UNA FORMULACION DE FACTOR DE COAGULACION VIII

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 38/37
11 Número de publicación:
2 193 159
7
51
ESPAÑA
A61K 38/02
A61K 35/16
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 94915722.6
kFecha de presentación: 31.03.1994
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 710 114
kFecha de publicación de la solicitud: 08.05.1996
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Una formulación de factor de coagulación VIII.
k
73 Titular/es: BIOVITRUM AB
k
72 Inventor/es: Spira, Jack;
k
74 Agente: Dávila Baz, Angel
30 Prioridad: 05.07.1993 SE 9302308
112 76 Stockholm, SE
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.11.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 193 159 T3
01.11.2003
Aviso:
k
k
Widlund, Lars y
Österberg, Thomas
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 193 159 T3
DESCRIPCION
Una formulación de factor de coagulación VIII.
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20
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La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica para la administración subcutánea,
intramuscular o intradérmica que comprende factor de coagulación VIII recombinante y al uso de la
misma para la fabricación de un medicamento para tratar la hemofilia. La formulación comprende un
factor de coagulación VIII recombinante altamente purificado en una concentración de al menos 1000
UI/ml, que da niveles sorprendentemente altos de factor VIII activo en la corriente sanguı́nea después
de la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica. La formulación está destinada al tratamiento de la hemofilia mediante la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica. El factor
VIII recombinante es preferiblemente un derivado de supresión del mismo, que puede usarse para la fabricación de un medicamento para la administración subcutánea.
Antecedentes de la invención
La hemofilia es una enfermedad hereditaria que se conoce desde hace siglos pero sólo en las últimas
tres décadas ha sido posible diferenciar entre las diversas formas: hemofilia A, hemofilia B y hemofilia
C. La hemofilia A es la forma más frecuente. Afecta sólo a varones con una incidencia de uno o dos
individuos por 10.000 varones nacidos vivos. La enfermedad está provocada por un nivel muy disminuido
o una ausencia de factor de coagulación VIII (factor antihemofı́lico) biológicamente activo, que es una
proteı́na normalmente presente en el plasma. La manifestación clı́nica de la hemofilia A es una fuerte
tendencia a la hemorragia y, antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de factor VIII,
la edad media de esos pacientes era menor que 20 años. Los concentrados de factor VIII obtenidos a
partir de plasma están disponibles desde hace aproximadamente tres décadas. Esto ha mejorado considerablemente la situación para el tratamiento de pacientes con hemofilia y les ha dado la posibilidad de
llevar una vida normal.
30
Los concentrados de factor VIII terapéuticos se han preparado hasta ahora mediante fraccionación
de plasma. Sin embargo, existen ahora métodos disponibles para la producción de factor VIII en cultivo
celular usando técnicas de DNA recombinante, según se presenta, por ejemplo, en J Gitschier y otros,
Nature 312, p. 330-37, 1984 y EP-A-160 457.
35
Los concentrados de factor VIII derivados de plasma humano contienen varias formas de factor VIII
completamente activas fragmentadas (Andersson y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 83, p. 297983, Mayo de 1986). La forma activa más pequeña tiene una masa molecular de 170 kDa y consiste en
dos cadenas de 90 kDa y 80 kDa que se mantienen unidas mediante un puente de ion metálico. Se hace
referencia aquı́ a EP-A-197 901.
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Kabi Pharmacia ha desarrollado un producto de factor VIII recombinante que corresponde a la forma
de factor VIII plasmático de 170 kDa en concentrados de factor VIII terapéuticos. La molécula de factor
VIII recombinante truncada se denomina r-VIII SQ y es producida por células de ovario de hámster chino
(CHO) en un procedimiento de cultivo celular en medio libre de suero.
La estructura y la bioquı́mica de los productos de factor VIII recombinante han sido descritas en
general por Kaufman en Tibtech, Vol 9, 1991 y Hematology, 63, p. 155-65, 1991. La estructura y la
bioquı́mica de r-VIII SQ han sido descritas en WO-A-91/09122.
Las proteı́nas grandes se administran normalmente intravenosamente de modo que el medicamento
esté directamente disponible en la corriente sanguı́nea. Sin embargo, serı́a ventajoso que un medicamento
pudiera administrarse subcutáneamente, intramuscularmente o intradérmicamente ya que estas formas
de administración son mucho más fáciles de manejar para el paciente. Especialmente, si el medicamento
debe tomarse regularmente durante toda la vida y el tratamiento ha de empezar pronto, cuando todavı́a
el paciente es un niño.
