SELECCIÓN DE INDIVIDUOS DE ENCINA (Quercus ilex L. spp
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SELECCIÓN DE INDIVIDUOS DE ENCINA (Quercus ilex L. spp ballota) Y ALCORNOQUE (Q. suber L.) TOLERANTES AL PATÓGENO Phytophthora cinnamomi Rands Dra. ISABEL LEÓN SÁNCHEZ Autores: Isabel León , Juan José García y Raúl Tapias. Área de Tecnología del Medio Ambiente Departamento de Ciencias Agroforestales Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Huelva EL DECAIMIENTO DE LOS QUERCUS. Origen y distribución. Principios del siglo XX: alrededor del mundo decaimiento y muerte de árboles del género Quercus (Brasier 1993). Años 80:decaimiento severo de Quercus en la Cuenca mediterránea (Moreira et al., 2006) Finales siglo XX: Andalucía se declara la región de España con mayor extensión de la enfermedad (Navarro et al., 2001). (Navarro et al. 2001) 2 ¿Qué factores provocan el decaimiento? -­‐‑ Factores predisponentes (largo plazo, asintomáticos, bióticos o abióticos) -­‐‑ Envejecimiento arbolado -­‐‑ Carencia regeneración -­‐‑ Falta de cuidados culturales -­‐‑ Factores incitantes (corta duración, generalmente abióticos, sintomáticos) -­‐‑ Alteraciones climáticas -­‐‑ Factores contribuyentes (largo plazo, bióticos, sintomáticos) -­‐‑ Hongos y bacterias -­‐‑ Insectos (plagas) 3 EL DECAIMIENTO DE LOS QUERCUS. 4 ¿Qué podemos hacer para controlar el decaimiento? 1. Buenas prácticas culturales 2 . A c t u a c i o n e s c u r a t i va s (aplicación de fungicidas, estudio interacción planta-­‐‑ patógeno) 3. Actuaciones preventivas (modelos predictivos, control d e p l a g a s , b ú s q u e d a d e genotipos tolerantes) 5 Actuaciones curativas Métodos químicos: -­‐ Aplicación de fungicidas sistémicos ( García et al., 1993) -­‐ Aplicación de fer?lizaciones de fósforo ( Fernández-­‐Escobar et al., 1999; 2002) 6 Métodos de Control de plagas No es fácil establecer un método de control ante P. cinnamomi. ¿por qué? -­‐‑ Amplia gama de huéspedes a los que afecta -­‐‑ L ongevidad de estructuras de resistencia -­‐‑ Facilidad de propagación 7 ¿Alternativas de lucha contra el decaimiento? Estudios de variabilidad genética. Ante el ataque de patógenos las plantas actúan mediante diferentes mecanismos (Larcher 1995): Mecanismos evitadores: respuestas que tienden a evitar o prevenir el estrés. Mecanismos tolerantes: adaptaciones que permiten soportar o resistir el estrés. -­‐‑ -­‐‑ Resistencia de progenies y líneas clonales a P.cinnamomi en árboles de: -­‐‑ Eucaliptus spp (Stuckely et al., 1994; Hüberli et al., 1997); Castanea spp (Marçais et al., 1996); Quercus spp . 8 OBJETIVOS 1. Selección de progenies de Q.ilex spp ballota y Q.suber con alto grado de tolerancia a P.cinnamomi 1.1. Efecto de la dosis de inóculo. 