EMPLEO DE CULTIVO INICIADOR PARA LA PRESERVACIÓN DE UN PRODUCTO CÁRNICO FRESCO Yamira Cepero*, Tatiana Beldarraín, Aster Bruselas, Norma Vergara, Yamilé Moya y Frank Rodríguez Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia Carretera al Guatao km 3½, La Habana, Cuba, C.P. 19 200 RESUMEN ABSTRACT El objetivo del presente trabajo fue determinar la durabilidad de un producto cárnico fresco empleando cultivo iniciador. Se elaboraron butifarras frescas con y sin cultivo iniciador que se almacenaron a temperaturas entre 4 y 8 ºC. Se evaluaron las principales propiedades industriales de 4 cultivos iniciadores para seleccionar el cultivo iniciador. Se evaluó el proceso de fermentación de la carne a dos niveles para determinar la dosis de adición del cultivo. Se realizaron determinaciones físico-químicas, microbiológicas y sensoriales de los productos. Se seleccionó el cultivo iniciador Lactobacillus casei a 2 % para su uso como bioconservador en la butifarra fresca. La durabilidad de la butifarra fresca a temperaturas entre 4 y 8 ºC empleando Lactobacillus casei como biopreservante fue de 21 días. Palabras clave: embutidos, durabilidad, fermentación, cultivos iniciadores, lactobacillus casei, biopreservativos. Use of starter culture for the preservation of a fresh meat product The objective of the present work was to determine the fresh meat product shelf-life using a starter culture. Fresh sausages with and without starter culture were elaborated and stored to temperatures between 4 and 8 ºC. The major industrial properties of 4 starter cultures were evaluated to select a starter culture. The meat fermentation at two levels was evaluated to determine the addition quantity of starter culture. Physicochemical, microbiological and sensory determinations of products were carried out. The starter culture Lactobacillus casei at 2% was selected for its use as biopreservante in the fresh sausage. The shelf-life of the fresh sausage at temperatures between 4 and 8 ºC using Lactobacillus casei like biopreservante was 21 days. Key words: sausages, shelf life, fermentation, starters, lactobacillus casei, biopreservatives. INTRODUCCIÓN *Y Betancourt: Ingeniera Química (Instituto Superior Yamira Cepero Betancourt Politécnico José Antonio Echeverría, 2000). Investigador Aspirante. Trabaja en la Planta Piloto de carne. Sus principales líneas de trabajo son calidad y clasificación de canales; tecnología de sacrificio de res y cerdos; obtención y utilización de subproductos; evaluación de rendimientos de cerdo, calamar, pollo y jurel; implementación de producciones más limpias en la industria cárnica y elaboración de productos cárnicos. 58 Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 La bioconservación mediante la adición de un licor de fermentación o cultivos iniciadores es una de las vías que se han estudiado y desarrollado más ampliamente con el objetivo de lograr procesos reproducibles y productos con la calidad deseada y duradera. En general, las propiedades más importantes que se definen para estos cultivos son: una elevada actividad acidificante comprendida en el intervalo de 0,78 y 1,8 % en ácido láctico y una población elevada entre 106 y 109 UFC/ g de cultivo iniciador (1,2). En productos frescos no es común adicionar cultivos iniciadores porque el gusto resultante podría ser demasiado ácido. En este sentido hay que considerar como primer paso seleccionar un cultivo que produzca poco ácido láctico y que tenga la capacidad antagónica frente a patógenos alimentarios para que funcione como un bioprotector o bioconservador en el alimento (2). Los productos cárnicos frescos poseen una corta vida de anaquel en refrigeración. Los productores industriales de nuestro país buscan conservarlos aplicando otros métodos sin tener que recurrir a la congelación, porque durante su distribución es imposible continuar la cadena de frío y debido, además, a las nuevas tendencias del mercado de consumir alimentos de forma segura que conserven su aroma natural y