Sin embargo, un medicamento con una molécula muy grande y lábil, tal como factor de coagulación VIII de 170 a 300 kDa, tiene normalmente una biodisponibilidad muy baja si se administra
subcutáneamente, intramuscularmente o intradérmicamente, ya que la captación no es suficiente y la
degradación es intensa. Por lo que se sabe, la única proteı́na de factor de coagulación que se ha administrado mediante inyección subcutánea es el factor IX (90 kDa).
Todas las preparaciones de factor VIII disponibles actualmente en el mercado se elaboran como una
formulación para administración intravenosa y se estabilizan con albúmina de suero humano.
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Descripción de la invención
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Con gran sorpresa, se ha encontrado que el factor VIII, que es una proteı́na muy sensible, puede
administrarse subcutáneamente y, en contraste con toda la experiencia previa, se obtuvo una absorción
aceptable y un alto nivel de proteı́na de factor VIII activo en la sangre.
Se ha desarrollado ası́ una formulación que hace posible administrar factor VIII subcutáneamente,
intramuscularmente o intradérmicamente y que da un gran beneficio a todos los pacientes que necesiten
factor VIII.
El factor VIII SQ recombinante está indicado para el tratamiento de la hemofilia clásica.
15
La semivida para r-VIII SQ es aproximadamente 12 horas para seres humanos cuando se inyecta
intravenosamente.
Para el tratamiento profiláctico, se administran 15-25 UI/kg de peso corporal de factor VIII tres veces
a la semana. Una inyección intravenosa es normalmente 5-10 ml.
20
Una inyección administrada subcutáneamente está entre 0,05 y 1 ml y la concentración de factor VIII
debe ser por lo tanto muy alta en tal formulación.
Esto es posible de obtener, por ejemplo, con el presente factor VIII recombinante altamente purificado.
25
La idea de la invención es ası́ una combinación del hallazgo de que el factor VIII puede absorberse en la
corriente sanguı́nea cuando se administra como una formulación farmacéutica subcutánea, intramuscular
o intradérmica y que es posible producir una formulación que comprende la alta concentración requerida
de factor VIII para este propósito.
30
La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica para la administración subcutánea,
intramuscular o intradérmica, que comprende factor de coagulación VIII recombinante altamente purificado en una concentración de al menos 1000 UI/ml, formulación que da un nivel terapéutico de actividad
de factor VIII en la sangre después de la administración.
35
La composición se administra preferiblemente subcutáneamente.
La actividad de factor VIII en la formulación es al menos 1000 UI/ml, preferiblemente más de 1500
UI/ml y lo más preferiblemente de 5000 a 100.000 UI/ml.
40
El volumen administrado es adecuadamente de 0,1 a 2 ml, preferiblemente de 0,25 a 1,5 ml y más
preferiblemente de 0,5 a 1 ml. El volumen también puede ser de 0,1 a 1 ml.
45
El factor VIII es recombinante y puede estar en su forma de longitud completa o preferiblemente
como un derivado de supresión del mismo. Más preferiblemente, el derivado de supresión es factor VIII
SQ recombinante (r-VIII SQ). Por derivado de supresión se entiende aquı́ factor de coagulación VIII en
el que falta la totalidad o parte del dominio B. Adicionalmente, la molécula de r-VIII SQ puede estar
modificada quı́micamente, por ejemplo mediante pegilación, carbohidratos o polipéptidos conectados covalentemente, para mejorar la estabilidad de la molécula in vivo.
50
El presente factor VIII usado está altamente purificado, es decir, tiene una actividad especı́fica de más
de 5000 UI/mg de proteı́na, incluso más de 12.000 UI/mg, y se estabiliza preferiblemente sin la adición
de albúmina.
55
La formulación también puede comprender cloruro sódico o potásico, preferiblemente en una cantidad
de más de 0,1 M.
60
Es necesario calcio (u otros iones metálicos divalentes) para el mantenimiento de la asociación de la
cadena pesada y ligera del factor VIII. Se añade aquı́ como cloruro cálcico (CaCl2 ), pero también pueden
usarse otras sales tales como gluconato cálcico, glubionato cálcico o gluceptato cálcico. La composición
comprende preferiblemente cloruro cálcico o gluconato cálcico en una cantidad de más de 0,5 mM.
