Universidad Nacional de San Luis Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia Departamento de Bioquímica y Cs. Biológicas Carrera: Licenciatura en Bioquímica Curso: Técnicas Moleculares aplicadas a Bioquímica Clínica E-mail: curso.tecmol@gmail.com Blog: http://qbpatologica.wordpress.com Año: 2013 GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS Equipo del Curso: Dra. Silvia M. Varas Dra. María G. Lacoste Dra. Mariana L. Ferramola Bqco. José L. Arias 1 CRONOGRAMA RESUMIDO: JUNIO: 24-28 Horario del curso: 8,30-12,30 hs 14- 18 hs 24 - Extracción de sangre AM - Teórico 1: Genoma Humano.Proyecto Genoma Humano. Controversias Éticas. Mutaciones más comunes según Human Gene Mutation Database. Deleciones y Mutaciones puntuales. Estrategias de laboratorio. Material usado en un laboratorio de biología molecular -Teórico 2: PCR; bases. Componentes. Templado o sustrato. Enzimas. Primers o iniciadores: diseño y concentración. Magnesio y NTPs. Eficiencia de una PCR (especificidad, rendimiento y fidelidad). Variaciones. Puesta a punto de una PCR. PM Extracción de ADN. Determinación de Pureza 25 PCRI: Alelo Duarte AM - Teórico 3: Técnicas usadas para la determinación de deleciones e inserciones. Otras variantes de PCR: SSCP, RFLP-PCR, RT-PCR. PM PCR II: Mutagénesis - Teórico 4: Diseño Oligos 26 PCRI: Alelo Duarte – Corte Enzima Restricción- Corrida de Geles de Agarosa AM Seminario 1 PM PCRII: Preparación geles de PAGE y corrida. Análisis resultados. Seminario 2 27 PCR III: MAS-PCR AM Seminario 3 Seminario 4 PM PCRIII: Armado de geles y corrida Teórico 5: Técnicas usadas para la determinación de mutaciones puntuales. MASPCR, ARMS, mutagénesis mediada por PCR y Dot blot. Seminario 5 Seminario 6 28 Teórico 5: Nuevas plataformas diagnósticas. Resumen gral. Discusión de Resultados e Informes Evaluación final 2 I- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL A PARTIR DE MUESTRA SANGUINEAS Introducción: La extracción de ADN a partir de una muestra constituye la etapa previa de todo análisis genético. Obtener ADN puro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que será destinado. En general, los métodos de extracción de ADN tienen una serie de pasos básicos: 1-disrupción celular con ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes y agentes quelantes que secuestran cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+. 2-eliminación de las proteínas que constituyen los principales contaminantes del extracto, 3-concentración del ADN que un medio con alta concentración de sales precipita con alcoholes, 4-lavado para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa y 5- resuspensión Para las muestras de sangre en particular, se han descritos distintos protocolos. En el siguiente práctico se aplicará un método que aprovecha el cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio. En resumen: Triton X-100 y SDS: son detergentes. EDTA: quelante de cationes divalentes como Ca2+ y Mg2+, sobre todo de este ultimo ya que existen en el medio enzimas que degradan los ácidos nucleicos (nucleasas- magnesio dependientes), es decir que son enzimas que solo actúan en presencia de este catión. Perclorato de sodio (NaClO4): se utiliza para desproteinizar las preparaciones de ADN. A altas concentraciones, el perclorato de sodio elimina el SDS y las proteínas asociadas con él, además, previene la precipitación de las proteínas con el ácido nucleico en el paso final de precipitación con etanol. 3 Etanol 70%: solución de lavado para eliminar, primordialmente, restos de SDS que es un inhibidor especifico de Taq polimerasa. TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO TOTAL MEDIANTE LA TÉCNICA DE SALTING OUT MEJORADO Objetivos: 1-Conocer los fundamentos de los pasos químicos utilizados para lograr el aislamiento de ADN a partir de una muestra biológica. 2-Determinar la eficiencia del proceso de purificación mediante el uso de índices de pureza. 3-Cuantificar el ADN extraído y preparar la muestra para su utilización en las técnicas posteriores. Fundamento del método En presencia de altas concentraciones de sales, la solubilidad de las proteínas disminuye y terminan por precipitar (salting out). El perclorato de sodio se utiliza para desproteinizar las preparaciones de ADN. A altas concentraciones, el perclorato de sodio elimina el SDS y las proteínas asociadas con él, además, previene la precipitación de las proteínas con el ácido nucleico en el paso final con etanol. Reactivos: 1) Buffer de Lisis I (lisis de glóbulos rojos) Concentración final: Sacarosa…………………...0.32 M Tris-HCl (pH 7.6) ……. 10 mM MgCl2 ………………………………… 5 mM Tritón X-100 .............. 1 % Almacenar a 4 ºC en oscuridad (mantener en frío hasta su uso) Preparación: Sacarosa 10,26 gr Tris-HCl 1 M (pH 7.6) 1 ml MgCl2 1M 0,5 ml H2O milliQ c.s.p 100 ml Esterilizar la solución por autoclavado Luego agregar 1 ml de Triton X-100 4 Preparación de la solución madre de Tris-HCl 1 M (pH=7,6) Disolver 12,11 g de Tris base en 80 ml de H2O. Ajustar el pH por el agregado de 6 ml HCl (c). Ajustar el volumen a 100ml. Esterilizar por autoclavado. 2) Buffer de Lisis II (lisis de glóbulos blancos) Concentración Final: EDTA pH=8,0 ……………………….. 25 mM NaCl ……………………………………... 