fresco. Por ello, el objetivo del presente trabajo fue determinar la durabilidad de un producto cárnico fresco empleando cultivo iniciador. MATERIALES Y MÉTODOS Para seleccionar el cultivo iniciador se evaluaron, a escala de laboratorio, las principales propiedades industriales (producción de acidez y población celular) de 4 cultivos iniciadores: C1 (mezcla de Staphylococcus carnosus-Leuconostoc pentosus), C3 (mezcla de Staphylococcus carnosusPediococcus pentasaceus), F4 (mezcla de Staphylococcus carnosus-Lactobacillus plantarum) y Lc (Lactobacillus casei). La producción de acidez se determinó inoculando los cultivos en frascos Enlenmeyer con 20 mL de caldo glucosado (OXOID) que se incubaron a 37 ºC. La acidez se midió a las 0, 24, 48, 72 y 96 h, expresándose los resultados en porcentaje en ácido láctico (3). Paralelamente se realizaron mediciones de pH por potenciometría (4). Se realizaron 3 réplicas por cada cultivo. Para determinar la población celular se utilizó el método de las diluciones en agua peptonada a 0,1 % y siembra en placa vertida con doble nivel. Se realizaron diluciones hasta 109 y se empleó el medio agar para conteo en placas. Las placas se incubaron 3 días a 37 ºC. Los resultados se expresaron como UFC/mL de cultivo. Se realizaron 3 réplicas por cada cultivo. La dosis de adición del cultivo iniciador se determinó evaluando los dos niveles más utilizados en el proceso de fermentación de la carne a temperaturas entre 4 y 8 ºC (1,5). Se inoculó el cultivo a 1 y 2 % en frascos Enlenmeyer que contenían carne de cerdo molida a la cual se le adicionaron 1,8 % de sal común, 0,25 % de sal de cura y 1 % de glucosa. Se determinó pH y acidez al inicio y a los 3 días de incubación (3,4). También se analizó la población celular del cultivo al inicio del proceso. Paralelamente se evaluó la carne sin inocular. Se realizaron 3 réplicas experimentales en cada prueba. La selección del cultivo iniciador y su dosis de adición se realizó sobre la base de que debía ser débil acidificante, es decir, producir valores de pH por encima de 4 y de acidez entre 0,76 y 0,92 % para que funcionara como un bioconservador en el producto (5). Con vistas a conocer el efecto del cultivo seleccionado en la durabilidad de un producto cárnico fresco, se elaboró una butifarra fresca empleando el cultivo iniciador (Lc1) y la formulación patrón (Patrón). La elaboración de los productos se llevó a cabo en planta piloto. Se elaboraron 3 lotes diferentes de 10 kg que se almacenaron a temperaturas entre 4 y 8 ºC con humedad relativa de 95 ± 4 % para la prueba de almacenamiento. Se siguió el procedimiento siguiente para el desarrollo de los productos. Las carnes congeladas, después de molidas por un disco de 13 mm de diámetro, se mezclaron con las sales, los condimentos y el cultivo iniciador durante 10 min. hasta obtener una masa mezclada homogénea. El cultivo se inoculó con una concentración de 10 9. Las masas elaboradas se embutieron en tripa de celulosa de 34 mm logrando piezas con un peso aproximado entre 75 y 100 g. Las piezas se colgaron en varillas a razón de 30 piezas por varilla. Los productos recién elaborados se caracterizaron desde el punto de vista físico-químico, microbiológico y sensorial. Las determinaciones físico-químicas realizadas fueron: pH (4), humedad (6), cenizas (7), proteína (8), grasa (9), cloruro de sodio y nitrito (6). Los análisis microbiológicos realizados fueron: conteo total de aerobios mesófilos (CTAM) (agar para conteo en placas, 37 ºC, 48 h), conteo de hongos (CH) y levaduras totales (CL) (agar extracto de malta con 0,2 % de ácido láctico, 30 ºC, 5 a 7 días), conteo de microorganismos psicrófilos (CPs) (ACP, 4 a 6 ºC, 7 días) y presencia de Salmonella (agar cromocen AGN, 37 ºC, 18 a 24 horas). La evaluación sensorial se realizó con un grupo de jueces Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 59 experimentados de 12 miembros donde se analizaron los atributos de textura, aspecto y sabor mediante una escala de calidad de 7 