trozos de
panales, exentos de larvas.
-Miel cristalizada o granulada, es la miel que ha experimentado un proceso de
natural solidificación como consecuencia de la cristalización de la glucosa.
-Miel cremosa, es la miel que tiene una estructura cristalina fina y que puede
haber sido sometida a un proceso físico que le confiere esa estructura y que la haga fácil de
untar.
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Según su destino:
-La miel para consumo directo, es la que responde o cumple ciertos requisitos
ya explicados (color, sabor, consistencia, etc.)
-La miel para ser utilizada por industria como endulzante y/o saborizante, es la
que responde a las características o requisitos previamente explicados, excepto en el índice de
diastasa y el contenido de hidroximetil furfural que podrán ser menor que 8 en la escala de
Gothe y mayor que 40 mg/Kg respectivamente. Sólo podrá ser empleada para la fabricación de
sustancias alimenticias como caramelos de miel, y otros productos que son saborizados y
aromatizados.
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2.2. Datos económicos
2.2.1 A nivel mundial
La miel es un producto al alza, pudiéndose deber al interés de los consumidores por
tomar alimentos más sanos, así como la demanda de productos naturales, provenientes de
agriculturas ecológicas.
Se estima que en el mercado europeo produce el 13% del total mundial, siendo los
principales productores España, Rumania, Grecia, Francia, Hungria, Alemania y Polonia.
La UE representa el 20-25% del consumo mundial de miel, en al año 2007, el consumo
de miel alcanzo las 310 mil toneladas
En general, el mercado de la miel es estable, lo que no significa que no esté
evolucionando. Por ejemplo la preferencia por miel monofloral se ha incrementado, ya que
también se ha incrementado la preocupación por los efectos de los cultivos intensivos, así como
del medioambiente en general. Esto ha motivado a la vez el interés por la miel orgánica y de
comercio justo.
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Cuadro 2 y 3: Principales exportadores e importadores de miel entre 2006 y 2010.
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El crecimiento promedio anual entre los años 2006 y 2010 ha sido de un 15%; siendo el
volumen de comercio de miel de abeja durante el año 2010 de 441 mil toneladas.
En el año 2008 el mercado mundial de la miel fue de 4000 millones de dólares, siendo
Europa Occidental el destino de un tercio de las ventas al por menor, seguido por la región de
Asia-Pacífico y luego América del Norte.
En términos de consumo per cápita, Suiza es líder con 1,4 kg, seguido por nueva
Zelanda y República Checa con 0,7 kg. Los consumidores estadounidenses presentaron un
consumo per cápita de 0,2kg.
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2.2.2 La miel en España
A continuación se muestran los datos de producción de miel a nivel del territorio
español mediante el censo apícola elaborado por el registro general de explotaciones ganaderas
en 2013 y su evolución. Los datos de años anteriores (desde el año 2008 hasta el año 2012) se
muestran en el Anejo I.
Cuadro 4: Distribución del número total de explotaciones apícolas por comunidades autónomas
Cuadro 7: Distribución del número total de explotaciones apícolas, mayo 2013
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Cuadro 8: Evolución del número de explotaciones apícolas por comunidades autónomas
Como podemos observar mediante las tablas, se aprecia un ligero incremento del
número de explotaciones apícolas, siendo las mayores productoras las comunidades autónomas
de Andalucía, Galicia y Castilla y León con un 15% de la producción cada una, así como
también un incremento en la producción de miel y ceras, llegando casi a duplicarse la
producción de miel y a triplicarse la producción de ceras.
Cuadro 9: Histórico de la producción de miel y cera en España
25
Cuadro 10: Evolución de la producción de miel y cera en España
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2.3. Composición de la miel
La composición de una miel va a depender de dos factores principales; (1) de la
composición del néctar o néctares de origen y (2) de factores externos. La primera va a
depender principalmente de la especie o conglomerado de especies de plantas que producen el
néctar. Factores externos, ajenos a la especie apibotánica o factores secundarios son: tipo y
química del suelo, clima, manejo apícola y manejo de la miel una vez cosechada por el
apicultor. Es sumamente difícil hablar de una muestra promedio o de una composición
promedio de miel ya que las variaciones encontradas a través del globo terráqueo son muy
amplias.
2.3.1 Composición media de la miel
La miel presenta una serie de compuestos los cuales vamos a describir a continuación
Azúcares, representando un 80% de los componentes totales.
Agua, la cantidad media suele ser de un 18%. Debido a la alta concentración de azúcares, la
miel presenta un alto grado de higroscopicidad, por lo que puede captar el agua cuando la
humedad relativa sea igual o superior al 60% .
El resto de los componentes de la miel solo alcanza un 2% del total, siendo:
Proteínas: las más importantes son enzimas, mayoritariamente aportadas por la abeja, y de
forma minoritaria por la planta.
Las principales enzimas existentes en la miel son:
Invertasa: convierte la Sacarosa del néctar en Glucosa y Fructosa.
Diastasa: hidroliza el almidón a dextrinas o azúcar. La α-amilasa divide las
cadenas de almidón produciendo dextrinas y la β- amilasa que separa la Maltosa de los
terminales de las cadenas de almidón.
Glucosa oxidasa: transforma la Glucosa en glucolactona, a su vez produce ácido
glucónico y peróxido de hidrogeno.
Catalasa: convierte el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno.
Fosfatasa ácida: es una hidrolasa que se encarga de eliminar grupos fosfato de
varios tipos de moléculas, es decir, realiza desfosforilaciones.
Sales minerales, ampliamente representadas en la miel aunque su presencia dependerá, como
anteriormente comentamos, del origen geográfico y floral de ésta. Es proporcional al color:
cuanto más oscura sea la miel, mayor contenido de sales minerales presentará.
Vitaminas, en mayor concentración se encuentran las vitaminas del grupo B y la vitamina C y,
en menor concentración las vitaminas A, D y K. Provienen del néctar y del polen, pero se
encuentran en muy pequeñas cantidades.
Ácidos, la miel contiene una serie de ácidos, dentro de los cuales se incluyen los aminoácidos
(0,05-0,1%) y ácidos orgánicos (0,17-1,17%). La acidez de la miel se encuentra en una escala de
pH, entre 3,2 y 4,5 siendo el promedio de 3,9.
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Entre los ácidos orgánicos presentes en la miel, se incluye: acético, butírico, cítrico,
fórmico, glucónico y láctico. El ácido más común presente es el ácido glucónico, asociado
fuertemente al contenido de glucosa, ya que la enzima glucosa-oxidasa convierte la glucosa en
ácido glucónico. También se forma durante este proceso peróxido de hidrógeno, uno de los
responsables de las propiedades antibacterianas de la miel.
La consecuencia más significativa del pH tan bajo es la estabilización contra
microorganismos. Además, los ácidos orgánicos interactúan con otros sabores.
2.3.2. Viscosidad de la miel
La miel se comporta como un líquido newtoniano, es decir que la viscosidad es
independiente de la velocidad de deformación.
La viscosidad es la propiedad de los fluidos que se caracteriza por su resistencia a fluir,
debida al rozamiento entre sus moléculas. En el sistema internacional se mide en Pascales por
segundo, pero la unidad más utilizada son los centipoise (cps). La miel presenta una viscosidad
aproximada de 10.000 cps medida a temperatura ambiente (normalizada a 21 ºC).
Cuadro 11: Viscosidades aproximadas de productos comunes.
La viscosidad de la miel es sumamente importante cuando hablamos de bombear miel
por un tubo o una manga. Mientras más viscosa la miel, más grande tiene que ser el tubo o hay
que aumentar la temperatura de la miel para que ésta sea menos viscosa o utilizar una bomba de
mayor capacidad y menor velocidad. Sin embargo, desde el punto de mantener la calidad de la
miel, es preferible aumentar el tamaño del tubo o aumentar la capacidad de la bomba antes que
aumentar la temperatura. Si hay que calentar la miel hay que tener la precaución de evitar
calentarla más arriba de los 43.33°C (110°F). De lo contrario se afectará el color, el sabor y
algunos componentes importantes como las enzimas.
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2.3.3. Cristalización de la miel
La cristalización de la miel se debe principalmente a la cantidad existente de glucosa en
proporción a la cantidad de Fructosa. La granulación se debe a la cristalización de la Glucosa
debido a su estado sobresaturado. La Glucosa se separa ya que es menos soluble que la
Fructosa, dando origen a hidratos de Glucosa en forma sólida. Puede ayudar a la granulación la
presencia de impurezas, como granos de polen, burbujas de aire y polvo o pequeñas moléculas
de cera creando núcleos de granulación originando los cristales.
Que aparezcan cristales en la miel no es indicador de una calidad inferior, aunque de
cara al consumidor éste prefiera una miel limpia y sin presencia de cristales, prefiriendo éstos
una miel de textura fina sin moléculas groseras.
Mediante el estudio de la proporción de glucosa, fructosa y agua podemos predecir la
posible cristalización de la miel. Para ello se han propuesto diferentes índices en los que se
relaciona la cantidad de Glucosa (g), Fructosa (f) y agua total presente (a) o disponibles
(actividad de agua, aw) de una miel:
(Fuente Consejería de Agricultura y Alimentación de La Rioja)
Análisis Criterio observación glucosa/agua fructosa/glucosa (glucosa‐agua)/fructosa 0= no hay cristales 2=muy pocos cristales 6=semi cristalino 9=completamente cristalino g/a<1,70 no hay granulación g/a>2,20 rápida granulación f/g>1,22 no hay granulación f/g<1,15 rápida granulación (g‐a)/f<0,36 no hay granulación (g‐a)/f>0,42 rápida granulación Siendo I2 = (glucosa/agua)/(1-aw)n
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2.3.4 Azúcares en la miel
Cómo hemos señalado, la miel está compuesta mayormente por azúcares,
aproximadamente un 77-80%, y son estos los que imparten a la miel sus características
principales como viscosidad, higroscopicidad, granulación, valor energético, propiedades
térmicas, poder rotatorio etc… Además, junto con otras sustancias como ácidos, compuestos
nitrogenados y minerales, contribuyen en el sabor de la miel.
-Monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos
En casi todas las muestras de miel, la Fructosa (levulosa) es el azúcar predominante
estando en mayor concentración con un 38 % por término medio, mientras que la glucosa
(dextrosa) presenta un porcentaje medio de un 31%. Aunque factible, es muy rara la muestra en
la cual la dextrosa es el azúcar principal. El valor medio de la relación Fructosa/Glucosa es
1,2:1, el cual va a variar dependiendo del tipo de miel. Estos dos azúcares juntos contabilizan el
85-95% de los carbohidratos de la miel. Existen unos doce o trece disacáridos adicionales pero
éstos contribuyen en un porcentaje muy bajo del total.
La composición en azúcares es útil para valorar el grado de pureza. En un principio se
pensó que la fracción de azúcares en la miel estaba compuesta básicamente por Glucosa y
Fructosa, con algo de Sacarosa y dextrinas en cantidades menores. Sin embargo, los nuevos
métodos de análisis y separación de azúcares han puesto en evidencia la presencia de más de
treinta azucares diferentes. White, (1975), Huidobro y Simal (1985).
Moreira y De María (2001) han descrito los siguientes di- y tri-sacáridos, aunque algunos de
ellos solo están presentes a nivel de trazas y en unas pocas muestras y otros no han podido ser
aun confirmados:
NOMENCLATURA TRIVIAL
DISACARIDOS
Celobiosa 2
Gentiobiosa 2
Isomaltosa 2
Isolamtulosa 4
Kojibiosa 1
Laminaribiosa 3
O-β-D glicopiranosil (1-4) D-glicopiranosa
O-β-D glicopiranosil (1-6) D-glicopiranosa
O-α-D glicopiranosil (1-6) D-glicopiranosa
O-α-D glicopiranosil (1-6) D-fructofuranosa
O-α-D glicopiranosil (1-2) D-glicopiranosa
O-β-D glicopiranosil (1-3) D- glicopiranosa
Leucrosa 4
O-α-D glicopiranosil (1-5) D- fructofuranosa
Maltosa 1
Maltulosa 2
Melobiosa 4
Neotrehalosa 3
Nigerosa 2
Palatinosa 2
Sacarosa 1
Turanosa 1
NOMENCLATURA SISTEMATICA
O-α-D glicopiranosil (1-4) D- glicopiranosa
O-α-D glicopiranosil (1-4) D- fructosa
O-α-D galactopiranosil (1-6) D-glicopiranosa
O-α-D glicopiranosil β-D glicopiranosido
O-α-D glicopiranosil (1-3) D-glicopiranosa
O-α-D glicopiranosil (1-6) D- fructosa
O-α-D glicopiranosil β-D fructofuranosido
O-α-D glicopiranosil (1-3) D- fructosa
Cuadro 12: Principales disacáridos existentes en la miel
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TRISACARIDOS
Centosa 4
1-cestosa 4
Erlosa 1
4-α-gentiobiosiglicosa 4
3-α-isomaltosilglicosa 4
Isomaltotriosa 2
Isopanosa 2
Laminaritriosa 4
Maltotriosa 2
Melizitosa 2
Panosa 2
Rafinosa 2
Teanderosa 2
1Mayoritarios 2Minoritarios
O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-2)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-2)-β-D-frucofuranosil (1-2)-β-D
fructofuranosido
O-α-D glicopiranosil(1-4)-α-D glicopiranosil-β-D fructofuranosido
O-β-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-4)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-3)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-6)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-6)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-3)-O-β-D glicopiranosil(1-3)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-4)Dglicopiranosa
O-α-D glicopiranosil(1-3)-O-β-D fructofuranosil(2-1)α-Dglicopiranosido
O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-4)Dglicopiranosa
O-α-D galactopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil β-Dfructofuranosido
O-α-D glicopiranosil(1-6)-α-D glicopiranosil β-D-fructofuranosido
3Trazas 4 No confirmados
Cuadro 13: Principales trisacáridos existentes en la miel
31
2.4. Métodos de determinación de azúcares en la miel
Actualmente entre los métodos más usados para la determinación de los azúcares en la
miel destacan la refractometría, la determinación química de azúcares reductores totales, los
métodos enzimáticos y la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
2.4.1. Refractometría
Es una técnica óptica basada en el índice de refracción, de la cual obtenemos
información sobre la materia seca presente en la miel, y nos proporciona una aproximación del
azúcar total presente. Se mide en grados Brix (ºBx), estimando el cociente total de azúcar
disuelto en el líquido. Es el método más sencillo, rápido y barato para hacer una estimación
aproximada de la cantidad de azúcar total presente en la miel, aunque tiene sus limitaciones de
exactitud.
Imagen 2: Refractómetro
2.4.2 Determinación química de azúcares totales
Se basa en el método de Lane-Eynon, el cual consiste en reducir el complejo de cobre
de un volumen dado del reactivo de Fehling en ebullición, mediante la adición de la muestra
diluida de miel, usando azul de metileno como indicador.
En soluciones alcalinas, la glucosa, la fructosa y otros azúcares reductores tienen la
propiedad de oxidarse a sus respectivos ácidos carboxílicos, reduciendo el cobre en estado
cúprico (Cu+2) a óxido cuproso (Cu+1). El método volumétrico de Lane y Eynon calcula el
volumen de una solución de prueba que se requiere para precipitar todo el cobre presente en una
cierta cantidad de solución de Fehling de concentración conocida.
La oxidación puede ocurrir tanto en ambiente básico ccomo en ambiente ácido. Una
oxidación suave de la aldosa produce el correspondiente acido carboxílico llamado ácido
glucónico, una oxidación muy enérgica produce el ácido dicarboxílico llamado ácido glucárico.
El reactivo de Fehling produce la oxidación alcalina de aldosas y de cetosas que van a
transformarse en ácido glucónico. Está compuesto de dos soluciones A y B que deben mezclarse
al momento de su uso. La solución A contiene CuSO4. La solución B contiene tartrato de sodio
en NaOH. El tartrato tiene la función de complejar al Cu2+ produciendo coloración azul. La
especie oxidante es el Cu2+ que se reduce a Cu+ precipitando como óxido de cobre Cu2O rojo.
32
La oxidación total de los monosacáridos tiene lugar por la intercepción de la forma de cadena
abierta presente en el equilibrio hemiacetal del aldehído-cetona, aunque en cualquier momento
sólo hay una cantidad pequeña de la forma de la cadena abierta, esa cantidad se reduce y
continúa hasta que toda la muestra ha experimentado la reacción.
2.4.3. Métodos enzimáticos
Los métodos enzimáticos han sido recomendados como técnica rutinaria y de
investigación en la miel por su especificidad y fácil y rápido manejo de la muestra. Existen en el
mercado kits ya preparados para realizar la determinación enzimática, como por ejemplo el kit
de la empresa Boehringer.
Determinación de D-glucosa
La enzima hexokinasa cataliza a pH 7,6 la fosforilación de D-glucosa con adenosin-5-trifosfato
con formación simultanea de adenosin-5-difosfato. La Glucosa 6-fosfato formada se oxida a
partir de la Nicotinamida Adenin-Dinucleótido-Fosfato en presencia de Glucosa 6-Fosfatodeshidrogenasa a gluconato-6-fosfato formándose Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato
reducido.
HK
D-glucosa + ATP
G-6-P + NADP+
G6P-DH
G-6-P + ADP
D-gluconato-6-fosfato + NADPH +H+
La cantidad de NADPH formada en la reacción equivale a la cantidad de D-glucosa, y se
determina por su absorción a longitudes de onda de 334, 340 ó 365 nm.
Determinación de fructosa
La hexokinasa también cataliza la fosforilación de la D-fructosa con ATP a fructosa-6-fosfato
Mas tarde, esta fructosa-6-fosfato se convierte em glucosa-6-fosfato mediante la
fosfoglucosaisomerasa
D-fructosa + AT
F-6-P
PGI
HK
F-6-P +ADP
G-6-P
La G-6-P reacciona con NADP formándose gluconato-6-fosfato y NADPH. Aquí también el
parámetro a medir es el NADPH, la cantidad formada es equivalente a la cantidad de fructosa.
Determinación de sacarosa (inversión enzimática)
La sacarosa se hidroliza mediante la enzima β-fructosidasa, una invertasa, a D-glucosa y Dfructosa
Sacarosa + H2O
β-FRUCTOSIDASA
D-glucosa + D-fructosa
De la diferencia de concentraciones de D-glucosa antes y después de la inversión enzimática, se
calcula la cantidad de sacarosa.
33
2.4.4. Métodos cromatográficos (HPLC)
Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una
fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil
Los azucares (pKa 12-13) se comportan como ácidos débiles a pH elevado (12-14) y
son parcial o totalmente ionizados. De este modo se pueden separar por un mecanismo de
intercambio iónico. Es necesario utilizar una columna de película resinosa no porosa, de alto
cambio iónico, con las siguientes propiedades:
-Rápida transferencia de masa y difusión
-Elevada estabilidad a variaciones de pH
-Buena estabilidad mecánica (4000 psi )
Imagen 3: Esquema y principales equipamientos en un cromatógrafo liquido de alta resolución
La identificación de los componentes se realiza midiendo los tiempos de retención, y la
cuantificación se realiza según el método del estándar externo a través de las áreas de los picos
o bien la altura de los mismos.
Este es el método de determinación de azúcares más preciso y fiable, pudiendo
utilizarse tanto para la cuantificación de azúcares mayoritarios como para la detección de
azúcares minoritarios. De hecho, es el método más utilizado en la literatura científica reciente
dedicada al análisis y caracterización de mieles. (León – Ruiz et al., 2011; Sporns, 1992; Ciulu,
2011; Primorac, 2011; Ouchemoukh, 2009; Foldhazi, 1994).