75 mM Preparación: EDTA 0,5M pH=8 5 ml NaCl 5M 4 ml H2O milliQ c.s.p 100 ml Esterilizar la solución por autoclavado. 3) SDS 10% Preparación: 0,5 g 5ml de H2O(d) 4) Perclorato de sodio (NaClO4) 5M Preparación: 1,4 g 2ml de H2O(d) 5) NaCl 5M Preparación: 29,22 g 100 ml de H2O(d) PROTOCOLO 1) Colocar 300 µl de la muestra de sangre total en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. 2) Agregar 1,2 ml de Buffer de Lisis I frío, mezclar y centrifugar 15 min a 2400 g (4°C). 3) Tirar el SN y agregar 350 µl de Buffer de Lisis I, mezclar y volver a centrifugar. 4) Tirar el SN y resuspender el pellet en: 135 µl de Buffer de Lisis II + 3,8 µl de SDS 10% + 33 µl de Perclorato de sodio. Agitar vigorosamente 10 segundos a temperatura ambiente. 5) Agregar 60 µl de NaCl 5 M y agitar vigorosamente 15 segundos. Centrifugar 10 minutos a 1500 g a temperatura ambiente. 5 6) Pasar el SN a un tubo limpio y agregar 210 µl de isopropanol frío (-20°C). Tapar y mezclar suavemente (se observa el ovillo). 7) Sacar el ADN con un tip (no aspirar) y colocarlo en 100 µl de etanol 70%. CUIDADO: el ADN es muy pegajoso, fijarse que no quede pegado en el tip. 8) Centrifugar 5 minutos a 1500 g. Descartar el etanol 70% y volver a lavar con 100 µl una vez mas. 9) Dejar secar el etanol. 10) Disolver el ADN en 30-50 µl de H2O mQ. 11) Incubar a 55°C 10-20 min para disolver. Observar a contraluz la disolución del ADN. Preparación de la dilución de las muestras de ADN En la preparación de la master mix se necesita que 400ng de ADN estén contenidos en 5µl de agua bidestilada estéril. A partir de la cuantificación de ADN. Complete esta tabla con sus datos, muestras 1-15: Muestra A260 Ejemplo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0,028 Acido Nucléico µg/ml (A260.50.100) 140 0,4 µg están en… (n µl) µl de H2O (5-n) 2,85 µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl µl (5µl -2,85µl) = 2,15 6 II-RFLP-PCR: DETERMINACION DEL ALELO DUARTE EN GALACTOSEMICOS: MUTACIÓN N314D EN EL EXÓN 10 DEL GEN GALT (GALACTOSA 1-FOSFATO URIDIL TRANSFERASA) Introducción Alelo Duarte: La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT, que da como resultado que la enzima presente una actividad alterada. Este polimorfismo es común en la población y puede pasar clínicamente desapercibido. En la mutación N314D hay una sustitución (c.940 A>G), que genera un cambio del aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico (Asp, D). El cambio N314D está asociado con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada, pero con fenotipos subclínicos diferentes: 1- En la variante D1, además del polimorfismo N314D se encuentra la mutación L218L (c.652C>T) que es una sustitución silenciosa. A los alelos que llevan tanto N314D como L218L se los conoce como alelo Los Angeles (LA) o alelo Duarte1 (D1). Estos alelos LA/D1 presentan actividad GALT normal o incluso superior a la normal (110-130% de lo normal). 2- La variante D2 está asociada con una disminución de la actividad de GALT e incluye N314D junto con tres cambios de nucleótidos dentro de los intrones. Para los alelos D2, el polimorfismo N314D es un desequilibrio de ligamiento con 3 sustituciones intrónicas (IVS-4 nt-27g>c; IVS-5 nt-24g>a y IVS-5 nt+62g>a) y una deleción de 4 pb en el promotor de GALT (las bases 116 a 119, corriente arriba del codón de iniciación metionina). Se ha sugerido que esta deleción de 4pb (-119delGTCA) en la región promotora 5’ del gen de GALT esta específicamente relacionada a una actividad reducida de la enzima. La combinación de estas dos variantes distingue Duarte 1 (D1) con una actividad relativamente normal de GALT, del genotipo Duarte 2 (D2) con actividad reducida de GALT. Para la genotipificación, varios autores consideran como genotipo D2 a los individuos con al menos una copia de N314D y al menos una copia de la deleción de 4 pb y con el genotipo D1 al individuo que presente al menos una copia de N314D y ausencia de la deleción de 4 pb. 7 La frecuencia total (D1+D2) de la mutación N314D en todo el mundo es de aproximadamente el 8-10%. Estudios realizados en gran escala (Suzuki y col., 2001) para los alelos de GALT estimaron que las frecuencias de los alelos D1 es de 2,7% y D2 es de 5,1%. Como se mencionó previamente, el alelo N314D es una mutación puntual de un cambio A por G, (cA940G) que determina un cambio de codón AAC por GAC, que codifica un cambio del aminoácido Asparagina (N) por Acido Aspártico (D) en el exón 10 del gen galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT). Este polimorfismo genera un cambio de bases que determina un sitio de corte para la enzima de restricción AvaII. AvaII GG (A/T) CC Figura 1: Exón 10 del gen GALT humano. En negrita se detalla el exón 10 del gen GALT, la flecha roja indica la mutación y la flecha negra pequeña, el sitio de corte con la enzima de restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los primers F y R. En la secuencia de reconocimiento de corte W indica A ó T. Por PCR se obtiene un producto final de 166 pb y luego del corte con la enzima de restricción Ava II, el alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 pb, mientras que el alelo normal tiene un fragmento de 166pb (ausencia de corte). 