Participación del óxido nítrico en la organogénesis de raíces y
Anuncio
Universidad Nacional de Mar del Plata Facultad de Ciencias Exactas y Naturales "Participación del óxido nítrico en la organogénesis de raíces y síntesis de celulosa en plantas" Lic. María Natalia Correa Aragunde Director: Dr. Lorenzo Lamattina Instituto de Investigaciones Biológicas CONICET Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Biológicas 2009 El observador es tan importante como el sistema que observa. Sin él, el sistema está indefinido entre cualquiera de las situaciones posibles. Paradoja del gato de Schrödinger AGRADECIMIENTOS - Al Dr. Lorenzo Lamattina, por la oportunidad de formarme en su laboratorio y la libertad que brinda para trabajar - al Lab 8 y sus integrantes, por el clima de trabajo, los mates y las charlas - a mis padres, por su valentía - a Seba por ser un compañero incondicional - a mis hermanos Caro y Gon, abu, Nico y sobris - a mis amigas, Jime, Leti, Mari, Manu, Ali y Lau - a Lu L, Lu P, Gabi, Ceci, Juli, Vicki y Fer, por enseñarme que existe el cambio - a la Lic. Magdalena Graziano, Lic. Cristina Lombardo, Prof. Eny Floh, Dr. Christian Chevalier y Dr. Joe Polacco por su colaboración para la realización de mi tesis. - al IIB y sus integrantes, por su generosidad - al CONICET y a la Universidad Nacional de Mar del Plata. Índice ÍNDICE TEMÁTICO RESUMEN ....................................................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN GENERAL 1.- Óxido nítrico .............................................................................................................. 2 1.1.- Características generales ............................................................................... 2 1.2.- Biosíntesis de NO en animales y plantas ....................................................... 3 1.3.- Mecanismo de acción del NO en sistemas biológicos ................................... 6 1.4.- Dadores y agentes secuestrantes de NO ........................................................ 8 1.5.- Efectos fisiológicos del NO en plantas, relación con hormonas y segundos mensajeros vegetales ....................................................................................... 9 1.5.1.- Participación del NO en respuestas de las plantas a estreses bióticos y abióticos ....................................................................................................... 10 1.5.2.- Participación del NO en procesos de crecimiento y desarrollo ........... 11 2.- Auxina ........................................................................................................................ 12 2.1.- Mecanismos de transducción de señales regulados por auxina ..................... 13 2.2.- Auxina en el crecimiento y desarrollo de raíces laterales (RLs) ................... 15 3.- Importancia del estudio del crecimiento del sistema radical ..................................... 15 3.1.-. Efecto del NO en el crecimiento y desarrollo de RLs – Antecedentes ........ 16 OBJETIVOS ................................................................................................................... 20 MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Material biológico....................................................................................................... 21 2.- Reactivos utilizados .................................................................................................... 22 3.- Cuantificación de raíces laterales (RLs) ..................................................................... 22 4.- Cuantificación de primordios ..................................................................................... 23 i Índice 5.- Cortes transversales y longitudinales de raíces .......................................................... 23 6.- Detección de NO ........................................................................................................ 24 7.- Medición del contenido de auxinas ............................................................................ 25 8.- RT-PCR semicuantitativa ........................................................................................... 25 8.1.- Extracción de RNA ........................................................................................ 25 8.2.- Síntesis de DNA copia ................................................................................... 25 8.3.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................................. 26 8.4.- Marcación de sondas con 32P e hibridación de las membranas ..................... 28 8.5.- Marcación de sondas con digoxigenina (DIG) e hibridación de las membranas ............................................................................................................. 28 9.- Cuantificación del contenido de celulosa ................................................................... 29 10.- Incorporación de 14C-glucosa a celulosa .................................................................. 30 11.- Análisis computacional ............................................................................................ 31 11.1.- Densitometría de bandas en los ensayos de RT-PCR semicuantitativa ...... 31 11.2.- Análisis y comparación de secuencias ........................................................ 32 11.3.- Análisis estadístico ...................................................................................... 32 RESULTADOS CAPÍTULO I: “Efecto del NO sobre la expresión de genes reguladores del ciclo celular durante la formación de raíces laterales en tomate” I.1.- INTRODUCCIÓN I.1.1.- La formación de raíces laterales .................................................................. 33 I.1.2.- El ciclo celular en plantas ........................................................................... 34 I.1.3.- Auxinas y el ciclo celular ............................................................................ 37 I.2.- RESULTADOS I.2.1.- La formación de primordios en tomate ....................................................... 38 I.2.2.- El NO induce la formación de primordios de RLs en tomate ..................... 39 I.2.3.- El NO sería requerido para el establecimiento del primordio de RL inducido por auxinas .................................................................................... 41 I.2.4.- El NO induce la expresión de genes reguladores del ciclo celular en tomate ........................................................................................................... 42 I.2.5.- El NO induce la expresión de genes reguladores del ciclo celular en el ii Índice sistema sincronizado de formación de RLs .................................................. 44 I.2.6.- Expresión de genes reguladores de ciclo celular en el sistema inducible basado en la depleción de NO endógeno ..................................................... 45 I.3.- DISCUSIÓN ............................................................................................................ 47 CAPÍTULO II: “Participación y fuentes de producción del NO en la señalización por auxinas durante la formación de raíces laterales en Arabidopsis thaliana” II.1.- INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 51 II.2.- RESULTADOS II.2.1.- Los dadores de NO inducen la promoción de RLs en plántulas de Arabidopsis thaliana .................................................................................... 54 II.2.2.- Efecto del NO en condiciones ambientales que reprimen la formación de RLs ............................................................................................................... 55 II.2.3.- El NO aumenta la sensibilidad a las auxinas durante la inducción de RLs en Arabidopsis .............................................................................................. 58 II.2.4.- El NO aumenta el contenido de auxinas en Arabidopsis ........................... 59 II.2.5.- Inhibidores de la actividad óxido nítrico sintasa (NOS) reprimen la promoción de RLs mediada por auxinas ...................................................... 60 II.2.6.- Las mutantes de Arabidopsis en las enzimas arginasa argah1-1 y argah2-1 poseen mayor contenido de NO en raíces .................................... 61 II.2.7.- Las mutantes de Arabidopsis de las enzimas arginasa argah1-1 y argah2-1 son más sensibles al tratamiento con auxinas .............................. 64 II.3.- DISCUSIÓN ........................................................................................................... 66 CAPÍTULO III: “Efecto del NO sobre la síntesis de celulosa en raíces de tomate” III.1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 71 III.2.- RESULTADOS III.2.1.- El tratamiento con NO altera el contenido de celulosa en raíces de tomate ........................................................................................................... 74 III.2.2.- El NO modifica la morfología de los vasos xilemáticos .......................... 75 14 III.2.3.- El NO modula la incorporación de C-glucosa a celulosa ...................... 77 III.2.4.- Inhibidores de la síntesis de celulosa disminuyen el contenido de celulosa en raíces de tomate. El tratamiento con bajas dosis de NO es iii Índice ineficaz para reestablecer el contenido de celulosa ..................................... 80 III.2.5.- Efecto del NO sobre la expresión de genes celulosa sintasa (CESA) en tomate ........................................................................................................... 82 III.3.- DISCUSIÓN .......................................................................................................... 85 DISCUSIÓN FINAL Y CONCLUSIONES .................................................................. 89 1.- La formación de raíces laterales. Rol del NO ........................................................... 89 2.- Mecanismos moleculares involucrados en la vía de señalización inducida por auxinas. Participación del NO ................................................................................... 92 3.- Fuentes enzimáticas de producción de NO durante el desarrollo de raíces ............... 93 4.- Óxido nítrico y síntesis de celulosa en raíces ............................................................. 95 5.- Importancia del estudio de la participación del NO en el crecimiento y desarrollo del sistema radical. Conclusiones y perspectivas ...................................................... 96 TRABAJOS PRESENTADOS ....................................................................................... 98 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 101 iv Abreviaturas ABREVIATURAS ABA: ácido abscísico ADC: arginina decarboxilasa ARE: elementos de respuesta a auxina ARF: factores de respuesta a auxina BH4: tetrahidrobiopterina BR: brasinosteroides CDK: quinasa dependiente de ciclina CESA: celulosa sintasa cGMP: GMP cíclico CPM: cuentas por minuto CPTIO: 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolino-1 oxil -3 óxido CSR: región específica de clase CYC: ciclina DAF-2 DA: 4,5-diamino- fluorescein diacetato DCB: 2,6-diclorobenzonitrilo di-cGMP: 3`-5` guanosil monofosfato cíclico dimérico DIG: digoxigenina FADH: flavina adenina dinucleótido FMN: flavina mononucleótido GC: guanilato ciclasa GMP: guanosina monofosfato GSH: glutatión GSNO: S-nitrosoglutatión HR: respuesta hipersensible IXB: isoxaben JA: ácido jasmónico KRP: proteína relacionada a kip LNAME: metil ester N-nitro-L-arginina LNMMA: N-monometil-L-arginina v Abreviaturas LNNA: N-nitro-L-arginina NAA: ácido 1-naftil acético NADH: nicotinamin adenina nucleótido Ni-NOR: nitrito-NO reductasa NO: óxido nítrico NOS: óxido nítrico sintasa NPA: ácido naftilftalámico NR: nitrato reductasa ODC: ornitina decarboxilasa ONOO-: peroxinitrito PA: ácido fosfatídico PR: primordio RA: raíz adventicia RL: raíz lateral SNP: nitroprusiato de sodio SNAP: S-nitroso-N-acetil-penicilamina Tg: tungstato WT: wild type o salvaje ZnBD: dominios de unión a zinc vi Resumen Resumen En el presente trabajo se estudiaron aspectos relacionados al rol del óxido nítrico (NO) en la regulación de la arquitectura del sistema radical en las plantas Solanum lycopersicum (tomate) y Arabidopsis thaliana. El tratamiento con NO promueve el desarrollo de primordios de raíces laterales (RLs) en tomate, tal como lo hacen las auxinas. El tratamiento con el agente secuestrante de NO CPTIO inhibe la promoción de primordios mediado por auxina, sugiriendo que el NO actuaría río abajo en la vía de señalización de auxinas. El NO es capaz de modular la expresión de genes involucrados en la regulación del ciclo celular en raíces, especialmente aquellos genes que controlan la transición de la fase G1 a S del ciclo celular. Estos resultados constituyen el primer reporte sobre la participación del NO en la regulación del ciclo celular en raíces de plantas. Por otra parte, plantas depletadas de NO endógeno exhiben una drástica reducción en la formación de primordios de RLs. Este efecto ocurriría mediante el arresto de las células del periciclo en la fase G1 del ciclo celular. De acuerdo a esta observación, desarrollamos un sistema inducible de formación de RLs basado en la depleción de NO endógeno. El tratamiento de estas plantas con auxinas o NO induce el desarrollo sincronizado de RLs. El NO también induce la formación de RLs en Arabidopsis thaliana, aún en condiciones represoras como el estrés osmótico y altas concentraciones de nitrato. El NO aumenta la sensibilidad del tratamiento con auxina en la formación de RLs en Arabidopsis. El contenido de auxinas aumenta en las plantas tratadas con NO. Esto sugiere una retroalimentación positiva entre auxina y NO. Por medio de herramientas genéticas y farmacológicas demostramos que una actividad dependiente de L-arginina es requerida para la producción de NO inducida por auxinas en raíces de Arabidopsis. Finalmente, se planteó como objetivo estudiar la síntesis de celulosa en raíces de tomate. El tratamiento con bajas concentraciones de NO (pmoles) aumenta la incorporación de 14C-glucosa a celulosa mientras que el tratamiento con concentraciones más altas de NO (nmoles), la inhibe. La inhibición de la síntesis de celulosa ocurriría a nivel de pared primaria. Los niveles de transcriptos de celulosa sintasa LeCESA1 y LeCESA3 demostraron ser afectados por tratamientos con dosis altas de NO, sugiriendo que, en parte el NO afecta los niveles de celulosa a nivel de la transcripción de los genes responsables de su síntesis. En conclusión, este trabajo es un aporte original al conocimiento del rol que cumple el NO en el crecimiento y desarrollo de las raíces. 1 Introducción General Introducción General INTRODUCCIÓN GENERAL 1.- Óxido nítrico. El óxido nítrico (NO) es un radical libre de pequeña masa molecular recientemente reconocido como molécula señal de origen ancestral (Durner y col. 1999). En animales, ha sido involucrado en diversos procesos fisiológicos entre los cuales se pueden mencionar: relajación del músculo liso, inhibición de la agregación de plaquetas, neurotransmisión, apoptosis y regulación de la respuesta inmune (Schmidt y Walter 1994). En 1992, debido a su importancia en animales fue elegida “Molécula del año” por la revista Science (Koshland, Jr. 1992). Años más tarde, se fundó la Sociedad del Óxido Nítrico y una revista (Nitric Oxide: Biology & Chemistry) dedicada a difundir estudios acerca de la biología del NO. En 1998, los investigadores Robert Furchgott, Ferid Murad y Louis Ignarro fueron galardonados con el Premio Novel en Medicina por su contribución sobre las funciones que cumple el NO en el sistema cardiovascular. 1.1.- Características generales. El NO es un radical libre gaseoso. Contiene un electrón desapareado en su orbital 2p-π y carga neta cero. Por su naturaleza radical puede ganar o perder un electrón, intercambiándose en tres especies diferentes: el radical (NO·), el catión nitrosonio (NO+) y el anión nitroxilo (NO-) con distintas propiedades fisico-químicas (Stamler y col. 1992). Estas tres formas son intercambiables dentro de la célula y dependen fuertemente del estado redox de la misma. El NO radical difunde libremente en 2 Introducción General soluciones acuosas y es capaz de atravesar membranas lipídicas (Subczynski y col. 1996). Por lo tanto, una vez producido, es capaz de moverse dentro de compartimentos celulares y de célula a célula. Sin embargo, debido a su rápida oxidación la vida media es del orden de pocos segundos (Stamler y col. 1992). Estas características permiten que el NO desempeñe un rol de mensajero celular muy eficientemente, ya que es rápidamente sintetizado, capaz de extender su señal a otras células y altamente reactivo induciendo efectos definidos en la célula. La producción de NO no se encuentra restringida a animales, sino que se ha conservado durante la evolución de las especies en todos los reinos. El NO es producido con propósitos regulatorios en bacterias (Zumft 1993), protozoos (Paveto y col. 1995) y hongos (Werner-Felmayer y col. 1994, Ninnemann y Maier 1996). La emisión de NO en plantas fue observada por primera vez por Klepper (1979) en soja. Originalmente, se creía que la liberación de NO era meramente un producto de desecho provocado por la acumulación de nitritos en plantas tratadas con herbicidas (Klepper 1979). Dos décadas más tarde, se descubrió que el NO es sintetizado para cumplir diversas funciones en la fisiología de las plantas. 