Anexo I -Manejo del Espectrofotómetro Jenway

TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
TP. ESPECTROFOTOMETRÍA/
Versión 4.3/
MODULO 4/
CÁTEDRA DE FÍSICA/
FFYB/
UBA/
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
TRABAJO PRÁCTICO DE ESPECTROFOTOMETRÍA
El TP de Espectrofotometría se realizará en dos días consecutivos.
Es importante comprobar siempre previo a su uso, si un equipo funciona adecuadamente. Por esta razón, el
primer día se realizarán los controles de los equipos.
El segundo día se utilizarán los mismos equipos para determinar la concentración de proteínas en una
muestra desconocida mediante el uso de una técnica espectrofotométrica específica para proteínas.
Además se observarán mediante el uso del espectroscopio, espectros de absorción en el visible de
soluciones coloreadas en presencia de luz blanca y también se realizará el barrido espectrofotométrico de
dos colorantes y de una mezcla de ambos.
Los grupos de trabajo deberán identificar el espectrofotómetro utilizado (cada aparato está rotulado con
un número), dado que usarán el mismo equipo el segundo día del trabajo práctico.
Para comprender el fundamento de las metodologías a usar durante el TP es importante leer
detenidamente la Guía de Fundamentos de Espectrofotometría y la Guía de Fundamento de
Espectroscopía.
Para profundizar el estudio acerca del funcionamiento de un espectrofotómetro leer el
Anexo Espectrofotometría.
Ir
Ir
Ir
Para familiarizarse con el uso del instrumental del TP recomendamos ver los videos
“Espectrofotometría” y “Espectroscopías” disponibles en el campus virtual.
Ir
USO DEL ESPECTROFOTÓMETRO
En el trabajo práctico utilizarán espectrofotómetros digitales, marca Jenway 6300 (Figura 1). Estos equipos
permiten variar la longitud de onda (λ) entre 320 y 1000 nm.
Teclas de selección
de T, abs y λ.
Pantalla
Tecla de
calibración
Tapa móvil,
cierra el
recinto donde
se coloca la
muestra a
medir
Cátedra de Física-FFYB-UBA [2]
Ir
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
Figura 1
INSTRUCCIONES
1. Encendido del equipo: Una vez que se encuentre ubicado en el lugar donde se lo va a utilizar,
conectar el mismo a la red eléctrica (220V) y encenderlo apretando la tecla encendido que se
encuentra en la parte posterior del equipo (figura 2). Esperar 10 minutos hasta que se estabilice.
Tecla de
encendido
Cable y
enchufe
Figura 2
2. Selección del modo de trabajo: Los espectrofotómetros permiten trabajar en modo absorbancia
(Abs) o transmitancia % (T%). Para seleccionar el modo deseado presionar la tecla lateral
correspondiente. El modo de trabajo seleccionado aparece marcado con una flecha en la parte
inferior de la pantalla de lectura (Figura 3).
Modo de
trabajo
Teclas
laterales
Figura 3
3. Selección de la longitud de onda: Apretar las teclas de selección de longitud de onda hasta obtener
el valor numérico deseado. En la pantalla aparece la longitud de onda en nm (Figura 4) Estos equipos
permiten variaciones de 1 nm.
Longitud de
onda (nm)
Selector de
longitud de
onda
Cátedra de Física-FFYB-UBA [3]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
Figura 4
4. Puesta a cero: en una cubeta de medida colocar el blanco (que puede ser agua o solvente
dependiendo de la experiencia). Abrir la tapa del equipo y colocar la cubeta en el porta-cubeta,
luego cerrar la tapa. Presionar la tecla CAL y esperar (figura 5). Aparecerá en el visor la lectura 0,000
de absorbancia ó 100 % de transmitancia, según el modo de trabajo seleccionado. Una vez realizada
la puesta a cero retirar la cubeta con el blanco. La puesta a cero deberá realizarse cada vez que se
modifique la longitud de onda.
Tecla CAL
Figura 5
5. Medida de la absorbancia de la muestra: Luego de retirar la cubeta con el blanco, colocar la cubeta
con la muestra a medir y cerrar la tapa del espectrofotómetro. Aparecerá en el visor el valor de Abs
o T% de la muestra. Registrarlo.
PARTE 1 / CONTROLES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
OBJETIVO
Realizar los siguientes controles a los espectrofotómetros:
1- Luz espuria
2- Volumen mínimo
3- Cubetas
4- Centro de Banda
5- Linealidad fotométrica
6- Veracidad
7- Precisión
MATERIALES