Sólo aproximadamente 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por
cromatografía de gases, ya sea porque no son suficientemente volátiles y no pasan a través de la
34
columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de
separación. HPLC no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de
sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es
imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase móvil un líquido. La
cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el análisis de los azúcares debido a su
gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separación de especies no volátiles o
termolábiles. Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada debido a sus
cualidades de sensibilidad, velocidad, reproducibilidad separación, y la exactitud de los
resultados, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su gran adaptabilidad
a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la sociedad,
2.4.5. Espectroscopía infrarroja (IR)
Esta espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las moléculas
en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha
energía incidente sea igual a la necesaria para que se dé una transición vibracional de la
molécula. Es decir, la molécula comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la
energía que se le suministra mediante luz infrarroja.
Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión. Las
vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace
entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que
forman dos enlaces. En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella
dactilar), debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatómicas homonucleares
como O2 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción de una
determinada longitud de onda en la zona del espectro electromagnético correspondiente al
infrarrojo.
De esta forma, analizando cuales son las longitudes de onda que absorbe una sustancia
en la zona del infrarrojo, podemos obtener información acerca de las moléculas que componen
dicha sustancia.
La espectroscopia infrarroja tiene su aplicación más inmediata en el análisis cualitativo
y se ha empleado en la detección de distintos compuestos en alimentos
35
Imagen 4: Analizador de infrarrojos Milkoscan, Foss Instruments, DK
2.4.6. Comparación de HPLC con espectroscopía IR
A pesar de su exactitud, el método HPLC, presenta una serie de inconvenientes, tales
como:
-elevado coste del equipo
-manejo complejo y necesidad de alto grado de formación del analista
-necesidad de realizar numerosas diluciones para la preparación de las muestras, con el
consiguiente acúmulo de error.
-duración del ensayo ya que cada carrera en el cromatógrafo son 70 minutos, mientras
que empleando el método de infrarrojos obtenemos resultados en 5 minutos.
Por ello, para los análisis rutinarios resultaría conveniente la utilización de un sistema
más sencillo y asequible. Los equipos Milkoscan/Foss vienen siendo utilizados en el análisis de
rutina de distintos alimentos (leche, vino, zumos…) por su sencillez de manejo y la rapidez en
la obtención de datos. Su adecuación al análisis de azúcares en miel puede ser una alternativa a
los problemas planteados por la Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
36
OBJETIVOS
37
38
3. OBJETIVOS
1.-Establecer la viabilidad de la aplicación de métodos estandarizados de análisis
químico de alimentos por Espectrometría Infrarroja (Milkoscan/Foss) en la determinación de la
composición de azúcares en la miel.
2.-Comparar los resultados obtenidos en la determinación de la composición de
azúcares en miel con Espectrofotometría Infrarroja con la composición hallada con el método
cromatográfico HPLC.
3.-Determinar si es factible la utilización del equipo Milkoscan/Foss en el análisis de la
composición de azúcares en miel.
39
40
MATERIALES
Y METODOS
41
42
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Muestras
Hemos usado 58 muestras en este estudio, 26 obtenidas directamente de los apicultores
de la zona y las restantes 32 han sido muestras comerciales obtenidas de los supermercados.
Las muestras de apicultores fueron traídas de regiones del centro de Portugal durante
dos años consecutivos. Esas muestras fueron guardadas con temperatura controlada de 15º C
El origen botánico de las 26 muestras obtenidas de los apicultores fue estudiado de
acuerdo a Louveaux et al. (1978), procediendo a afirmar que son mieles multiflorales con un
importante porcentaje de polen de Romero, aunque no suficiente como para considerarse miel
monofloral.
Las otras 32 mieles comerciales portuguesas fueron identificadas con la referencia de la
etiqueta como:
-algarroba (3 muestras);
-eucalipto (5);
-girasol;
-naranja (2);
-multifloral (6);
-madroño;
-romero (6);
-romero y brezo;
-tomillo;
-tomillo y romero;
-brezo (5)
43
4.2. Método analítico mediante HPLC
Se utilizó un Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución, el cromatógrafo Dionex ICS
3000, con detector electromecánico IPAD (Detector Integrado de Pulso Amperométrico).
La columna analítica utilizada fue una columna de acero inoxidable de diámetro 4,6 mm
y longitud 250 mm, conteniendo gel de sílice modificado con grupos aminos, con tamaño de
partícula de 5 micras. Concretamente, se utilizó la columna CarboPac PA20 de 3x150 mm con
dos precolumnas AminoTrap 3x30 mm y CarboPac PA20 2x30 mm.
Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron:
Flujo: 0,5 mL/min
Volumen de eluyente inyectado: 500µL
Temperatura de la columna: 30 ºC
Temperatura del detector: 30 ºC
Tiempo de carrera: 35 minutos
Tiempo de regeneración: 40 minutos
Los eluyentes (solución de NaOH) son dos:
-Fase A, de regeneración 200mM de NaOH
-Fase B, fase móvil 15mM de NaOH
El volumen de muestra inyectado fue de 10 µL
Imagen 5: Cromatógrafo Dionex ICS 3000 empleado en el ensayo
Preparación de las soluciones estándar
Se obtuvieron curvas de calibración inyectando soluciones estándar de azúcares,
midiendo la altura de los picos obtenidos (absorbancia). Las curvas se ajustaron por análisis de
regresión de mínimos cuadrados.
44
Se utilizaron soluciones estándar de glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, turanosa,
trehalosa y melezitosa para identificar y cuantificar individualmente los componentes
azucarados de las muestras de miel. El método fue adaptado por Bognanov, (1997).
Imagen 6 y 7: Microjeringa y útiles para la preparación de disoluciones empleados en los
ensayos
Padrão m (g) Glucose Sacarose Frutose Turanose Maltose Trehalose Melezitose 0,10057 0,10083 0,10084 0,1002 0,10037 0,10067 0,10031 Solução Mãe Pureza (%) 99,7 100 100 99,5 99,7 100 99,7 Mix Padrões Conc (mg/ml) Vi (mL) 1,0027 1,0083 1,0084 0,9970 1,0007 1,0067 1,0001 1 1 1 1 1 1 1 Vf (mL) 50 50 50 50 50 50 50 Conc. (ppm) 20,054 20,166 20,168 19,940 20,014 20,134 20,002 Vi (mL) Vf (mL) P0 P1 P2 P3 P4 P5 1 1 2,5 2,5 1 2,5 200 100 100 50 10 10 0,10027 0,10083 0,10084 0,09970 0,10007 0,10067 0,10001 0,20054 0,20166 0,20168 0,19940 0,20014 0,20134 0,20002 0,50134 0,50415 0,50420 0,49850 0,50034 0,50335 0,50005 1,00268 1,00830 1,00840 0,99699 1,00069 1,00670 1,00009 2,00537 2,01660 2,01680 1,99398 2,00138 2,01340 2,00018 5,01341 5,04150 5,04200 4,98495 5,00344 5,03350 5,00045 Estándares químicos usados (pureza, proveedor y número de referencia)
Analyte
CAS number
Supplier
Purity (%)
Water (%)
Trehalose
6138-23-4
Sigma-Aldrich
100
10
Fructose
57-48-7
Sigma-Aldrich
100
--
Glucose
50-99-7
Sigma-Aldrich
99.7
--
Sucrose
57-50-1
Sigma-Aldrich
100
--
Melezitose
207511-10-2
Sigma-Aldrich
100
4
Turanose
547-25-1
Sigma-Aldrich
99.5
--
Maltose
6363-53-7
Sigma-Aldrich
99
5
El agua utilizada fue agua ultrapura obtenida mediante sistema SG Ultra Clear TWF
45
Preparación de los eluyentes (fases A y B)
Para la fase A: diluimos 21 mL de NaOH al 50% en 2 litros de agua
Para la fase B: diluimos 1,6 mL de NaOH al 50% en 2 litros de agua
Una vez preparadas las disoluciones, debemos filtrar las posibles impurezas que
obstruyan los conductos del cromatógrafo por lo tanto se utiliza una bomba de vacio (-14 bares)
y además se introducen en un baño de ultrasonidos para eliminar las posibles burbujas.
Imagen 8 : Preparación de eluyente
burbujas de los eluyentes
Imagen 9 :Eliminación de
Los eluyentes se utilizaron inicialmente en una proporción de 80% de B y 20% de A. Se
realizaron pruebas y los tiempos de retención no concordaban con los patrones por lo que se
modificaron un poco las proporciones, siendo para el B un 83% y para A un 17%.
Para la preparación de las muestras:
El procedimiento fue el siguiente:
-Pesamos 1g de muestra de miel con un error de ±0,0001 g y disolvemos en 500
mililitros de agua ultrapura.
-Un mililitro de esta disolución se lleva a un volumen de 200 ml también con
agua ultrapura.
-Esta muestra se filtra mediante una jeringa y un filtro GHP Acrodisk de 0,2
micras.
-Las muestras se incorporan al revolver de muestreo del cromatógrafo y se
comienza el análisis, con el programa Chromeleon.
46
4.3 Milkoscan / FOSS
El equipo se encontraba calibrado mediante un programa predefinido para mieles y
zumo, por lo que se procedió directamente al análisis de las muestras de miel.
Metodología
Pesamos cinco gramos de muestra de miel previamente homogeneizada, rigurosamente
con un error de ±0,001 g, y disolvemos en un matraz de 50 mL.
Las muestras se introducen directamente, a través de una malla metálica a modo de
filtro de posibles impurezas, a un vaso para poder introducir los sensores del aparato.
Cada cinco muestras, por duplicado, se realiza una limpieza del sensor con agua
ultrapura.
La solución es determinada en el Milkoscan FT120 usando el programa predefinido
“calibración de miel y zumo”
4.4 Análisis estadístico
En cuanto al análisis estadístico, se realizaron cálculos sencillos como trabajo con
tablas, medias y desviaciones, mediante el programa de cálculo Excell versión 2003.
47
48
RESULTADOS
49
50
5. RESULTADOS
5.1. Composición de azúcares obtenida mediante HPLC
5.1.1. Calibración del equipo
Se obtuvieron curvas de calibración inyectando soluciones estándar de azúcares,
midiendo la altura de los picos obtenidos (absorbancia). Las curvas se ajustaron por análisis de
regresión de mínimos cuadrados.