8 Figura 2: Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea 4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y líneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal. TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 DETERMINACION DEL ALELO DUARTE (MUTACIÓN N134D) PARA EL GEN GALT UTILIZANDO PCR Y POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION (PCR-RFLP) Objetivos: 1-Establecer los conceptos básicos de la técnica de RFLP-PCR. 2- Detectar por PCR seguida con digestión con enzima de restricción (AvaII) la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT. Fundamento del método: La mutación N314D genera un sitio de corte para la enzima Ava II en el exón 10 del gen GALT. Se amplificará un fragmento de 166 pb y luego se procederá a un corte con la enzima de restricción AvaII. PROTOCOLO 1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5 µl a la muestra de ADN. Necesita 400 ng de ADN genómico para esta reacción de PCR. Calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,4 µg. 2.- Rotular todos los tubos con el número de muestra que le corresponde. 3.-Identificar cuatro tubos de PCR M1, M2 y M3 y al restante con el signo (-), ya que será su Control Negativo. 9 4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco. Composición de la Master Mix: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. H2O (csp 20µl)................................ 14,75µl... .............57 µl Buffer 10X.......................................... 2,5 µl... .....…... 12,5 µl Mg Cl2 50 mM…..…..…....................... 1 µl ...... ............ 5 µl dNTPs 2,5 mM............................... 2,0µl ...... x 5 ............ 10 µl Primer Galt-10-S (25 pM/µl)....….......1 µl……... ..………... 5 µl Primer Galt-10-AS (25 pM/µl)….…..1 µl……...... ….………..5 µl Taq pol. (5 U/µl)………………………….0,25 µl ….. ………… 1,25 µl ADN ...........................400ng/5µl 5.- Preparación de la master mix. Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer. PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo. NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP anterior. En el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador. Programa de ciclado: 92°C ..............1 minuto 59°C ..............1 minuto 40 ciclos 72°C ..............1 minuto Extensión final: 72°C ................ 10 minutos 10 7.- Digestión con la enzima de restricción AvaII: En un tubo estéril agregar los siguientes reactivos en el orden indicado: H2O (csp 20 µl) 16,3 µl Buffer AvaII 10X 2 µl BSA Acetilada (10 µg/µl) 0,2 µl Producto de PCR 10 µl Mezclar suavemente con la pipeta, centrifugar por unos pocos segundos y agregar: AvaII (10 U/µl) o,5 µl Incubar a 37 ºC por 1 hora. De los 20 µl del producto de PCR: 10 µl son el producto de PCR sin corte y 10µl son usados para la digestión con la ER. Al sembrar en el gel de cada muestra se sembrará por duplicado: sin corte y con corte. Los fragmentos resultantes de la digestión se separarán en geles de agarosa al 2,5%. Electroforesis en geles de agarosa: 1-Preparar 75 ml de agarosa al 2,5 %, (1,9 g en 75 ml de buffer TAE 1X). 2-Disolver la agarosa en el horno de microondas. 3-Dejar enfriar la solución a 50ºC y agregar 3 µl de una solución stock de GelRed 10.000X (Para una concentración final de 1X). 4-Volcar en la gelera preparada con el peine. 5-Dejar solidificar. 6- Extraer el peine. 7- Agregar buffer de corrida (TBE 0,5X) en la gelera. 8- Siembra: colocar en un tubo para sembrar: 11 Producto de PCR Buffer de siembra M sin corte (-) AvaII 10 µl 3 µl M con corte (+) AvaII 10 µl 3µl 9-Realizar un spin en la centrifuga y sembrar los 13 µl por inmersión. En uno de los pocillos sembrar 5 µl de patrones de peso molecular. 10-Electroforesis: -Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder. -Aplicar un voltaje constante, a razón de 4V/ cm. -Dejar correr hasta ≅ unos 4-5 cm por lo menos desde el lugar de siembra. -Desconectar la fuente de poder. -Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida en el transiluminador. Reactivos utilizados: Buffer de corrida: TBE 0,5X Solución Madre de TBE 5X, pH=8: Tris Base …….............54 g Ac. Bórico …….......…27,5g EDTA 0,5M pH=8 .... 20 ml H2O csp …..…......…. 1000 ml Solución Stock de GelRed: 10.000X en agua. Buffer de siembra 6 X: 30% glicerol ( v/v en H2O ). 0,25 % azul de bromo fenol. Observación e interpretación de los Resultados Bibliografía: Chike Item, Brian P. Hagerty, Adolf Mühl, Susanne Greber-Platzer, Sylvia Stöckler-Ipsiroglu, and Wolfgang Strobl. 2002. Mutations at the Galactose-1-PUridyltransferase Gene in Infants with a Positive Galactosemia Newborn Screening Test. Pediatric Research. Vol. 51, No. 4, 511-516. 