puntos (1 pésimo 7 excelente) de las butifarras que previamente se sumergieron en agua hirviendo durante 7 a 10 min, se dejaron refrescar y se frieron en aceite caliente durante 1 a 2 min. Las muestras se sirvieron a temperatura ambiente entregándole a cada juez una butifarra identificada. Para determinar la durabilidad de los productos en refrigeración, se empleó un diseño parcialmente escalonado y se tomó como unidad experimental 14 butifarras de cada variante (10). Se aplicó el método de “aceptación o rechazo” simple acorde al diseño experimental con un grupo de 12 jueces experimentados. Si los jueces marcaban la muestra como rechazable debían indicar en qué consistía el deterioro apreciado, para poder tener conocimiento de la vía de deterioro que se manifestaba. Paralelamente las variantes fueron analizadas mediante determinaciones analíticas según el diseño experimental: pH, CTAM y CPs. Los resultados obtenidos en las evaluaciones sensoriales se procesaron como “datos incompletos de fracaso” por el método de ploteo de riesgos, admitiendo 5 % de unidades deterioradas (11). Para determinar la durabilidad se tomó como criterio de fracaso la coincidencia en este dictamen con el número mínimo significativo de jueces dado por una distribución binomial con p=0,01 y se seleccionó el límite inferior para aumentar el margen de seguridad. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La Tabla 1 muestra los resultados obtenidos en las evaluaciones realizadas para seleccionar el cultivo iniciador. Se observó un rápido descenso del pH en todas las cepas. Esta caída puede estar determinada fundamentalmente por la interacción entre el ácido láctico formado a partir de los carbohidratos de la glucosa añadida (12). Como puede apreciarse en la tabla todas las cepas alcanzaron valores de pH finales por encima de 4, donde los de las cepas Lc y C3 fueron los más bajos logrados. Los resultados del valor de pH concordaron con los valores de acidez alcanzados en las cepas aunque solo L. casei (Lc) alcanzó un valor dentro del rango recomendado para la utilización de cultivos iniciadores como bioconservadores. En relación a la viabilidad, se puede afirmar que el proceso de cultivo y concentración practicado fue eficaz debido a que al ser inoculados se alcanzaron valores finales entre 107 y 108 UFC/mL, esta población celular garantiza un proceso de fermentación adecuado en la carne (1). Tabla 1. Principales propiedades industriales de los cultivos iniciadores evaluados t=0 C.I. pH Ac. 6,9 0,2 C1 (0,01) (0,01) 6,9 0,2 C3 (0,01) (0,01) 6,9 0,2 F4 (0,01) (0,01) 6,9 0,2 Lc (0,01) (0,01) C.I.: cultivo iniciador ( ): Desviación estándar 60 t=24 h t=48 h t=72 h pH Ac. pH Ac. pH Ac. 4,23 0,65 4,33 0,60 4,16 0,70 (0,32) (0,01) (0,18) (0,01) (0,02) (0,06) 4,05 0,66 3,99 0,75 4,05 0,60 (0,01) (0,01) (0,01) (0,01) (0,01) (0,01) 4,10 0,67 3,99 0,70 4,00 0,59 (0,01) (0,01) (0,01) (0,01) (0,01) (0,06) 4,16 0,60 4,38 0,66 4,18 0,76 (0,08) (0,06) (0,06) (0,06) (0,03) (0,06) Ac.: Acidez expresada en porcentaje de ácido láctico Lc: Lactobacillus casei. Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 t=96 h pH 4,39 (0,1) 4,00 (0,01) 4,03 (0,06) 4,00 (0,01) Ac. 0,56 (0,12) 0,57 (0,05) 0,60 (0,03) 0,65 (0,06) Viabilidad (UFC/mL) 1,01 x 108 9,97 x 10 7 1,83 x 10 8 2,23 x 10 8 Todas las cepas presentaron propiedades industriales propias de cultivos débiles acidificantes, sin embargo se seleccionó la Lc para su uso en el producto fresco como bioconservador, porque además de que alcanzó un valor de pH final por encima de 4 y su producción de acidez fue la única que se acercó al rango recomendado para la inhibición de microorganismos indeseables, se conoce que, esta cepa no es lipolítica, lo que favorece que no se liberen determinadas sustancias en el producto que provocan afectaciones en su calidad organoléptica (12). También tiene una mayor capacidad de desarrollo a altas concentraciones de sales en comparación con las otras cepas (13). La Tabla 2 presenta que en el proceso de