1.2.- Biosíntesis de NO en animales y plantas. En animales, la biosíntesis de NO es principalmente catalizada por la enzima NO sintasa (NOS; EC 1.14.13.39). Tres isoformas de NOS han sido identificadas: dos constitutivas, NOS neuronal (nNOS) y endotelial (eNOS) y una NOS inducible (iNOS; Alderton y col. 2001). Las enzimas NOS actúan como homodímeros catalizando la formación de Lcitrulina y NO a partir del sustrato L-arginina utilizando NADH y O2 como cosustratos 3 Introducción General (Alderton y col. 2001). Además requiere de los cofactores flavina mononucleótido (FMN), flavina adenina dinucleótido (FADH) y tetrahidrobiopterina (BH4). Todas las NOS poseen dos dominios: oxigenasa (conteniendo un centro hemo) y reductasa (contiene sitios de unión para NADPH, FAD y FMN). Ambos dominios están conectados por un sitio de unión a calmodulina (Alderton y col. 2001). En plantas, sin embargo, existen varias fuentes de producción de NO, enzimáticas y no enzimáticas. La producción de NO en plantas podría dividirse en dos grupos de acuerdo al sustrato: i) producción de NO a partir de L-arginina y ii) producción de NO a partir de nitrito (NO2; Fig. 1a). La existencia de NOS en plantas ha sido inferida mediante el uso de anticuerpos anti-NOS de animales (Kuo y col. 1995, Sen y Cheema 1995), detección de la actividad en extractos vegetales (Cueto y col. 1996, Ribeiro y col. 1999, Caro y Puntarulo 1999, Simontacchi y col. 2004) y mediante el uso de inhibidores específicos (Cueto y col. 1996, Bright y col. 2006, Valderrama y col. 2007). A nivel subcelular, NOS ha sido asociada a peroxisomas (Barroso y col. 1999, Corpas y col. 2001), cloroplastos (Jasid y col. 2006), mitocondrias (Kaiser y col. 2007) y citoplasma (Ribeiro y col. 1999). Sin embargo, a pesar de los indicios sobre la existencia de NOS en plantas, aún no se ha identificado la proteína responsable de la actividad. Dos reportes acerca de la identificación de la proteína NOS en plantas fueron posteriormente retractados o fuertemente cuestionados (Klessig y col. 2004, Zemojtel y col. 2006), indicando claramente que no es un estudio fácil de abordar. La enzima nitrato reductasa (NR, EC 1.6.6.2) es otra fuente importante de producción de NO en plantas (Fig. 1a). Klepper (1990) reportó que durante tratamientos con herbicidas, plantas de soja mutantes en NR emitían menores niveles de NO que 4 Introducción General plantas salvajes. Posteriormente, la capacidad de la NR de producir NO a partir de nitrito y NADH se ensayó in vitro (Yamasaki y col. 1999, Rockel y col. 2002) e in vivo (Rockel y col. 2002). Los ensayos indican que la producción de NO por la enzima NR resulta importante cuando las plantas se someten a condiciones de anoxia (Rockel y col. 2002). Otras enzimas han sido reportadas capaces de producir NO. Stöhr y col. (2001) detectaron producción de NO dependiente de nitrito en extractos de raíces tabaco. La enzima responsable se encontraría unida a membrana plasmática y fue designada como nitrito-NO reductasa (Ni-NOR; Stohr y col. 2001). Aún no ha sido clonado el gen responsable de esta actividad. Una actividad de tipo Ni-NOR también ha sido detectada en mitocondras aisladas de raíces pero no pudo ser detectada a partir de mitocondrias de hojas (Gupta y col. 2005). La producción no-enzimática de NO a partir de formas oxidadas del nitrógeno también parece ocurrir en plantas. Los pigmentos carotenoides son capaces de producir NO a partir de NO2-, en una reacción dependiente de la luz (Cooney y col. 1994). Además, se ha observado generación de NO a partir de nitrito en el apoplasto de células de la aleurona bajo condiciones reductoras y a un pH de 5,5 (Bethke y col. 2004). Parecería ser que la contribución de las distintas fuentes de NO en plantas dependería de la especie, célula o tejido involucrado, condiciones de crecimiento y fisiológicas de las plantas (Neill y col. 2003). Por otra parte, el tipo de fuente de producción de NO, especie molecular generada: NO· (radical libre sin carga), NO+ (ión nitrosonio), NO- (ión nitroxilo) y localización subcelular podrían inducir una señal específica y desencadenar una respuesta fisiológica definida en plantas. Para los fines de esta tesis, en adelante se llamará NO de manera genérica sin conocer exactamente la 5 Introducción General proporción de cada una de las tres formas en los experimentos y resultados que se describan. Fig. 1. Síntesis de óxido nítrico (NO) en plantas y reacciones químicas del NO en sistemas biológicos. (a) El NO es producido a partir de arginina (L-Arg) catalizada por una actividad óxido nítrico sintasa (NOS). El signo de pregunta (?) indica que la enzima no ha sido aún identificada en plantas. El NO además puede ser producido a partir de nitrito (NO2-) catalizado por la enzima nitrato reductasa (NR), por actividad nitrito-NO reductasa (Ni-NOR) o no enzimáticamente. (b) Una vez producido, el NO puede interactuar con metales (Me) tales como Fe, Cu o Zn para formar complejos metal-nitrosilo (Me-NO). En presencia de superóxido (O2-), el NO forma peroxinitrito (ONOO-), capaz de nitrar residuos tirosina (Tyr-NO2) u oxidar residuos cysteína (R-SOxH, R-SS-R). El NO es además capaz de nitrosilar residuos cisteína (CysNO) presentes en proteínas. En presencia de oxígeno, el NO es oxidado a NO2, el cual reacciona con NO para dar N2O3 y luego NO2- y NO3-. 1.3.- Mecanismo de acción del NO en sistemas biológicos. Una vez producido en la célula, el NO actúa principalmente a través de tres mecanismos (Fig. 1b): i) El NO es capaz de donar electrones a metales de transición tales como Fe, Cu y Zn, que forman parte de grupos prostéticos de proteínas o coordinan clusters de 6 Introducción General factores de transcripción (Stamler y col. 1992). En plantas, existen enzimas que contienen Fe cuya actividad es regulada por NO, tales como aconitasa (Navarre y col. 2000) y citocromo c oxidasa (Millar y Day 1996). Además, complejos NOleghemoglobina fueron detectados en nódulos de soja (Mathieu y col. 1998). En animales, muchos de los efectos del NO involucran la producción de GMP cíclico (cGMP) mediante la activación de la enzima guanilato ciclasa (GC). Se ha demostrado que el NO se une al Fe del motivo hemo de GC, con la consecuente activación de la enzima (Arnold y col. 1977). Se ha identificado una GC en plantas (Ludidi y Gehring 2003). Si bien la GC de Arabidopsis es insensible a NO en ensayos in vitro, se detectó un aumento de cGMP inducido por NO en extractos vegetales (Reggiani 1997, Durner y col. 1998, Pharmawati y col. 1998). Por otro lado, procesos mediados por NO en plantas parecen involucrar a cGMP (Bowler y col. 1994, Durner y col. 1998, Pagnussat y col. 2003). La capacidad del NO de controlar la actividad de algunas proteínas a través de la liberación del Zn2+ que llevan unidos, es un mecanismo demostrado en animales para la regulación de factores de transcripción, metalotioneínas y canales iónicos (Kröncke 2001). Aún no existen ejemplos sobre la ocurrencia de este mecanismo en plantas. ii) El NO reacciona con el anión superóxido para dar lugar a peroxinitrito (ONOO-), el cual puede nitrar residuos tirosina de proteínas (Fig. 1b). La nitración de proteínas es una modificación postraduccional irreversible y generalmente se encuentra asociada a efectos tóxicos generados por NO (Giasson y col. 2000, Blanchard-Fillion y col. 2001). La nitración de tirosina ocurre en plantas, aunque se le ha prestado poca atención hasta el momento. Mediante la utilización de anticuerpos anti-nitrotirosina se detectaron proteínas nitradas en una mutante de tabaco con alta tasa de liberación de NO (Morot-Gaudry-Talarmain y col. 2002) y en extractos de hojas de Olea europaea 7 Introducción General sometidas a estrés salino (Valderrama y col. 2007). Se ha propuesto el patrón de proteínas nitradas como un marcador biológico del estrés nitrosativo (Corpas y col. 2007). iii) El NO es capaz de nitrosilar residuos cisteína facilitado por un aceptor de electrones para formar nitrosotioles (Fig. 1b). Es abundante la información relativa a la S-nitrosilación de proteínas en plantas. Se trata de una modificación postraduccional semejante a la fosforilación en cuanto a reversibilidad y especificidad (Mannick y Schonhoff 2002), requiriendo de un motivo consenso dentro de la secuencia aminoacídica y un aceptor de electrones tales como NAD+, Fe2+, Zn2+ o Cu2+ (Hess y col. 2005). Reductores celulares, modificaciones en el pH, metales de transición o la luz pueden denitrosilar proteínas (Mannick y Schonhoff 2002). En plantas, varias proteínas del metabolismo relacionadas con estrés o involucradas en procesos de señalización así como factores de transcripción son blanco para este tipo de modificación postraduccional (Lindermayr y col. 2005, Lindermayr y col. 2006, Romero-Puertas y col. 2007, Belenghi y col. 2007, Romero-Puertas y col. 2008). 1.4.- Dadores y agentes secuestrantes de NO. Dada la limitada utilización del NO en forma gaseosa para el estudio de sus efectos biológicos en diversos sistemas experimentales y la corta vida media del NO, se han desarrollado diversos compuestos químicos con capacidad para liberar NO. Estos compuestos, llamados en forma genérica dadores de NO, son utilizados como herramienta farmacológica para investigar el rol del NO en la fisiología de animales, plantas y bacterias. 8 Introducción General Complejos de NO con metales de transición representan una clase importante de dadores de NO. El más comúnmente utilizado es el nitroprusiato de sodio (SNP), un dador de NO+. Una solución de SNP 100 µM libera en promedio 167 nM NO por hora en 48 horas (Beligni y Lamattina 2002). S-nitrosotioles pertenecen a otro importante grupo de dadores de NO. La descomposición de los nitrosotioles conlleva a la formación de un disulfuro y liberación de NO. Esta reacción es dependiente de parámetros tales como luz, temperatura y pH. Los dadores más frecuentemente utilizados son el nitrosoglutatión (GSNO), dador de NO+ y S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP), dador de NO· (Floryszak-Wieczorek y col. 2006). Adicionalmente, para el estudio de las funciones del NO en sistemas biológicos es importante el uso de agentes secuestrantes de NO. Entre ellos, el 2-(4-carboxifenil)4,4,5,5-tetrametilimidazolino-1 oxil -3 óxido (CPTIO) es uno de los más utilizados. La reacción del CPTIO con NO ocurre rápidamente y de forma estequiomética, liberando como producto de la reacción 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazoline 1-oxil (PTI) y NO2 en relación molar 1:1 (Maeda y col. 1994). 1.5.- Efectos fisiológicos del NO en plantas, relación con hormonas y segundos mensajeros vegetales. A partir de la década del 90’ y hasta la actualidad, numerosos reportes han sido publicados acerca de los efectos del NO en la fisiología de las plantas. Los efectos del NO en plantas se pueden dividir en dos tipos: aquéllos que ocurren en la fisiología del estrés y aquéllos relacionados con procesos del crecimiento y desarrollo. 9 Introducción General 1.5.1.- Participación del NO en respuestas de las plantas a estreses bióticos y abióticos. La participación del NO en las interacciones planta-patógeno es una de las primeras funciones del NO descriptas en plantas. El NO protege hojas de papa (Solanum tuberosum) del ataque del hongo patógeno Phytophtora infestans (Laxalt y col. 1997) y acumulado en respuesta al ataque de patógenos (Delledonne y col. 1998, Foissner y col. 2000, Laxalt y col. 2007). Se ha demostrado que el NO participa en el proceso de muerte celular programada durante la respuesta hipersensible (HR) a través de una vía que involucra Ca2+ y cGMP, causando la acumulación de transcriptos relacionados con el estrés biótico (Delledonne y col. 1998, Durner y col. 1998). La participación de una actividad de tipo NOS durante HR ha sido inferida (Delledonne y col. 1998, Durner y col. 1998). Recientemente, un estudio proteómico identificó proteínas nitrosiladas en Arabidopsis durante HR inducida por tratamiento con la bacteria patógena Pseudomonas syringae (Romero-Puertas y col. 2008). El NO ha sido asociado también a varios estreses abióticos. El tratamiento con dadores de NO previene la clorosis generada por la deficiencia de Fe en plantas y aumenta la transcripción de genes responsables de la internalización de Fe en dicotiledóneas (Graziano y col. 2002, Graziano y Lamattina 2007). El NO participa también de la respuesta de las plantas al déficit hídrico, induciendo las respuestas adaptativas para enfrentar el estrés por sequía (García-Mata y Lamattina 2001). Se demostró que el NO es requerido por la hormona ácido abscísico (ABA) durante la inducción del cierre estomático (García-Mata y Lamattina 2001). La inducción del cierre estomático por NO y ABA involucra segundos mensajeros tales como Ca2+ (García-Mata y Lamattina 2007), cGMP (Neill y col. 2002, García-Mata y col. 2003) y 10 Introducción General ácido fosfatídico (PA; Distéfano y col. 2008). El tratamiento con dadores de NO alivia diversos estreses oxidativos, tales como tratamiento con herbicidas o exposición a luz UV (Beligni y Lamattina 1999, Tesis de Doctorado, MV Beligni 2001). Por último, el estrés por daño mecánico induce la producción de NO (Huang y col. 2004, Paris y col. 2007), el cual estaría involucrado en la cicatrización de heridas (Paris y col. 2007). 1.5.2.- Participación del NO en procesos de crecimiento y desarrollo. Un campo de estudio muy importante es la participación del NO en procesos de crecimiento y desarrollo en plantas. El NO ha sido involucrado en procesos de maduración y senescencia de frutos y órganos vegetativos (Leshem y col. 1998). Se acumula rápidamente en respuesta a citoquininas (Tun y col. 2001) y media respuestas inducidas por la luz incluyendo germinación, inhibición de la elongación del hipocótilo y de-etiolación (Beligni y Lamattina 2000). Por otra parte, durante el desarrollo de xilema primario se observó un aumento en la producción de NO que conduce a la muerte celular programada y lignificación de vasos xilemáticos (Gabaldon y col. 2005). Por último, el NO controlaría el tiempo de floración en Arabidopsis (He y col. 2004). Numerosos reportes asocian al NO con respuestas mediadas por la hormona auxina. Estudios pioneros realizados por Gouvea y col. (1997) mostraron que el NO induce la elongación de raíces de maíz de forma dosis dependiente, exhibiendo un comportamiento similar al tratamiento con auxinas. En el año 2002, Pagnussat y col. reportaron que el tratamiento con auxinas induce la producción de NO durante la formación de raíces adventicias (RAs) en pepino. A partir de esta evidencia, se reportó la participación del NO en otros procesos regulados por auxinas tales como la 11 Introducción General formación de raíces laterales (RLs; Correa-Aragunde y col. 2004), gravitropismo (Hu y col. 2005) y formación de pelos radiculares (Lombardo y col. 2006). La participación del NO en la vía de transducción de señales reguladas por auxinas resulta un hecho particularmente novedoso que genera nuevas preguntas sobre la vía de señalización de esta hormona. 2.- Auxina. Las auxinas constituyen un grupo pequeño de hormonas vegetales, originalmente identificada por su rol en respuestas trópicas. Actualmente se sugiere que posee propiedades morfogenéticas análogas a hormonas presentes en el reino animal, participando en procesos que incluyen desarrollo de embrión, raíz y fruto, diferenciación de sistema vascular, crecimiento trópico y dominancia apical (Teale y col. 2006). La síntesis de auxinas ocurre principalmente en el meristema apical del tallo, aunque otros órganos también poseen la capacidad de sintetizarla (Ljung y col. 2001). Evidencias genéticas y farmacológicas apoyan la hipótesis de que el transporte de auxinas es un proceso crítico para el correcto desarrollo y crecimiento de las plantas. El transporte de auxinas es complejo y estrictamente regulado, involucrando a numerosas proteínas (Morris 2000). Estudios recientes indican que el transporte de auxinas es acompañado de procesos de secreción de vesículas y endocitosis (Baluska y col. 2003), sugiriendo que, en adición a las propiedades morfogenéticas análoga a hormonas animales, las auxinas poseen un transporte similar al descripto para neurotransmisores. Por otro lado, eventos moleculares río abajo de las auxinas son necesarios para 12 Introducción General transducir la señal de las auxinas y completar su función biológica en la célula. A pesar de la información generada a lo largo de más de 100 años de estudio respecto a la función biológica de las auxinas en plantas, el señalamiento por auxinas durante el desarrollo y crecimiento de las plantas, así como el rol específico de las moléculas involucradas en la vía de transducción aún no han sido completamente elucidados 2.1.