Se usa preferiblemente un aminoácido para tamponar el sistema y también protege a la proteı́na en la
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fase amorfa si la formulación se liofiliza. Un tampón adecuado podrı́a ser L-histidina, lisina y/o arginina.
La L-histidina se ha elegido primeramente debido a la buena capacidad tamponadora de la L-histidina
alrededor de pH 7.
5
La formulación podrı́a comprender
i) al menos 1500 UI/ml de un derivado de supresión de factor VIII recombinante
ii) al menos 0,01 mg/ml de un éster de ácido graso de polioxietilensorbitán
10
iii) cloruro sódico, preferiblemente en una cantidad de más de 0,1 M
iv) sal cálcica, tal como cloruro cálcico o gluconato cálcico, preferiblemente en una cantidad de más de
0,5 mM
15
v) un aminoácido tal como L-histidina en una cantidad de más de 1 mM.
20
También puede estar presente en la formulación un tensioactivo no iónico y se elige preferiblemente de
copolı́meros de bloques, tales como poloxámero o éster de ácido graso de polioxietilensorbitán, tal como
monolaurato de polioxietilen-(20)-sorbitán o monooleato de polioxietilen-(20)-sorbitán. El tensioactivo
no iónico, si se usa, debe estar presente preferiblemente en una cantidad por encima de la concentración
micelar crı́tica (CMC). Véase Wan y Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p. 136, 1974.
25
El éster de ácido graso de polioxietilensorbitán se usa preferiblemente en una cantidad de al menos
0,01 mg/ml.
30
35
40
Podrı́an añadirse a esta formulación mono- o di-sacáridos o alcoholes sacáricos, preferiblemente sacarosa. Podrı́an añadirse antioxidantes tales como glutationa, acetilcisteı́na, tocoferol, metionina, EDTA,
ácido cı́trico, butil-hidroxitolueno y/o butil-hidroxianisol. Además, podrı́an añadirse conservantes tales
como alcohol bencı́lico, fenol, ácido sórbico, parabenes y clorocresol.
La formulación comprende preferiblemente L-histidina y sacarosa. La relación de cloruro sódico a
L-histidina y sacarosa en la composición para liofilización es adecuadamente mayor que 1:1 (p:p), preferiblemente mayor que 2:1 (p:p).
La formulación podrı́a estar en una forma secada, preferiblemente liofilizada. El producto secado se
reconstituye con agua estéril para inyección o una solución tamponadora farmacéuticamente aceptable, o
se mezcla o reconstituye con una solución acuosa, que contiene mejoradores de la absorción o inhibidores
de proteasas, antes de la administración.
La formulación reivindicada también puede ser una solución acuosa estable lista para la administración. También puede ser una dispersión, por ejemplo una suspensión, una formulación liposómica o
una emulsión.
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50
55
60
La formulación podrı́a almacenarse en un ambiente con oxı́geno reducido según se describe en la solicitud de patente en tramitación junto con la presente PCT/-SE94/00265.
Podrı́an añadirse mejoradores de la absorción o inhibidores de proteasas. Ejemplos de mejoradores
de la absorción adecuados son fosfolı́pidos, ácidos grasos, sales biliares, salicilatos y EDTA. Ejemplos de
inhibidores de proteasas adecuados son aprotinina y EDTA.
La formulación reivindicada puede prepararse mezclando factor VIII con un tensioactivo no iónico en
una solución acuosa, preferiblemente junto con un aminoácido tal como L-histidina, sal sódica, sacarosa
y una sal cálcica, o eluyendo factor VIII procedente de la última etapa de purificación con un tampón que
contiene un tensioactivo no iónico en una solución acuosa, preferiblemente junto con sal sódica, sacarosa,
sal cálcica y un aminoácido tal como L-histidina.
La invención también se refiere al uso de la formulación reivindicada para la fabricación de un medicamento para la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica para tratar la hemofilia,
preferiblemente para el uso de un derivado de supresión de factor VIII recombinante para la fabricación
de un medicamento para la administración subcutánea. El medicamento puede estar en una solución
o dispersión acuosa adecuada, o liofilizado. También se refiere a un método para el tratamiento de la
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hemofilia mediante la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica de la formulación reivindicada.