8,00 Trehalose
Area [nC*min]
External
ED_1
16,0 Glucose
Area [nC*min]
5,00
10,0
2,50
5,0
0,00
0,00
ug/mL
1,25
7,00 Sacarose
Area [nC*min]
2,50
External
0,0
0,00
4,50
ED_1
ED_1
ug/mL
1,25
16,0 Frutose
Area [nC*min]
2,50
External
4,50
ED_1
10,0
4,00
5,0
2,00
0,00
0,00
External
ug/mL
1,25
4,50 Turanose
Area [nC*min]
2,50
External
0,0
0,00
4,50
ug/mL
1,25
8,00 Melzitose
Area [nC*min]
ED_1
2,50
External
4,50
ED_1
5,00
2,50
2,50
1,25
0,00
0,00
ug/mL
1,25
2,50
0,00
0,00
4,50
7,00 Maltose
Area [nC*min]
External
ug/mL
1,25
2,50
4,50
ED_1
4,00
2,00
0,00
0,00
ug/mL
1,25
2,50
4,50
51
P2
9 - 28,350
25,0
10,0
5,0
10
11 -- 34,167
34,600
15,0
8 - Maltose - 15,784
1 - Trehalose - 1,917
- Glucose
- 3,900
3 -2Frutose
- 4,350
4 - Sacarose - 5,100
5 - 5,767
6 - Melezitose - 7,284
7 - Turanose - 9,234
20,0
ED_1
12 - 36,367
30,0 MEL 20130617 #7
nC
0,0
-5,0
0,0
min
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,2
Cuadro 14: Cromatograma tipo obtenido de la solución patrón de azúcar P2 .
Una vez obtenidas las rectas de calibración con los azúcares estándar individuales, se
procedió a obtener el cromatograma de una mezcla patrón de azúcares, obteniendo
cromatogramas tipo como el que muestra el Cuadro 14.
Tras analizar los cromatogramas obtenidos, se pudo establecer los tiempos de retención
da cada uno de los azúcares y las características de los picos que los detectan. Así se obtuvieron
los datos que se recogen en la Tabla 1.
No.
Time
Peak Name
min
Width
Height
Resol.
Resol.
Plates
Plates
Asymmetry
nC
4,611
(USP)
8,354
(EP)
8,531
(USP)
1209
(EP)
1276
1,324
1
1,917
Trehalose
min
0,221
2
3,900
Glucose
0,254
9,184
1,684
1,709
3763
3848
n.a.
3
4,350
Frutose
0,280
7,982
2,509
2,542
3862
3962
n.a.
4
5,100
Sacarose
0,318
2,878
2,171
2,209
4120
4188
1,038
5
5,767
n.a.
0,296
0,373
4,300
4,344
6060
6326
1,055
7,284
Melezitose
0,409
2,520
4,361
4,444
5070
5046
1,105
6
7
9,234
Turanose
0,485
1,163
10,779
10,817
5795
6178
1,063
8
15,784
Maltose
0,730
1,357
9,371
7,735
7476
7194
1,048
9
28,350
n.a.
1,952
15,282
n.a.
n.a.
3375
2036
n.a.
10
34,167
n.a.
n.a.
0,083
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
11
34,600
n.a.
0,638
0,240
3,963
3,845
47108
42797
0,978
36,367
n.a.
0,254
9,907
n.a.
n.a.
327995
332255
2,270
AVERAGE:
0,531
4,632
5,277
5,131
37.803,
37.737,
1,235
12
Tabla 1. Relación de tiempos de retención, área de picos de la solución patrón de azúcar P2.
5.1.2. Análisis de muestras de miel
52
El siguiente cuadro (Cuadro 15) muestra el cromatograma que se obtiene al analizar los
azúcares de una muestra de miel. El análisis de los picos obtenidos y su comparación con los
resultados de los cromatogramas empleados en la estandarización previa, permitió determinar y
cuantificar los azúcares presentes en cada muestra. La Tabla 2 recoge los resultados
correspondientes al cromatograma de la miel del Cuadro 15.
3 - Glucose -43,91
7
- Frutose
- 4,350
100
88
75
63
1200493
ED_1
Log pH.Value
120 MEL 20130408 #18 [modified by geral.lab]
nC
50
17 - 34,517
18 - 35,084
16 - 28,067
15 - 26,217
11 - 12,084
12 - 13,250
13 - 14,567
14 - Maltose - 15,817
13
10 - Turanose - 9,250
25
5 - Sacarose - 5,100
6
7
7--6,11
6,367
8
elzitose
- 7,150
9--M
7,45
0
1 - Trehalose - 1,850
2 - 2,784
38
0
min
-20
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,2
Cuadro 15: Cromatograma tipo para una muestra de miel.
No.
Ret.Time
1
1,85
3
Peak Name
Cal.Type
Points
Offset
(C0)
(C1)
(C2)
%
Trehalose
LOff
12
0,012
1,939
0,000
3,92
Glucose
LOff
12
0,054
3,885
0,000
4
4,35
Frutose
LOff
12
0,065
3,784
0,000
99,990
0,058
0,580
5
5,10
Sacarose
LOff
12
0,010
1,577
0,000
99,996
0,015
0,149
min
Slope
Curve
R-Square
Std.Dev.
LQ
99,998
0,013
0,132
99,993
0,048
0,484
8
7,15
Melzitose
LOff
12
-0,003
1,674
0,000
99,996
0,016
0,157
10
9,25
Turanose
LOff
12
-0,015
0,968
0,000
99,996
0,010
0,095
14
15,82
Maltose
LOff
12
-0,018
1,725
0,000
99,998
0,011
0,108
Tabla 2: Relación de tiempos de retención, área de picos de una muestra de miel.
Los tiempos de retención de los picos obtenidos en cada cromatograma de las muestras
de miel analizadas se recogen en el Anexo II. Con ellos, y utilizando los resultados obtenidos en
la estandarización de azúcares (apartado 5.1.1) pudo determinarse la composición en azúcares
53
de las muestras de miel analizadas. Los resultados obtenidos, expresados en porcentaje, se
recogen en la Tabla 3.
Las muestras se analizaron por duplicado para obtener un resultado más fiable. Se puede
observar la repetibilidad de los resultados para todos los azucares analizados.
54
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA
1200488
1200488d
1200498
1200498d
1200480
1200480d
1200495
1200495d
1200496
1200496d
1200476
1200476d
1200494
1200494d
1200492
1200492d
1200487
1200487d
1200497
1200497d
1200483
1200483d
1200490
1200490d
1200499
1200499d
1200486
1200486d
1200489
1200489d
n.a.
n.a.
0,012
0,005
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,025
0,024
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
25,693
25,580
25,794
25,819
26,432
26,746
23,482
23,481
30,358
30,125
26,822
26,894
23,242
23,253
25,063
25,008
31,083
31,110
27,839
27,872
26,351
26,281
24,301
24,204
25,866
25,938
25,172
25,533
25,723
25,690
37,688
37,650
33,758
34,037
38,206
38,608
34,888
34,840
35,019
35,192
38,397
38,622
34,441
34,525
36,603
36,536
45,176
45,260
37,364
37,228
38,074
38,065
37,174
36,996
33,294
33,426
37,717
38,286
36,664
36,823
SACAROSA MELZITOSA
1,029
1,041
0,831
0,843
0,521
0,510
0,677
0,655
0,650
0,705
0,599
0,621
0,608
0,616
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
0,520
0,561
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
<0,400
3,151
3,248
1,454
1,529
1,474
1,459
2,488
2,498
1,059
1,074
1,073
1,291
2,462
2,422
1,357
1,132
0,914
0,911
1,791
1,758
1,742
1,757
1,521
1,504
2,090
2,108
1,717
1,810
3,141
3,079
TURANOSA MALTOSA
2,232
2,251
2,418
2,445
2,126
2,094
2,683
2,709
2,434
2,445
2,097
2,105
2,652
2,676
2,010
2,021
2,432
2,431
2,616
2,612
1,931
1,948
2,708
2,519
2,421
2,448
2,164
2,164
2,196
2,218
2,029
1,948
1,734
1,622
0,885
1,017
1,374
1,399
1,340
1,302
1,792
1,844
1,234
1,280
1,559
1,568
2,143
2,101
1,435
1,412
1,959
1,934
1,157
1,154
1,676
1,681
2,283
2,294
1,793
1,772
TOTAL
F/G
71,823
71,717
65,989
66,295
69,644
70,435
65,592
65,581
70,860
70,843
70,781
71,377
64,639
64,772
66,592
66,265
81,748
81,813
71,564
71,442
70,057
69,986
66,861
66,377
65,345
65,602
69,052
70,087
69,516
69,581
1,467
1,472
1,309
1,318
1,445
1,444
1,486
1,484
1,154
1,168
1,432
1,436
1,482
1,485
1,460
1,461
1,453
1,455
1,342
1,336
1,445
1,448
1,530
1,529
1,287
1,289
1,498
1,499
1,425
1,433
55
1200500
1200500d
1200501
1200501d
1200493
1200493d
1200491
1200491d
L24
L24d
1200482
1200482d
1200485
1200485d
1200479
1200479d
1200477
1200477d
1200481
1200481d
R6
R6d
1200478
1200478d
L4
L4d
L14
L14d
I5
I5d
M2
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA
n.a.
26,145
38,672
n.a.
26,494
38,802
n.a.
18,353
44,149
n.a.
18,502
44,601
0,072
25,694
38,299
0,072
25,680
38,383
n.a.
24,563
37,963
n.a.
24,453
38,059
n.a.
23,516
37,218
n.a.
23,767
37,655
n.a.
26,216
39,195
0,007
26,200
39,171
0,145
27,067
37,308
0,142
27,040
37,568
0,040
27,209
40,108
0,022
27,374
40,184
0,039
28,874
39,326
0,037
28,753
39,531
n.a.
24,267
40,743
n.a.
24,263
40,665
n.a.
21,660
38,686
n.a.
21,713
38,633
0,028
27,517
40,597
0,032
27,482
40,444
0,033
23,425
35,387
0,034
23,470
35,358
n.a.
29,611
38,603
n.a.
29,643
38,636
0,013
26,559
41,723
0,013
26,536
41,677
n.a.