1.2. Diferencias entre especies. 1.3. Diferencias entre procedencias. 1.4. Diferencias entre progenies. 2. Selección de genotipos de Q.ilex spp ballota y Q.suber con alto grado de tolerancia a P.cinnamomi 9 1. Selección de progenies de Q.ilex spp ballota y Q.suber con alto grado de tolerancia a P.cinnamomi 10 1.1. Efecto de la dosis de inóculo 11 Metodología Material vegetal: semillas de encina y alcornoque recogidas durante los meses de octubre y noviembre de 2008 de dos regiones de procedencia diferentes. Siembra y plantación: febrero 2009 durante 1 año. Inóculo: cepas P45, P37 y P203 de P.cinnamomi cultivadas en V8. Infección: 10 ml de inóculo infectivo inyectado a lo largo del cepellón. Trasplante: 25 plantas en caja de poliestireno expandido de 45 litros con sustrato perlita. Metodología 13 Metodología Clase 0 1 2 3 4 CAPÍTULO 1-­‐‑ Material y métodos Porcentaje de afección 0-­‐‑10% 10-­‐‑25% 26-­‐‑75% 76-­‐‑90% 91-­‐‑100% Sintomatología radicular Sintomatología aérea Necrosis radicular Defoliación y/o marchitez foliar 14 Metodología 100 plantas de un año de edad de cada especie; 3 dosis + testigo; 25 plantas por tratamiento. Duración del ensayo: 1 mes Parámetros medidos: Ψ, PRN, LRN, PRS, PRP, VR, PTP, LTP, NHJ y VA. Análisis de datos: ANOVA à modelo lineal general (GLM). Test Tukey-­‐‑b. Correlación de Pearson. Dosis Composición del inóculo infectivo D1 Contenido de micelio de 1,5 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8(½ de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas. D3 Contenido de micelio de 6 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8 (2 de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas. D5 Contenido de micelio de 24 placa Petri de 15 cm de diámetro en medio V8 (8 de cada cepa) de P. cinnamomi + 300 ml agua destilada para 30 plantas. 15 Resultados Dosis Q. ilex 0,14 Q. ilex 2,5 0,10 2 -­‐‑Ψ (Mpa) PRN (g) 0,12 D3 D5 0,08 D1 1,5 0,06 0,04 C 1 0,02 0,5 0,00 0 25 C D1 D3 PRN LRN PRS PRP LRP PTP LTP NHJ VR LRN (cm) LRN 0,785** 1 PRS 0,191 0,234 1 15 PRP 0,139 0,223 0,367** 1 LRP 0,025 0,183 -­‐‑0,174 0,314* 10 PTP 0,054 0,109 0,430** 0,620** -­‐‑0,088 LTP 0,088 0,116 0,424** 0,438** -­‐‑0,144 0,816** NHJ 0,146 0,171 0,228 20 5 0 C D1 D3 D5 D5 0,249 1 1 1 -­‐‑0,031 0,464** 0,551** 1 VR -­‐‑0,129 -­‐‑0,260* -­‐‑0,426** -­‐‑0,338** -­‐‑0,042 -­‐‑0,396** -­‐‑0,323* -­‐‑0,087 VA 0,118 0,101 -­‐‑0,15 -­‐‑0,206 0,065 -­‐‑0,042 0,05 1 -­‐‑0,034 0,042 16 Resultados Dosis Q. suber 0,018 Q. suber 2,9 0,014 -­‐Ψ(MPa) 2,7 0,012 2,5 0,01 2,3 0,008 2,1 0,006 1,9 0,004 1,7 0,002 1,5 C D1 3,0 D3 D5 VR 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 P/L 0,016 C D1 D3 D5 0 