práctica 1. extracción, separación y cuantificación de

INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE CALKINI EN EL
ESTADO DE CAMPECHE
PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE
PIGMENTOS VEGETALES
El estudio de los compuestos biológicos implica su extracción y separación del
material (célula, tejido, órgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes
más utilizados para este propósito consiste en el uso de técnicas de cromatografía
(proceso de separación de mezclas complejas mediante particiones entre una fase
fluida móvil y una fase estacionaria). Otra técnica es la de separación por reparto
entre disolventes inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en
función de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles.
Como aplicación de estas dos técnicas, en el desarrollo de esta práctica se
extraerán 4 tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas.
Todos ellos tienen carácter apolar, qunque su graod de polaridad varía en función
de su composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde
el más apolar al menos apolar.
Esta propiedad permite su separación, y su distinto color su identificación.
Su color permite también su cuantificación por técnicas espectrofotométricas.
Finalmente, mediante métodos polarográficos, con la ayuda de un oxímetro
(electrodo de oxígeno), se medirá el desprendimiento fotosintético de O 2 en un
cultivo de cianobacterias (microalgas verde-azuladas).
1.- Separación por reparto en disolventes inmiscibles
Los pigmentos vegetales se extraerán en medio líquido (etanol) con calor, y
se separarán utilizando disolventes inmiscibles de distinto grado de polaridad.
Práctica
En las mesas hojas de espinaca, distintos disolventes y embudos de
decantación para separar fases inmiscibles.
Método:
1. Extracción: trocear la hoja de espinaca. Introducir los trozos en un tubo de
ensayo de calibre grueso y añadir 10 mL de etanol. Taparlo con algodón y
calentarlo al baño ‘María’ durante aproximadamente 5 min (retirarlo cuando
el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol con los
pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo.
2. Separación:
-
Añadir al embudo de cdecantación (con la llave cerrada) 5 mL de
gasolina.
-
Tomar 5 mL de extracto de pigmentos y añadirlos sobre el embudo
de decantación. Se formarán dos fases (A y B)
A
B
-
Añadir 2 mL de agua (o más, hasta que la fase inferior quede sin
pigmentos).
-
Desechar la fase inferior (B).
-
Añadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarán dos
fases (C y D).
C
A
-
D
Recoger ambas fases en sendos tubos de ensayo (usar un tubo de
ensayo largo para la fase C)
-
Añadir al tubo con la fase C 2 mL de KOH-metanólica 30% (p/v) y
agitar bien durante 2 min. Se formarán dos fases (E y F).
E
C
Cuestiones:
1. ¿Qué contiene cada una de las fases?¿Por qué esa distribución?
2. ¿Cómo se separarían los pigmentos de la fase D?
3. Cuantificación de clorofila a
Los pigmentos fotosintéticos tienen capacidad de absorber distintas
longitudes de onda dentro del espectro de luz blanca. Cada pigmento tendrá un
máximo de absorbancia característico en una l determinada. Midiendo en una
mezcla la DO a la l correspondiente a un pigmento determinado, se podrá calcular
la cantidad del mismo en dicha mezcla.
Práctica
La clorofila a presenta un máximo de absorbancia a 665 nm. Utilizando
técnicas espectrofotométricas, se cuantificará la cantidad de clorofila a presente
en el extracto de pigmentos de hoja de espinaca en etanol obtenido en la primera
parte de la práctica. Para ello, se aplicará la fórmula de Marker.
[clorofila a]g.mL-1 = D.O.665 nm x 13,14
Método
1. Tomar 0.3 mL del extracto etanólico de pigmentos y añadir 2.7 mL de etanol
2. Medir la DO a 665 nm utilizando etanol como blanco
Cuestiones
1. Calcular la concentración de clorofila a en el extracto inicial de la hoja de
espinaca.
2. ¿Cuántos mg de clorofila a se han extraído de la hoja de espinaca?
3. ¿Se han extraído todos los pigmentos?
4. ¿Qué es 13,14 en la fórmula de Marker?
5. ¿Interfieren el resto de pigmentos en la determinación de clorofila a?