1 Espectrofotómetro Jenway 6300

3 cubetas para espectrofotómetro
Cátedra de Física-FFYB-UBA [4]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA

1 cubeta de obstrucción para control de luz espuria

1 Gradilla

8 tubos de vidrio

Pipetas de 5 y 10 mL

2 vasos de precipitado

Solución de rojo congo llamada solución madre o SM (cc = 80 mg/l): 10 ml. Para el control de
linealidad fotométrica.
Solución de rojo congo llamada solución de trabajo o ST (40 mg/l): 10 ml. Para el resto de los
controles.
Solución de referencia de Cloruro de Cobalto para el control de veracidad y precisión.


PRECAUCIONES
Para el buen desarrollo del TP es esencial prestar especial cuidado en el manejo de las soluciones, se debe
mantener el valor del pH de las mismas y evitar que se contaminen. Para ello recomendamos:
- Utilizar material limpio o lavarlo bien antes de comenzar a trabajar, sobre todo tener especial
atención cuando se dispense la solución madre en el recipiente de trabajo.
- No pipetear directamente del frasco que contiene la solución madre.
- No usar el mismo material volumétrico para dispensar diferentes soluciones sin haberlo lavado bien
previamente.
- Si bien no se trabaja con material biológico que pueda ser peligroso desde el punto de vista
sanitario, utilizar guantes para evitar el contacto de los reactivos con las manos dado que éstos
pueden tener un pH alto o las soluciones coloreadas manchar la piel.
PROCEDIMIENTO
1 - Control de luz espuria
Para realizar este control se puede trabajar a cualquier longitud de onda, aquí la fijaremos en la región en
que va a ser usado el equipo (se trabajará alrededor de los 500 + 10nm).
i)
ii)
iii)
iv)
Seleccionar la opción transmitancia en el display del equipo.
Fijar el selector de longitud de onda en 500 nm.
Colocar 3 mL de agua en una cubeta de medida y poner a cero el equipo con la tecla CAL (T% =
100%) Retirarla.
Colocar la cubeta de obstrucción (cubeta pintada de negro) y registrar el valor de T % obtenido.
El valor de T% registrado representa directamente el porcentaje de luz espuria. Informar dicho valor. Se
consideran como aceptables valores de hasta el 1% de luz espuria.
2 - Control de volumen mínimo
i)
ii)
Seleccionar la opción absorbancia (Abs) en el display del equipo.
Fijar el selector de longitud de onda en 500 nm.
Cátedra de Física-FFYB-UBA [5]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
iii)
iv)
v)
vi)
vii)
Llenar con agua una cubeta de medida y llevar a cero el equipo. Retirarla.
Colocar en otra cubeta 0,5 mL de ST (solución de trabajo) y medir la Abs de la misma.
Repetir este procedimiento agregando alícuotas de 0,5 mL hasta llegar a 2,0 mL y luego alícuotas de
0,2 mL hasta un volumen final de 3,0 mL.
Registrar las Abs medidas para los distintos volúmenes.
Graficar Abs medida en función del volumen de solución en la cubeta.
Determinar el volumen mínimo, como el volumen a partir del cual la Abs se mantiene constante y luego,
calcular el volumen de trabajo. Ver “volumen de trabajo” en Guía de Fundamentos de Espectrofotometría.
Trabajar de ahora en adelante, con un volumen igual o superior al volumen de trabajo en las cubetas de
lectura.
3- Control de cubetas
i)
ii)
iii)
iv)
v)
Seleccionar en el equipo el modo T%.
Fijar el selector de longitud de onda en 500 nm.
Colocar en la cubeta de medida un volumen adecuado de agua (teniendo en cuenta el volumen de
trabajo calculado anteriormente) y llevar a T% = 100%. Retirar la cubeta. Ésta será la cubeta de
referencia.
Proceder de igual manera con todas las cubetas que se quieran utilizar y comparar la T% leída en
cada una de ellas con la de la cubeta de referencia.