- Mecanismos de transducción de señales regulados por auxina. El señalamiento por auxinas se encuentra íntimamente asociado a procesos de degradación de proteínas. Los receptores descriptos para auxinas son las proteínas de la familia F-box, componentes del complejo ubiquitin ligasa SCF, entre los cuales el más estudiado es TIR1 (Dharmasiri y col. 2005, Kepinski y Leyser 2005). La unión de la molécula auxina con TIR1 permite interactuar con proteínas de la familia Aux/IAA y ubiquitinarlas para su posterior degradación (Fig. 2). Las proteínas Aux/IAA son represores transcripcionales que dimerizan con los factores de transcripción de respuesta a auxina (ARF). La dimerizacion de ARF con Aux/IAA previene la unión de ARF a elementos de respuesta a auxinas (ARE) en promotores de genes. Por lo tanto, la degradación de proteínas Aux/IAA mediada por auxina permite a los factores ARF activar la transcripción de genes de respuesta a auxina (Fig. 2). 13 Introducción General Fig. 2. Señalamiento por auxina mediado por SCFTIR1. (a) Los factores de respuesta a auxina (ARF) son factores de transcripción que se unen a elementos de respuesta a auxina (ARE) en promotores de genes, mediando su transcripción. Los miembros de la familia Aux/IAA son proteínas que se unen a los ARF, inhibiendo de esta forma la transcripción de genes de respuesta a auxina. (b) La degradación mediada por ubiquitina (Ub) de las proteínas Aux/IAA es inducida por la unión de la hormona auxina a la proteína Fbox TIR1, componente del complejo SCF E3 ligasa que reconoce específicamente a las proteínas para ser degradadas. (c) En ausencia de Aux/IAA, la transcripción de los genes de respuesta a auxina es inducida. Esquema adaptado de Teale y col. (2006). Otras respuestas celulares mediadas por auxina no se encuentran tan obviamente conectadas a la degradación de proteínas y regulación génica. Por ejemplo, la auxina activa rápidamente canales de K+ y bombas de H+ en la membrana plasmática (Claussen y col. 1997, Hager 2003). Por otro lado, varios segundos mensajeros han sido involucrados en respuesta a auxina tales como el Ca2+ (Vissenberg y col. 2001), cGMP (Pagnussat y col. 2003, Hu y col. 2005) y PA (Li y Xue 2007, Lanteri y col. 2008). Recientemente, se describió la participación de la fosfatasa IBR5 en la respuesta a auxinas a través de un mecanismo de acción independiente de TIR1 (Strader y col. 2008). Con especial interés para nuestro trabajo, el NO también es requerido para varias respuestas reguladas por auxinas en el crecimiento y desarrollo del sistema radical (Lanteri y col. 2006). La pregunta que aún queda por responder es de qué manera y 14 Introducción General mediante qué mecanismos moleculares se articulan las auxinas y los segundos mensajeros, entre ellos el NO en la determinación de la arquitectura del sistema radical. 2.2.- Auxina en el crecimiento y desarrollo de raíces laterales (RLs). Numerosos estudios indican que la hormona auxina cumple un papel fundamental en el desarrollo de RLs. El bloqueo del transporte de auxinas desde el meristema apical del tallo a la raíz inhibe la formación de RLs (Reed y col. 1998, Casimiro y col. 2001, Bhalerao y col. 2002). Por el contrario, la aplicación o sobreproducción de auxina causa un incremento en los eventos de iniciación de RLs (Blakely y col. 1988, Boerjan y col. 1995). En concordancia con estas evidencias, plantas mutantes afectadas en la síntesis, transporte y metabolismo de auxina presentan defectos en el desarrollo de RLs (Casimiro y col. 2003). 3.- Importancia del estudio del crecimiento del sistema radical. El estilo de vida sésil de las plantas ha generado la evolución de estrategias adaptativas especiales para responder efectiva y rápidamente a los cambios del medio ambiente que las rodea. El sistema radical desempeña varias funciones que incluyen la absorción de agua y nutrientes, anclaje al suelo, almacenamiento de fotoasimilados, síntesis de fitohormonas, interacciones bióticas en la rizósfera y sensor de estreses (Osmont y col. 2007). Por lo tanto, el control de la estructura espacial del sistema radical es un aspecto fundamental del crecimiento, desarrollo y capacidad de adaptación de las plantas ya que les permite responder frente cambios en las condiciones ambientales y sobrevivir a 15 Introducción General situaciones adversas. El conocimiento detallado de los mecanismos que controlan la determinación del sistema radical permitiría el desarrollo de herramientas dirigidas a modular finamente el crecimiento del sistema radical. Esto permitiría optimizar el rendimiento de los cultivos en regiones con condiciones de suelo y medio ambiente menos favorables. 3.1.-. Efecto del NO en el crecimiento y desarrollo de RLs – Antecedentes. Varios procesos afectan la arquitectura del sistema radical: i) Crecimiento indeterminado de la raíz primaria, ii) la formación postembriónica de RLs y iii) la formación de pelos radicales (Osmont y col. 2007). De los factores que modelan la arquitectura del sistema radical, el desarrollo de RLs es uno de los más estudiados ya que introduce las mayores modificaciones en la arquitectura del sistema radical. En nuestro laboratorio, estudios realizados con plántulas de pepino mostraron que dadores de NO inducen la formación de raíces adventicias (RAs), mientras que el agregado de un agente secuestrante de NO bloquea la inducción de RAs inducida por auxinas (Pagnussat y col. 2002). Esta primera evidencia nos llevó a analizar otro proceso de organogénesis de raíces como es la formación de raíces laterales (RLs). Analizamos el desarrollo de RLs en plántulas de tomate (Solanum lycopersicum) tratadas con el dador de NO SNP. El NO provoca un aumento en el número de RLs en plántulas de tomate (Fig. 3a y b), de forma similar a los tratamientos con la hormona auxina. El tratamiento de plántulas con el secuestrante específico de NO CPTIO inhibe completamente el desarrollo de RLs (Fig. 3b), indicando que el NO sería requerido durante las primeras etapas de la formación de RLs. En concordancia con estos 16 Introducción General resultados, se detectó la presencia de NO asociada a primordios de RLs desde los primeros estadíos del desarrollo (Fig. 3c). En cuanto al efecto del NO en relación a las auxinas, el agente secuestrante de NO CPTIO reprime la inducción de RLs mediada por auxinas indicando que el NO participaría de la vía de transducción de auxinas (Correa-Aragunde y col. 2004). Hemos visto, además, que el NO es capaz de inducir RLs en ausencia de auxinas endógenas, en plántulas de tomate tratadas con el inhibidor del transporte de auxinas ácido naftilftalámico (NPA; Correa-Aragunde y col. 2004). En conjunto los resultados obtenidos en el laboratorio indican que el NO sería un nuevo componente en la cadena de eventos que llevan a la formación de RLs y actuaría río abajo de las auxinas. Varios interrogantes surgieron a partir de estas observaciones iniciales, los cuales llevaron al desarrollo de la presente tesis. Los capítulos I y II avanzan sobre el estudio del rol del NO en el desarrollo de primordios de RLs, regulación del ciclo celular y su relación con la hormona auxina. 17 Introducción General Fig. 3. Efecto del óxido nítrico (NO) en la formación de raíces laterales (RLs) en tomate (Solanum lycopersicum). (a) Plántulas de tomate fueron crecidas en placas de Petri conteniendo H2O (control) o diferentes concentraciones del dador de NO nitroprusiato de sodio (SNP). Número de RLs a los 5 días de tratamiento. Los asteriscos representan diferencias significativas respecto al control (t-test, P < 0,05). (b) Fotografías de plántulas de tomate crecidas durante 5 días en H2O (control), SNP 200 µM o 1 mM del agente secuestrante de NO CPTIO. Barra: 2 cm. (c) Detección de NO durante el desarrollo de primordios de RLs mediante el probe fluorescente DAF-2 DA. Plántulas de tomate fueron crecidas en H2O durante 3 días. Las raíces fueron incubadas con DAF-2 DA 15 µM durante 30 minutos y observadas por microscopía de campo claro y epifluorescencia. El panel superior muestra las células del periciclo de la raíz sin formación de primordios. La formación del primordio se hace evidente por división transversal (puntas de flecha) en células del periciclo (panel medio). El panel inferior muestra un primordio de RLs. La acumulación de NO se observa como fluorescencia verde. per: periciclo, xil: xilema. Barra: 0,1 mm. 18 Introducción General Por otro lado, observaciones de raíces tratadas con dadores de NO indicaron un efecto de acortamiento de la longitud celular y aparente engrosamiento de pared celular en raíces de tomate. Teniendo en cuenta que el NO es biológicamente activo en procesos que requieren de síntesis de pared celular tales como elongación celular (Gouvea y col. 1997), división celular (Ötvös y col. 2005) y diferenciación celular (Gabaldon y col. 2005, Lombardo y col. 2006), nos decidimos a estudiar el efecto del NO sobre la síntesis de celulosa en raíces de tomate. Los resultados obtenidos relacionados con este objetivo son presentados en el capítulo III. 19 Objetivos Objetivos OBJETIVOS El objetivo general de esta Tesis es: Contribuir al conocimiento de la biología del NO en las plantas Los objetivos particulares de esta Tesis son: − Estudiar el efecto del NO en la formación y crecimiento de raíces laterales (RLs) tanto a nivel molecular como fisiológico y avanzar en el conocimiento de la relación del NO con la fitohormona auxina. − Evaluar la participación de una actividad de tipo óxido nítrico sintasa (NOS) como fuente de NO para la formación de RLs inducida por auxinas. − Estudiar el efecto del NO en la síntesis de celulosa en raíces. 20 Materiales y Métodos Materiales y Métodos MATERIALES Y MÉTODOS 1.- Material biológico. Semillas de tomate (Solanum lycopersicum Mill. cv Ace 55) fueron germinadas durante 3 días en placas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido en agua destilada. Semillas germinadas con radícula de 2-3 mm de longitud fueron transferidas a placas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido en las soluciones correspondientes a los distintos tratamientos. Las plántulas fueron crecidas en un cuarto a una temperatura controlada de 25 ± 1 ºC y con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Para el estudio de la fuente de NO durante la formación de RLs, se utilizaron semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipos Columbia (Col-0) y mutantes de la enzima arginasa denominados argah1-1 y argah2-1 cedidas por el Dr. Joe Polacco (Departamento de Bioquímica y Grupo Interdisciplinario de Plantas, Universidad de Missouri, Columbia, Missouri, USA). Las semillas fueron esterilizadas en hipoclorito de sodio al 30 % y tritón X100 al 0,1 % por 15 minutos, lavadas exhaustivamente 3 veces en agua estéril y sembradas en el medio nutritivo ATS-agar. El medio ATS-agar contiene KNO3 5 mM; Ca(NO3)2 2 mM; MgSO4.7H2O 2 mM; KPO4 2,5 mM; H3BO3 70 µM; MnCl2 14 µM; ZnSO4 1 µM; CuSO4 0,5 µM; Na2MoO4 0,2 µM; NaCl 10 µM; CoCl2 0,01 µM; Fe-EDTA 50 µM; sacarosa 1% (p/v) y agar 0,8 % (p/v). Las placas se mantuvieron 2 días a 4 ºC y en condiciones de oscuridad para la estratificación de las semillas. Las plántulas se crecieron durante 4 días en posición vertical y luego fueron transferidas a nuevas placas conteniendo ATS-agar con los distintos tratamientos 21 Materiales y Métodos durante 4 días adicionales. Las plántulas se mantuvieron en un cuarto de cultivo a una temperatura de 25 ± 1 ºC y un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. 2.- Reactivos utilizados. Como dadores de NO se utilizaron nitroprusiato de sodio (SNP, Sigma, St Luis MO, USA) y nitrosoglutatión (GSNO). El GSNO fue preparado a partir de volúmenes equimolares de NaNO2 en HCl 0,1 M y glutatión (GSH, Sigma) en buffer fosfato pH 7. La auxina sintética ácido 1-naftil acético (NAA) fue adquirida en Sigma. Como control del efecto del NO, se utilizó el agente secuestrante específico de NO 2-(4-carboxifenil)4,4,5,5-tetrametilimidazolino-1 oxil -3 óxido (CPTIO; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). El inhibidor del transporte de auxinas ácido naftilftalámico (NPA) fue adquirido en Chemical Services (West Chester, PA, USA). El inhibidor del ciclo celular olomoucina fue adquirido en Sigma. Los inhibidores de la enzima NOS, N-nitro-Larginina (LNNA), metil ester N-nitro-L-arginina (LNAME) y N-monometil-L-arginina (LNMMA) se adquirieron en Calbiochem (San Diego, CA, USA). En los experimentos de síntesis de celulosa se utilizaron los inhibidores de síntesis de celulosa 2,6diclorobenzonitrilo (DCB) e isoxaben (IXB) adquiridos en Fluka (Buchs, Switzerland) y Sigma respectivamente. 3.- Cuantificación de raíces laterales (RLs). Semillas germinadas de tomate fueron crecidas durante 5 días en placas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido en 4 ml de la solución tratamiento según se 22 Materiales y Métodos indica en las leyendas de las figuras. Finalizado el tratamiento, se cuantificó el número de raíces laterales (RLs) por visualización directa. Se consideró RL a aquéllas que superaban los 2 mm de longitud. Plántulas de Arabidopsis de 4 días, fueron transferidas a medio ATS-agar conteniendo los tratamientos y crecidas durante 4 días adicionales. Para el ensayo de estrés osmótico, el medio ATS-agar fue suplementado con manitol 60 mM y sacarosa 4,5 % (p/v). Para el ensayo del exceso de nitrato, el medio ATS-agar fue suplementado con KNO3 hasta alcanzar una concentración de 50 mM. La cuantificación de RLs se realizó por visualización directa con ayuda de una lupa de mano. 4.- Cuantificación de primordios. Semillas germinadas de tomate fueron incubadas en los distintos tratamientos durante 3 días. La cuantificación de primordios de RLs en todo el largo de la raíz primaria se realizó a partir de preparados de raíces mediante la técnica de `squash´ y visualización en un microscopio óptico (Eclipse E 200, Nikon, Tokio). Las imágenes fueron capturadas usando una cámara digital (Coolpix 990, Nikon, Tokio), adaptada al microscopio. 5.- Cortes transversales y longitudinales de raíces. Raíces provenientes de los distintos tratamientos fueron fijadas en FAA (etanol:agua:formalina:ácido acético en volúmenes 10:7:2:1). Segmentos por debajo de la unión tallo-raíz fueron deshidratados y embebidos en Paraplast de acuerdo a 23 Materiales y Métodos D’Ambrogio de Argüeso (1986). Cortes transversales y longitudinales fueron realizados con un micrótomo tipo Minot y teñidas con azul de Toluidina. Para la visualización de la morfología de vasos conductores, las raíces fueron fijadas en FAA y los cortes transversales se realizaron a mano alzada utilizando una hoja de afeitar. La extracción de vasos xilemáticos fue realizada de acuerdo a la técnica de maceración de Boddle (D'Ambrogio de Argüeso 1986). Las muestras fueron examinadas bajo un microscopio óptico (Eclipse E 200, Nikon, Tokio). Las imágenes fueron capturadas usando una cámara digital (Coolpix 990, Nikon, Tokio), adaptada al microscopio. Los procedimientos de histología vegetal se realizaron con la ayuda de la Lic. Cristina Lombardo (Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata). 6.- Detección de NO. La producción de NO se detectó mediante la utilización de la sonda fluorescente DAF-2 DA (Calbiochem, San Diego, CA, USA). Raíces de Arabidopsis fueron incubadas en DAF-2 DA 15 µM en buffer MES 5 mM pH 5,7; KCl 250 µM y CaCl 1 mM durante 30 minutos en oscuridad y temperatura ambiente. Se realizó un lavado con buffer fresco durante 20 minutos. Posteriormente, las raíces fueron incubadas en buffer MES o en buffer más el agregado de NAA 5 µM durante 2 horas. Finalmente, las raíces fueron observadas por microscopía de fluorescencia y campo claro (Eclipse E 200, Nikon, Tokio). Las imágenes fueron capturadas usando una cámara digital (Coolpix 990, Nikon, Tokio), adaptada al microscopio. 24 Materiales y Métodos 7.- Medición del contenido de auxinas. Plantas de Arabidopsis fueron crecidas en ATS-agar durante 7 días. Las plantas fueron transferidas a placas con ATS-agar más el agregado de GSNO 50 µM o SNP 1 µM y crecidas durante 1 día. Finalmente se cosecharon plántulas (aproximadamente 1 gr) y el material fue liofilizado en condiciones de oscuridad. El contenido de auxinas se midió por cromatografía gaseosa seguida de espectrometría de masa (GC-MS) por la Dra. Eny Floh en el Departamento de Botánica de la Universidad de Sao Paulo, Brasil. 