22,544
38,760
SACAROSA MELZITOSA
<0,400
1,821
<0,400
1,827
<0,400
1,596
<0,400
1,568
0,491
1,363
0,482
1,358
0,748
1,546
0,807
1,586
1,125
2,670
1,086
2,692
0,767
1,057
0,736
1,070
0,695
1,788
0,671
1,855
1,196
1,037
1,408
1,049
0,809
1,244
0,797
1,186
0,716
1,749
0,833
1,757
1,079
2,787
1,120
2,841
1,163
0,919
1,235
0,938
1,037
3,552
1,028
3,527
1,016
1,513
0,833
1,534
1,089
0,717
1,141
0,700
1,305
3,138
TURANOSA MALTOSA
2,326
1,454
2,345
1,468
2,225
2,057
2,235
2,021
2,311
1,899
2,206
1,862
2,782
1,155
2,575
1,087
3,759
2,001
3,821
1,954
2,585
2,625
2,596
2,498
2,693
1,404
2,720
1,381
2,170
3,041
2,166
3,043
2,345
2,200
2,349
1,990
2,508
0,693
2,505
0,807
3,589
1,117
3,541
1,263
2,352
1,810
2,347
1,974
3,371
1,240
3,350
1,171
2,687
0,553
2,784
0,539
2,264
2,708
2,251
2,939
3,965
1,513
TOTAL
70,418
70,936
68,380
68,927
70,057
69,972
68,757
68,568
70,289
70,974
72,444
72,271
70,955
71,236
74,761
75,225
74,798
74,605
70,675
70,831
68,918
69,111
74,358
74,419
68,012
67,904
73,982
73,969
75,060
75,244
71,225
F/G
1,479
1,465
2,405
2,411
1,491
1,495
1,546
1,556
1,583
1,584
1,495
1,495
1,378
1,389
1,474
1,468
1,362
1,375
1,679
1,676
1,786
1,779
1,475
1,472
1,511
1,507
1,304
1,303
1,571
1,571
1,719
56
M2d
L8
L8d
L10
L10d
L3
L3d
L18
L18d
L16
L16d
OA1
OA1d
I6
I6d
I12
I12d
L9
L9d
OA2
OA2d
L15
L15d
I13
I13d
L17
L17d
L25
L25d
I29
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,055
0,078
n.a.
n.a.
0,007
0,003
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,065
0,079
n.a.
n.a.
0,094
0,084
0,118
0,115
0,357
0,353
0,323
22,795
30,517
30,483
24,892
24,765
25,104
25,089
22,270
22,287
20,513
20,328
29,894
29,928
21,976
21,801
22,514
22,479
19,566
19,645
27,454
27,441
23,060
23,009
25,768
25,743
23,143
23,315
20,886
20,853
16,888
39,230
41,695
41,752
40,906
41,139
37,297
37,364
36,371
36,411
35,616
35,399
38,580
38,716
37,089
37,309
37,514
37,474
31,492
31,301
39,617
39,166
38,852
38,853
33,213
33,109
34,360
34,197
30,300
30,303
25,546
1,292
0,831
0,881
0,814
1,006
1,102
1,128
1,533
1,443
1,644
1,703
1,362
1,446
1,375
1,462
0,928
1,055
2,059
2,040
1,345
1,316
1,237
1,377
<0,400
<0,400
1,321
1,443
1,335
1,398
0,679
3,069
1,000
1,007
1,268
1,229
3,275
3,257
2,290
2,254
1,710
1,656
1,584
1,540
1,998
1,958
1,874
1,898
1,690
1,720
1,951
1,982
2,187
2,233
1,539
1,503
2,471
2,433
6,566
6,595
4,783
3,981
2,377
2,343
2,783
2,830
3,560
3,573
3,026
3,198
3,209
3,195
2,785
2,865
2,400
2,856
2,613
2,275
3,474
3,492
1,842
1,837
3,253
3,233
1,056
1,190
2,898
2,764
3,100
3,001
2,098
1,691
1,729
2,046
2,018
2,259
1,177
1,186
1,547
1,225
0,702
0,683
0,714
0,761
0,728
0,790
0,874
0,896
0,932
0,850
2,390
2,383
2,239
2,223
0,712
0,427
1,476
1,200
0,994
1,493
0,711
72,057
78,149
78,511
72,682
73,228
71,516
71,597
67,037
66,818
63,394
62,963
74,919
75,256
65,566
66,175
66,317
66,077
59,213
59,048
74,599
74,126
70,828
70,928
62,382
62,056
65,668
65,353
63,181
63,642
50,705
1,721
1,366
1,370
1,643
1,661
1,486
1,489
1,633
1,634
1,736
1,741
1,291
1,294
1,688
1,711
1,666
1,667
1,610
1,593
1,443
1,427
1,685
1,689
1,289
1,286
1,485
1,467
1,451
1,453
1,513
57
I29d
L22
L22d
I9
I9d
I15
I15d
I11
I11d
media
desviación
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA
0,321
16,906
25,468
0,683
17,706
30,946
0,680
17,630
30,985
n.a.
20,825
34,031
0,009
20,719
33,911
0,116
22,595
32,389
0,102
22,616
32,340
n.a.
23,614
37,405
n.a.
23,479
37,460
SACAROSA MELZITOSA
0,673
4,801
2,025
1,464
2,080
1,509
1,425
1,954
1,373
2,014
1,504
2,722
1,430
2,750
1,887
2,016
1,963
1,986
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA
0,060
25,076
37,541
1,067
0,164
3,212
3,494
0,410
TURANOSA
2,058
3,397
3,297
3,018
3,009
3,319
3,401
1,836
1,786
MALTOS
A
0,650
0,577
0,581
0,848
0,908
1,259
1,709
1,835
2,232
MELZITOSA TURANOSA MALTOSA
1,757
2,514
1,472
1,020
0,562
0,609
TOTAL
50,557
56,115
56,081
62,101
61,935
63,788
64,247
68,594
68,906
F/G
1,506
1,748
1,758
1,634
1,637
1,433
1,430
1,584
1,595
TOTAL
69,808
5,393
F/G
1,485
0,186
Tabla 3.- Contenido en Azúcares de distintas muestras de miel realizado por duplicado y determinado mediante HPLC, expresado en porcentaje %.
58
La precisión de ese método nos permite establecer un ajuste hasta la milésima. Destacar
igualmente la práctica ausencia de variabilidad entre los datos obtenidos en el análisis de cada
miel y su correspondiente duplicado, indicador de la repetibilidad del método.
Los datos obtenidos muestran que el azúcar mayoritario es la Fructosa, con una
cantidad media de 37,541 %, seguido por la Glucosa con una cantidad media de 25,076 %. Ya
en mucha menor proporción aparece la Turanosa, con una cantidad media de 2,514 %. La
relación media entre los azúcares mayoritarios es de 1,485.
El análisis de azúcares por este método, no permite determinar el contenido en Sacarosa
cuando esta se presenta en cantidades inferiores al 0,400 % . Con todo, la media del contenido
en este azúcar en las mieles analizadas fue de 1,067%
Los resultados obtenidos son coherentes con los señalados por otros autores en mieles
de origen floral de otras regiones geográficas, como los obtenidos por Pajuelo (2004), con unas
composiciones medias de Glucosa de 22 a 40%, Fructosa de 27 a 44% y Sacarosa de 2 a 15 %.
Por tanto nuestros datos se encuentran dentro del rango de sus composiciones medias.
Igualmente, y dado el diferente origen y procedencia de las mieles, las desviaciones
encontradas entre las concentraciones de azucares están dentro de lo esperable.
Comparando con otros autores como White (1962) en su estudio Composition of
American Honeys, expone unos valores medios:
Glucosa 31,3%
Fructosa 38,2%
Sacarosa 1,31%
También podemos comparar los resultados con los obtenidos por los obtenidos por el
Departamento de Agricultura y Alimentación de La Rioja, en su estudio La Rioja honey
composition (Sanz, 1994), en el cual la Fructosa obtiene un 38,08%, Glucosa 30,80% y
Sacarosa 1,85%.
También se obtuvieron datos correctos respecto a las mieles italianas (Ciulu, 2011), asi como
las mieles croatas (Primorac, 2011) y las obtenidas en Argelia (Ouchemoukh, 2009).
En cuanto al país vecino Portugal, legislativamente (Decreto-Lei nº 214/2003 ), la
composición media de Fructosa y Glucosa es de 38% y 31% respectivamente. Según el Codex
Alimentarius, al igual que el Boletín Oficial del Estado (BOE, 1975), expresa la cantidad de
Fructosa y Glucosa (la suma de ambas), no menos de 60g/100 g, es decir un mínimo de 60 %.
Para el contenido de Sacarosa se exige un contenido máximo de 5g/100g, un 5%. Podemos
afirmar que las mieles analizadas cumplen ambas exigencias legales.
59
5.2. Composición de azúcares obtenidos mediante Milkoscan/Foss
Este equipo se encontraba estandarizado para la determinación de azúcares en otras
muestras alimentarias por lo que se procedió a su utilización directa con las muestras de miel.
Es necesario señalar que este método sólo permite el análisis de los tres azúcares más
importantes en miel y cuyos requisitos de composición recoge la legislación actual, tal y como
hemos señalado. Se trata de los dos azúcares mayoritarios (Fructosa y Glucosa) y de Sacarosa,
azúcar indicador del grado de madurez de la miel.
En la Tabla 4 se recogen los resultados obtenidos en la determinación del contenido en
Glucosa, Fructosa y Sacarosa de las diferentes muestras de miel analizadas.
Tabla 4.- Contenido en Azúcares de distintas muestras de miel analizado por duplicado,
determinado mediante Milkoscan /Foss, expresado en porcentaje (%).