Para poder utilizar indistintamente las cubetas, la diferencia de T% entre ellas debe ser menor o igual al 1%.
Informar los valores de T% obtenidos para las distintas cubetas e indicar si podrán ser utilizadas o no
indistintamente.
4 - Control de centro de banda
Se realizará un barrido espectral de la solución de trabajo de rojo congo para ello:
i)
Cargar una cubeta con agua.
ii)
Cargar otra cubeta con la solución de trabajo.
iii)
Con el selector de longitud de onda fijar diferentes valores de λ de trabajo. Para dicha
selección, proceder como se indica a continuación:
a)
b)
c)
d)
e)
iv)
v)
entre 400 y 480 nm cada 20nm
entre 480 y 490 nm cada 5nm
entre 490 y 510 nm cada 2nm
entre 510 y 540 nm cada 10nm
entre 540 y 600 nm cada 20nm
Para cada  seleccionada llevar a 0.000 de Abs con la cubeta con agua.
Medir la Abs del rojo congo a las distintas λ seleccionadas y registrar dichos valores
Cátedra de Física-FFYB-UBA [6]
Ir
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
vi)
vii)
viii)
Graficar Abs de rojo congo en función de la longitud de onda.
Determinar gráficamente la longitud a la cual la absorbancia es máxima.
Comparar el valor obtenido con el valor teórico de la solución de rojo congo (498 nm).
Se considera como aceptable un corrimiento de +/- 5 nm respecto del valor de referencia. En caso de que la
diferencia entre la lectura y el valor de referencia se encuentre dentro de dicho rango, la misma puede ser
considerada como error sistemático.
Elección de la  óptima de trabajo para rojo congo
A partir del gráfico de Abs = f (), seleccionar para el colorante su  óptima de trabajo. Este valor será
empleado en los controles subsiguientes. Tener en cuenta los criterios de selección, para ello ver “Elección
de longitud de onda óptima de trabajo” en Guía de Fundamentos de Espectrofotometría.
5 - Control de linealidad fotométrica
i)
A partir de la SM de rojo congo de concentración conocida (su valor figura en el rótulo de la botella)
a la que llamaremos 100%, preparar diluciones para obtener soluciones de las siguientes
concentraciones (% V/V): 75%, 50%, 25% y 12,5%. Seleccionar la  óptima de trabajo de rojo congo a
ii)
iii)
iv)
v)
partir del gráfico de Abs en función de  (control de centro de banda).
Llevar a 0.000 de Abs con agua.
Medir las Abs de las distintas soluciones por duplicado.
Graficar Abs en función de la concentración (expresada en % de dilución respecto de la ST).
Informar el rango de linealidad fotométrica, es decir, entre qué valores de absorbancia, el equipo
tiene una respuesta lineal.
6 - Control de veracidad
i)
Seleccionar la opción Abs en el display del equipo.
ii)
iii)
iv)
v)
Seleccionar la longitud de onda de trabajo, teniendo en cuenta que la  óptima de la solución de
Cloruro de Cobalto es 512 nm y realizando la corrección correspondiente, en caso de existir
corrimiento del centro de banda. (NOTA: Es válido considerar constante el corrimiento de centro de
banda, ya que se trabaja a longitudes de onda, cercanas a las evaluadas en el Control de Centro de
Banda)
Llevar a 0.000 de Abs con la cubeta que contiene agua.
Cargar otra cubeta con solución de referencia y medir su Abs.
Repetir los pasos iii) y iv) hasta obtener 10 lecturas de Abs para el Cloruro de Cobalto.
vi)
Calcular con estos datos la media de absorbancias (Abs exp)
La veracidad fotométrica se estimará según el error fotométrico% (EF%) que se calcula según:
(Abs – Abs ref) . 100
EF % = +/Abs ref
Cátedra de Física-FFYB-UBA [7]
Ir
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
Donde Abs ref es el valor consignado en el rótulo del envase.
Se considera como aceptable un error fotométrico comprendido entre +/- 5%.
7 - Control de la precisión fotométrica
i)
ii)