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 C D1 D3 D5 D3 D5 R C D1 17 Resultados Dosis Q. suber LRN PRS PRP LRP VR F P R PTP LTP NHJ 0,675* 1 0,552 0,040 1 0,661*0,776** 0,397 1 0,398 0,608* 0,089 0,661* 1 -­‐‑0,054 0,516 -­‐‑0,612* 0,210 0,195 1 0,798**0,915** 0,319 0,795** 0,635 0,408 1 0,894** 0,538 0,727* 0,706* 0,548 -­‐‑0,1230,785** 1 0,665* -­‐‑0,0710,765** 0,217 -­‐‑0,051 -­‐‑0,595 0,180 0,674* 1 0,649* 0,692* 0,364 0,478 0,531 0,096 0,778**0,604* 0,239 1 0,424 0,802** 0,218 0,826**0,800**0,222 0,739** 0,481 -­‐‑0,1460,647* 1 0,372 0,309 0,037 0,642* 0,196 0,169 0,240 0,295 0,281 -­‐‑0,169 0,204 1 -­‐‑0,100 -­‐‑0,096 -­‐‑0,114 -­‐‑0,572 -­‐‑0,148 -­‐‑0,128 -­‐‑0,094 -­‐‑0,165 -­‐‑0,214 0,172 -­‐‑0,198-­‐‑0,866** PRN PRS PRP LRP VR F P R PTP LTP NHJ VA LRN 18 1.2. Diferencias entre especies 19 Metodología 380 plantas de un año de edad de cada especie. Duración del ensayo: 4 meses. Parámetros medidos: VA, VR. Análisis de datos: ANOVA à modelo lineal general (GLM). 20 Resultados 3,5 3 3 2,5 2 2 Control 1,5 VR VA 2,5 C 1,5 Inoculada I 1 1 0,5 0,5 0 Encina 0 Alcornoque Encina Alcornoque 3,0 2,5 -Ψ(Mpa) 2,0 Qi 1,5 Qs 1,0 0,5 0,0 0 1 2 3 4 5 Isabel María León Sánchez Universidad de Huelva 21 1.3. Diferencias entre procedencias 22 Metodología 70 plantas de dos años de edad de cada procedencia de cada especie; inoculación de 10 ml de inóculo 35 plantas de cada procedencia con dosis= 3placas de micelio en 300ml de agua para 30 plantas. Duración del ensayo: 5 meses. Parámetros medidos: PRN, LRN, F, P, R, LTP, SF, NHJ y VA. Análisis de datos: Análisis de datos: ANOVA à modelo lineal general (GLM). Test Tukey-­‐‑b. Correlación de Pearson. 23 Resultados Q. suber 1,4 160 140 120 100 80 60 40 20 0 1,2 1 c i PRN (g) LRN (cm) Q.ilex 0,8 C 0,6 I 0,4 0,2 0 RE PASR SCR SBRPII NHJ SF VA 0,385 <0,001 <0,001 0,001 T <0,001 <0,001 <0,001 0,762 <0,001 <0,001 0,002 0,105 0,244 p PROC 0,002 0,002 0,005 0,395 0,004 0,050 <0,001 0,224 0,172 T*PROC 0,168 0,320 0,181 0,794 0,336 Quercus PRN LRN R P F LTP NHJ SF VA suber T 0,003 0,593 0,047 <0,001 0,37 0,048 0,77 0,865 0,034 0,363 0,253 0,807 0,753 0,291 0,827 0,112 p PROC 0,016 0,2 Isabel María León Sánchez Universidad Huelva T*PROC 0,326 0,582 0,84 0,783 0,842 0,63 de 0,835 0,17 0,62824 Quercus ilex PRN LRN R P F LTP 1.4. Diferencias entre progenies 25 Metodología Temporada otoñal 2009/2010 200 semillas por árbol: 98 progenies de Q.ilex y 69 progenies de Q.suber. Villanueva de los Castillejos (HR) Puebla de Guzmán (PG) Las Herrerías (HE) Paymogo (PAY) Castaño del Robledo (CR) Zalamea la Real (ZR) Campofrío (CP) Cortes de la Frontera (CO) Los Barrios (BA) Bajo Alentejo (ABA) Alto Alentejo (AA) Algarve (ALG) 26 Metodología 27 Metodología 1. Duración: 6 meses. 