GLUCOSA
muestra
1200490
1200490d
1200488
1200488d
1200492
1200492d
1200476
1200476d
1200486
1200486d
1200480
1200480d
1200487
1200487d
1200489
1200489d
1200494
1200494d
1200495
1200495d
1200496
1200496d
1200498
1200498d
1200501
1200501d
1200500
1200500d
1200497
1200497d
1200483
37,0
37,0
35,5
35,7
35,0
35,0
35,6
35,5
36,2
36,3
36,4
36,0
35,6
35,5
33,7
34,0
37,4
37,2
37,0
37,0
35,5
35,5
36,6
36,3
26,9
26,6
32,6
32,4
37,7
37,5
36,6
FRUCTOSA SACAROSA
40,8
40,7
42,8
43,0
43,2
43,4
44,5
44,6
44,6
44,6
43,7
43,4
43,2
42,9
42,5
42,4
42,3
42,1
42,5
42,4
45,5
45,5
41,3
41,0
51,1
51,0
46,2
46,2
43,3
43,5
42,8
3,7
3,3
3,3
3,3
2,2
2,3
2,2
2,4
2,6
2,5
1,0
1,2
1,8
2,1
3,8
3,4
2,3
2,0
2,0
1,7
2,0
1,9
2,9
2,8
1,8
1,6
1,8
1,6
3,7
4,1
3,3
TOTAL
fructosa/glucosa
81,5
81,0
81,6
82,0
80,4
80,7
82,3
82,5
83,4
83,4
81,1
80,6
80,6
80,5
80,0
79,8
82,0
81,3
81,5
81,1
83,0
82,9
80,8
80,1
79,8
79,2
80,6
80,2
84,7
85,1
82,7
1,1
1,1
1,2
1,2
1,2
1,2
1,3
1,3
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,3
1,3
1,1
1,1
1,2
1,2
1,3
1,3
1,1
1,1
1,9
1,9
1,4
1,4
1,2
1,2
1,2
60
1200483d
1200499
1200499d
1200490
1200490d
1200488
1200488d
1200493
1200493d
1200491
1200491d
L24
L24d
1200482
1200482d
1200485
1200485d
1200479
1200479d
1200477
1200477d
1200481
1200481d
R6
R6d
1200478
1200478d
L3
L3d
OA1
OA1d
l15
l15d
L9
L9d
I12
I12d
OA2
OA2d
L17
L17d
L16
L16d
36,8
38,1
38,1
37,0
37,0
35,5
35,7
34,6
34,6
33,1
33,0
35,9
35,9
37,0
37,0
38,1
38,2
37,1
37,0
32,9
33,2
31,9
31,9
34,0
33,9
29,9
29,9
37,5
37,3
41,6
41,9
34,4
34,3
38,4
38,4
32,4
32,7
34,8
35,0
36,0
36,1
34,6
34,5
42,8
41,2
41,0
40,8
40,7
42,8
43,0
43,0
42,8
43,7
44,0
45,1
45,1
44,1
44,1
42,3
42,4
43,7
43,9
45,3
45,2
46,0
46,1
46,1
46,3
48,4
48,1
43,8
43,9
45,0
45,0
46,4
46,7
43,6
43,4
43,3
43,4
42,2
42,0
41,8
41,9
44,1
44,3
3,4
3,7
3,8
3,3
3,7
3,3
3,4
2,6
2,7
1,8
1,9
3,1
3,1
3,6
3,5
3,1
3,1
3,9
3,8
2,1
2,2
2,1
2,2
2,1
2,5
1,7
1,4
2,9
3,0
1,0
1,4
2,9
2,8
2,8
3,2
2,0
1,9
1,8
1,8
2,3
2,1
1,7
1,9
83,0
83,0
82,9
81,1
81,4
81,6
82,1
80,2
80,1
78,6
78,9
84,1
84,1
84,7
84,6
83,5
83,7
84,7
84,7
80,3
80,6
80,0
80,2
82,2
82,7
80,0
79,4
84,2
84,2
87,6
88,3
83,7
83,8
84,8
85,0
77,7
78,0
78,8
78,8
80,1
80,1
80,4
80,7
1,2
1,1
1,1
1,1
1,1
1,2
1,2
1,2
1,2
1,3
1,3
1,3
1,3
1,2
1,2
1,1
1,1
1,2
1,2
1,4
1,4
1,4
1,5
1,4
1,4
1,6
1,6
1,2
1,2
1,1
1,1
1,3
1,4
1,1
1,1
1,3
1,3
1,2
1,2
1,2
1,2
1,3
1,3
media
desviación
35,7
2,6
43,5
2,1
2,5
0,8
81,5
2,1
1,2
0,1
61
Este método permite la determinación de los azucares Glucosa, Fructosa y Sacarosa,
con una precisión de dos decimales, pero hemos ajustado a un decimal ya que los resultados
había que multiplicarlos por 10 debido al factor de dilución.
Viendo los resultados obtenidos mediante Milkoscan/Foss observamos, tal y como
ocurría para el análisis con HPLC, una repetitividad en cuanto a las cantidades de azúcares
obtenidas en los análisis duplicados de cada muestra.
De nuevo, los resultados obtenidos permiten afirmar que el azúcar mayoritario es la
Fructosa, con una proporción media de 43,5% seguido de la Glucosa con un 35,7%. La
Sacarosa presentó una cantidad media de 2,6 %.
A pesar de que, y tal como se discute en el siguiente apartado, los datos obtenidos
mediante el sistema Milkoscan/Foss son mayores respecto a los obtenidos por el método
cromatográfico, según los valores medios anteriormente citados del Boletín Oficial del Estado y
de los valores determinados por White (1962) y otros autores, las muestras se encuentran dentro
de los valores estimados como normales, incluyendo el valor máximo exigido para la sacarosa.
62
5.3. Comparación de los resultados obtenidos mediante HPLC y Milkoscan
La Tabla 5 muestra una comparación de resultados para los parámetros Glucosa,
Fructosa y Sacarosa entre método cromatográfico HPLC ajustados a un decimal y método de
infrarrojo Milkoscan/Foss.
Tabla 5: Comparación de resultados entre HPLC y Milkoscan.
MUESTRA
1200490
1200490d
1200488
1200488d
1200492
1200492d
1200476
1200476d
1200486
1200486d
1200480
1200480d
1200487
1200487d
1200489
1200489d
1200494
1200494d
1200495
1200495d
1200496
1200496d
1200498
1200498d
1200501
1200501d
1200500
1200500d
1200497
1200497d
1200483
1200483d
1200499
1200499d
1200493
1200493d
1200491
1200491d
GLUCOSA
HPLC
FOSS
24,3
37,0
24,2
37,0
25,7
35,5
25,6
35,7
25,1
35,0
25,0
35,0
27,0
35,6
27,0
35,5
25,2
36,2
25,5
36,3
26,4
36,4
26,6
36,0
31,1
35,6
31,1
35,5
25,7
33,7
25,7
34,0
23,2
37,4
23,2
37,2
23,5
37,0
23,5
37,0
30,4
35,5
30,1
35,5
25,8
36,6
25,8
36,3
18,3
26,9
18,5
26,6
26,1
32,6
26,5
32,4
27,8
37,7
27,9
37,5
26,3
36,6
26,3
36,8
25,9
38,1
25,9
38,1
25,7
34,6
25,7
34,6
24,5
33,1
24,4
33,0
FRUCTOSA
HPLC
FOSS
37,7
40,8
37,6
40,7
36,6
42,8
36,5
43,0
37,2
43,2
37,0
43,4
38,2
44,6
38,6
44,6
38,4
44,6
38,6
44,6
37,7
43,7
38,3
43,4
34,4
43,2
34,5
42,9
45,2
42,5
45,3
42,4
36,7
42,3
36,8
42,1
33,8
42,5
34,0
42,4
34,9
45,5
34,8
45,5
35,0
41,3
35,2
41,0
37,3
51,1
37,2
51,0
38,6
46,2
38,8
46,2
44,1
43,3
44,6
43,5
38,0
42,8
38,0
42,8
33,3
41,2
33,4
41,0
38,3
43,0
38,4
42,8
37,9
43,7
38,0
44,0
SACAROSA
HPLC
FOSS
1,0
3,7
1,0
3,3
1,0
3,3
1,0
3,4
<0,4
2,3
<0,4
2,2
0,5
2,4
0,5
2,6
0,6
2,5
0,6
2,6
0,5
1,2
0,5
1,0
0,6
2,1
0,6
1,8
<0,4
3,4
<0,4
3,8
0,6
2,0
0,6
2,3
0,8
1,7
0,8
2,0
0,7
2,0
0,6
1,9
0,6
2,8
0,7
2,9
0,5
1,6
0,6
1,8
<0,4
1,6
<0,4
1,9
0,5
4,1
0,5
3,7
<0,4
3,4
<0,4
3,3
<0,4
3,8
<0,4
3,7
0,5
2,7
0,5
2,6
0,7
1,9
0,8
1,8
63
L24
L24d
1200482
1200482d
1200485
1200485d
1200479
1200479d
1200477
1200477d
1200481
1200481d
R6
R6d
1200478
1200478d
L3
L3d
OA1
OA1d
l15
l15d
L9
L9d
I12
I12d
OA2
OA2d
L17
L17d
L16
L16d
23,5
23,8
26,2
26,2
27,0
27,0
27,2
27,4
28,9
28,7
24,3
24,3
21,6
21,7
27,5
27,5
25,1
25,1
29,9
29,9
22,6
22,6
19,6
19,6
22,5
22,5
27,4
27,4
23,1
23,3
20,5
20,3
35,9
35,9
37,0
37,0
38,1
38,2
37,1
37,0
32,9
33,2
31,9
31,9
34,0
33,9
29,9
29,9
37,5
37,3
41,6
41,9
34,4
34,3
38,4
38,4
32,4
32,7
34,8
35,0
36,0
36,1
34,6
34,5
37,2
37,6
39,2
39,2
37,3
37,5
40,1
40,2
39,3
39,5
40,7
40,6
38,7
38,6
40,6
40,4
37,3
37,3
38,6
38,7
32,4
32,3
31,4
31,3
37,5
37,5
39,6
39,3
34,3
34,2
35,6
35,4
45,1
45,1
44,1
44,1
42,3
42,4
43,7
43,9
45,3
45,2
46,0
46,1
46,1
46,3
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48,1
43,8
43,9
45,0
45,0
46,4
46,7
43,6
43,4
43,3
43,4
42,2
42,0
41,8
41,9
44,1
44,3
1,1
1,1
0,7
0,7
0,7
0,7
1,2
1,4
0,8
0,8
0,7
0,8
1,1
1,1
1,2
1,2
1,1
1,1
1,4
1,4
1,5
1,4
2,0
2,0
0,9
1,0
1,3
1,3
1,3
1,4
1,6
1,7
3,1
3,1
3,5
3,6
3,1
3,1
3,8
3,9
2,2
2,1
2,1
2,2
2,5
2,1
1,4
1,7
2,9
3,0
1,0
1,4
2,9
2,8
3,2
2,6
2,0
1,9
1,8
1,8
2,1
2,3
1,9
1,7
media
25,7
35,6
37,6
43,6
0,8
2,3
De nuevo los datos obtenidos para la Sacarosa por el método HPLC por debajo de 0,40
% no fueron estimados y, por tanto, estos se han expresado como < 0,4.