Con los 10 valores de Abs obtenidos durante el control de veracidad calcular el desvío estándar (SD).
Calcular el coeficiente de variación porcentual (CV%) según:
SD . 100
CV% =
Abs
Se considera como aceptable un CV% menor al 1%
PARTE 2/ APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
OBJETIVO
- Calcular la concentración de proteínas de una solución empleando la reacción del Biuret como técnica
espectrofotométrica.
- Cálculo de Absortividad de una muestra de Rojo Congo
- Obtener los espectros de absorción de azul de metileno, paranitrofenol en solución acuosa y de una mezcla
de ambos en partes iguales.
1. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS CON EL REACTIVO DE BIURET
MATERIALES
●
●
●
●
●
●
●
●
Espectrofotómetro Jenway 6300
Cubetas semimicro para espectrofotómetro
Pipetas de vidrio de 1 y 5 mL
Reactivo de Biuret
Soluciones testigo de colágeno hidrolizado (CH) de concentración (Test. CH) : 30 g/L
Dos soluciones muestras de concentración desconocida.
Tubos de hemólisis de vidrio
Vasos de precipitado
Cátedra de Física-FFYB-UBA [8]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
PRECAUCIONES
En esta segunda parte del TP tener en cuenta las mismas precauciones que para realizar los controles de
calidad espectrofotométricos ya que se utilizarán soluciones alcalinas (Biuret).
PROCEDIMIENTO
i)
Preparar los tubos según se indica en la siguiente tabla. Ver el apartado “Muestra, testigo
y blanco” en Guía de Fundamentos de Espectrofotometría.
Ir
Testigo C.H. 30 g/L
Reactivo Biuret
Agua destilada
Muestra con C.H.
Tubo 1
0,40 mL
1,80 mL
-
-
Tubo 2
0,40 mL
1,80 mL
-
-
Tubo 3
0,40 mL
-
1,80 mL
-
Tubo 4
0,30 mL
1,80 mL
0,10 mL
-
Tubo 5
0,30 mL
1,80 mL
0,10 mL
-
Tubo 6
0,30 mL
-
1,90 mL
-
Tubo 7
0,20 mL
1,80 mL
0,20 mL
-
Tubo 8
0,20 mL
1,80 mL
0,20 mL
-
Tubo 9
0,20 mL
-
2,00 mL
-
Tubo 10
0,10 mL
1,80 mL
0,30 mL
-
Tubo 11
0,10 mL
1,80 mL
0,30 mL
-
Tubo 12
0,10 mL
-
2,10 mL
-
Tubo 13
-
1,80 mL
0,40 mL
-
1,80 mL
-
0,40 mL
1,80 mL
-
0,40 mL
Tubo 16
-
1,80 mL
0,40 mL
Tubo 17
1,80 mL
-
0,40 mL
1,80 mL
-
0,40 mL
-
1,80 mL
0,40 mL
Tubo 14
Tubo 15
Tubo 18
Tubo 19
Tubos correspondiente a
la muestra 1
Tubos correspondiente a
la muestra 2
Cátedra de Física-FFYB-UBA [9]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
Mezclar cada tubo por inversión delicadamente con tapón de goma, evitando la formación
de
espuma.
Incubar a temperatura ambiente 20 min.
Seleccionar la longitud de onda 540 nm (tener en cuenta todos los controles realizados previamente)
y llevar a 0,000 de Abs con agua.
Leer las Abs de todos los tubos.
Graficar Abs en función de concentración de CH (concentración en el tubo) de los testigos
procesados.
vii)
A partir del gráfico, obtener la ecuación de la recta e informar el rango de linealidad.
viii)
Utilizando la ecuación del gráfico, calcular la concentración de muestra incógnita en cada uno de los
tubos donde se procesó (recordar que se midió por triplicado).
ix)
A partir de los valores de concentración de proteína de la muestra en cada tubo, obtenidos en el
punto anterior, calcular las correspondientes concentraciones de proteína de la muestra original y
luego informar su valor promedio.
2. DETERMINACIÓN DE LA ABSORTIVIDAD DE ROJO CONGO
i)
ii)
A partir de los resultados obtenidos en el control de Linealidad (día 1 de TP), graficar Abs en función
de la concentración, expresada en g/L, partiendo del dato de la concentración de la ST, indicado en
el rótulo de la botella, de la cual se le entregó la muestra.
Calcular a partir de la pendiente del gráfico el valor de absortividad de Rojo Congo a la longitud de
onda de trabajo.
3. ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE DOS COLORANTES Y DE SU MEZCLA
MATERIALES