5
Los datos presentados en los ejemplos indican que el r-VIII SQ puede inyectarse subcutáneamente y
recuperarse en una forma activa intravenosamente in vivo. Este es un hallazgo muy sorprendente, ya que
tal formulación no se ha conocido previamente.
La protección no se limita a una composición bajo estos ejemplos.
10
Parte experimental
Materiales y métodos
15
20
25
30
La producción de factor VIII SQ recombinante (r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se describe
en la Patente WO-A-91/09122, ejemplo 1-3. Una lı́nea celular CHO deficiente en DHFR (DG44N.Y.) se
sometió a electroporación con un vector de expresión que contenı́a el gen de r-VIII SQ y un vector de
expresión que contenı́a el gen de dihidrofolato-reductasa. Después de la selección sobre medio selectivo
las colonias supervivientes se rastrearon individualmente con respecto a la actividad del factor VIII. Se
eligió un clon de producción y este se adaptó subsiguientemente al crecimiento en suspensión libre de
suero en un medio definido y finalmente se desarrolló un procedimiento de fermentación a gran escala.
El sobrenadante se recoge después de ciertos perı́odos de tiempo y se purifica adicionalmente según se
describe más adelante.
El medio acondicionado clarificado se ajustó con respecto al pH y se aplicó a una columna de SSepharose FF. Después del lavado, el factor VIII se eluyó con un tampón salino que contenı́a CaCl2 5
mM.
La inmunoabsorción se llevó a cabo en una resina de inmunoafinidad en la que el ligando era un anticuerpo monoclonal (8A4) dirigido hacia la cadena pesada del factor VIII. Antes de cargar a la columna,
el eluato S se trató con TNBP al 0,3 % y Octoxynol 9 al 1 %.
La columna se equilibró, se lavó y el factor VIII se eluyó con un tampón que contenı́a CaCl2 0,05 M
y etilenglicol al 5 %.
35
40
El eluato de mAb se cargó en una columna Q-Sepharose FF, equilibrada con el tampón de elución
en la etapa de inmunoafinidad. Después de lavar, el factor VIII se eluyó con L-histidina 0,05 M, cloruro
sódico 0,6 M, cloruro cálcico 4 mM y pH 6,8.
El eluato Q se aplicó a una columna de filtración en gel (Superdex 200 p.g.). La equilibración y la
elución se llevaron a cabo con un tampón que contenı́a L-histidina, cloruro sódico y cloruro cálcico.
El pico de la proteı́na se recogió y la solución se formuló antes de liofilizar.
45
Este material de r-VIII SQ se recibı́a a partir de la etapa de purificación final. La actividad del factor
VIII y la concentración de los componentes inactivos se ajustaron diluyeron con un tampón apropiado que
contenı́a polietilenglicol (PEG). La solución se filtró estérilmente (0,22 µm) a continuación, se distribuyó
y se liofilizó.
Ejemplo 1
50
Se preparó factor VIII recombinante de acuerdo con el método descrito bajo la Parte Experimental.
La composición liofilizada que contenı́a r-VIII SQ era la siguiente, por vial, que se reconstituı́a en 4
ml de agua estéril para inyección:
55
60
5
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Composición por vial:
5
10
L-Histidina, mg
Cloruro sódico, mg
Cloruro cálcico·(2 H2 O), mg
Polietilenglicol (PEG 4000), mg
R
Monooleato de polioxietilen-(20)-sorbitán (Tween 80
), mg
VIII:C cargados, UI/vial
VIII:C en solución reconstituida, UI/ml
31,0
70,1
2,35
4,0
1
4400
1060
Ratones albinos macho que pesaban aproximadamente 30 g y de la raza NMRI, SPF, fueron inyectados subcutáneamente en el cuello con la solución de r-VIII SQ reconstituido.
15
20
25
El volumen inyectado al nivel de dosis de 10.000 UI/kg era 9,4 ml/kg y el nivel de dosis superior
50.000 UI/kg, 5 veces mayor, 47 ml/kg. En el tratamiento con placebo se usó solución salina, 9,4 ml/kg.
Tres-cinco minutos antes del muestreo de sangre los ratones fueron anestesiados intraperitonealmente con
R
(pentobarbital) veterinario, 60 mg/ml. El volumen inyectado era 9,4 ml/kg, es decir aproxiMebumal
madamente 0,3 ml/ratón. Bajo la anestesia, se recogieron 0,45 ml de sangre de la vena cava en jeringas
de plástico que contenı́an 0,05 ml de citrato sódico 0,13 M. El plasma se preparó a continuación a partir
de la sangre recogida mediante centrifugación (8800 g durante 7 minutos) y se mantuvo congelado en
tubos Cryoflex de plástico a -70◦C hasta el momento de la determinación de la actividad del factor VIII.