Se puede observar que los datos obtenidos por el método de infrarrojos Milkoscan son
notablemente más altos que los obtenidos por el método HPLC. Así, la cantidad de Glucosa fue
1,38 veces mayor en el análisis efectuado con Milkoscan que con el realizado con HPLC, 1,15
veces mayor para Fructosa y 2,77 veces mayor para la Sacarosa.
Esto puede ser debido a la menor precisión en los ensayos de Milkoscan o a que el
programa que está siendo utilizado para la determinación de azucares en la miel no es el
correcto, o simplemente, este método no es el adecuado para la determinación de los azúcares
en la miel.
64
La disparidad entre los datos obtenidos en ambos análisis se muestra en las Gráficas 16. Puede observarse la falta de correlación entre los resultados obtenidos entre ambos métodos.
Resulta especialmente importante señalar en el caso de la determinación de la Sacarosa,
como el método de análisis por HPLC no detecta cantidades de este azúcar apreciables en
muestras en las que el método Milkoscan señala un contenido en azúcar próximo al 4%. Esta
gran disparidad puede resultar muy importante ya que se trata de un azúcar cuyo contenido
resulta determinante para establecer su aptitud para la comercialización de la miel (recordemos
que la legislación exige un contenido en Sacarosa <5%).
Gráfica 1: Dispersión de datos para las muestras de sacarosa.
Gráfica 2: Dispersión de datos para las muestras de glucosa.
65
Gráfica 3: Dispersión de datos para las muestras de fructosa.
En el Centro de Apoyo Tecnológico Agroalimentario de Portugal en el que se realizó
este estudio, se elaboraron gráficas incluyendo más datos de muestras de miel, como se puede
observar en las siguientes gráficas 4,5 y 6. Las conclusiones a las que se llegó fueron las
mismas: hay una falta de correlación entre los resultados conseguidos entre un método y otro.
6,0
45
40
35
30
Ideal line
25
Frucose
20
20
25
30
35
40
45
Carboydrates mesured with Milkoscan
Carboydrates mesured with Milkoscan
50
5,0
4,0
3,0
2,0
Ideal line
1,0
Sacarose
0,0
50
0
1
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
2
3
4
5
6
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
Carboydrates mesured with Milkoscan
45
40
35
30
25
Ideal line
20
Glucose
15
15
20
25
30
35
40
45
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
Graficas 4,5, 6:
Dispersión de datos de
66
Fructosa, Sacarosa y Glucosa
Cabe destacar los valores obtenidos para la sacarosa mediante el método
Milkoscan/Foss, con unos datos de entre 5 y 6% , que no presentan ninguna coherencia y según
la legislación nos encontraríamos con unas mieles no aptas para el consumo debido al alto
porcentaje de este azúcar. Si utilizásemos este método, los datos obtenidos y con ellos las
decisiones a tomar serían erróneas, ya que no se corresponden con los datos reales y correctos
obtenidos por el HPLC.
67
68
CONCLUSIONES
69
70
6. CONCLUSIONES
A la vista del trabajo realizado se concluye que:
1.-Se ha puesto a punto el método cromatográfico HPLC para la detección y cuantificación de
azúcares en miel.
2.-Este método mostró una buena reproducibilidad en los datos obtenidos permitiendo además
cuantificar la presencia de azúcares minoritarios con alta precisión.
3.-Los resultados obtenidos en el análisis de la composición de azúcares en mieles por HPLC de
58 muestras de miel floral de distinta procedencia y origen, concuerdan con la composición en
azúcares establecida por otros autores.
4.-Se ha analizado la composición en los azúcares glucosa, fructosa y sacarosa de las mismas
muestras siguiendo el método estandarizado del equipo Milkoscan/Foss
5.-Los resultados obtenidos mediante este método fueron, igualmente, altamente reproducibles
si bien presentaron un nivel de precisión menor que con el método HPLC.
6.-Los resultados obtenidos por el método Milkoscan/Foss muestran valores más elevados para
los tres azúcares analizados que los obtenidos por el método HPLC lo que, en el caso de la
sacarosa puede tener repercusiones a la hora de establecer su aptitud para la comercialización.
7.-Por todo ello se concluye que el método estándar de determinación de azúcares del equipo
Milkoscan/Foss, si bien proporciona resultados de forma más rápida y sencilla que el método
HPLC, debe ser ajustado para la determinación precisa de azúcares en miel.
71
72
REFERENCIAS
73
74
7. REFERENCIAS
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ANEJO I
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81
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83
84
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ANEJO II
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ANEJO II
ANION SUMMARY REPORT
No.
Name
Time
Area
min
nC*min
Trealose
Trealose
Trealose
Trealose
ED_1
ED_1
ED_1
Asymmetry(EP)
Plates(EP)
Height
Resolution(EP)
Amount
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Trealose
Trealose
ED_1
ED_1
ED_1
ED_1
nC
(%)
1
branco
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
2
branco
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
3
P0
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
4
P0
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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5
P1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P2
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P3
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P3
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
11
P4
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P4
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P5
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
14
P5
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
15
branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
16
P2
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
17
1300448
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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1300448d
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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I8
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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I8d
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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L2
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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L2d
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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R1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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R1d
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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L28
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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L28d
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
n.a.
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n.a.
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P2
n.a.
n.a.
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n.a.
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I10
n.a.
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n.a.
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n.a.
n.a.
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n.a.
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L26d
n.a.
n.a.
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branco
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P2
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Glucose
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2,377
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3891
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n.a.
3848
9,184
1,71
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8
P2
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3882
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3762
21,218
1,70
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10
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3,635
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3830
21,461
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11
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3,90
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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branco
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P2
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n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
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n.a.
n.a.
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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branco
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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No.
Name
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branco
Area
Area
Area
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nC*min
Area
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nC*min
nC*min
nC*min
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ED_1
ED_1
ED_1
ED_1
ED_1
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n.a.
n.a.
n.a.
ED_1
1
Area
n.a.
n.a.
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nC*min
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2
branco
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n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
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1,556
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P3
n.a.
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1,659
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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P5
n.a.
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branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P2
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branco
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n.a.
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branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P2
n.a.
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L1
n.a.
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L1d
n.a.
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48
branco
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
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P2
n.a.
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51
branco
branco
n.a.
n.a.
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n.a.
n.a.
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0,761
n.a.
n.a.
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n.a.
n.a.
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0,501
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%
n.a.
n.a.
0,000
#¡DIV/0!
Height
Height
No.
n.a.
n.a.
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Name
Height
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Height
Height
Height
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Height
#¡DIV/0!
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50
branco
branco
P0
P0
P1
P1
P2
P2
P3
P3
P4
P4
P5
P5
branco
P2
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I8d
L2
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R1
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L28
L28d
branco
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I10d
M1
M1d
L26
L26d
branco
P2
branco
L20
L20d
L23
L23d
M4
M4d
branco
P2
L1
L1d
branco
P2
branco
nC
Trealose
ED_1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
51
branco
n.a.
Sum:
Average:
No.
0,000
nC
Glucose
ED_1
n.a.
n.a.
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n.a.
9,267
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n.a.
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n.a.
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nC
Frutose
ED_1
n.a.
n.a.
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2,080
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n.a.
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n.a.
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n.a.
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61,001
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n.a.
7,936
58,216
58,545
n.a.
8,026
n.a.
nC
Sacarose
ED_1
n.a.
n.a.
0,739
0,734
1,432
1,418
2,878
2,908
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7,168
14,218
14,388
27,864
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n.a.
2,859
4,226
4,166
0,331
0,324
0,436
0,417
0,552
0,585
0,330
0,301
n.a.
2,844
0,525
0,540
1,203
1,177
0,466
0,495
n.a.
2,650
n.a.
0,851
0,860
0,534
0,521
0,120
0,133
n.a.
2,337
0,148
0,136
n.a.
2,321
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
141,388
138,310
65,902
64,812
1,648
153,556
%
1,706
185,286
%
1.644,217 1.779,658
#¡DIV/0!
40,103
43,406
Rel.Std.Dev:
#¡DIV/0!
58,631 %
58,534 %
Name
Amount
Amount
Amount
3,448
188,381
%
Amount
nC
nC
Melezitose Turanose
ED_1
ED_1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,300
1,278
0,600
1,265
0,563
2,520
1,163
2,541
1,133
6,246
2,852
6,250
2,850
12,287
5,661
12,309
5,671
24,215
11,327
24,201
11,268
n.a.
n.a.
2,512
1,127
0,596
0,366
0,568
0,387
0,949
0,516
0,920
0,538
1,454
0,862
1,471
0,856
1,310
0,829
1,320
0,842
0,803
0,522
0,804
0,552
n.a.
n.a.
2,483
1,136
1,370
0,722
1,367
0,682
3,678
0,992
3,679
1,000
1,195
0,887
1,175
0,886
n.a.
n.a.
2,489
1,138
n.a.
n.a.
0,724
0,416
0,748
0,468
2,449
0,898
2,455
0,808
1,026
0,774
1,026
0,760
n.a.
n.a.
2,494
1,111
0,818
0,675
0,817
0,652
n.a.
n.a.
2,500
1,113
n.a.
n.a.