12 III- MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR Introducción En esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una enzima de restricción introducida por una modificación de un nucleótido en un cebador o primer. Específicamente, en esta técnica se utiliza un cebador forward (F) con un cambio puntual (GC) en la base 433 () del exón 10 del gen del CFTR. Dicho cambio artificial es vecino al sitio de mutación dF508 (recordemos que en dicha mutación hay una pérdida del triplete CTT que codifica para el aminoácido fenilalanina). La enzima MboI reconoce la secuencia (↓GATC). El cambio introducido genera un sitio de corte para la enzima MboI en el alelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción dF508, ya que debido a la ausencia del triplete no se puede completar la secuencia de reconocimiento para el corte de la enzima. En el alelo normal hay corte con la ER (+) mientras que en el alelo mutado no hay corte (-). GEN: Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10. ACCESSION GENEBANK: M55115 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=306520) 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggc[[accat ]ctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 421 taaagaaaat atcat] 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 661 721 781 ttatgtttcc tgctttaaga catttgatca gacaaacgtc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgacc[[ta agcttgca]]aa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t Figura 3: Exón 10 del gen del CFTR humano, con gris se detalla la deleción de tres pares de bases que codifica para el aminoácido fenilalanina y con flechas el sitio de corte con la enzima de restricción. Con corchetes y subrayado se indica la zona de hibridación de los primers F y R. El tamaño del producto de amplificación será 262 pb para el alelo normal y de 259 pb para el mutado. 13 Además, se eligió un cebador reverse (R) que permitiera la inclusión de un sitio de corte constitutivo para la enzima MboI, a efectos de servir como control interno de la actividad de la enzima de restricción (posición 634). Ver figura3. Luego del corte con la enzima, se observan los siguientes fragmentos para el alelo normal (N): 17 pb, 201 pb y 44 pb y para el alelo mutado (M): 215 pb y 44 pb. Sin corte con la enzima de restricción: Figura 4a: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR. Línea 1, 3 y 8 heterocigotas, 7 marcador de peso molecular 14 Con corte con la enzima de restricción: Figura 4b: Fragmentos obtenidos luego de la reacción de PCR después del tratamiento con la enzima MboI. Linea 1, 2, 5 y 6 heterocigotas, 3 homocigota normal y 4 homocigota (df508/df 508) TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 DETERMINACION DE PORTADORES PARA LA MUTACION ∆F508 DEL GEN CFTR USANDO MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR (MMPCR) Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la MM-PCR 2- Utilizar la técnica para determinar la mutación mas frecuente en pacientes con fibrosis cística. 3- Determinar la frecuencia de portadores de la mutación dF508 Fundamento del método: esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una enzima de restricción en un alelo específico, a través de la modificación de un nucleótido en uno de los cebadores. PROTOCOLO 1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos. Conclusión: el ADN de la muestra debe estar contenido en 5 µl. A partir de los 15 datos de concentración de su ADN muestra, obtenidos en el práctico anterior, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 1 µg. En el caso de que este volumen sea menor a 5 µl, llevar a volumen con agua destilada estéril. 2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. 3.-Identificar cuatro de los tubos de PCR con una M1, M2 y M3 y al restante con el signo (-), ya que será su Control Negativo. 4.- El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco. Composición de la Master Mix: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. H2O (csp 20µl)............ 11,25µl....... .............57 µl Buffer 10X..................... 2,5 µl...... .......….. 12,5 µl Mg Cl2 50 mM…..…..… 1 µl ......... ............ 5 µl dNTPs 2,5 mM............. 2,0µl ....... x 5 ............ 10 µl Primer S (25 pM/µl).... 1 µl……..... ……....... 5µl Primer S (25 pM/µl)…. 1 µl……….. ….….…. 5 µl Taq pol. (5 U/µl)………….0,25 µl ….. ..……….. 1,25 µl ADN ...............................5µl (ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) 5.- Preparación de la master mix. Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer. PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo. NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador. 16 Programa de ciclado: Preciclo: 94°C ............. 3 minutos. 95°C ..............1 minutos 50°C ..............2 minutos 72°C ..............1 minuto 35 ciclos Extensión final: 72°C ................ 5 minutos. IV- ARMADO Y CORRIDA DE GELES DE POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTES. TINCION DE GELES. OBSERVACION DE RESULTADOS E INFORME. Introducción La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para la resolución de secuencias de ADN de bajo peso molecular (entre 40 pb y 200 pb) cuya observación se dificulta en geles de menor resolución, como por ejemplo, los geles de agarosa. La técnica consiste en la elaboración de una capa fina de gel de poliacrilamida por la cual migra el ADN. Al igual que en los geles de agarosa, la migración responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y a la concentración del gel. Las secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad mientras que las más grandes quedan retrasadas. En resumen, la migración del ADN a través de los geles de poliacrilamida dependerá de: el tamaño molecular del ADN, la concentración de poliacrilamida, la conformación espacial del ADN y la corriente aplicada. La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con un colorante