8.- RT-PCR semicuantitativa. 8.1.- Extracción de RNA. Se homogeneizaron aproximadamente 200 mg de tejido de raíz en N2 líquido. El RNA total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) de acuerdo a las instrucciones otorgadas por el fabricante. El RNA fue resuspendido en agua bidestilada estéril. La cuantificación del RNA se realizó por absorbancia a 260 nm (Abs260), considerando que una solución de ARN de concentración 40 µg/ml posee una Abs260 = 1. El RNA fue conservado a -20 ºC hasta su posterior utilización para la síntesis de DNA copia. 8.2.- Síntesis de DNA copia. 25 Materiales y Métodos Dos microgramos de RNA total fueron tratados con 1 U de la enzima DNAsa (Promega, Madison, WI, USA) e incubada a temperatura ambiente durante 15 minutos, con el fin de eliminar ADN contaminante. La reacción fue detenida por el agregado de 1 µl de EDTA 25 mM e incubación a 65 ºC durante 15 minutos. El RNA libre de DNA se utilizó para sintetizar DNA copia (cDNA) en una reacción conteniendo 100 ng de oligonucleótido poly(dT)12-18; 0,5 mM dNTPs y 200 U de transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) en un volumen de reacción de 20 µl. La reacción se incubó a 37 ºC durante 1 hora y se finalizó por incubación a 72 ºC durante 10 minutos. El cDNA sintetizado se conservó a -20 ºC hasta su utilización. 8.3.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las amplificaciones por PCR fueron realizadas utilizando 2 µl de una dilución 1/5 del cDNA; 10 pmol de los oligonucleótidos específicos; dNTP 0,2 mM y 1,5 U de la polimerasa Taq (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) en un volumen de reacción de 20 µl. Para verificar la fase exponencial de amplificación se analizó un rango de 20 a 35 ciclos de amplificación para cada par de oligonucleótidos. La Tabla 1 muestra la secuencia de los oligonucleótidos utilizados para amplificar los transcriptos de ciclinas (CYCs), quinasa dependiente de ciclina A (CDKA), celulosa sintasa (CESA) y actina junto con el tamaño de los fragmentos de amplificación esperado. Los oligonucleótidos correspondientes a ciclinas (CYCA2;1, CYCA3;1, CYCB1;1, CYCD3;1) y CDKA fueron cedidos por el Dr. Christian Chevalier (Centre de Recherche INRA, Bordeaux, Francia). Los oligonucleótidos restantes fueron sintetizados por el servicio de síntesis de Sigma. 26 Materiales y Métodos Tabla 1. Secuencias de los oligonucleótidos específicos utilizados para amplificar por PCR los transcriptos de genes que codifican para ciclinas (CYC), quinasa dependiente de ciclina A (CDKA), celulosa sintasa (CESA) y actina de tomate. Número de acceso de las secuencias de cDNA en bases de datos y el tamaño de los productos esperados en la reacción de PCR. Nombre Secuencia (5’ → 3’) Nro. de acceso Producto (pb) CYCA2;1 Sentido: TAT GAA GAA ATT TGT GCA CCT CGT G Antisentido: GGA TTG GCC ACC GAG ACT TAA AAT CAG C AJ243452a 554 CYCA3;1 Sentido: GAA TTT TGA GAT CAG TAG TCC CAC C Antisentido: GCT TGG TGA ACA TCT TTG GGG CTC G AJ243453a 472 CYCB1;1 Sentido: ATA ACA GAC AAC GCT TAT GTC AGG G Antisentido: GAC ATG ATC TAA CTT CAC ACA TTC AC AJ243454a 505 CYCD3;1 Sentido: TTA TCT TTC ATT GAT CAT ATT ATG AGG Antisentido: CTA GGT AAT CTA GAG AAC AAG ATA TCG AJ245415a 525 CDKA1 Sentido: GCT TAT TGT CAT TCT CAT AGA GTT CTT Antisentido: TCG TTG AAG CAC TCA TGC TCA AGG GC Y17225a 520 KRP2 Sentido: CCC TCA CTG CCC TCT GCT TCT G Antisentido: CAA TTT CAT CAG CCC CAC CAG C AJ441250a 450 CESA1 Sentido: TGA GAT GCA ATG GGG AGG TGT TAC Antisentido: TTT GGC GGT GAA TGG GTT GAG SGNU315440b 539 CESA2 Sentido: TAA GAA GAG GGC AGG GAA AAG AGC Antisentido: GGA GGC ATG CAA TAG AGG GAA TAC SGNU316878b 376 CESA3 Sentido: ATG GGG ACT TTG CGG AAC TCT AC Antisentido: CAC ATG GAC AAA CAA CAA GCA CAC SGNU315838b 513 SGNU313632b 272 Sentido: AAG AGC TAT GAG CTC CCA GAT GG Antisentido: TTA ATC TTC ATG CTG CTA GGA G a Números de accesos correspondientes a GenBank (NCBI) Actina b Números de acceso de Unigene (Sol Genomics Network) Finalizada la PCR, se sembraron 10 µl de los productos de amplificación en geles de agarosa 1 % (p/v) y fueron sometidos a electroforesis (10 V/cm de gel). Los geles fueron transferidos a membranas de Nylon (Hybond-N Amersham) durante toda la noche utilizando como buffer de transferencia una solución de NaOH 0,4 N. El DNA transferido fue fijado a las membranas por exposición a luz UV durante 3 minutos. Las 27 Materiales y Métodos membranas fueron conservadas a -20ºC hasta su hibridación con las sondas correspondientes. 8.4.- Marcación de sondas con 32P e hibridación de las membranas. La marcación de las sondas de CYC, CDKA y actina de tomate se llevó a cabo mediante la técnica de random priming utilizando el kit de marcación Megaprime DNA Labelling System (Amersham) de acuerdo al protocolo detallado por el proveedor, utilizando α32P-dCTP (3000 µCi/nmol). La marcación se realizó durante 30 minutos a 37 ºC en un volumen final de 20 µl y fue detenida por el agregado de 2 µl EDTA 0,2 M. Las sondas fueron purificadas mediante columnas de Sephadex G-50 en buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5; EDTA 1 mM). Las membranas se prehibridaron durante 1 hora a 65 ºC en solución Church [buffer fosfato 0,5 M pH 7,2; SDS 7 % (p/v); EDTA 10 mM]. Las hibridaciones de las membranas con las sondas se realizaron en solución Church a 65 ºC durante toda la noche. Se efectuaron dos lavados con SSC 2X (NaCl 0,3 M; citrato de sodio 0,03 M pH 7) durante 15 minutos y un lavado con SSC (2X), SDS 0,1 % (p/v) durante 30 minutos. Las membranas fueron expuestas a películas autorradiograficas en una casetera a temperatura ambiente durante 1-2 días y finalmente reveladas. 8.5.- Marcación de sondas con digoxigenina (DIG) e hibridación de las membranas. La marcación de las sondas de CESA y actina de tomate se llevó a cabo utilizando el kit de marcación DIG High Prime DNA Labeling (Roche Molecular Biochemicals, 28 Materiales y Métodos Mannheim, Germany) de acuerdo al protocolo detallado por el proveedor. La marcación se realizó durante toda la noche a 37 ºC en un volumen final de 20 µl y fue detenida por el agregado de 2 µl EDTA 0,2 M. Las membranas se prehibridaron durante 3 horas a 68 ºC en buffer de hibridación [SSC (5X); laurilsarcosina 0,1 % (p/v); SDS 0,2 % (p/v); caseína 1 % (p/v)]. La hibridación de las membranas se realizó en buffer de hibridación a 68 ºC durante toda la noche. Los lavados se efectuaron con SSC (2X); SDS 0,1 % (p/v) durante 15 minutos a temperatura ambiente (dos veces) y SSC (0,5X); SDS 0,1 % (p/v) durante 15 minutos a 42 ºC (dos veces). Las membranas se incubaron en blocking buffer [buffer ácido maleico (0,5X); caseína 0,5 % (p/v)] conteniendo el anticuerpo antiDIG conjugado a peroxidasa alcalina (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) durante 30 minutos. Se realizaron dos lavados de 15 minutos en buffer ácido maleico (1X); Tween 0,3 % (v/v). Las membranas fueron incubadas 5 minutos en TrisHCl 0,1 M pH 9,5; NaCl 0,1 M y finalmente se agregó 1 ml del reactivo CDP-Star (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Las membranas fueron rápidamente expuestas a películas autorradiográficas durante distintos tiempos y finalmente reveladas. 9.- Cuantificación del contenido de celulosa. Raíces de tomate fueron fijadas en etanol 96 % por 24 horas y secadas a 40 ºC en estufa por 48 horas. Las muestras fueron cortadas en pequeñas secciones y resuspendidas en 500 µl de una solución de ácido acético/ácido nítrico/agua (8/1/2; v/v/v) según lo descripto por Updegraff (1969). Las muestras fueron hervidas por 2 horas. La fracción ácido-insoluble, correspondiente a celulosa en estado cristalino (Peng y col. 2000), fue 29 Materiales y Métodos recuperada por centrifugación a 10.000 rpm por 10 minutos. El precipitado fue lavado con 1 ml de agua y luego con 1 ml de acetona. Finalmente, las muestras fueron secadas a 30 ºC toda la noche y resuspendidas en ácido sulfúrico al 67 % (v/v). El contenido de celulosa fue cuantificado colorimétricamente usando el método de fenol-sulfúrico descripto por Dubois (1956). Brevemente, se preparó una dilución de la muestra en 400 µl de agua destilada, se adicionó 50 µl de fenol al 5 % (p/v) y finalmente 1 ml de ácido sulfúrico 100 %. Los tubos se agitaron vigorosamente y se dejaron reposar durante 1015 minutos hasta llegar a la temperatura ambiente. Se cuantificó la absorbancia de las muestras a 490 nm. El contenido de celulosa se calculó como µg de glucosa contenida en celulosa por mg de peso seco a partir de una curva estándar realizada con una solución de glucosa de concentración conocida. 10.- Incorporación de 14C-glucosa a celulosa. Plántulas de tomate crecidas durante 2 días en agua destilada fueron transferidas a placas de Petri conteniendo un papel de filtro embebido en los distintos tratamientos durante 1 día. Cinco plántulas por tratamiento fueron luego incubadas en 1 ml de la solución tratamiento con el agregado de 0,16 µCi ml-1 [U14C]-glucosa (Perkin-Elmer Life Science, Boston, MA, USA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las plántulas fueron lavadas 2 veces con 3 ml de agua estéril y el exceso de agua fue retirado apoyando las plántulas sobre papel de filtro. Se cosecharon las raíces y se fijaron en 2 ml de etanol 96 % (v/v). Posteriormente, las raíces fueron cortadas en pequeñas secciones e incubadas en 500 µl de una solución de ácido acético/ácido nítrico/agua (8/1/2; v/v/v) según lo descripto por Updegraff (1969). Los materiales 30 Materiales y Métodos ácido-insoluble (celulosa) y ácido-soluble fueron separados mediante filtración a través de filtros de microfibra de vidrio (GF/A; 2,5 cm de diámetro; Munktell, Grycksbo, Suecia). Los filtros fueron lavados con 500 µl de una solución de ácido acético/ácido nítrico/agua (8/1/2; v/v/v) a fin de remover exhaustivamente la radiactividad soluble. La solución ácida colectada (aproximadamente 750 µl) constituye la fracción ácidosoluble. Finalmente, los filtros conteniendo la fracción ácido-insoluble fueron lavados con 10 ml de agua y 5 ml de etanol. La radiactividad en cada una de las fracciones (ácido-soluble y ácido-insoluble) se cuantificó en un contador de centelleo. El porcentaje de marca incorporada en la fracción de celulosa fue expresada de acuerdo a la siguiente ecuación: 11.- Análisis computacional. 11.1.- Densitometría de bandas en los ensayos de RT-PCR semicuantitativa. Las bandas obtenidas en los ensayos de RT-PCR semicuantitativa fueron analizadas densitométricamente mediante la utilización del programa Matrox Inspector 2.2 (Matrox Electronic System). 31 Materiales y Métodos 11.2.- Análisis y comparación de secuencias. La base de datos Sol Genomics Network (http://www.sgn.cornell.edu/), de acceso público, fue inicialmente analizada para la búsqueda de secuencias de cDNA de genes que codifican para celulosa sintasa (CESA) de tomate con homología a las CESA de papa previamente descriptas (Oomen y col. 2004). El alineamiento de las secuencias de CESA de tomate y papa fue realizado mediante la utilización del programa CLUSTALW versión 1.81 (Thompson y col. 1997). El alineamiento fue verificado y corregido manualmente con el programa GENEDOC versión 2.5.010. 11.3.- Análisis estadístico. Para la evaluación de la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos, se realizaron distintos tests estadísticos (mencionados en las leyendas de las figuras) utilizando el programa SigmaStat versión 3.1. 32 Resultados Capítulo I “Efecto del NO sobre la expresión de genes reguladores del ciclo celular durante la formación de raíces laterales en tomate” Resultados – Capítulo I I.1.- INTRODUCCIÓN I.1.1.- Formación de raíces laterales (RLs). Las RLs se originan a partir de una capa especializada de células en la raíz primaria, denominada periciclo, adyacente al haz vascular (en algunos casos se ha observado que también pueden originarse a partir de las células de la endodermis). En Arabidopsis thaliana (y la mayoría de las dicotiledóneas) la primera evidencia de la formación de RLs son divisiones anticlinales en células del periciclo localizadas adyacentes al xilema (en otras especies como cereales, maíz y arroz, se originan a partir de células adyacentes al polo floemático), formando una hilera de 8-10 células (Malamy y Benfey 1997). Las células se expanden radialmente y se dividen periclinalmente generando un primordio de dos hileras. Estas células continúan dividiéndose organizadamente para formar el primordio de RL. El primordio emerge de la raíz por elongación de las células existentes. Finalmente, el meristema apical del primordio se activa, para permitir el crecimiento organizado de la RL (Malamy y Benfey 1997). Mecanismos aún desconocidos seleccionan aquellas células del periciclo que fundarán RLs. Las células fundadoras de RLs eran originalmente consideradas diferenciadas, ocurriendo eventos de de-diferenciación durante la formación del primordio. Nuevos estudios han observado que aquellas células fundadores de RLs, continúan dividiéndose lentamente o al menos mantienen la competencia para reingresar al ciclo celular (Dubrovsky y col. 2001, De Smet y col. 2006a). 33 Resultados – Capítulo I I.1.2.- El ciclo celular en plantas El ciclo celular se compone de cuatro fases secuenciales que distinguen la replicación del material genético de la segregación de los cromosomas en dos células hijas. Las fases de síntesis de DNA (S) y mitosis (M) se encuentran separadas por fases Gap (G1 y G2). La fase G1 intercede entre la fase M anterior y la fase S. La fase G2 se encuentra entre la fase S y M (Fig. 4; Dewitte y Murray 2003, Inze y De Veylder 2006). El ciclo celular en plantas, al igual que en todos los organismos eucariotas, se encuentra controlado por la actividad de complejos de quinasas dependientes de ciclinas (CDKs), clasificadas en plantas desde la A a E (Joubes y col. 2000). Las funciones de CDKA y CDKB son las mejores documentadas. En Arabidopsis ha sido descripto un único gen para CDKA, cuya actividad se incrementa en las fases G1 y S. Los niveles de expresión de CDKA1 son elevados en células en activo crecimiento así como en células con competencia para la división celular (Hemerly y col. 1993). Las CDKs de tipo B se dividen en dos subclases y participan de la transición G2 a M (Segers y col. 1996). La actividad CDK es controlada por una gran variedad de mecanismos incluyendo unión a proteínas ciclinas, fosforilación de residuos tirosina o unión a inhibidores (Mironov y col. 1999). Las ciclinas (CYCs) han sido clasificadas en cinco tipos en Arabidopsis (tipo A, B, C, D y H) y se encuentran reguladas por procesos de transcripción y degradación controlada (Shaul y col. 1996, Genschik y col. 1998, Criqui y col. 2000). Los tipos de CYCs más importantes pertenecen a las clases A, B y D, divididas a su vez en los subgrupos A1, A2, A3, B1, B2 y D1 a D7 (Dewitte y Murray 2003). Los puntos regulatorios del ciclo celular ocurren en las transiciones de la fase G1 a S y de la fase G2 a M (Dewitte y Murray 2003). Durante la transición G1 a S, se ha 34 Resultados – Capítulo I demostrado que la asociación de CDKA1 y CYCD3 produce un complejo quinasa activo que fosforila la proteína retinoblastoma (Rb; Boniotti y Gutierrez 2001). La fosforilación de Rb resulta en la liberación del complejo E2F-DP, responsable de la transcripción de genes de la fase S (Nakagami y col. 2002). Se han descripto 7 genes que codifican para proteínas inhibitorias relacionadas a la familia Kip/Cip de animales (KRPs; De Veylder y col. 2001). Las proteínas KRPs se unen fuertemente a CDKA o CYCD (De Veylder y col. 2001), inhibiendo su actividad y la transición de la fase G1 a S (Jasinski y col. 2002, Schnittger y col. 2003). La regulación de la transición de la fase G2 a M se encontraría a cargo de CDKs de tipo A y B y de CYCs de tipo A y B (Reichheld y col. 1996, Segers y col. 1996, Joubes y col. 2000, Weingartner y col. 2003). La Fig. 4 muestra un modelo simplificado de la regulación del ciclo celular en plantas y hormonas involucradas en las transiciones de la fase G1 a S y de la fase G2 a M. 35 Resultados – Capítulo I Fig. 4. El ciclo celular en plantas. Durante la fase G1, varias hormonas tales como auxinas, citoquininas y brasinosteroides (BR) regulan la expresión de ciclinas de tipo D (CYCD) y su subunidad catalítica quinasa dependiente de ciclina A (CDKA). La activación del complejo CDKA-CYCD requiere la disociación de proteínas inhibitorias (KRP), cuya transcripción es inducida por la hormona ácido abscísico (ABA) y la fosforilación de un residuo treonina en la posición 160 (T160) de la CDKA mediada por la quinasa activadora de CDK, CDKD;1. El complejo CDK-CYCD activo fosforila la proteína retinoblastoma (Rb) en la fase G1 tardía, liberando el complejo E2F-DP que promueve la transcripción requerida para la progresión de la fase S. En la transición de la fase G2 a M las auxinas y citoquininas inducen la transcripción de quinasas de tipo A y B (CDKA/B) y ciclinas A y B (CYCA/B). La activación del complejo CDKA/B-CYCA/B en la transición de la fase G2 a M requiere la fosforilación de la CDK en la T160 por la quinasa activadora de ciclinas (CAK) y la desfosforilación de los residuos treonina en la posición 14 y tirosina en posición 15 (T14/Y15) mediado por la fosfatasa CDC25. La proteína Wee1 es responsable de la fosforilación de la CDK en los residuos T14/Y15 inhibiendo el complejo CDKA/BCYCA/B. El signo de pregunta indica una vía aún no demostrada experimentalmente. Esquema adaptado de Stals y Inze (2001). 