2. Parámetros evaluados: PRN, LRN, DIRP, P, R, F y VR. 3. Total de plantas evaluadas: -­‐‑ 5 inoculadas y 2 control en Q.i de 80 progenies diferentes. -­‐‑ 5 inoculadas y 2 control en Q.s de 64 progenies diferentes. 4. Análisis estadístico: GLM Univariante con los factores fijos tratamiento (T) y progenie (Pr). 28 Metodología 1. Duración: 6 meses. 2. Parámetros evaluados: PRN, LRN, DIRP, P, R, F, LTP, NHJ y VA. 3. Total de plantas evaluadas: 20 plantas de 8 familias seleccionadas del ranking del ensayo anterior de Q.ilex. 4. Análisis estadístico: GLM Univariante con los factores fijos tratamiento (T) y nivel de tolerancia (To). 29 Resultados Quercus ilex p T p Pr p Pr*T 0,25 PRN LRN DIRP P R F VR <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,935 <0,001 0,868 <0,001 <0,001 0,002 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,653 1 40 PRN (g) R 35 0,2 30 PGE6 0,15 CPE10 HRE8 0,1 HRE10 COE22 25 CPE10 20 HRE4 15 PGE7 10 0,05 5 0 0 PRN LRN DIRP P R F VR C 0,185±0,014 37,542±2,179 4,078±0,091 5,013±0,325 32,320±2,182 10,807±0,523 1,022±0,044 I 0,047±0,003 11,078±0,600 4,061±0,055 1,661±0,097 10,352±0,760 3,254±0,164 2,247±0,050 30 Resultados FAMILIA PGE6 PAYE7 ZRE8 PGE15 COE22 PAYE10 PGE4 COE31 CPE8 COE23 CPE1 COE15 CR2 CPE6 PAYE11 PGE10 COE30 ZRE1 HRE15 CPE10 Quercus ilex 7,336 5,302 4,798 3,564 3,551 3,397 2,998 2,626 2,621 2,376 2,231 1,994 1,937 1,650 1,626 1,565 1,520 1,435 1,294 1,143 IR HT HT HT HT HT HT HT HT HT HT HT Tl Tl Tl Tl Tl Tl Tl Tl Tl GT FAMILIA CPE4 ZRE9 HEE8 HEE5 COE7 CPE3 PGE13 COE1 CR3 COE6 HEE14 PAYE9 CPE7 HRE16 CPE2 HEE11 COE29 HEE1 PGE8 HEE10 IR= PRN+LRN+P+R+F Nyassé et al., 1995 1,121 1,079 0,907 0,893 0,725 0,691 0,564 0,559 0,529 0,472 0,463 0,434 0,383 0,324 0,214 0,191 -­‐‑0,069 -­‐‑0,074 -­‐‑0,213 -­‐‑0,251 IR Tl Tl MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT S S S S GT FAMILIA ZRE6 HRE13 COE8 ZRE11 ZRE12 COE24 HEE9 CPE5 HEE12 COE9 PAYE4 COE25 PGE7 HRE14 HEE15 HEE4 PGE9 HEE2 CPE9 HEE3 FAMILIA -­‐‑0,269 S HRE2 -­‐‑0,290 S ZRE7 -­‐‑0,327 S HRE4 -­‐‑0,357 S COE14 -­‐‑0,365 S HRE11 -­‐‑0,499 S HEE7 -­‐‑0,501 S PAYE8 -­‐‑0,711 S PGE11 -­‐‑0,730 S ZRE4 -­‐‑0,771 S PAYE2 -­‐‑0,848 S HRE3 -­‐‑0,883 S HRE9 -­‐‑0,969 S PAYE5 -­‐‑1,035 S ABA110 -­‐‑1,043 S COE26 -­‐‑1,162 S HRE7 -­‐‑1,178 S PAYE3 -­‐‑1,211 S PAYE1 -­‐‑1,264 S HRE10 Isabel María León Sánchez -­‐‑1,299 S de Huelva HRE8 Universidad IR GT IR -­‐‑1,469 -­‐‑1,588 -­‐‑1,608 -­‐‑1,700 -­‐‑1,766 -­‐‑1,842 -­‐‑1,954 -­‐‑2,117 -­‐‑2,583 -­‐‑2,626 -­‐‑2,639 -­‐‑2,680 -­‐‑2,692 -­‐‑2,954 -­‐‑3,013 -­‐‑3,231 -­‐‑3,321 -­‐‑3,652 -­‐‑3,926 -­‐‑1,441 S S S S S S S S HS HS HS HS HS HS HS HS HS HS HS HS 31 GT Resultados