fluorescente, como por ejemplo, el GelRed. El GelRed fue diseñado como un colorante de reemplazo del Bromuro de Etidio en la tinción de ADN doble cadena (ds), ADN simple cadena (ss) o ARN. Este colorante posee las ventajas de ser extremadamente estable en el tiempo, NO ES MUTAGENICO NI CITOTOXICO y es seguro para el medio ambiente. Ver anexo 17 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 ARMADO, CORRIDA E INTERPRETACION DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA LA DETERMINACION DE PORTADORES PARA LA MUTACION ∆F508 DEL GEN CFTR POR MM-PCR Objetivos: 1-Conocer el fundamento y las aplicaciones de los geles de poliacrilamida para la separación de ADN. 2- Llevar a cabo los procedimientos de preparación, corrida y tinción de geles de poliacrilamida 3- Aplicar la técnica para el análisis de productos obtenidos por MM-PCR PROTOCOLO Los productos de amplificación obtenidos por MM-PCR se separarán por corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 12%. La preparación de los geles se llevará a cabo utilizando SIEMPRE guantes, ya que la acrilamida es una sustancia neurotóxica que se absorbe por la piel. 1- Se utilizará una cuba vertical para el armado de los geles. Limpiar los vidrios con detergente no iónico, enjuagar con agua común, etanol y finalmente con agua destilada. Secar. 2- Armar la cuba vertical. 3- Preparación del gel poliacrilamida al 12%: En un tubo Falcon de 15 ml medir los siguientes reactivos para la preparación de un gel de poliacrilamida: Reactivos ↓ / Concentración de poliacrilamida → 12 % Acrilamida (30%) 4 ml Agua 3,93 ml TBE 5X 2 ml Persulfato de amonio (25%) 70 µl TEMED 3,5 µl Rango de separación 40-200 pb 18 4- Cargar la solución del gel con una jeringa, colocar el peine y esperar aproximadamente 40 minutos a que el mismo polimerice. Buffer de corrida para electroforesis: TBE 0,5 X, pH 8. Preparación de las muestras a sembrar: 1.- Enumerar tantos tubos como muestras haya (incluido el control negativo). 2.- Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2 µl de buffer de siembra. El Buffer de Siembra contiene azul de bromofenol como marcador del frente de corrida (en un gel de poliacrilamida al 12%, el colorante se ubica en la posición de 20 pb). 3.- Realizar un spin. 4.- Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical, tratando de no romper los pocillos. En uno de los pocillos sembrar 2 µl de patrones de peso molecular. 5.- Correr a 100 V aproximadamente. 6.- Terminada la corrida, sacar el gel y teñir aproximadamente 10 minutos en una solución 1X de GelRed 7.- Visualizar en el transiluminador las bandas amplificadas. 8.- Interpretación de los resultados. 19 V- MAS-PCR Introducción La PCR Múltiple Alelo Especifica (MAS-PCR) es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Esta estrategia involucra la elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de corrida de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el diagnostico de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, beta talasemia y el screnning de 4 de las mutaciones más comunes para fibrosis cistica (dF508, G542X, G551D y N1303K). TRABAJO PRÁCTICO Nº 6 DETERMINACION DE LAS MUTACIONES dF508 y G542X POR PCR MULTIPLE ALELO ESPECÍFICA (MAS-PCR) Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica MAS-PCR. 2- Utilizar la técnica para la determinación de las mutaciones dF508 y G542X. Fundamento del método: En el TP se realizara el diagnóstico de las mutaciones dF508 y G542X. Cada muestra se amplifica en dos tubos: en el primer tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos normales (cebadores F: CF-W1468-N y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-N para la mutación G542X). En el segundo tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos mutados (cebadores F: dF 508 y R: CF-508 RP para la mutación dF508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-M para la mutación G542X). Primers CF-W1468-N CF-508 RP ∆F 508 Secuencia 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ 5’IVS-11 G542X-N G542X-M 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ Tipo F1 R1 F2 F3 R3 R4 20 Figura 5: Exón 10 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de hibridización de los primers F (alelos específicos) y R (común) para la detección de la mutación dF508. Figura 6: Exón 11 del gen CFTR humano, se detalla con corchetes y subrayado la zona de hibridización del primers F (común) y R (alelos específicos) para la detección de la mutación G542X. Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para el alelo normal de dF508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X (Figura 5 y 6). 21 Figura 7: Análisis de las mutaciones dF508 y G542X en el gen CFTR humano. Pacientes P1 a P4: homocigotas para los alelos normales, P5: Homocigota para el alelo normal de G542X y homocigota para la mutación dF508 y P6: Homocigota para el alelo normal de G542X y heterocigota para la mutación dF508. PROTOCOLO 1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5 µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,1 µg. 2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. 3.-Identificar ocho de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1N, M1M, M2N, M2M, M3N y M3M y a los dos restantes con el signo (-N) y (-M). 