Resultados
TABLA 1
30
35
40
45
50
VIII:C en plasma a partir de ratones que reciben 10.000 UI/kg
de peso corporal de r-VIII SQ subcutáneamente
Tiempo después
de la administración
(horas)
0
0,33
1,0
1,5
2,0
4,0
6,0
8,0
16,0
20,0
24,0
VIII:C
(UI / ml) X ± Sd
0,82 ±
1,23 ±
1,38 ±
1,83 ±
1,43 ±
1,34 ±
1,27 ±
1,55 ±
0,62 ±
0,58 ±
0,76 ±
0,43
0,41
0,56
0,60
0,91
0,72
0,42
0,80
0,28
0,12
0,53
55
60
6
n
número de observaciones
12
3
4
12
8
6
4
4
4
3
4
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TABLA 2
5
Dosis - Respuesta en ratones que reciben r-VIII SQ subcutáneamente.
Dosis: Dosis de r-VIII SQ administrada (UI/kg).
Respuesta: VIII:C en plasma (UI/ml) 1,5 horas después de la administración subcutánea.
Dosis
(UI/kg)
Respuesta
(UI/ml)
Respuesta
(UI/ml) (ajustada
a la lı́nea de base)
n
número de
observaciones
Blanco
(lı́nea de base)
Solución salina
10.000
50.000
0,82 ± 0,43
-
12
1,21 ± 0,34
1,83 ± 0,60
2,47 ± 0,60
0,39
1,01
1,65
4
12
6
10
15
20
25
30
35
Resultados
1. El cambio de VIII:C en el plasma con el tiempo después de una dosis subcutánea de r-VIII SQ,
10.000 UI/kg, muestra el modelo tı́pico para un fármaco que es absorbido a partir de un depósito
subcutáneo (véase la Tabla 1). El nivel de VIII:C máximo en plasma se observa aproximadamente
1,5 horas después de la administración (véase la Tabla 1).
2. La absorción de r-VIII SQ a partir de un depósito subcutáneo se verifica adicionalmente por el
incremento en la concentración máxima observada cuando la dosis se incrementa cinco veces. No
se observó un efecto significativo sobre el nivel en plasma obtenido de VIII:C cuando el volumen de
inyección subcutánea se cambiaba desde 9,4 hasta 47 ml/kg mientras que la dosis de r-VIII SQ se
mantenı́a constante. Además, el VIII:C obtenido en el plasma era esencialmente independiente de
la osmolalidad de la solución de administración.
3. La biodisponibilidad de r-VIII SQ después de la administración subcutánea en el ratón era aproximadamente 10 % de la biodisponibilidad después de la administración intravenosa. La biodisponibilidad se calculó a partir del área bajo la curva de actividad (VIII:C)-tiempo.
Ejemplo 2
Se usó factor VIII derivado de plasma.
40
La composición de la solución congelada que contenı́a factor VIII derivado del plasma era la siguiente:
Composición por ml:
45
50
L-Histidina, mg
Cloruro sódico, mg
Cloruro cálcico·(2 H2 O), mg
Polietilenglicol (PEG 4000), mg
Albúmina humana, mg
VIII:C, UI/ml
7,8
35,1
0,59
1,0
10,0
250
55
Ratones albino macho que pesaban aproximadamente 30 g y de la raza NMRI, SPF, fueron inyectados
subcutáneamente en el cuello con la solución de factor VIII reconstituida.
60
El volumen inyectado al nivel de dosis de 10.000 UI/kg era aproximadamente 40 ml/kg. En el tratamiento con placebo se usó una solución que contenı́a cloruro sódico al 9 % (p/v). Tres-cinco minutos antes
R
(pentodel muestreo de la sangre los ratones fueron anestesiados intraperitonealmente con Mebumal
barbital) veterinario, 60 mg/ml. El volumen de la dosis era aproximadamente 1,2 ml/ratón. Bajo la
anestesia, se recogieron 0,45 ml de sangre de la vena cava en jeringas de plástico que contenı́an 0,05 ml de
citrato sódico (0,13 M). Se preparó plasma a partir de la sangre mediante centrifugación (8800 g durante
7
ES 2 193 159 T3
7 minutos) y a continuación se almacenó en tubos Cryoflex de plástico a -70◦C hasta la determinación
de VIII:C.