fermentación de la carne se evidenció que la dosis de adición más efectiva es a 2 %, este resultado concordó con los informados por otros autores en la literatura especializada (1,5,12-14). En el medio cárnico, la cepa en ambas dosis de adición mostró un descenso de pH rápido y por encima de 4. No obstante, con la mayor dosis empleada se logró el pH final más bajo, esto es lógico porque el aumento de la cantidad de cultivo iniciador en el medio facilitará que compita con la flora espontánea presente en la carne. Similares resultados se obtuvieron en la producción de acidez. En este caso los valores concordaron con los establecidos por la literatura especializada lo que puede estar asociado a la presencia de carbohidratos en la carne que favorecieron el proceso de fermentación (5). Tal afirmación es válida si se toma en consideración que la glucosa se añade al medio con el objetivo de proporcionarle al cultivo iniciador un azúcar fácilmente fermentable para que pueda comenzar su rápida multiplicación (12). En el medio cárnico, el proceso de cultivo y concentración practicado también fue bueno debido a que se alcanzaron valores de viabilidad del cultivo iniciador según los recomendados. Las Tablas 3, 4 y 5 muestran los resultados de la caracterización de las butifarras al inicio del estudio de conservación. Como expresa la Tabla 3, los valores de pH están en el rango permitido para este tipo de producto (15). Los valores de proteína y grasa obtenidos en las butifarras permiten afirmar que se logró una buena estandarización de la materia prima cárnica utilizada en cada lote, lo que proporcionó que presentaran parámetros nutricionales de proteína y grasa característicos de este tipo de producto. En cuanto al contenido de humedad, cloruro, cenizas y nitritos, también se encontraron dentro de las especificaciones para productos crudos frescos. Tabla 2. Valores de pH, acidez y viabilidad del cultivo iniciador (log10 UFC/g) en el medio cárnico Carne sin inocular Lc a 1% Lc a 2% ( ): Desviación estándar Lc: Lactobacillus casei. pH 5,7 (0,01) 5,7 (0,01) 5,7 (0,01) t= 0 Acidez (%) 0,5 (0,25) 0,5 (0,25) 0,5 (0,25) Viabilidad 7,95 8,12 t= 3 días pH Acidez (%) 6,15 (0,03) 0,92 (0,07) 5,20 (0,03) 0,87 (0,01) 5,06 (0,02) 0,96 (0,07) Tabla 3. Valores medios de la caracterización físico-química de los productos al inicio del experimento Grasa Proteína (%) (%) Patrón 6,16 9,7 (0.5) 17,5 (0,5) Lc 6,00 9,3 (0,05) 15,0 (0,3) ( ): Desviación estándar. Variante pH Cenizas (%) 2,3 (0,1) 2,3 (0,4) Humedad (%) 68,0 (2,4) 68,5 (2,5) Cloruros (%) 1,9 (0,2) 2,3 (0,2) Nitritos (%) 111,2 (2,2) 71,1 (3,6) Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 61 La Tabla 4 refleja que los conteos microbiológicos obtenidos para las variantes al inicio del estudio, están dentro de los límites permisibles, independientemente de los valores iniciales de pH obtenidos. También se observó que los productos se encontraron exentos del microorganismo patógeno Salmonella. Todos estos resultados indican que las butifarras tuvieron una buena calidad microbiológica. Asimismo, desde el punto de vista sensorial, las butifarras al inicio del experimento presentaron buena calidad donde la calificación de los atributos aspecto, textura y sabor oscilaron entre bueno y muy bueno (5,9 a 6,3) (Tabla 5). En cuanto a los resultados obtenidos en las pruebas de aceptación-rechazo en la conservación, para el patrón, los jueces comenzaron a rechazar los productos por la aparición de un sabor ácido atípico, olor ácido y rancio en algunos casos, lo que pudo deberse a la acción de bacterias ácido-lácticas así como a la oxidación de las grasas de la carne de tercera. En el caso del producto con cultivo, los jueces rechazaron el aspecto debido a untuosidad, olor ácido y cambio de coloración del producto. La prueba de bondad de ajuste de KolmogorovSmirnov indicó que en todos los casos la distribución probabilística de los tiempos de fallos puede ser descrita por la ley de Weibull. La Tabla 6 indica las variantes