4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco. 22 Entonces se hacen dos MIX: Composición de la Master Mix NORMAL: 1. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl.......... 2. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl............ 57 µl ............. ……...… 12,5 µl 3. Mg Cl2 50 mM……………………………….. 1 µl ......... ........... 5 µl 4. dNTPs 2,5 mM..................................... 2 µl ......... x 5 ............. 10 µl 5. Primer CF-W1468-N (25 pM/µl) .......... 0,6 µl……….. ………... 3 µl 6. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl……….. …….…… 3 µl …….…….. 4 µl 7. Primer G-542-N (25 pM/µl)............... 0,8 µl……….. 8. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ……….. ............... 4 µl 9. Taq pol. (5U/µl).............…………............0,3 µl …...… …...……… 1,5 µl 10. ADN ……...............................................5µl Composición de la Master Mix MUTANTE: 11. H2O (csp 20 µl).................................. 11,4 µl......... ........... 57 µl 12. Buffer 10X...............................………….. 2,5 µl.......... ……...… 12,5 µl 13. Mg Cl2 50 mM……………………………….. 1 µl .............. ............. 5 µl 14. dNTPs 2,5 mM..................................... 2 µl ............. x 5 ............ 10 µl 15. Primer dF508 (25 pM/µl) .................... 0,6 µl……….. ….….... 3 µl 16. Primer CF-508-RP (25 pM/µl)............. 0,6 µl………. ….…… 3 µl 17. Primer G-542-M (25 pM/µl)...............…0,8 µl…… 18. Primer 5´IVS-11 (25 pM/µl) …...............0,8 µl ……… 19. Taq pol. (5U/µl).............………….............0,3 µl …...… .…….. 4 µl ............. 4 µl ………… 1,5 µl 20. ADN ……...............................................5µl 5.- Preparación de la master mix Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer. PRECAUCIONES: Trabajar SIEMPRE sobre hielo. NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 23 6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador. Programa de ciclado: Preciclo: 95°C ............. 5 minutos 95°C ..............1 minuto 60°C ............. 1 minuto 30 ciclos 72°C .............. 1 minuto Extensión final: 72°C ................ 5 minutos Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al 3%. Observación e interpretación de los Resultados VI- ARMS-PCR: GENOTIPIFICACION DE APO E Introducción APOPROTEÍNA E: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN Gen El gen de la Apo E se localiza en el cromosoma 19 (19q13.2) y tiene una longitud de 3,7 Kb. Esta agrupado con los genes de las apolipoproteínas CI, CII y CIV, y comprende cuatro exones y tres intrones. Se trata de un gen polimórfico con tres alelos codominantes (ε2, ε3, ε4), que dan lugar a seis posibles genotipos: ε2ε2, ε2ε4, ε3ε2, ε3ε3, ε3ε4, ε4ε4. Las tres isoformas que se originan a partir de los tres alelos se diferencian entre sí en 1 ó 2 aminoácidos. Los polimorfismos del gen de la Apo E, que se localizan en el exón 4, consisten en diferencias de una base en las posiciones 112 y/ó 158 (cambio de una citosina por una timina), que supone un cambio de Arginina por Cisteína. La isoforma E2 tiene una Cisteína en posición 112 y 158, E3 tiene Cisteína en posición 112 y Arginina en posición 158 y E4 tiene una Arginina en ambas posiciones, 112 y 158. 24 El ARNm tiene 1164 nt, el transcripto primario tiene 317 aminoácidos con un péptido señal de 18 aminoácidos sobre el extremo N-terminal. La apo E madura es secretada como una proteína de 299 aminoácidos. Proteína Se ha encontrado expresión de Apo E en hígado, cerebro, bazo, pulmón, glándula adrenal, ovario, riñón y músculo. La mayor producción es en hígado. Modelo de la estructura de Apo E libre de lípidos: El dominio N-terminal consiste de un manojo de 4 hélices (hélice 1, rojo; hélice 2, azul; hélice 3, verde; hélice 4, amarillo). Ver figura 8. El dominio N-terminal contiene la región de unión al receptor de LDL (R-LDL) en la hélice 4. La región de alta afinidad al RLDL requiere también la Arg172 en la región bisagra que conecta los dominios N- y C terminal. El dominio N-terminal contiene 2 posiciones polimorficas en posición 112 y 158 que distingue las 3 isoformas de Apo E. El dominio Cterminal (gris) contiene los principales elementos de unión a lipoproteínas. Figura 8: Estructura de la proteína de Apo E. 25 Tabla 1: Frecuencia de los alelos de Apo E humanas y sus diferencias Alelo Frecuencia Variación de aminoácido en Afinidad Preferencia de Desordenes alélica (%) posición: al RLDL unión a LP Asociados 112 158 Apo E2 7 Cys Cys Baja HDL HLP tipo III Apo E3 78 Cys Arg Alta HDL Desconocidos Apo E4 15 Arg Arg Alta VLDL, LDL Alzheimer, aterosclerosis Figura 9: Secuencia del exón 4 del gen de Apo E. Se denota el codón 112 y 158 que genera los polimorfismos que determinan los distintos alelos de Apo E. Se denota con corchetes el primer reverse común para los 4 primers forward ARMS. ARMS-PCR (Amplification refractory mutation system-PCR) El Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación (ARMS) por PCR usado para detección de mutaciones ha demostrado ser una herramienta de gran utilidad en la identificación de portadores y en el diagnostico prenatal de enfermedades hereditarias, puesto que permite la detección de mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, polimorfismos