36 Resultados – Capítulo I I.1.3.- Auxinas y el ciclo celular Las auxinas promueven la formación de RLs mediante la inducción de genes regulatorios del ciclo celular en el periciclo (Himanen y col. 2002, Himanen y col. 2004). Himanen y col. (2002) desarrollaron un sistema inducible de formación de RLs basado en la depleción de auxinas por tratamiento con el inhibidor del transporte de auxinas ácido naftilftalámico (NPA). El tratamiento con NPA causa un arresto de las células del periciclo en la fase G1 del ciclo celular (Himanen y col. 2002). La readición de auxinas al medio causa una iniciación sincronizada de RLs, mediante la inducción de la transcripción de CYCs involucradas en la fase G1 y más tardíamente CYCs de la fase G2. Por otro lado, las auxinas causan una rápida represión de la transcripción de los genes que codifican para las proteínas inhibidoras de CDK, KRP1 y KRP2 (Himanen y col. 2002), sugiriendo un rol importante en el control de la formación de RLs. En el presente capítulo, intentaremos avanzar en el conocimiento del rol del segundo mensajero NO durante el desarrollo de RLs. Hemos visto que el NO induce el desarrollo de primordios de RLs en tomate y que participa en la inducción de genes regulatorios del ciclo celular durante el desarrollo de RLs en tomate. El NO es capaz de inducir la expresión de genes que codifican para CYCs y CDK, en especial aquéllos involucrados en la transición de la fase G1 a S. 37 Resultados – Capítulo I I.2.- RESULTADOS I.2.1.- La formación de primordios en tomate. Con el objetivo de avanzar en el conocimiento de los mecanismos por el cual el NO aumenta el número de RLs, se caracterizó la formación de primordios de RLs en Solanum lycopersicum (tomate). Para ello, semillas germinadas de tomate fueron crecidas en placas de Petri conteniendo agua destilada estéril. Durante los siguientes 5 días, se cuantificó el número de primordios y RLs desarrollados. Como se muestra en la Fig. 5a, la formación de primordios resulta visible al 2do día de crecimiento. El mayor número de primordios se detectan al 3er día de crecimiento mientras que la emergencia de RLs de la raíz primaria comienza al 4to día de crecimiento (Fig. 5a). La iniciación de los primordios de RLs en tomate ocurre a partir de células del periciclo adyacentes al polo xilemático (Fig. 5b), al igual que lo reportado para Arabidopsis y otras dicotiledóneas (Malamy y Benfey 1997). Por otro lado, los primordios desarrollados en plántulas de tomate tratadas durante 3 días con la auxina sintética ácido 1-naftil acético (NAA) o con el dador de NO nitroprusiato de sodio (SNP) no presentan alteraciones morfológicas visibles respecto al tratamiento control (Fig. 5c). 38 Resultados – Capítulo I Fig. 5. Caracterización de la formación de raíces laterales (RLs) en tomate (Solanum lycopersicum). (a) Cuantificación del número de primordios y RLs en raíces de plántulas de tomate crecidas en agua durante 5 días. Los valores son el promedio y las barras representan el error estándar resultado de dos experimentos independientes (n=5). (b) Secciones transversales de raíces, mostrando distintos eventos de la formación de primordios de RLs en tomate. Las puntas de flecha indican divisiones celulares en la región de iniciación del primordio (PR). X: xilema, F: floema. (c) Morfología de los primordios de RLs en plántulas incubadas durante 3 días en agua, en la auxina ácido 1-naftil acético (NAA) 100 nM y en el dador de NO nitroprusiato de sodio (SNP) 200 µM. Los primordios de RLs fueron visualizados a partir de preparados de raíces mediante la técnica de `squash´ y utilizando microscopía óptica. Barra: 200 µm. I.2.2.- El NO induce la formación de primordios de RLs en tomate. Con el fin de evaluar el efecto del NO sobre la formación de primordios de RLs, semillas germinadas de tomate fueron crecidas en placas de Petri conteniendo la auxina NAA o el dador de NO SNP, con o sin el agregado del agente secuestrante de NO 2 -(4carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolino-1-oxil-3-óxido (CPTIO) durante 3 días. La Fig. 6 muestra que el tratamiento con SNP es capaz de inducir la formación de primordios de RLs. El número de primordios en las raíces tratadas con SNP es similar al observado por tratamiento con NAA (Fig. 6). Este resultado concuerda con el número de RLs cuantificado a los 5 días de tratamiento (Correa-Aragunde y col. 2004). El 39 Resultados – Capítulo I efecto del SNP es inhibido por el CPTIO, indicando que el NO es la molécula responsable de la iniciación de primordios de RLs en tratamientos con SNP (Fig. 6). El CPTIO, aplicado solo, causa una drástica reducción en la formación de primordios respecto del control, sugiriendo que el NO es requerido durante los primeros eventos de la formación de los primordios de RLs. Por otro lado, el CPTIO inhibe la formación de primordios inducido por NAA (Fig. 6). Este resultado apoya la hipótesis de la participación del NO en la vía de señalización por auxinas (Correa-Aragunde y col. 2004). Fig. 6. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la formación de primordios de RLs en tomate. Semillas de tomate germinadas fueron incubadas en agua, NAA 100 nM o SNP 200 µM en ausencia (barras negras) o presencia (barras grises) de 1 mM del agente secuestrante de NO CPTIO durante 3 días. En otro experimento (barras rayadas), plántulas de tomate fueron incubadas en CPTIO 1 mM durante 2 días y luego transferidas a agua, NAA 100 nM o SNP 200 µM durante 3 días. Los primordios de RLs fueron visualizados a partir de preparados de raíces mediante la técnica de `squash´ y utilizando microscopía óptica. Los valores son el promedio y las barras representan el error estándar calculado a partir de tres experimentos independientes (n=5). Letras diferentes indican diferencias significativas (ANOVA, P < 0,05). 40 Resultados – Capítulo I Himanen y col. (2002) desarrollaron un sistema inducible de formación de RLs, basado en la depleción de auxinas por tratamiento con NPA. El traspaso a un medio con auxina dispara la formación sincronizada de RLs (Himanen y col. 2002). La fuerte inhibición del CPTIO sobre la formación de primordios sugiere la posibilidad de desarrollar un sistema de sincronización similar al reportado. Plántulas de tomate fueron tratadas con CPTIO durante 2 días para prevenir la formación de primordios. Posteriormente, la transferencia a medios conteniendo NAA o SNP promueve la formación de primordios (Fig. 6). Este resultado sugiere que el tratamiento con CPTIO es reversible y que es posible generar un sistema inducible de formación de RLs basado en la depleción de NO endógeno. I.2.3.- El NO sería requerido para el establecimiento del primordio de RL inducido por auxinas. La formación de RLs se podría dividir en dos etapas principales: i) activación de la división celular en el periciclo durante la formación del primordio y ii) elongación de células del primordio durante la emergencia de la RL (Malamy y Benfey 1997). Para evaluar el requerimiento de NO en alguna o ambas etapas, semillas germinadas de tomate fueron tratadas con NAA durante 5 días con el agregado de CPTIO luego de 0, 1, 2, 3 o 4 días. La Fig. 7a muestra que la adición de CPTIO en los primeros días de tratamiento con NAA causa una reducción de hasta 5 veces en la formación de RLs. Por el contrario, se observa un efecto reducido cuando se adiciona CPTIO al 3er o 4to día de tratamiento (Fig. 7a). Estos resultados sugieren que el NO sería requerido para la activación del ciclo celular y establecimiento del primordio de RL. En acuerdo con estos 41 Resultados – Capítulo I resultados, la adición del inhibidor de CDK olomoucina (Abraham y col. 1995) a plántulas de tomate tratadas con SNP luego de 0, 1, 2, 3 y 4 días resulta en una respuesta similar (Fig. 7b). Se ha reportado que la olomoucina induce el arresto del ciclo celular en la fase G1 por inhibición de la actividad de la CDKA en suspensiones celulares de Arabidopsis y petunia (Glab y col. 1994). Fig. 7. El óxido nítrico (NO) es requerido durante los primeros eventos de la formación de primordios en tomate. (a) Semillas de tomate germinadas fueron incubadas en NAA 100 nM en las cuales se adicionó CPTIO 1 mM a tiempos 0, 1, 2, 3 y 4 días de tratamiento con NAA. (b) Semillas de tomate germinadas fueron incubadas en SNP 200 µM en las cuales se adicionó el inhibidor del ciclo celular olomoucina 50 µM a tiempos 0, 1, 2, 3 y 4 días de tratamiento con SNP. Se cuantifico el número de RLs luego de 5 días de tratamiento. Los promedios y barras de error fueron calculados a partir de tres experimentos independientes (n=5). Letras diferentes indican diferencias significativas (ANOVA, P < 0,05). I.2.4.- El NO induce la expresión de genes reguladores del ciclo celular en tomate. Basados en estos resultados, resultó interesante analizar la influencia del NO sobre la expresión de genes que participan de la regulación del ciclo celular. Raíces de tomate fueron tratadas con SNP, NAA y NAA con el agregado de CPTIO durante 1, 2 y 3 días. Se extrajo RNA y se analizaron los niveles de expresión de genes CYC y CDKA 42 Resultados – Capítulo I mediante RT-PCR semicuantitativa. La Fig. 8 muestra que el tratamiento con NAA causa la inducción de la expresión de CYCA2;1, CYCA3;1, CYCB1;1 y CYCD3;1 y CDKA1 luego de 2 días de tratamiento. El tratamiento con CPTIO provocó una inhibición en la expresión de los transcriptos CYC inducidos por tratamiento con NAA y un retraso en la expresión de CDKA1 (Fig. 8). El tratamiento con SNP provocó un aumento en la expresión de CYCA2;1, CYCD3;1 y CDKA1. La inducción de estos genes es prolongada en el tiempo observándose niveles elevados al 3er día de tratamiento. Por el contrario, el SNP no fue capaz de inducir la expresión de los genes de CYCA3;1 y CYCB1;1 (Fig. 8). Estos resultados indican que el NO modula la expresión de genes involucrados en la regulación del ciclo celular, en especial aquéllos involucrados en la transición de la fase G1 a S (CYCD3;1 y CDKA1) y que es además requerido para la inducción mediada por auxina. Fig. 8. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la expresión de genes reguladores de ciclo celular. Plántulas de tomate fueron incubadas en agua (control), SNP 200 µM, NAA 100 nM o NAA 100 nM con el agregado de CPTIO 1 mM durante 1, 2 y 3 días. Finalizado el tratamiento se extrajo RNA total de raíz, se sintetizó cDNA y se amplificaron los transcriptos correspondientes a CYCA2;1, CYCA3;1, CYCB1;1, CYCD3;1 y CDKA1 utilizando primers específicos. Se utilizó actina como control de carga de la reacción de PCR. Los productos de la reacción de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1%, transferidos a membranas de Nylon e hibridados con sondas específicas marcadas radiactivamente con 32 P. 43 Resultados – Capítulo I I.2.5.- El NO induce la expresión de genes reguladores del ciclo celular en el sistema sincronizado de formación de RLs. La ausencia de sincronía en los eventos conducentes a la formación de primordios de RLs, dificulta la atribución de un rol preciso al NO en la regulación del ciclo celular. Decidimos implementar la estrategia de sincronización desarrollada por Himanen y col. (2002) basado en la depleción de auxina. El tratamiento con el inhibidor del transporte de auxinas NPA causa un arresto de las células del periciclo en la fase G1 del ciclo celular impidiendo el desarrollo de primordios en Arabidopsis (Himanen y col. 2002). La inhibición de la formación de RLs por tratamiento con NPA también fue observado en plántulas de tomate (Correa-Aragunde y col. 2004). Dado que se ha propuesto que CYCD3 cumple un rol primordial en la transición de la fase G1 a S (Dewitte y Murray 2003), se analizó el efecto del NO en la inducción de CYCD3;1 en raíces sincronizadas por tratamiento con NPA. El análisis se realizó a tiempos cortos de activación (2 y 6 horas) tal como fue reportado por Himanen y col. (2002). La Fig. 9a muestra que la transcripción de CYCD3;1 es inducida por NAA y en menor medida por SNP luego de 2 horas de tratamiento. Este resultado indica que el NO es capaz de inducir rápidamente la expresión de CYCD3;1 en condiciones subóptimas de auxinas (Fig. 9a). CDKA1 se expresa constitutivamente en raíces tratadas con NPA (Fig. 9a), indicando que la sincronización de raíces de tomate se comporta de un modo similar a lo reportado en Arabidopsis (Himanen y col. 2002). La Fig. 9b muestra el incremento del número de RLs en tratamientos con NAA y SNP luego del tratamiento durante 2 días con NPA, evidenciando la reversibilidad del sistema. 44 Resultados – Capítulo I Fig. 9. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la expresión de CYCD3;1 y CDKA1 en el sistema inducible de tomate basado en la depleción de auxinas. Semillas germinadas de tomate fueron tratadas con NPA 5 µM durante 2 días (T0) y luego transferidas a agua, NAA 10 µM o SNP 200 µM. (a) Se extrajo RNA total de raíz luego de 2 y 6 horas de incubación, se sintetizó cDNA y se amplificaron los transcriptos correspondientes a CYCD3;1 y CDKA1 utilizando primers específicos. Los productos de la reacción de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1%, transferidos a membranas de Nylon e hibridados con sondas específicas marcadas radiactivamente con 32 P. (b) Número de RLs en plantas tratadas con NPA 5 µM durante 2 días y luego transferidas a tratamientos con H2O, NAA y SNP durante 4 días. I.2.6.- Expresión de genes reguladores del ciclo celular en el sistema sincronizado basado en la depleción de NO endógeno. Finalmente, se analizó la expresión de genes reguladores del ciclo celular en el sistema inducible desarrollado en este trabajo, basado en la depleción de NO endógeno. Plántulas de tomate fueron tratadas con CPTIO durante 2 días y luego sometidas a tratamientos con SNP o NAA. La Fig. 10a y b muestra que a T0 (2 días en presencia de CPTIO 1 mM) y el tratamiento con agua (control) los niveles de CYCD3;1 se mantienen relativamente bajos. Por el contrario, el SNP y NAA inducen la expresión de CYCD3;1 luego de 4 horas de incubación (Fig. 10a y b). La expresión del inhibidor de CDKA, KRP2, fue incluido en este estudio. Los niveles de KRP2 son elevados al T0, indicando 45 Resultados – Capítulo I una represión en la transición de la fase G1 a S del ciclo celular. Los niveles de KRP2 se incrementan luego de la transferencia a agua. Por el contrario, los tratamientos con SNP y NAA causan una drástica reducción de los niveles de KRP2 luego de 2 y 6 horas respectivamente (Fig. 10a y b). Fig. 10. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la expresión de CYCD3;1, CDKA1 y KRP2 en el sistema inducible de RLs basado en la depleción de NO endógeno. Semillas germinadas de tomate fueron tratadas con CPTIO 1 mM durante 2 días (T0) y luego transferidas a agua, NAA 100 nM o SNP 200 µM. (a) Se extrajo RNA total de raíz luego de 2, 4 y 6 horas de incubación, se sintetizó cDNA y se amplificaron los transcriptos correspondientes a CYCD3;1, CDKA1 y KRP2 utilizando primers específicos. Los productos de la reacción de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1%, transferidos a membranas de Nylon e hibridados con sondas específicas marcadas radiactivamente con 32P. (b) Análisis densitométrico de las bandas correspondientes a CYCD3;1, CDKA1 y KRP2 en los distintos tratamientos corregidos utilizando el transcripto de actina como control de carga. Los valores se presentan como número de veces respecto del T0. 46 Resultados – Capítulo I I.3.