estudiadas de durabilidades de butifarra fresca tomando el límite inferior para un percentil de 5 %. Tabla 4. Valores medios de los resultados microbiológicos del producto terminado al inicio del experimento (log10 UFC/g) Variante CTAM CL CH CPs Patrón 3,88 2,28 1.00 4,30 Lc 5,82 3,3 1,00 3,90 CTAM: conteo total de aerobios mesófilos CH: conteo de hongos CL: conteo de levaduras totales CPs: conteo de microorganismos psicrófilos. Salmonella Neg. 25g Neg. 25 g Tabla 5. Resultados de la evaluación sensorial de los productos al inicio del estudio Variante Patrón Lc Aspecto 6,0 5,9 Textura 6,0 6,0 Sabor 6,3 5,9 Tabla 6. Tiempo de durabilidad (días). Valores del percentil 5 % para las butifarras frescas (n=3) Variante Patrón Lc 62 Valor Medio (días) 6,4 23,1 Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 Límite Inferior (días) 4,7 21,7 Límite Superior (días) 8,6 24,6 El pH inicial de los productos estuvo por encima del óptimo, debido a su valor en las materias primas cárnicas empleadas, sin embargo, esto no impidió el normal descenso del mismo durante el estudio de conservación. La Fig. 1 muestra los cambios ocurridos de pH de las variantes estudiadas. En el patrón la acidificación como resultado de la caída de pH ocurrió con mayor celeridad que en la variante con cultivo. En esta última la curva de pH mostró un decrecimiento paulatino en el tiempo. Los valores iniciales descendieron desde 6,0 hasta 5,9 en los primeros 5 días, esto puede estar relacionado con el consumo de sustrato por el cultivo iniciador y bajas concentraciones de ácido láctico; continuó descendiendo progresivamente hasta alcanzar un valor mínimo de 5,3. Este período final está en correspondencia directa con un mayor incremento en la producción de ácido láctico. Este resultado corrobora que se trabajó con un cultivo débil acidificante y que se adaptó satisfactoriamente en la masa del embutido. Se observó un efecto del cultivo iniciador como biopreservante al presentar un mejor comportamiento. La Fig. 2 muestra los valores medios del logaritmo de los conteos totales de microorganismos aerobios mesófilos. Como se puede observar los conteos microbianos aumentan con respecto al tiempo en el caso de las dos variantes, sin embargo, este comportamiento es marcado en el patrón donde el crecimiento de microorganismos alcanza la fase aceleración en un intervalo menor de tiempo, lo que podría deberse a que en esta variante no se utilizó ningún método de conservación drástico y por lo tanto es más susceptible al ataque microbiano. La Fig. 3 muestra el promedio del logaritmo de los recuentos totales de microorganismos psicrófilos. En el patrón, el crecimiento siempre va en aumento y con una pendiente cercana a 1; mientras que en Lc2 se puede observar la presencia del factor de inhibición con un crecimiento más lento. 6,40 6,00 pH Patrón Lc 5,60 5,20 0 5 10 15 20 25 30 35 Tiempo (días) Fig 1. Variaciones del pH durante el estudio de conservación de la butifarra fresca. Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 63 7,00 Prom. log UFC/g 6,00 Patrón Lc 5,00 4,00 3,00 0 10 20 30 Tiempo (días) Fig. 2. Valores medios de los conteos totales de microorganismos aerobios mesófilos obtenidos durante el estudio de conservación de la butifarra fresca. 7,00 Prom. log UFC/g 6,00 5,00 Patrón Lc 4,00 3,00 0 10 20 30 Tiempo (días) Fig. 3. Valores medios de los conteos de microorganismos psicrófilos obtenidos durante el estudio de conservación de la butifarra fresca. 64 Ciencia y Tecnología de Alimentos Vol. 18, No. 1, 2008 CONCLUSIONES Se seleccionó el cultivo iniciador Lactobacillus casei a 2 % para su uso como bioconservador en la butifarra fresca. La durabilidad de la butifarra fresca a temperaturas entre 4 y 8 ºC empleando Lactobacillus casei como biopreservante fue de 21 días. REFERENCIAS 1. Fernández, M.; Valladares, C.; Herrera, H.; Fernández, C. y Ramos, R. Caracterización de cultivos iniciadores para la elaboración de embutidos. 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