Espectrofotómetro Jenway 6300

Solución de azul de metileno

Solución de paranitrofenol

Cubetas plásticas

Pipetas
PROCEDIMIENTO
1. Cargar en 2 cubetas distintas 3 ml de cada solución.
Cátedra de Física-FFYB-UBA [10]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
2. En una tercera cubeta colocar 1,5 ml de cada una de las soluciones anteriores y mezclar
delicadamente por inversión. Una vez realizada la mezcla de los colorantes, comenzar
inmediatamente a realizar las lecturas pues la mezcla es inestable, para ello:
3. Seleccionar la opción Abs en el display del equipo.
4. Realizar el barrido espectral de cada una de las tres soluciones. Para ello, fijar con el selector de 
distintos valores de  desde 400 a 700 nm. En dicho rango, seleccionar la λ de medida cada 10 nm.
5. Con agua llevar a 0.000 de Abs en el espectrofotómetro a cada λ.
6. Medir las Abs de las tres soluciones a cada λ.
7. Graficar en un mismo par de ejes para las tres soluciones Abs = f ( λ ).
INFORME
Les proponemos que tengan en cuenta las siguientes preguntas, al realizar el análisis de resultados:
- Cuando realizaron el control de volumen mínimo, a medida que aumentaba el volumen de solución
agregada en la cubeta ¿qué ocurría con los valores de absorbancia? ¿Fueron aumentando siempre hasta
llegar a un valor de absorbancia máxima que se mantenía? ¿Cómo pueden explicarlo? ¿A qué podrían
atribuirlo?
- ¿Cuándo seleccionaron la longitud de óptima de trabajo del rojo congo para realizar el control de
linealidad fotométrica, qué tuvieron en cuenta para decidirlo?
- Para realizar la técnica del Biuret debían trabajar a 540 nm con el espectrofotómetro. ¿el resultado de qué
control tuvieron en cuenta para seleccionar la longitud de onda en el display?
- Para calcular la concentración de las proteínas en una muestra incógnita mediante la técnica de Biuret, se
utilizó un protocolo con varios tubos. ¿Cuál fue la finalidad de cada uno de los tubos procesados?
- ¿Qué características presentó el espectro del paranitrofenol? ¿Hay relación entre el color observado y su
respectivo espectro? ¿Tiene algún pico de máxima absorbancia? ¿Dónde? ¿Y el azul de metileno? ¿Se
superponen en algún tramo ambos espectros?
- ¿Cuál fue el color de la mezcla resultante? ¿Tiene alguna relación con el espectro observado?
- ¿Cómo resultó el perfil del espectro de la mezcla de ambos colorantes en comparación con los de las
soluciones de los colorantes por separado?
- ¿Cómo resultó la absorbancia de los picos de ambos colorantes en la mezcla a cada λ en comparación con
el valor la absorbancia de cada componente por separado? ¿A qué se podría atribuir?
Cátedra de Física-FFYB-UBA [11]
TP. ESPECTROFOTOMETRIA 4.3/ M4/ FISICA
ALGUNAS IDEAS PARA DISCUTIR EN GRUPO
- ¿Qué ocurriría si por error no se cierra completamente la tapa del porta cubetas al realizar una lectura de
absorbancia? Si esta situación se mantiene cuando realizan el control de luz espuria, ¿cómo influiría en el
valor de T % medido?
- ¿A qué causas podrían atribuir un aumento superior al 1% de T para el dicho control?
- Si el control de centro de banda a 498 nm da una diferencia del -3 nm, ¿sería válido aplicar la misma
corrección en una zona de λ 400 nm? ¿Cómo lo solucionarían?
- Para realizar el control de linealidad fotométrica se utiliza una sustancia que se sabe que cumple con la
Ley de Lambert-Beer y que permite medir absorbancias hasta 1.500. Si luego realizan la medida en un
espectrofotómetro observando que hay linealidad hasta 0.800 ¿a qué lo podrían atribuir? ¿Qué parte del
instrumental puede no estar en condiciones?
- Si alguna de las muestras dio una Abs por fuera del rango de calibración, ¿Puede informar la concentración
de proteínas de la muestra? Indique cómo procedería
- ¿Podrían leer las absorbancias de todos los tubos del protocolo del Biuret contra el tubo blanco de reactivo
en vez de leerlo contra el tubo que contiene agua? En caso de que la respuesta sea negativa ¿Cuáles
deberían leer contra blanco de agua indefectiblemente?
- Realizaron el control de linealidad fotométrica con rojo congo (cc solución madre = 1.0 g/L) y éste se
cumplió hasta una absorbancia de 1.500 con el instrumento usado. Posteriormente se preparó una solución
madre de otro colorante: rojo certificado, de igual concentración que el anterior y a partir de ésta se
hicieron distintas diluciones. Luego se midieron las absorbancias de la madre y de sus distintas diluciones. La
linealidad con este colorante se mantuvo hasta a 0.800 de absorbancia, correspondiente a una
concentración de 0.75 g/L. ¿Qué pueden decir de dicha sustancia? ¿Podrían calcular la absortividad de dicha
sustancia? ¿Qué tendrían en cuenta?
-
Si para seguir espectrofotométricamente la mezcla de colorantes hubiesen colocado una parte de
paranitrofenol y dos partes de azul de metileno ¿cómo habría sido el nuevo espectro en comparación con el
que realizaron en el TP?
Cátedra de Física-FFYB-UBA [12]