- DISCUSIÓN En este primer capítulo, hemos demostrado que la aplicación exógena de NO induce el desarrollo de primordios de RLs en tomate. Los resultados indican que el NO promueve la iniciación de RLs mediante la modulación de la expresión de genes regulatorios del ciclo celular. La formación de RLs, así como varios procesos asociados con el desarrollo y organogénesis, enfrentan eventos de iniciación asincrónicos espacial y temporalmente. Por lo tanto, estrategias para el desarrollo de sistemas sincronizados son de gran utilidad para estudiar señales y vías regulatorias que gobiernan dichos procesos. Para el proceso de desarrollo de RLs hemos desarrollado un sistema sincronizado de iniciación basado en la depleción de NO. Análisis microscópico de las raíces indica que el tratamiento con CPTIO bloquearía la formación de primordios en un estadío temprano de la formación. Proponemos a este sistema inducible como herramienta complementaria para el estudio de los eventos iniciales durante la formación de RLs. En este capítulo, se demostró que en los dos sistemas inducibles, el NO y la auxina, inducen la transcripción de CYCD3;1 mientras que los niveles de CDKA1 permanecen elevados. CYCD3 ha sido demostrada como un factor limitante e imprescindible para la efectiva transición de la fase G1 a S, dado que la sola sobreexpresión de CYCD3 en Arabidopsis o tabaco estimula la salida de la fase G1 (Nakagami y col. 2002). La expresión de CYCD3 ha sido asociada a mutantes de Arabidopsis con altos niveles de citoquininas o inducida por tratamiento con dicha hormona (Riou-Khamlichi y col. 1999). Por otro lado, se ha observado que el tratamiento con citoquininas en células de tabaco inducen la liberación de NO (Tun y 47 Resultados – Capítulo I col. 2001). El NO podría estar actuando por lo tanto, debajo de auxinas y citoquininas durante la inducción de la expresión de CYCD3 con la consecuente activación del ciclo celular. La función descripta para las proteínas KRPs es la de prevenir la formación de un complejo CYC/CDK activo que regula la transición de G1 a S, ya sea por unión a CDK o a CYCs (Wang y col. 1998, Verkest y col. 2005). La unión de KRPs al complejo CDK/CYCD previene la fosforilación de Rb (Jasinski y col. 2002). Por otro lado, la sobreexpresión de un gen que codifica para una proteína KRP en tricomas restablece el fenotipo inducido por la sobreexpresión de CYCD3 (Schnittger y col. 2003). Durante la formación de RLs en Arabidopsis, se demostró que KRP1 y KRP2 son fuertemente reprimidos por tratamiento con auxinas (Himanen y col. 2002). Los resultados presentes en este trabajo indican que KRP2 de tomate se comporta similar al de los genes KRPs en Arabidopsis ya que es fuertemente reprimido en presencia de auxinas. Además, hemos mostrado que KRP2 también es reprimido por tratamiento con NO. Un trabajo publicado paralelamente con nuestro estudio, mostró que el NO es capaz de promover la división celular y la embriogénesis en protoplastos de hojas de alfalfa (Ötvös y col. 2005). Dadores de NO estimulan la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) en el DNA mientras que inhibidores de la enzima NOS reprimen dicha incorporación. Adicionalmente, el NO es capaz de activar la quinasa SERK, proteína utilizada como marcador de embriogénesis somática. En suspensiones de células el NO induce la expresión de los genes CYCD3;1 y CYCA2;1 de alfalfa (Ötvös y col. 2005). Este estudio refuerza nuestros resultados sobre la participación del NO en el ciclo celular en plantas. Sin embargo, en el trabajo de Ötvös y col. (2005), el efecto del NO en protoplastos de alfalfa sólo ocurre en presencia de bajas 48 Resultados – Capítulo I concentraciones de auxinas. Esta discrepancia aparente con los resultados obtenidos en nuestro laboratorio indica que: i) las respuestas de tratamientos con hormonas en planta entera no refleja necesariamente lo que ocurre en cultivo de células o ii) el tratamiento con NPA no depleta completamente de auxinas al sistema de raíces de tomate. El patrón de inducción de genes presentado en este trabajo permite sugerir un modelo sencillo de participación del NO en la activación del ciclo celular en el periciclo de la raíz (Fig. 11). En tratamientos con NPA o CPTIO, las células del periciclo exhiben bajos niveles de CYCD3 y elevados niveles de KRP2. En estos tratamientos los niveles de CDKA1 permanecen elevados, indicando que las células del periciclo mantienen su competencia para la división celular (Hemerly y col. 1993). Cuando aumentan los niveles de auxinas o NO en raíces, la expresión de KRP2 disminuye rápidamente acompañado por una acumulación de CYCD3, favoreciendo su asociación con CDKA y transición de la fase G1 a S. Este estudio constituye la primera evidencia que involucra al NO en la regulación del ciclo celular en raíces de plantas. 49 Resultados – Capítulo I Fig. 11. Modelo propuesto para la activación del ciclo celular durante la formación de RLs mediado por auxinas y óxido nítrico (NO). Los tratamientos con CPTIO o NPA inhiben la formación de RLs mediante el arresto de las células del periciclo en la fase G1, evidenciado por niveles altos de KRP2 y bajos niveles de CYCD3. El tratamiento con auxinas o NO inducen la expresión de CYCD3 e inhibición de la expresión de KRP2 estimulando la transición de la fase G1 a S, con la consecuente activación del ciclo celular y formación del primordio de RL. 50 Capítulo II “Participación y fuentes de producción del NO en la señalización por auxinas durante la formación de raíces laterales en Arabidopsis thaliana” Resultados – Capítulo II II.1.- INTRODUCCIÓN La formación de RLs es un proceso interesante ya que involucra la formación de un órgano en respuesta a factores ambientales y factores intrínsecos de la planta. La plasticidad del desarrollo provee grandes ventajas a las plantas, permitiendo captar señales del ambiente e incorporarlas a las decisiones que llevan al crecimiento y desarrollo de nuevos órganos (Malamy 2005). Nuevos estudios avanzan para responder la pregunta: ¿cómo las señales ambientales son integradas y convergen en el control de la iniciación de RLs? El sistema radical es altamente influenciado por las condiciones ambientales. La adaptación del sistema radical frente a la disponibilidad de nutrientes en el suelo es uno de los mejores ejemplos que muestran la plasticidad del desarrollo de la raíz (LopezBucio y col. 2003). Por ejemplo, la disponibilidad de nitrato afecta el desarrollo de RLs de dos formas diferentes. La presencia de altas concentraciones de nitrato localizado en parches en el suelo resulta en la formación de nuevas RLs o elongación de las RLs existentes en las regiones con nitrato (Granato y Raper 1989, Zhang y Forde 1998). Por otro lado, un efecto inhibitorio sistémico en la emergencia de RLs ocurre cuando un exceso de nitrato se encuentra homogéneamente distribuido en el suelo (Zhang y col. 1999). Este efecto inhibitorio estaría mediado por una vía de señalización que involucra a la fitohormona ácido abscísico (ABA; Signora y col. 2001). El estrés osmótico también ejerce un efecto inhibitorio de la formación de RLs similar al exceso de nitrato. Plántulas de Arabidopsis crecidas bajo condiciones de baja disponibilidad de agua producen raíces cortas y la emergencia de RLs es reprimida, sin embargo la iniciación de éstas no se encuentra afectada (van der Weele y col. 2000, Deak y Malamy 2005, 51 Resultados – Capítulo II Xiong y col. 2006). El efecto inhibitorio del estrés osmótico también se encontraría mediado por ABA y es revertido por tratamiento con auxinas (Deak y Malamy 2005). El desarrollo de RLs es también regulado por otras hormonas. Etileno, brasinosteroides y citoquininas han sido implicados en la regulación de la activación del meristema en el primordio y emergencia de RLs. Las citoquininas actúan como reguladores negativos de la formación de RLs, previniendo a las células del periciclo la entrada al ciclo celular (Li y col. 2006). Por otro lado, etileno y brasinosteroides afectan la formación de RLs mediante una vía dependiente de auxinas. Se ha demostrado que los brasinosteroides actúan sinérgicamente con las auxinas promoviendo la formación de RLs (Bao y col. 2004). Los autores demostraron que los brasinosteroides estimulan el transporte de auxinas en raíces (Bao y col. 2004). Con respecto al etileno, se ha demostrado que aumenta el contenido de auxinas mediante la inducción de genes que codifican para la síntesis de triptofano, el precursor de auxinas (Stepanova y col. 2005). En este capítulo, se avanzará en el estudio del efecto del NO durante la formación de RLs en condiciones represoras de crecimiento (alta concentración de nitrato y estrés osmótico) en Arabidopsis thaliana. Además, estudiaremos el efecto del tratamiento conjunto de auxinas y NO en la formación de RLs. Por último, evaluaremos si el NO es capaz de afectar el contenido de auxinas en plantas. Por otro lado, es interesante conocer los mecanismos de síntesis de NO que participan en los distintos procesos en los cuales el NO está involucrado. El interés radica en que existen varias fuentes de producción de NO en plantas. La mayoría de los trabajos publicados hasta el momento analiza dos fuentes de producción enzimática de NO en plantas: i) una actividad dependiente de arginina conocida como óxido nítrico sintasa (NOS) y ii) una actividad nitrato reductasa (NR). Varios reportes indican que las 52 Resultados – Capítulo II auxinas inducen la producción de NO en raíces (Pagnussat y col. 2002, CorreaAragunde y col. 2004, Hu y col. 2005, Lombardo y col. 2006), sin embargo aún se desconoce la fuente de producción. En este capítulo evaluaremos si una actividad dependiente de arginina (actividad tipo NOS) es requerida para la producción de NO durante la promoción de RLs mediada por auxinas. Utilizaremos mutantes de Arabidopsis thaliana que proveen herramientas genéticas para evaluar la fuente de producción de NO durante la formación de RLs mediada por auxinas. 53 Resultados – Capítulo II II.2.- RESULTADOS II.2.1.- Los dadores de NO inducen la promoción de RLs en plántulas de Arabidopsis thaliana. Para avanzar en el conocimiento del rol que cumple el NO en la formación de RLs y estudiar la contribución de las fuentes enzimáticas que participan en este proceso, en primer lugar se evaluó el efecto de dadores de NO (GSNO y SNP) sobre la formación de RLs en Arabidopsis thaliana. Plántulas de Arabidopsis fueron crecidas en placas de Petri con medio nutritivo ATS-agar durante 4 días y luego transferidas a nuevas placas con concentraciones crecientes de los dadores de NO por otros 4 días. Como se observa en la Fig. 12a y b, los dadores de NO inducen la promoción de RLs de manera dosis dependiente, al igual que en tomate (Correa-Aragunde y col. 2004). Las concentraciones de GSNO y SNP que inducen un aumento significativo en el número de RLs en Arabidopsis son 50 µM y 1 µM, respectivamente (Fig. 12c). Es destacable que el nivel de respuesta que se obtiene aplicando dadores de NO en Arabidopsis es bastante menor respecto a lo observado en tomate. En efecto, en tomate la inducción en la formación de RLs promovida por NO alcanza valores de inducción similares al tratamiento con auxinas (Correa-Aragunde y col. 2004). En Arabidopsis, la auxina sintética NAA duplica el número de RLs respecto del tratamiento control, superando en un 50 % los valores de inducción promovido por aplicación de los dadores de NO (Fig. 12c y d). 54 Resultados – Capítulo II Fig. 12. Efecto del tratamiento con dadores de NO (SNP y GSNO) sobre la promoción de RLs en Arabidopsis thaliana. Plantas de Arabidopsis fueron crecidas en ATS-agar durante 4 días. Las plantas fueron transferidas a placas conteniendo ATS-agar más el agregado de concentraciones crecientes de SNP (a y c), GSNO (b y c) o 100 nM de la auxina NAA (c) durante 4 días. Finalizado el tratamiento se cuantificó el número de RLs. Los promedios y barras de error son resultado de al menos 5 experimentos independientes (n=5). Diferentes letras indican diferencias significativas entre los tratamientos (ANOVA, P < 0,05). (d) Fotografías mostrando el fenotipo de las plántulas control y tratadas con SNP, GSNO o NAA. Barra: 1 cm. II.2.2.- Efecto del NO en condiciones que reprimen la formación de RLs. Para avanzar en el conocimiento del rol del NO en la promoción de RLs, evaluamos si es capaz de promover el desarrollo de RLs en plantas crecidas en condiciones que reprimen la formación de RLs, tales como estrés osmótico y exceso de nitrato. Es 55 Resultados – Capítulo II conocido que tanto la reducción de la disponibilidad de agua como el exceso de nitrato en el medio reprime fuertemente la formación de RLs (Fig. 13a). Sin embargo, la iniciación de primordios de RLs no es afectada. Los primordios permanecen en estado latente hasta su activación (Deak y Malamy 2005, Malamy 2005). Con el objetivo de analizar el efecto del NO frente al estrés osmótico y exceso de nitrato en el suelo, plántulas de Arabidopsis fueron crecidas bajo estrés osmótico (manitol 60 mM, sacarosa 4,5 % (p/v); Deak y Malamy 2005) o exceso de nitrato (KNO3 50 mM; Signora y col. 2001) durante 7 días. Al día 7 de crecimiento, los primordios de RLs ya se encuentran formados en la raíz (Deak y Malamy 2005). Luego, las plantas fueron transferidas a placas en las mismas condiciones represoras más el agregado de NAA, SNP o GSNO por 4 días. La adición de auxinas exógenas revierte el efecto represor del estrés osmótico y exceso de nitrato (Fig. 13b y c; Deak y Malamy 2005). El tratamiento con dadores de NO (GSNO y SNP) también es capaz de revertir el efecto del manitol y exceso de nitrato (Fig. 13b y c), indicando que es capaz de estimular la formación de RLs aún en situaciones represoras. La represión del desarrollo de RLs en condiciones de estrés osmótico y exceso de nitrato estaría mediado por la hormona ABA (Signora y col. 2001, Deak y Malamy 2005). Experimentos realizados por De Smet y col. (2003) indicaron, sin embargo que el tratamiento con auxinas no sería capaz de revertir el efecto del ABA. De acuerdo a esto, nos preguntamos si el NO es capaz de revertir el efecto mediado por ABA. Para ello, plantas de Arabidopsis fueron crecidas en ATS-agar con el agregado de ABA 1 µM durante 7 días y luego transferidas a placas con ABA 1 µM más el agregado de SNP o GSNO por 4 días. Los valores obtenidos no resultaron significativamente distintos al control con ABA (control 4,5 ± 0,39; GSNO 5,05 ± 1,02; SNP 4,75 ± 1,08). 56 Resultados – Capítulo II Este resultado indica que el NO, al igual que las auxinas es incapaz de promover la formación de RLs en presencia de ABA. Fig. 13. Efecto del NO sobre el desarrollo de RLs en condiciones represoras de crecimiento de RLs. Plantas de Arabidopsis thaliana fueron crecidas en ATS-agar (control) o en ATS-agar más el agregado de KNO3 hasta alcanzar la concentración final de 50 mM o más el agregado de 60 mM manitol y sacarosa 4,5 % (p/v). (a) Fenotipo de las plántulas luego de 12 días de crecimiento. Barra: 1,5 cm. (b) Plantas crecidas en KNO3 50 mM durante 7 días fueron transferidas a placas con KNO3 50 mM o KNO3 más el agregado de SNP 1 µM, GSNO 10 µM o NAA 50 nM durante 4 días. (c) Plantas crecidas en manitol 60 mM, sacarosa 4,5 % (p/v) durante 7 días fueron transferidas a placas con manitol 60 mM, sacarosa 4,5 % (p/v) o manitol 60 mM sacarosa 4,5 % (p/v) más el agregado de SNP 1 µM, GSNO 10 µM o NAA 50 nM durante 4 días. Se cuantificó el número de RLs en los distintos tratamientos. Los valores son el promedio y las barras representan el error estándar de tres experimentos independientes (n=5). 57 Resultados – Capítulo II II.2.3.- El NO aumenta la sensibilidad a las auxinas durante la inducción de RLs en Arabidopsis. Se evaluó si el NO incrementa la respuesta a auxinas en la inducción de RLs, tal como lo hacen los brasinosteroides (Bao y col. 2004). Para ello, se realizaron ensayos conjuntos con auxinas y NO. Plantas de Arabidopsis de 4 días fueron transferidas a placas de Petri con concentraciones crecientes de NAA con y sin el agregado de GSNO 10 µM. El agregado de GSNO al tratamiento con NAA aumenta el número de RLs respecto al tratamiento con NAA solo (Fig. 14). Un efecto similar fue observado en tomate (resultados no mostrados). La diferencia resultó significativamente diferente (ttest, P < 0,05) cuando se ensayó la mayor concentración de NAA (100 nM). Fig. 14. El NO aumenta la respuesta a auxinas durante la promoción de RLs. Plantas de Arabidopsis fueron crecidas en ATS-agar durante 4 días. Las plantas fueron transferidas a placas conteniendo concentraciones crecientes de NAA o NAA más el agregado de GSNO 10 µM durante 4 días. Finalizado el tratamiento se cuantificó el número de RLs. Los promedios y barras de error son resultado de 5 experimentos independientes (n=5). El asterisco indica una diferencia significativa respecto al control (ttest, P < 0,05). 58 Resultados – Capítulo II II.2.4.