y otras variaciones conocidas del ADN. 26 La PCR-ARMS se fundamenta en que la amplificación del ADN será ineficiente o completamente refractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre el nucleótido del extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente nucleótido en ADN molde. Debido a que la Taq ADN polimerasa carece de actividad exonucleasa 3´ a 5´correctora, no puede corregir el error en el extremo 3´del cebador. Por lo tanto, se requiere un apareamiento de bases complementario en el extremo 3´del cebador para que la Taq ADN polimerasa pueda amplificar eficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo mayor especificidad y discriminación por parte de la enzima. De esta manera, el método ARMS permite la amplificación de alelos específicos usando cebadores especiales que se hibridan completamente al alelo deseado y no lo hacen al otro alelo debido al cambio de una base en el nucleótido 3’ terminal de los mismos. De este modo, el alelo deseado es amplificado fácilmente mientras que el otro no es amplificado o lo es escasamente. Un ensayo típico de ARMS comprende dos reacciones de PCR, donde se utilizan el mismo ADN sustrato y tres cebadores. Ambas reacciones contienen un cebador común, complementario para los dos alelos de interés, que se alinea con una secuencia invariable del ADN próxima a la mutación que va a ser detectada. El extremo 3’ del cebador común se orienta hacia la mutación. Los otros dos cebadores restantes son alelo específicos, en una de las reacciones se coloca el cebador específico para el alelo normal (WT) y en la otra se incluye el cebador específico para el alelo mutado (M). - Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el alelo WTse trata de un paciente homocigoto normal. - Si hay productos con los dos cebadores (tubo WT y tubo M) se trata de un paciente heterocigoto. - Si solo se obtiene producto con la reacción que contiene el cebador para el alelo Mse trata de un paciente homocigoto para la mutación (Figura 10). 27 Figura 10: Fundamento de ARMS-PCR. Se preparan dos mezclas de reacción separadas para PCR, una para cada mezcla de cebadores: Mezcla A: cebador para el alelo normal (color amrillo) con el cebador común (color rosa) y Mezcla B: cebador para el alelo mutado (color gris) con el cebador común (color rosa). Para incrementar la especificidad propia de los cebadores por cada alelo, además se introduce en ellos un cambio de una base adicional en el segundo al cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, de este modo se asegura que cada cebador permita únicamente la amplificación del alelo para el que su nucleótido 3’ terminal es complementario (Figura 11). Figura 11: Especificidad de los iniciadores o primers ARMS con un cambio de base adicional en el segundo a cuarto nucleótido de su extremo 3’. La doble cadena de ADN se representa con líneas azules; en una de las cadenas se hibrida el iniciador común (en rosa) y en la otra se alinea uno de los iniciadores ARMS (línea gris con el nucleótido de su extremo 3’ en verde) con o sin cambio de base adicional (letras rojas y negras), de lo que dependerá que se obtenga sólo el producto de amplificación deseado. Si la prueba de ARMS se usa para detectar una deleción o inserción no se requiere introducir ningún cambio de base adicional, ya que la mutación por si misma provee diferencia suficiente entre un iniciador y el alelo no 28 correspondiente. Por otra parte, varios iniciadores ARMS pueden ser combinados en los mismos tubos de reacción para detectar varias mutaciones o polimorfismos simultáneamente; esta modificación del método ARMS se denomina ARMS múltiple. Ventajas del método: El procedimiento tiene la ventaja de no ser radiactivo y requiere menos de 5 horas para su realización. Es una técnica sencilla, exacta, rápida y reproducible. Una desventaja del método es que solo es posible detectar mutaciones puntuales previamente conocidas para de esta manera poder diseñar los cebadores correspondientes. TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 GENOTIPIFICACION DE APO E UTILIZANDO EL SISTEMA DE MUTACIÓN REFRACTARIO A LA AMPLIFICACION POR PCR (ARMS-PCR) Objetivos: 1- Establecer los conceptos básicos de la técnica ARMS-PCR. 2- Utilizar la técnica para determinar cada uno de los alelos de apo E y el genotipo de la muestras. 3- Determinar la frecuencia del alelo Apo E2, el cual está asociado a la presencia de disbetaliproteinemia (hiperlipoproteinemia tipo III), en muestras de la población universitaria. Fundamento del método: En el presente TP hemos aplicado el concepto de ARMS-PCR para la genotipificación de Apo E. Para asegurar la especificidad de los primers, se ha introducido deliberadamente un error de apareamiento adyacente al nucleotido 3’ terminal, donde se han cambiado las G señalizadas por T (Figura 12). 