Resultados
5
TABLA 3
VIII:C en plasma a partir de ratones que reciben factor VIII derivado de plasma,
10.000 UI/kg, subcutáneamente. VIII:C en la solución de administración
era aproximadamente 250 UI/ml.
10
15
Tiempo después
de la administración
(horas)
VIII:C (UI/ml) X±SD
n
número de observaciones
0
1
1,5
2
4
6
8
16
20
24
1,04±0,30
1,20±0,53
1,39±0,04
0,85±0,34
1,19±0,49
1,32±0,53
1,15±0,39
1,27±0,08
1,17±0,41
1,32±0,21
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
20
25
30
35
Resultados
1. La biodisponibilidad de factor VIII derivado del plasma es bastante baja de acuerdo con los resultados del estudio in vivo en ratones (Tabla 3). La biodisponibilidad del factor VIII derivado del
plasma es aproximadamente 1/10 de la biodisponibilidad de r-VIII SQ. De ahı́ que la biodisponibilidad de r-VIII SQ sea sustancialmente superior que la biodisponibilidad de factor VIII derivado
de plasma humano. El nivel de plasma máximo de VIII:C se observa aproximadamente 1,5 horas
después de la administración subcutánea.
40
Ejemplo 3
45
Se preparó factor VIII recombinante de acuerdo con el método descrito bajo la Parte Experimental,
con las siguientes excepciones: (i) el material de r-VIII SQ que era recibido a partir de la etapa de
purificación final se diluı́a con un tampón que no contenı́a PEG, (ii) la solución de r-VIII SQ no se
liofilizaba, se almacenaba a -70◦ C. La solución de r-VIII SQ tenı́a la siguiente composición:
Composición por vial:
L-Histidina, mg
Sacarosa, mg
Cloruro sódico, mg
Cloruro cálcico·(2 H2 O), mg
R
Monooleato de polioxietilen-(20)-sorbitán (Tween 80
, mg)
VIII:C cargado, UI/vial
VIII:C, UI/ml∗
50
55
∗
60
7,5
158
45
1,25
0,50
6070
1130
Solución de r-VIII SQ diluida (una parte de solución de r-VIII SQ + 1 parte de agua, v:v)
La solución de r-VIII SQ se diluyó con agua estéril para inyección (1 parte de solución de r-VIII SQ
+ 1 parte de agua, v:v) antes de la administración cuando la dosis de VIII:C estaba por debajo de 3000
8
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UI/kg de peso corporal.
5
10
Monos cynomolgus hembra (Macaca fascicularis) que pesaban aproximadamente 3-3,5 kg fueron inyectados con la solución de r-VIII SQ subcutáneamente en la región dorsal. Dependiendo de la dosis, el
volumen de inyección se variaba entre aproximadamente 0,2 y 2,0 ml/kg de peso corporal. Se administraron inyecciones subcutáneas con dosis simples de 250, 2500 y 5000 UI/kg. En cada ocasión de muestreo,
se recogieron 1,8 ml de sangre en tubos que contenı́an citrato como anticoagulante (0,2 ml). Después de
la centrifugación, el plasma se separó y se congeló en partes alı́cuotas (< -60◦ C).
Resultados
TABLA 4
15
20
25
30
VIII:C en plasma de monos que recibı́an r-VIII SQ, 250 UI/kg, subcutáneamente.
El VIIII:C en la solución de administración era aproximadamente 1130 UI/ml.
Mono N◦
1
2
3
Muestreo después
de la inyección (Horas)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
0
1
4
8
10
12
14
24
30
48
2,15
2,32
2,43
2,48
2,41
2,29
2,20
1,76
2,31
2,18
1,49
1,75
1,52
1,67
1,76
1,70
1,69
1,32
1,46
1,64
1,76
1,92
1,89
1,92
2,03
2,01
2,00
1,98
1,90
1,96
35
TABLA 5
40
45
50
55
VIII:C en plasma de monos que recibı́an r-VIII SQ, 2500 UI/kg, subcutáneamente.