- El NO aumenta el contenido de auxinas en Arabidopsis. Está reportado que la aplicación de auxinas aumenta los niveles de NO en raíces en varias especies vegetales (Pagnussat y col. 2003, Hu y col. 2005, Correa-Aragunde y col. 2006, Lombardo y col. 2006). Sin embargo aún no existen reportes acerca del efecto del NO sobre los niveles de auxinas, el cual podría explicar también el aumento de sensibilidad a esta hormona por tratamiento con dadores de NO. Para evaluar si el NO afecta el contenido de auxinas, plantas de Arabidopsis crecidas 7 días en ATS-agar fueron tratadas con GSNO 50 µM o SNP 1 µM durante 1 día. La Fig. 15 muestra que en planta entera, los tratamientos con GSNO y SNP aumentan el contenido de auxina libre alrededor de 60 y 100 % respectivamente. Fig. 15. Efecto del NO sobre el contenido de auxinas en Arabidopsis thaliana. Plántulas de Arabidopsis de 7 días de edad fueron transferidas a placas de Petri conteniendo ATS-agar (control) o ATS-agar más el agregado de GSNO 50 µM o SNP 1 µM durante 1 día. Las plántulas enteras fueron cosechadas y liofilizadas. La medición del contenido de auxinas se realizó por cromatografía gaseosa y espectrometría de masa (GC-MS). Los resultados del control y GSNO son el promedio de tres experimentos independientes. El resultado para SNP fue obtenido a partir de una única medición. El asterisco indica la existencia de diferencias significativas respecto del control (t-test, P < 0,05). 59 Resultados – Capítulo II II.2.5.- Inhibidores de la actividad óxido nítrico sintasa (NOS) reprimen la promoción de RLs mediada por auxinas. Para evaluar la participación de las enzimas NR y/o actividad de tipo NOS durante la promoción de RLs mediada por auxinas, realizamos ensayos en presencia de los inhibidores conocidos para NR (tungstato; Tg) y NOS (L-NAME, L-NNA y LNMMA). La aplicación de Tg fue incapaz de reprimir la formación de RLs mediada por auxinas (Fig. 16a y b). Por el contrario, la aplicación de los inhibidores de NOS, LNAME, LNAA y LMNNA son capaces de inhibir la respuesta a auxinas. El efecto drástico observado para LMNNA se mantiene aún utilizando concentraciones relativamente bajas del inhibidor (100 µM). Fig. 16. Efecto de los inhibidores de NOS y NR en la promoción de RLs mediada por auxinas. Plántulas de Arabidopsis de 4 días fueron transferidas a placas conteniendo ATS-agar más el agregado de NAA o NAA más el agregado del inhibidor de la NR (Tg 250 µM) o inhibidores de NOS (LNAME 1 mM, LNNA 1 mM, LNMMA 100 µM) o el agregado del agente secuestrante de NO (CPTIO 1 mM) durante 4 días. (a) Finalizado el tratamiento, se cuantificó el número de RLs. Los promedios y barras de error resultan de 4 experimentos independientes (n=5). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (ANOVA, P < 0,05). (b) Fotografías mostrando el fenotipo de las plántulas. Barra: 1 cm. 60 Resultados – Capítulo II El tratamiento con CPTIO también reprime la formación de RLs (Fig. 16a y b). La longitud de RLs y raíz primaria también se ven reducidas por tratamiento con los análogos inactivos de arginina (Fig. 16b). Estos resultados indicarían que una actividad dependiente de arginina sería requerida para la producción de NO mediada por auxinas durante la formación y elongación de RLs. II.2.6.- Las mutantes de Arabidopsis en las enzimas arginasa argah1-1 y argah2-1 poseen mayor contenido de NO en raíces. En los últimos años ha resultado interesante analizar el metabolismo de arginina dada su contribución en la generación de NO por ser el sustrato de la enzima NOS. La arginina es un aminoácido con un metabolismo complejo ya que es precursor no sólo de la síntesis de proteínas y NO sino también de poliaminas, urea, ornitina, prolina y glutamato (Fig. 17a). Por lo tanto, cambios en la actividad de las enzimas del metabolismo de arginina juegan un rol principal en la determinación de su destino metabólico. Se ha observado en numerosos sistemas animales que la adición de arginina o la inhibición de la actividad arginasa (enzima que degrada L-arginina a L-ornitina y urea, Fig. 17a) causan un incremento en los niveles de NO (Tenu y col. 1999, Zhang y col. 2004). Arabidopsis contiene dos genes que codifican para la enzima arginasa, llamados ARGAH1 y ARGAH2 (Krumpelman y col. 1995, Flores y col. 2008). Recientemente en el laboratorio del Dr. Joe Polacco (Departamento de Bioquímica de la Universidad de Missouri, USA) han sido caracterizados dos mutantes de las enzimas arginasa descriptas en Arabidopsis denominados argah1-1 y argah2-1 (Flores y col. 2008). La medición de actividad arginasa en las mutantes reveló que las mutantes 61 Resultados – Capítulo II argah1-1 y argah2-1 retienen alrededor del 85 % y 15 %, respectivamente, de la actividad total presente en plantas wt, Col-0 (Flores y col. 2008). La Fig. 17b muestra el fenotipo de las plantas mutantes argah. La mutante argah1-1 presenta un fenotipo sin alteraciones importantes respecto a plantas wt, mientras que las mutante argah2-1 son plantas de tamaño pequeño y color ligeramente violáceo debido probablemente a la acumulación de antocianinas. Fig. 17. Metabolismo del aminoácido L-arginina y fenotipo de mutantes de la enzima arginasa argah1-1 y argah2-1 de Arabidopsis. (a) Metabolismo del aminoácido L-arginina. Arginina puede ser sustrato de la enzima arginasa (ARGAH1, ARGAH2) para dar origen a L-ornitina y urea, de una actividad de tipo óxido nítrico sintasa (NOS) con la formación de L-citrulina y NO, y puede ser sustrato para la síntesis de proteínas y poliaminas. (b) Fenotipo de plantas de Arabidopsis mutantes en las enzimas ARGAH1 (argah1-1) y ARGAH2 (argah2-1). Barra: 1 cm. En colaboración con el laboratorio del Dr. Joe Polacco, evaluamos la producción de NO en estas mutantes, utilizando la sonda fluorescente DAF-2 DA que evidencia la presencia de NO en tejidos. La Fig. 18a muestra que las mutantes argah1-1 y argah2-1 presentan un mayor contenido de NO en condiciones basales de crecimiento respecto a 62 Resultados – Capítulo II la planta wt Col-0. Tal como se ha reportado anteriormente, el tratamiento con NAA 5 µM provoca un aumento en la acumulación de NO en raíces (Fig. 18b). Una mayor acumulación de NO es observada en las mutantes argah1-1 y argah2-1 tratadas con auxina respecto a las plantas wt. Fig. 18. Acumulación de NO en raíces de mutantes argah1-1 y argah2-1. Plantas de Arabidopsis wt (Col0) y mutantes argah1-1 y argah2-1 fueron crecidas en medio ATS-agar durante 4 días. Las plantas fueron incubadas durante 30 minutos con la sonda fluorescente DAF-2 DA 15 µM en buffer MES 5 mM pH 5,7 y lavadas en buffer fresco durante 20 minutos. Posteriormente, las plantas fueron incubadas con buffer (a) o con buffer más el agregado de NAA 5 µM (b) durante 2 horas. Las raíces fueron visualizadas en microscopía de fluorescencia y campo claro. La presencia de NO se visualiza como fluorescencia verde. Barra: 2 mm. 63 Resultados – Capítulo II II.2.7.- Las mutantes de Arabidopsis de las enzimas arginasa argah1-1 y argah2-1 son más sensibles al tratamiento con auxinas. La mayor producción de NO en las mutantes de arginasa nos llevó a evaluar la respuesta en la formación de RLs mediada por auxinas en argah1-1 y argah2-1. Para ello, plantas de Arabidopsis wt y mutantes de 4 días fueron crecidas con o sin el agregado de NAA durante 4 días adicionales. La Fig. 19a y b muestra que ambas mutantes argah presentan un mayor desarrollo de RLs en presencia de auxinas respecto al wt Col-0. Este resultado indicaría que las mutantes de arginasa poseen mayor sensibilidad al tratamiento con auxinas. Por último, el tratamiento con LNAME o CPTIO reprime la inducción de RLs mediada por auxinas en las mutantes argah (Fig. 19c). 64 Resultados – Capítulo II Fig. 19. Número de RLs en mutantes de Arabidopsis argah1-1 y argah2-1. Plantas de Arabidopsis fueron crecidas en ATS-agar durante 4 días. (a) Las plantas fueron transferidas a placas conteniendo NAA 100 nM durante 4 días. Número de RLs en plantas salvaje (Col-0) y mutantes argah1-1 y argah2-1. (b) Fotografías mostrando el fenotipo de las plántulas salvaje (Col-0) y mutantes argah1-1 y argah2-1. Barra: 0,5 cm. (c) Número de RLs en plantas argah1-1 y argah2-1 tratadas con NAA 100 nM o NAA 100 nM más el agregado de LNAME 1 mM, NAA 100 nM más CPTIO 1 mM o LNAME 1 mM sólo. Los promedios y barras de error son resultado de 4 experimentos independientes (n=5). Diferentes letras indican diferencias significativas entre los tratamientos (ANOVA, P < 0,05). 65 Resultados – Capítulo II II.3.- DISCUSIÓN En este capítulo, hemos demostrado que distintos dadores de NO (SNP y GSNO) inducen la formación de RLs en Arabidopsis thaliana, un proceso regulado por auxinas. Este resultado es similar a lo observado en tomate (Correa-Aragunde y col. 2004). Sin embargo, en Arabidopsis, la inducción de RLs por NO no alcanza los niveles generados por la hormona auxina. Las respuestas disminuidas de Arabidopsis frente a tratamientos con dadores de NO respecto a otras especies también se ha observado en otros procesos fisiológicos en los cuales el NO participa, tales como deficiencia de Fe o estrés por UV (resultados en nuestro laboratorio aún no publicados). No puede descartarse que la absorción, transporte y/o metabolismo de NO exógeno sea diferente en Arabidopsis respecto a otras especies. Para avanzar en el conocimiento de las condiciones fisiológicas y la participación del NO en la formación de RLs, se estudió el efecto del NO en dos condiciones que reprimen el crecimiento de RLs como el exceso de nitrato y el estrés osmótico. Ambos estreses reprimen el desarrollo de RLs bloqueando la activación del meristema y provocando entonces, la permanencia del primordio en estado latente. Hemos visto que el tratamiento con los dadores de NO estimulan la formación de RLs aún en condiciones en que dicha formación está reprimida. Sin embargo, al igual que las auxinas, el NO es incapaz de inducir la formación de RLs en presencia de ABA. Este resultado indica que el efecto de estrés osmótico y exceso de nitrato en el suelo sobre la formación de RLs no sería análogo al del ABA o no actuarían en la misma vía o sobre los mismos blancos de acción. Esto sugiere la existencia de un sistema de regulación de formación de RLs extremadamente complejo. Se ha reportado que el ABA induce la expresión del 66 Resultados – Capítulo II inhibidor de CDK, KRP1 (Wang y col. 1998), sugiriendo que el ABA podría participar, además, en etapas tempranas de la formación de RLs inhibiendo la activación del ciclo celular. Hemos visto que el NO sensibiliza el efecto de las auxinas en cuanto a la formación de RLs. Evaluamos la capacidad del NO de aumentar el contenido de auxinas en Arabidopsis observando que tratamientos con NO elevan el contenido de auxinas aproximadamente un 40 % respecto del control no tratado. Esto sugiere la existencia de una posible retroalimentación positiva entre auxinas y NO, las auxinas inducen un aumento de NO mientras que el NO también es capaz de aumentar el contenido de auxinas. Es necesario destacar que la medición de auxinas fue realizada en planta entera, por lo que no podemos concluir cual es la real concentración de auxinas en las raíces. Nuevas cuantificaciones del contenido de auxina discriminando parte aérea y raíz y medición del transporte de auxinas en plantas tratadas con NO serán necesarios para conocer si el aumento en el contenido de auxinas es transportado a las raíces, ejerciendo un efecto positivo en el desarrollo de RLs. Un efecto de retroalimentación positiva se ha reportado para el NO y el ácido jasmónico (JA). El tratamiento de plantas de Arabidopsis con JA induce la producción de NO en células epidérmicas de la hoja, mientras que el NO es capaz de inducir genes reguladores de la biosíntesis de JA en plantas (Huang y col. 2004). Tratamientos con etileno producen un aumento en el contenido de auxinas en Arabidopsis. Este aumento es debido a un incremento en la transcripción del gen que codifica para la enzima antranilato sintasa involucrada en la síntesis de triptofano, precursor de auxina (Stepanova y col. 2005). Sería interesante evaluar los niveles de transcriptos de esta enzima en plántulas tratadas con NO. Los resultados obtenidos proveen un importante 67 Resultados – Capítulo II avance para futuros experimentos sobre lo que sugiere una relación compleja entre auxinas y NO. Por último, analizamos la fuente de producción de NO mediada por auxinas durante la formación de RLs. Todos los inhibidores de la actividad tipo NOS utilizados (análogos de arginina) reprimen la formación de RLs mediada por auxinas. De acuerdo a esto, hemos visto que mutantes de Arabidopsis en la enzima arginasa (argah1-1 y argah2-1) poseen mayores niveles de NO en raíces y un aumento en la sensibilidad al tratamiento con auxinas. En conjunto, los resultados indican que una actividad dependiente del aminoácido arginina es requerida para la formación de RLs mediada por auxinas. Apoyando nuestras conclusiones, Ötvös y col. (2005) reportaron que el tratamiento con inhibidores de la actividad NOS bloquea la progresión del ciclo celular mediada por auxinas en células de alfalfa. El aminoácido L-arginina, como precursor de poliaminas, puede estimular también la producción de NO indirectamente. La poliamina espermina es capaz de inducir la producción de NO en Arabidopsis mediante un mecanismo aún desconocido (Tun y col. 2006). La espermina es producida a partir de putrescina, que puede ser generada a partir de arginina mediante dos rutas: i) vía arginasa a ornitina y luego a putescina por la enzima ornitina decarboxilasa (ODC) o ii) vía arginina decarboxilasa (ADC) a agmatina y luego, vía N-carbamoilputrescina a putrescina (Illingworth y col. 2003). Arabidopsis carece de la enzima ODC, pero posee dos isoenzimas ADC (Hanfrey y col. 2001, Hummel y col. 2004). La Fig. 20a presenta un modelo en el cual el aminoácido arginina y su derivado espermina son fuentes de producción de NO en Arabidopsis. En nuestro modelo, la disminución de la actividad arginasa en las mutantes argah1-1 y argah2-1 puede generar mayor arginina disponible para la actividad NOS o 68 Resultados – Capítulo II para la síntesis de espermina y otras poliaminas la cual puede también inducir la producción de NO (Fig. 20b). De acuerdo a nuestros resultados, podemos proponer que las auxinas causarían un incremento de NO en raíces mediante una vía argininadependiente, ya sea por inducción de la actividad de tipo NOS o por activación de la vía de síntesis de poliaminas. Fig. 20. Modelo simplificado de producción de NO a partir de arginina y poliaminas (espermina). (a) El aminoácido arginina es precursor para la formación de poliaminas y NO. La arginina puede producir NO vía una actividad de tipo óxido nítrico sintasa (NOS). El signo de pregunta indica que la proteína aún no ha sido identificada. Las enzimas arginasas (ARGAH1 y ARGAH2) convierten arginina en ornitina y urea. Arabidopsis carece de ornitina decarboxilasa (ODC), en el modelo la vía se muestra bloqueada. Dos reacciones enzimáticas convierten el producto de ADC, agmatina, a putrescina, un precursor de espermidina y finalmente espermina. Espermina es capaz de inducir la producción de NO mediante un mecanismo aún desconocido. (b) En las mutantes de arginasa (argah1-1 y argah2-1), disminuída la vía de producción de ornitina, la arginina se encuentra más disponible para la actividad de tipo NOS o ADC. Por otro lado, el inhibidor de la enzima NR tungstato fue incapaz de inhibir la formación de RLs mediada por auxinas. Arabidopsis contiene dos genes que codifican para la enzima NR, NIA1 y NIA2 (Cheng y col. 1991). Han sido identificados mutantes de la enzima NR en Arabidopsis basados en la resistencia selectiva de las mutantes al 69 Resultados – Capítulo II herbicida clorato (Abergs 1947). La mutante nia1-2 retiene el 90 % de la actividad NR (Wilkinson y Crawford 1991). Por otra parte, la doble mutante G’4-3 mantiene el 1 % de la actividad NR total y posee un retardo en el crecimiento cuando es crecida en NO3como única fuente de nitrógeno (Wilkinson y Crawford 1993). Analizamos la respuesta a auxinas durante la formación de RLs en las mutantes nia1-2 y G’4-3. Ensayos preliminares indicaron que ambas mutantes responden sin alteraciones al tratamiento con auxinas respecto a plantas wt (datos no mostrados). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la enzima NR no se encontraría involucrada en la formación de RLs. Sin embargo, un estudio publicado por Kolbert y col. (2007) reportaron que la mutante de Arabidopsis nula en NR nia1/nia2, presenta bajos niveles de NO en primordios de RLs en tratamientos con auxinas. Estos resultados se contraponen a lo reportado por nosotros en el presente capítulo. Los autores postulan que la enzima NR se encuentra involucrada en la formación de RLs mediada por auxinas en Arabidopsis. En conclusión, nuevos experimentos deberían realizarse para dilucidar la compleja red enzimática que controla la producción de NO inducida por auxinas durante la formación de RLs. No puede descartarse que diferentes fuentes de NO actúen en diferentes etapas del desarrollo de RLs. 70 Capítulo III “Efecto del NO sobre la síntesis de celulosa en raíces de tomate” Resultados – Capítulo III III.1.