29 Figura 12: Secuencia de los cebadores forward ARMS para la genotipificación de Apo E. El último nucleótido marcado en negrita denota los polimorfismos par el gen de Apo E; el penúltimo nucleótido (G) es el nucleótido que se cambia por T para aumentar la especificidad del método. El primer reverse es común a todos ellos. En las reacciones de amplificación se incorporan dos cebadores de un gen que actúa como CONTROL POSITIVO INTERNO, en nuestro caso es el gen α1antitripsina (AAT) que genera un fragmento de 360 pb. Este fragmento, que es co-amplificado con los fragmentos correspondientes a los alelos específicos, debe estar presente en todos los tubos con las muestras de pacientes. Cada muestra será procesada por duplicado (Tubo A y Tubo B). En ambos tubos se colocarán los cebadores F y R del gen control (F-AAT y R-AAT)) y el cebador R común para todos los alelos de apo E (R-ApoE). Además, el tubo A contendrá los 2 cebadores ARMS Cys: Cys 112 y Cys 158 y el tubo B contendrá los 2 cebadores ARMS Arg: Arg 112 y Arg 158. - Para el Alelo Apo E2: habrá amplificación en el tubo A de un fragmento de 588 pb ARMSCys112 y uno de 451 pb ARMSCys158. No hay amplificación en el tubo B. - Para el Alelo Apo E3: hay amplificación en el tubo A de un fragmento de 588 pb del ARMSCys112 y en el tubo B uno de 451pb del ARMSArg158. - Para el Alelo Apo E4: hay amplificación en el tubo B de un fragmento de 588 pb del ARMSArg112 y uno de 451pb ARMSArg158. No hay amplificación en el tubo A. Ver Figura 13 y Tabla 2 para la interpretación de los distintos genotipos que surjan de la combinación de estos 3 alelos. 30 Figura 13: Productos de amplificación correspondientes a los seis genotipos ApoE posibles obtenidos por ARMS-PCR. (A) y (B): es el producto de amplificación del tubo A y B, respectivamente. Tabla Nº 2: MASTER MIX A MASTER MIX B GENOTIPO Cys 112 Cys 158 Arg 112 Arg 158 Primer Forward 588 pb 451pb 588 pb 451 pb Tamaño del (ARMS) producto de amplificación + + - - 2/2 + - - + 3/3 - - + + 4/4 + + + + 2/4 - - + + 3/4 + + - + 2/3 R-Apo E común R-Apo E común Primer Reverse 31 Primers Secuencia (le cambiamos las G señaladas por T) nt Cys 112 5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GT-3’ 20 Cys 158 5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGT-3’ 21 Arg 112 5’-CGC GGA CAT GGA GGA CGT GC-3’ 20 Arg 158 5’-ATG CCG ATG ACC TGC AGA AGC-3’ 21 R-ApoE 5’-GTT CAG TGA TTG TCG CTG GGC A-3’ 22 F- AAT 5’-CCC ACC TTC CCC TCT CTC CAG GCA AAT GGG-3’ 30 R- AAT 5’-GGG CCT CAG TCC CAA CAT GGC TAA GAG GTG-3’ 30 PROTOCOLO 1.- Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de nuestra PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5 µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, obtenidos en el primer práctico, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,25 µg. 2.- Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. 3.-Identificar ocho (tres chicos por comisión y dos tubos por cada uno más dos negativo uno por cada mix) de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1A, M1B, M2A, M2B, M3A y M3B y a los dos restantes con el signo (-A) y (-B). 4.- Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX A y la Master MIX B. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco. Entonces se hacen dos MIX 32 Composición de la Master Mix TUBO A: 1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl........... ............. 62,25 µl 2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............ ……...… 12,5 µl 3. Mg Cl2 50 mM…………………… 0,75 µl ........... ............... 3,75 µl 4. dNTPs 10 mM.......................... 0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl 5. Primer Cys 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl……….. .....…........ 2 µl 6. Primer Cys 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl……….. . …….…… 1 µl 7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)…. 0,4 µl……….... …….…….. 2 µl 8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ………... ............... 2 µl 9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ……….. ............... 2 µl 10. DMSO……………………………….… 1,8 µl............. ................ 9 µl 11. Taq pol. (5U/µl).............…………...0,2 µl ……… ………… 1 µl 12. ADN .....................................5µl Composición de la Master Mix TUBO B: 1. H2O (csp 20 µl)........................ 12,45 µl........... ............. 62,25 µl 2. Buffer 10X....................………….. 2,5 µl............ ……...… 12,5 µl 3. Mg Cl2 50 mM……………………....0,75 µl ........... ............... 3,75 µl 4. dNTPs 10 mM............................0,5 µl ........... x 5 .............. 2,5 µl 5. Primer Arg 158 (50 pM/µl) ....... 0,4 µl……….. …….…... 2 µl 6. Primer Arg 112 (50 pM/µl)........ 0,2 µl……….. …….…… 7. Primer R-Apo E (50 pM/µl)….. 0,4 µl……….. …….…….. 2 µl 8. Primer F-AAT (0,5 pM/µl) …....0,4 µl ……….. ............... 2 µl 9. Primer R-AAT (0,5 pM/µl) ….....0,4 µl ……….. ............... 2 µl 10. DMSO……………………………….… 1,8 µl........... ................ 9 µl 11. Taq pol. (5U/µl).............………….0,2 µl …… …………… 1 µl 1 µl 12. ADN ......................................5µl 5.- Preparación de la master mix: Idem a las anteriores 6.- Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo preparado en el TP1. En el tubo de Control Negativo colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador. 33 Programa de ciclado: Preciclo: 95°C ............. 4 minutos 96°C ..............45 segundos 66°C ..............45 segundos 35 ciclos 72°C ..............45 segundos Extensión final: 72°C ................ 5 minutos Los fragmentos resultantes de la digestión se separan en geles de agarosa al 2,5%. Observación e interpretación de los Resultados 34