El VIIII:C en la solución de administración era aproximadamente 1130 UI/ml.
Mono N◦
4
5
6
Muestreo después
de la inyección (Horas)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
0
2
6
9
11
13
22
40
1,95
2,43
3,51
3,91
3,47
3,11
2,38
2,01
1,35
1,86
2,45
2,47
2,24
2,06
1,55
1,49
2,30
3,05
3,59
4,16
3,68
3,34
2,79
2,38
60
9
ES 2 193 159 T3
TABLA 6
5
10
VIII:C en plasma de monos que recibı́an r-VIII SQ, 5000 UI/kg, subcutáneamente.
El VIIII:C en la solución de administración era aproximadamente 2470 UI/ml.
Mono N◦
7
8
9
Muestreo después
de la inyección (Horas)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
VIII:C
(UI/ml)
0
2
6
9
11
13
22
40
2,04
2,99
4,56
4,75
4,72
4,23
3,03
2,76
1,78
2,37
3,33
3,89
3,82
3,06
2,33
1,77
1,54
2,99
5,32
5,70
5,46
4,63
3,46
2,60
15
20
TABLA 7
25
Dosis-respuesta en monos que recibı́an r-VIII SQ subcutáneamente.
Dosis: Dosis de r-VIII SQ administrada (UI/kg de peso corporal).
Respuesta: VIII:C en plasma (UI/ml) aproximadamente 9 horas después de la administración.
30
Dosis
(UI/kg)
Respuesta
(UI/ml)
Respuesta
(UI/ml, ajustada
a la lı́nea de base)
n
número de
observaciones
35
Blanco
(lı́nea de base)
250
2500
2500
5000
1,8 ± 0,3
-
9
0,37 ± 0,05
1,70 ± 0,06
2,05 ± 0,57
3,4 ± 1,20
3
3
3
3
40
Resultados
45
50
1. De acuerdo con los resultados (Tabla 4-6), la concentración en plasma como una función del tiempo
sigue el modelo tı́pico para el fármaco que es absorbido después de la administración subcutánea. La
concentración máxima de VIII:C se observa aproximadamente 9 horas después de la administración.
2. La relación dosis-respuesta (Tabla 7) da una verificación adicional de que existe una absorción de
VIII:C en la corriente sanguı́nea después de una inyección subcutánea.
3. La biodisponibilidad de r-VIII SQ después de la administración subcutánea en el mono era aproximadamente 5-10 %. La biodisponibilidad se calculó a partir del área bajo la curva de actividad
(VIII:C)-tiempo. La biodisponibilidad era esencialmente independiente de la dosis de r-VIII SQ.
55
60
10
ES 2 193 159 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Una formulación farmacéutica adecuada para la administración subcutánea, intramuscular o intradérmica, que comprende factor de coagulación VIII recombinante altamente purificado en una concentración de al menos 1000 UI/ml.
2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, que está adaptada para la administración subcutánea.
10
3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la actividad del factor VIII es
mayor que 1500 UI/ml.
4. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene un volumen
de 0,1 a 2 ml.
15
20
5. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el factor VIII
es un derivado de supresión de factor de coagulación VIII recombinante donde falta la totalidad o parte
del dominio B.
6. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:
(i) al menos 1500 UI/ml de un derivado de supresión de factor VIII recombinante en el que falta la
totalidad o parte del dominio B;
25
(ii) al menos 0,01 mg/ml de un éster de ácido graso de polioxietilensorbitán;
(iii) cloruro sódico;
(iv) una sal cálcica; y
30
(v) un aminoácido en una cantidad de más de 1 mM.
7. La formulación de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en la que dicho derivado de supresión del
factor VIII es el derivado de supresión denominado “factor VIII SQ”.
35
8. La formulación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el factor VIII SQ se ha modificado
quı́micamente mediante pegilación o carbohidratos o polipéptidos enlazados covalentemente.
9. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es una solución
acuosa estable lista para la administración.
40
45
10. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se liofiliza y se
reconstituye con agua estéril o una solución tamponadora farmacéutica aceptable antes de la administración.
11. La formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se mezcla o se
reconstituye con una solución acuosa que contiene mejoradores de la absorción o inhibidores de proteasas
antes de la administración.
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
11