3,546
156,524 %
Amount
Amount
nC
Maltose
ED_1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,681
0,666
1,357
1,338
3,373
3,362
6,682
6,655
13,315
13,249
n.a.
1,323
1,142
1,143
0,150
0,165
0,393
0,413
0,384
0,415
0,222
0,231
n.a.
1,230
n.a.
0,164
0,135
0,142
0,506
0,524
n.a.
1,041
n.a.
0,816
0,821
0,214
0,227
0,313
0,274
n.a.
0,801
0,149
0,152
n.a.
0,643
n.a.
Amount
107
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
Trealose
ED_1
branco
n.a.
branco
n.a.
P0
n.a.
P0
n.a.
P1
n.a.
P1
n.a.
P2
n.a.
P2
n.a.
P3
n.a.
P3
n.a.
P4
n.a.
P4
n.a.
P5
n.a.
P5
n.a.
branco
n.a.
P2
n.a.
1300448
n.a.
1300448d
n.a.
I8
n.a.
I8d
n.a.
L2
n.a.
L2d
n.a.
R1
n.a.
R1d
n.a.
L28
n.a.
L28d
n.a.
branco
n.a.
P2
n.a.
I10
n.a.
I10d
n.a.
M1
n.a.
M1d
n.a.
L26
n.a.
L26d
n.a.
branco
n.a.
P2
n.a.
branco
n.a.
L20
n.a.
L20d
n.a.
L23
n.a.
L23d
n.a.
M4
n.a.
M4d
n.a.
branco
n.a.
P2
n.a.
L1
n.a.
L1d
n.a.
branco
n.a.
P2
n.a.
branco
n.a.
branco
n.a.
Sum:
0,000
Average: #¡DIV/0!
ug/mL
Glucose
ED_1
n.a.
n.a.
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0,0892
0,1840
0,1838
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0,4171
0,9973
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1,9988
2,0111
3,9791
3,9724
n.a.
0,4173
25,4513
25,3868
27,0991
27,1099
23,8819
23,8363
22,9841
23,0653
25,9796
26,0313
n.a.
0,4167
27,7232
27,7367
16,5848
16,5689
23,5068
23,5994
n.a.
0,4146
n.a.
27,3663
27,2642
19,5134
19,4907
29,9353
29,7436
n.a.
0,4091
30,8745
31,0346
n.a.
0,4131
n.a.
n.a.
619,177
15,102
Rel.Std.Dev:
82,121 %
#¡DIV/0!
ug/mL
Frutose
ED_1
n.a.
n.a.
0,0872
0,0900
0,1808
0,1770
0,4378
0,4434
1,0223
1,0255
2,0702
2,0956
4,0770
4,1090
n.a.
0,4435
38,8604
38,7841
36,3226
36,2464
34,9259
35,0711
34,5418
34,7701
37,2550
37,2989
n.a.
0,4497
32,9506
32,9492
31,4878
31,4668
37,3599
37,2762
n.a.
0,4407
n.a.
35,4479
35,3726
34,2304
34,2760
34,7008
34,8673
n.a.
0,4204
33,5283
33,2978
n.a.
0,4376
n.a.
n.a.
861,296
21,007
ug/mL
ug/mL
ug/mL
Sacarose Melezitose Turanose
ED_1
ED_1
ED_1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,1064
n.a.
n.a.
0,1068
n.a.
0,1111
0,1956
0,1952
0,2095
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0,1947
0,1919
0,3933
0,4083
0,4082
0,3942
0,4140
0,3939
0,9528
1,0417
0,9844
0,9593
1,0380
1,0025
1,9685
2,0598
1,9830
2,2092
2,0840
2,0085
3,9498
4,1157
4,0187
4,0063
4,1183
3,9880
n.a.
n.a.
n.a.
0,3794
0,4099
0,3930
5,9810
0,9408
1,3316
5,7973
0,8137
1,4490
0,5397
1,5054
1,9253
0,5777
1,4464
1,9895
0,6726
1,9670
3,2352
0,6601
2,0486
3,0963
0,8761
1,7794
2,8621
1,0328
1,8301
2,8651
0,5124
1,2030
1,9141
0,5177
1,2900
1,9679
n.a.
n.a.
n.a.
0,4048
0,4024
0,3930
0,8474
1,9772
2,7394
0,9374
1,9761
2,3159
1,8544
6,7304
3,7056
1,7601
6,7152
3,6595
0,7384
1,9482
3,3259
0,8894
1,9306
3,1734
n.a.
n.a.
n.a.
0,3674
0,4052
0,3944
n.a.
n.a.
n.a.
1,1237
1,1010
1,3714
1,1201
1,1894
1,7654
0,7233
3,8422
3,1767
0,7050
3,6897
2,7301
0,2336
1,6380
2,8050
0,2706
1,5802
2,8477
n.a.
n.a.
n.a.
0,3022
0,4075
0,3855
0,2557
1,2862
2,3978
0,2782
1,1915
2,4037
n.a.
n.a.
n.a.
0,3237
0,4088
0,3870
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
46,113
69,324
78,306
1,125
1,778
1,958
124,122
%
81,330 %
87,178 % 61,523 %
ug/mL
Maltose
ED_1
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
0,1995
0,1971
0,4030
0,4033
1,0031
1,0099
2,0028
2,0001
4,0259
4,0005
n.a.
0,3966
3,7968
3,6709
0,4492
0,4639
1,1712
1,2693
1,2186
1,3463
0,6257
0,6431
n.a.
0,3611
n.a.
0,4702
0,3750
0,3827
1,5886
1,6088
n.a.
0,3063
n.a.
2,7309
2,9169
0,5875
0,6641
0,9124
0,7824
n.a.
0,2426
0,3983
0,4210
n.a.
0,1839
n.a.
n.a.
45,230
1,190
96,526 %
108
Pressure
1:MEL 20130617
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
5.500 TREND
3s(Viewed:4857.28)
2s(Viewed:4411.24)
4.000
Mean or Target(Viewed:3519.18)
3.000
2s(Viewed:2627.12)
3s(Viewed:2181.08)
2.000
51
1.000
Inject Time
0
17-06-2013 07:20:00
19-06-2013 01:00:00
20-06-2013 18:40:00
Background Signal Trend Plot and pump pressure trend plot
Background
1:MEL 201
32,0 TREND
nC
30,0
3s(Viewed:30.0063)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
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34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
2s(Viewed:28.6284)
27,5
Mean or Target(Viewed:25.8725)
25,0
2s(Viewed:23.1167)
22,5
3s(Viewed:21.7387)
51
20,0
16,0
17-06-2013 07:20:00
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Inject Time
19-06-2013 01:00:00
20-06-2013 18:40:00
Pump_1_Pressure.Step = Auto
Pump_1_Pressure.Average = On
EDet1.Mode = IntAmp
EDet1.CellControl = On
Data_Collection_Rate = 1.00
pH.UpperLimit = 13.00
pH.LowerLimit = 10.00
Electrode = AgCl
Waveform Time = 0.00, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
109
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:48
18:51:49
18:51:49
18:51:49
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:44
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
18:52:45
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18:53:15
19:17:45
19:17:45
19:17:45
19:17:45
19:17:51
19:17:51
19:17:51
19:17:51
19:17:51
19:17:51
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
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0.000
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25.000
25.000
25.000
25.000
25.100
25.100
25.100
25.100
25.100
25.100
Waveform Time = 0.20, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = On, Integration = On
Waveform Time = 0.40, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
Waveform Time = 0.41, Potential = -2.00, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
Waveform Time = 0.42, Potential = -2.00, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
Waveform Time = 0.43, Potential = 0.60, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
Waveform Time = 0.44, Potential = -0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
Waveform Time = 0.50, Potential = -0.10, LastStep = On, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration =
Off
Column_TC.Mode = On
Column_TC.TemperatureSet = 30.00
Compartment_TC.Mode = On
Compartment_TC.TemperatureSet = 30.00
Wait Column_TC.TemperatureState
Wait finished
Wait Compartment_TC.TemperatureState
Wait finished
Wait SampleReady
Wait finished
Load
Waiting for load response on AS50LoadState.
Got load response
EDet1.Autozero
Flow = 0.500
%B = 83.0
%C = 0.0
%D = 0.0
Wait CycleTimeState
Wait finished
Inject
Injecting from vial position 1.
Injection Volume is 500.0 µl.
Wait InjectState
Wait finished
Pump_1_Pressure.AcqOn
ED_1.AcqOn
The pH at Acquisition start = 12.0.
ED_1_Total.AcqOn
The pH at Acquisition start = 12.0.
Sampler.ReleaseExclusiveAccess
Exclusive access finished.
Flow = 0.500
%B = 83.0
%C = 0.0
%D = 0.0
Log Pressure: 3505.4 [psi]
Log Background: 28.4 [nC]
Flow = 0.500
%B Gradient Start = 83.0, End = 0.0, Duration = 0.100
%C = 0.0
%D = 0.0
Pump_1_Pressure.AcqOff
Flow = 0.500
%B = 0.0
%C = 0.0
%D = 0.0
Log pH.Value: 12.05
110
19:17:51
19:17:51
19:17:51
19:17:51
19:27:51
19:27:51
19:27:51
19:27:51
19:27:57
19:27:57
19:27:57
19:27:57
19:47:57
19:47:57
19:47:57
19:47:57
20:02:57
20:02:57
20:03:04
25.100
25.100
25.100
25.100
35.100
35.100
35.100
35.100
35.200
35.200
35.200
35.200
55.200
55.200
55.200
55.200
70.200
70.200
Compartment_TC.ReleaseExclusiveAccess
Exclusive access finished.
Column_TC.ReleaseExclusiveAccess
Exclusive access finished.
Flow = 0.500
%B Gradient Start = 0.0, End = 83.0, Duration = 0.100
%C = 0.0
%D = 0.0
Flow = 0.500
%B = 83.0
%C = 0.0
%D = 0.0
Flow = 0.500
%B = 83.0
%C = 0.0
%D = 0.0
ED_1.AcqOff
ED_1_Total.AcqOff
End of sample "branco".
111