Quercus suber p T p Pr p Pr*T 200 180 PRN <0,001 <0,001 <0,001 LRN <0,001 <0,001 0,001 120 100 80 60 40 20 0 P <0,001 0,009 0,065 0,7 R 0,6 160 140 DIRP 0,583 1 1 HEE6 0,5 R <0,001 <0,001 <0,001 F <0,001 0,20 0,608 VR <0,001 0,960 0,948 PRN (g) SALG297 SAA359 0,4 SBA326 COA49 0,3 COA49 SAA360 0,2 BAA13 0,1 0 PRN LRN DIRP P R F VR C 1,021±0,070 111,357±5,404 4,613±0,086 6,492±0,438 165,175±10,153 16,365±0,605 0,750±0,038 I 0,151±0,012 21,137±1,259 6,349±2,063 2,602±0,159 22,152±1,442 6,020±0,296 1,870±0,051 32 Resultados Quercus suber IR GTFAMILIAIR HEE6 5,244 HTSAA361 0,791 SALG297 5,050 HTCOA2 0,781 SBA326 3,734 HTCOA10 0,735 BAA6 3,483 HTCOA3 0,709 SAA359 3,463 HTSALG82 0,625 BAA26 2,621 HTBAA10 0,421 COA4 2,459 HTBAA3 0,392 BAA9 2,189 HTCOA5 0,315 SAA355 1,947 Tl BAA24 0,082 SAA370 1,837 Tl BAA18 0,002 BAA1 1,691 Tl SABA330 -­‐‑0,047 BAA5 1,629 Tl SALG295 -­‐‑0,113 COA9 1,416 Tl BAA17 -­‐‑0,118 BAA11 1,304 Tl BAA28 -­‐‑0,128 BAA16 1,135 Tl COA8 -­‐‑0,206 COA40 1,055 Tl BAA23 -­‐‑0,369 FAMILIA MT MT MT MT MT MT MT MT MT MT S S S S S S GT IR= PRN+LRN+P+R+F IR GT FAMILIAIR GT COA47 -­‐‑0,495 S BAA27 -­‐‑1,151 S COA6 -­‐‑0,527 S COA7 -­‐‑1,204 S BAA22 -­‐‑0,579 S BAA29 -­‐‑1,220 S BAA4 -­‐‑0,607 S COA48 -­‐‑1,273 S BAA7 -­‐‑0,661 S COA45 -­‐‑1,470 S SALG307 -­‐‑0,662 S BAA15 -­‐‑1,481 S BAA8 -­‐‑0,672 S SALG296-­‐‑1,489 S BAA12 -­‐‑0,726 S SALG299-­‐‑1,559 S ZRA5 -­‐‑0,735 S COA43 -­‐‑2,063 HS COA1 -­‐‑0,746 S SAA356 -­‐‑2,096 HS BAA25 -­‐‑0,818 S COA46 -­‐‑2,181 HS COA41 -­‐‑0,867 S COA44 -­‐‑2,309 HS BAA20 -­‐‑0,868 S CRA1 -­‐‑2,384 HS COA42 -­‐‑0,986 S BAA14 -­‐‑2,528 HS BAA30 -­‐‑1,034 S SAA360 -­‐‑2,885 HS Isabel María León Sánchez BAA13 -­‐‑1Universidad ,099 S COA49 -­‐‑3,747 HS de Huelva 33 FAMILIA Resultados Quercus ilex 0,6 120 PRN 0,5 LRN 100 HS C 0,4 HS I 0,3 0,1 20 0 0 90 HT C 40 HT I 100 HS I 60 HT C 0,2 HS C 80 HT I R 80 70 60 50 40 30 HS C HS I HT C HT I 20 10 0 34 Conclusiones ü Dosis: Síntomas radiculares: en encina mayores síntomas a mayor dosis, en alcornoque no. ü Diferencias entre especies: forma de producir raíces, comportamiento ante diferentes dosis. ü La infección del patógeno muestra un patrón de sintomatología similar en diferentes localizaciones. En Q.i existen diferencias significativas entre procedencias en la mayoría de los parámetros medidos. ü Se han encontrado diferencias en la resistencia a la enfermedad entre progenies tanto en encina como en alcornoque. 35 Conclusiones ü Los resultados de crecimiento de raíz son significativamente menores en plantas inoculadas que en controles. ü Existe diversidad entre las distintas especies en la producción de raíces nuevas. ü La proporción de desarrollo de raíces postinfección depende de la progenie. ü Distinto comportamiento entre progenies. 36 2. Selección de genoEpos de Q.ilex spp ballota y Q.suber con alto grado de tolerancia a P.cinnamomi 37 Metodología Selección de 5 geno?pos de alcornoque con mayor tolerancia al patógeno en el ensayo anterior. Mul?plicación in vitro de segmentos nodales. Enraizadas en MSR4 (1 mes) y vermiculita (15 días). 3 cepas de P. cinnamomi en V8 líquido durante el período de máxima producción de zoosporas a dosis de 3.5x10^6 zoosporas/planta. Evaluación de síntomas a lo largo de 30 días. Evaluación . ◦ Tallo: nivel de daño, longitud (L). ◦ Raíces: longitud total y necrosada, diámetros, número. ◦ Tiempo en aparecer los síntomas y de supervivencia. 38 Resultados Trat C I Clon NºR inic ΔrelNºR LR inic (cm) LR final (cm) ΔrelLR DR final LRN (cm) %ΔLRN B24 1,8 ± 0,8a 0,0 ± 0,0a 1,2 ± 0,4a 3,1 ± 1,6a 1,6 ± 0,6a 1,5 ± 0,3a 0,13 ± 0,08a 4,0% ± 4%a C4 16 ± 7,2b 0,0 ± 2,5a 14,8 ± 6,9b 51,6 ± 40,3b 2,5 ± 1,1a 1,7 ± 0,3a 0,67 ± 0,67a 1,3% ± 1,3%a C47 3,0 ± 1,1a 0,0 ± 0,3a 3,4 ± 1,1a 17,7 ± 3,8a 4,2 ± 1,4a 1,4 ± 0,4a 0,0 ± 0,0a 0% ± 0%a H6 2,4 ± 0,5a 0,14 ± 0,14a 3,4 ± 1,2a 13,3 ± 2,5a 2,9 ± 1,5a 1,6 ± 0,2a 0,11 ± 0,11a 0,9% ± 0,8%a S297 3,0 ± 1,2a 0,33 ± 0,9a 5,0 ± 1,7a 14,7 ± 4,4a 2,0 ± 0,8a 2,3 ± 0,3a 1,20 ± 0,65a 8,1%± 7,8%a B24 2,0 ± 0,5a 0,6 ± 0,4a 2,4 ± 0,7a 6,2 ± 1,6c 1,6 ± 0,4b,c 1,7 ± 0,24a,b 0,64 ± 0,2b 10,4% ± 4%b C4 11,2 ± 2,2b -4,8 ± 1,8a 13,8 ± 3,3b 19,2 ± 2,2d 0,4 ± 0,3b 1,2 ± 0,17b 7,95 ± 2,0c 41% ± 10%c C47 2,5 ± 0,6a -0,2 ± 0,13a 2,5 ± 0,9a 6,8 ± 1,3c 1,7 ± 0,8b,c 2,0 ± 0,2a,b 1,78 ± 0,78b 26% ± 10%c H6 2,2 ± 0,5a 0,0 ± 0,0a 2,4 ± 0,5a 7,7 ± 2,1c 2,3 ± 0,5b,c 1,7 ± 0,15a,b 2,58 ± 0,83b 34% ± 6%c S297 3,3 ± 1,0a -0,7 ± 0,5a 4,3 ± 1,3a 11,9 ± 3,0c 1,8 ± 0,5b,c 2,1 ± 0,26a 3,93 ± 2,6b,c 33% ± 11%c 39 Resultados Clon C4 tras 15 días de la inoculación in vitro 40 41 Conclusiones ü Se han encontrado diferencias entre individuos en los tiempos de aparición de síntomas. ü L o s r e s u l t a d o s d e s u p e r v i v e n c i a s o n significativamente diferentes entre clones. ü Existe diversidad en la producción de raíces nuevas. ü La proporción de necrosis depende de los clones. ü Distinto comportamiento entre clones. 42 FINANCIACIÓN Y PARTICIPANTES: Programa Interreg III 2004-­‐2006 Consejería de innovación, Ciencia y empresa, Junta de Andalucía (2008-­‐2012) Universidad do Algarve Ins?tuto Nacional de Inves?gaciones Agrarias de Oeiras Universidad de Huelva 43 Dra. ISABEL LEÓN SÁNCHEZ Área de Tecnología del Medio Ambiente Departamento de Ciencias Agroforestales Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Huelva Carretera De la Rábida, 0 S/N, 21810 Palos de la Frontera, Huelva ileon@dcaf.uhu.es 44