- INTRODUCCIÓN La formación de la pared celular es un determinante crítico en el crecimiento de células y órganos de la planta. La celulosa es el principal componente de la pared celular, formada por 36 cadenas lineales de β-1,4-glucosa, unidas por puentes de hidrógeno e interacciones de Van der Waals (Delmer 1999, Somerville 2006). En plantas, la celulosa se sintetiza en la membrana plasmática por estructuras conocidas como complejos terminales de rosetas. Cada complejo terminal está conformado por 6 subunidades (Mueller y Brown 1980, Kimura y col. 1999) y cada una de las subunidades contiene 6 proteínas celulosa sintasa (CESA) que sintetizan una cadena glucosídica (Herth 1983). En este contexto, 36 cadenas de β-1,4 glucosa emergen al apoplasto y cocristalizan para formar la fibra de celulosa. Las proteínas CESA son glicosiltransferasas codificadas por una familia de genes. CESA posee 8 dominios transmembrana, cuatro “dominios U” (importantes para la especificidad del sustrato y catálisis) y un motivo QxxRW esencial para la catálisis. En plantas superiores, la proteína CESA incluye una región específica de clase (CSR) que define subclases dentro de las CESA de plantas. La CSR consiste en aproximadamente 70-100 aminoácidos entre el segundo y tercer “motivo U” y se encuentra bien conservado entre ortólogos (Vergara y Carpita 2001). En Arabidopsis se han descripto diez genes que codifican para CESA, denominados de 1 a 10 (Richmond y Somerville 2000). Evidencias genéticas acerca de la función de CESA provienen de la observación de mutantes de CESA que presentan fenotipos característicos de una severa reducción del contenido de celulosa. Durante la síntesis de celulosa en la pared primaria se requiere la actividad de CESA1, CESA3 y 71 Resultados – Capítulo III CESA6 (Persson y col. 2007). La reducción en la síntesis de celulosa en la pared primaria incluye fenotipos de reducción en la longitud celular en raíces e hipocótilos y un ensanchamiento radial de las células en la raíz (Arioli y col. 1998, Fagard y col. 2000, Ellis y Turner 2001, Williamson y col. 2001, Caño-Delgado y col. 2003). Durante la síntesis de celulosa en la pared secundaria, se han identificado tres genes esenciales de CESA en Arabidopsis: CESA4, CESA7 y CESA8. Las proteínas codificadas interactúan in vivo y son requeridas para el correcto ensamblaje del complejo (Taylor y col. 2000, Taylor y col. 2003). Mutantes en dichos genes presentan un severo colapso en los vasos xilemáticos (Turner y Somerville 1997, Taylor y col. 1999, Taylor y col. 2000, Zhong y col. 2003). Evidencias relacionadas al mecanismo de regulación o participación de moléculas señales en la síntesis de celulosa son escasas (Somerville 2006). En bacterias, la síntesis de celulosa es activada por la molécula señal 3’-5’ guanosil monofosfato cíclico dimérico (c-diGMP; Römling y col. 2005). Hasta el momento no se ha encontrado c-diGMP en plantas, aunque existen indicios de que podría estar presente (Amor y col. 1991). Potikha y col. (1999) reportaron la participación de peróxido de hidrógeno (H2O2) como señal durante la síntesis de celulosa en paredes secundarias de fibras de algodón. Adicionalmente, se ha demostrado que la dimerización de proteínas CESA mediante puentes disulfuro intermoleculares ubicados en los dominios de unión a Zn (ZnBD) es regulada por el estado redox de la célula (Kurek y col. 2002). Estudios recientes indican que el dominio ZnBD en estado reducido del monómero CESA1 es rápidamente degradado, mientras que el dímero oxidado es resistente a la degradación (Jacob-Wilk y col. 2006). 72 Resultados – Capítulo III Dado que el NO pertenece al conjunto de moléculas que participan en la regulación del estado redox celular, nos preguntamos si el NO cumple un rol en la síntesis de celulosa. En el presente capítulo se mostrarán los resultados del estudio sobre el efecto del NO en la síntesis de celulosa en raíces de tomate. En particular, analizamos la morfología de la raíz, contenido de celulosa, incorporación de 14C-glucosa a celulosa y regulación de los niveles de transcriptos de genes CESA frente a distintas dosis del dador de NO SNP. 73 Resultados – Capítulo III III.2.- RESULTADOS III.2.1.- El tratamiento con NO altera el contenido de celulosa en raíces de tomate Hemos visto que el NO modifica sustancialmente la arquitectura de la raíz en tomate (Correa-Aragunde y col. 2004). Una reducción en la longitud de la raíz primaria y aumento en el número de RLs se obtiene por aplicación de SNP 200 µM (Fig. 21a). Las raíces exhiben un acortamiento del 30 % en las células corticales, cuando son tratadas con SNP 200 µM respecto al control, mientras que no se detectan diferencias en raíces tratadas con dosis más bajas de SNP (10-2 µM; Fig. 21b). El fenotipo de acortamiento celular podría estar asociado a una deficiencia en la síntesis de celulosa, sin embargo es compartido en plantas que poseen insuficiencias en la síntesis y/o en vías de señalamiento de hormonas. Para estudiar el efecto del NO sobre la síntesis de celulosa, plántulas de tomate fueron tratadas durante 4 días con el dador de NO y analizamos el contenido de celulosa en raíces. La Fig. 21c muestra que raíces de tomate tratadas con SNP 10-2 µM contienen aproximadamente un 20 % más de celulosa que raíces control (los valores absolutos son 92 ± 6 y 110 ± 5 µg de glucosa en celulosa por mg de peso seco en los tratamientos control y SNP respectivamente). Por el contrario, el tratamiento de raíces con SNP 200 µM contiene sólo el 65 % del contenido de celulosa presente en el control (Fig. 21c). 74 Resultados – Capítulo III Fig. 21. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la morfología de la raíz y contenido de celulosa en raíces de tomate. Semillas germinadas de tomate fueron mantenidas en agua (control) o tratadas con SNP 10-2 µM o SNP 200 µM durante 4 días. (a) Fotografías mostrando el fenotipo de las plantas finalizado el tratamiento. Barra: 1 cm. (b) Secciones longitudinales de raíces mostrando una reducción en la longitud celular en raíces tratadas con SNP 200 µM. Barra: 10 µm. (c) Contenido de celulosa en raíces tratadas con SNP. El contenido de celulosa, medido como µg de glucosa en celulosa por mg de peso seco fue expresado como porcentaje respecto del tratamiento control. Los valores son promedios y las barras de error son resultado de 5 experimentos independientes. Asteriscos indican diferencias significativas respecto del tratamiento control (test de Mann-Whitney, P < 0,05). III.2.2.- El NO modifica la morfología de los vasos xilemáticos. Plantas con alteraciones en la síntesis de la pared secundaria exhiben vasos xilemáticos colapsados (Turner y Somerville 1997, Turner y col. 2001). Para estudiar el efecto del NO sobre la morfología vascular, se realizaron secciones transversales de raíces tratadas y se visualizaron por microscopía de campo claro. Raíces de tomate tratadas con SNP 200 µM exhiben un aparente crecimiento anisotrópico en acuerdo con una deficiencia 75 Resultados – Capítulo III en el contenido de celulosa (Fig. 22a). Sin embargo, las raíces no exhiben colapso de vasos xilemáticos (Fig. 22a). Por el contrario, se observa un mayor número de vasos conductores en raíces tratadas con SNP 200 µM respecto de las raíces control (Fig. 22a). La Fig. 22c también muestra que la longitud de los vasos xilématicos es menor en Fig. 22. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la estructura del sistema vascular en raíces de tomate. Semillas germinadas de tomate fueron tratadas en agua (control), SNP 10-2 µM o SNP 200 µM con y sin el agregado de CPTIO 1 mM durante 4 días. (a) Secciones transversales (panel superior) y regiones magnificadas (panel inferior) mostrando elementos de floema y xilema en tratamientos control y SNP visualizadas por microscopía de campo claro. (b) Secciones transversales (panel superior) y regiones magnificadas (panel inferior) mostrando elementos de floema y xilema en tratamientos control y SNP con el agregado de CPTIO. co: corteza, ep: epidermis, fl: floema, xil: xilema. La flecha indica el fenotipo de los elementos de xilema en el tratamiento con SNP 200 µM. Barra = 150 µm. (c) Fenotipo de los vasos xilemáticos en raíces tratadas con agua (control) y SNP 200 µM durante 4 días. Cada elemento corresponde a protoxilema. Barra: 100 µm. 76 Resultados – Capítulo III las raíces tratadas con SNP 200 µM. El fenotipo producido por SNP es completamente revertido por tratamiento con el agente secuestrante de NO CPTIO (Fig. 22b). El fenotipo de los vasos xilemáticos producido por SNP 200 µM también es generado por tratamiento con la hormona auxina, dado que la hormona induce una rápida diferenciación de los vasos conductores (Aloni y Zimmermann 1983). El NO también ha sido involucrado en la diferenciación del xilema en Zinnia elegans (Gabaldon y col. 2005). En conjunto, estos resultados indican que altas dosis de NO no producen colapso de xilema y por lo tanto, no alterarían la síntesis de celulosa en paredes secundarias. Sugerimos entonces, que dosis elevadas de NO afectarían la biosíntesis de celulosa en la pared primaria en raíces de tomate. III.2.3.- El NO modula la incorporación de 14C-glucosa a celulosa. Para analizar el efecto del NO sobre la incorporación de 14 C-glucosa en celulosa, se midió la incorporación de 14C-glucosa en la fracción de pared celular insoluble en una solución de ácido acético/nítrico. Esta fracción es principalmente (1-4)-β-glucosa y es considerada celulosa en estado cristalino (Peng y col. 2000). La incorporación de 14 C- glucosa en raíces enteras (total de cuentas por minuto [cpm] incorporadas; Fig. 23a) o en la fracción enriquecida en celulosa (cpm en la fracción ácido-insoluble; Fig. 23a, inserto) muestra una respuesta lineal hasta al menos 2 horas luego de la adición del sustrato. Por lo tanto, todos los experimentos de incorporación de 14 C-glucosa fueron detenidos luego de 1 hora de la adición del sustrato. El tratamiento con el dador de NO SNP incrementa la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa en bajas concentraciones (10-3 µM a 10 µM SNP) respecto al tratamiento control (Fig. 23b). La concentración de 77 Resultados – Capítulo III SNP a la cual se alcanza un máximo de incorporación resultó ser 10-2 µM (Fig. 23b). El tratamiento con concentraciones de SNP superiores a 10 µM muestra un efecto negativo sobre la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa. El tratamiento con SNP 200 µM inhibe aproximadamente un 50 % la incorporación de 14C-glucosa respecto de plántulas no tratadas (Fig. 23b). Los datos indican que el SNP afecta la incorporación de glucosa de forma dosis dependiente. Analizamos la incorporación de 14 14 C- C-glucosa en plántulas tratadas con SNP 10-2 µM y 200 µM durante distintos tiempos de tratamiento (1, 2 y 3 días). La Fig. 23c muestra que las mayores diferencias se observan 1 día luego de la adición de SNP. No se detectaron diferencias significativas luego de 2 y 3 días de tratamiento (Fig. 23c). Este resultado se correlaciona con el tiempo de vida media de liberación de NO por parte de SNP bajo iluminación continua (t1/2 = 12 hs; FloryszakWieczorek y col. 2006). Por lo tanto, la disminución de la incorporación de 14C-glucosa a celulosa observada en el tratamiento con SNP 200 µM luego de 2 y 3 días (Fig. 23c) podría ser debido a un descenso en la tasa de liberación de NO. Este resultado, además, podría indicar que el efecto de NO sobre la incorporación de 14C-glucosa a celulosa es transiente y reversible, es decir cuando disminuyen los niveles de NO, la incorporación de 14C-glucosa se restablece en sus niveles normales. En acuerdo con esta hipótesis, el traspaso de plántulas a placas con SNP 200 µM fresco luego de 1 y 2 días mantiene inhibida la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa (Fig. 23c). Por el contrario, el traspaso de plántulas a placas con SNP 10-2 µM fresco luego de 1 y 2 días fue incapaz de mantener el incremento en la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa (datos no mostrados). 78 Resultados – Capítulo III Fig. 23. Efecto del óxido nítrico (NO) sobre la incorporación de 14 C-glucosa en celulosa en raíces de 14 tomate. (a) Análisis de la incorporación total de C-glucosa en raíces de tomate (cpm total incorporada), expresada como cpm.102 por plántula. El gráfico inserto muestra la cuantificación de cpm incorporada a la fracción celulósica. (b) Curva dosis-respuesta en la incorporación de 14C-glucosa en celulosa. Plántulas de tomate de 2 días fueron tratadas con diferentes concentraciones de SNP por 1 día. (c) Plántulas de tomate de 2 días fueron incubadas en agua (control), SNP 10-2 µM o SNP 200 µM por 1, 2 y 3 días. En otro experimento (indicado como SNP 200 µM→SNP 200 µM plántulas de tomate fueron sometidas a tratamientos con SNP 200 µM y transferidas a SNP 200 µM fresco al 1er y 2do día. La incorporación de 14 C-glucosa en celulosa se encuentra expresada como porcentaje de 14 C-glucosa en la fracción correspondiente a celulosa respecto al total de cpm incorporadas. Los valores son el promedio y las barras representan el error estándar de 4 experimentos independientes (n=5). Asteriscos indican diferencias significativas respecto al tratamiento control (test de Mann-Whitney, P < 0,05). 79 Resultados – Capítulo III El efecto del SNP sobre la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa es una respuesta específica de la molécula de NO dado que el agente secuestrante de NO CPTIO inhibe el efecto del dador (Fig. 24). Los resultados mostrados en la Fig. 24 también indican que la adición de CPTIO sólo no afecta la incorporación de 14C-glucosa a celulosa respecto a las plántulas no tratadas. Fig. 24. Efecto del agente secuestrante de NO CPTIO sobre la incorporación de 14C-glucosa en celulosa en raíces de tomate. Plántulas de tomate de 2 días fueron incubadas en agua (control), SNP 10-2 µM o SNP 200 µM con y sin el agregado de CPTIO 1 mM durante 1 día. La incorporación de 14C-glucosa en celulosa se encuentra expresada como porcentaje de 14C-glucosa en la fracción correspondiente a celulosa por el total de cpm incorporada. Los valores corresponden al promedio y el error estándar de 4 experimentos independientes (n=5). Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (ANOVA, P < 0,05). III.2.4.- Inhibidores de la síntesis de celulosa disminuyen el contenido de celulosa en raíces de tomate. El tratamiento con bajas dosis de NO es ineficaz para reestablecer el contenido de celulosa. 80 Resultados – Capítulo III Se evaluó la posibilidad de que bajas dosis de SNP fueran capaces de revertir el efecto de la disminución del contenido de celulosa causada por el tratamiento con los inhibidores específicos de la síntesis, isoxaben (IXB; Heim y col. 1990) y 2,6diclorobenzonitrilo (DCB; Debolt y col. 2007). Plantas de tomate fueron incubadas con bajas dosis de SNP más el agregado de IXB y DCB y se analizó el contenido de celulosa luego de 4 días de tratamiento. La Fig. 25 muestra que el tratamiento con los inhibidores DCB e IXB causa una reducción del 40 % y 20 % en el contenido de celulosa en raíces de tomate respecto al control respectivamente. El tratamiento con SNP no revierte el efecto de los inhibidores de celulosa, revelando valores de contenido de celulosa similar a los obtenidos en el tratamiento con los inhibidores. Fig. 25. Efecto de los inhibidores de la síntesis de celulosa DCB e IXB sobre el contenido de celulosa en raíces de tomate incubadas en presencia de bajas dosis del dador de NO SNP. Semillas germinadas de tomate fueron tratadas en agua (control) o SNP 10-2 µM con o sin el agregado de los inhibidores IXB 10 nM y DCB 0,1 µM. El contenido de celulosa, medido como µg de glucosa en celulosa por mg de peso seco fue expresado como porcentaje respecto del tratamiento control. Los valores son promedios y la barras son errores estándar de 3 experimentos independientes. Asteriscos indican diferencias significativas respecto del tratamiento control (test de Mann-Whitney, P<0,05). 81 Resultados – Capítulo III III.2.5.- Efecto del NO sobre la expresión de genes celulosa sintasa (CESA) en tomate. Mediante análisis bioinformático se identificaron tres secuencias que codifican para proteínas CESA en tomate, a las cuales llamamos SlCESA1, SlCESA2 y SlCESA3. Los tres clones de cDNA no contienen la secuencia del gen completo, careciendo aproximadamente 0,5 kb en el extremo 5’. La secuencia aminoacídica de los motivos `U´ y regiones específicas de clase (CSRs) de los tres clones fueron alineados con las cuatro secuencias correspondiente a las CESA de Solanum tuberosum (papa) previamente identificadas (Fig. 26a; Oomen y col. 2004). Las cuatro secuencias de papa codifican para proteínas CESA involucradas en la síntesis de celulosa en la pared primaria (Oomen y col. 2004). De acuerdo al porcentaje de identidad de las secuencias CSRs entre las CESA de papa y tomate (Fig. 26b), podemos predecir que las secuencias de tomate SlCESA1, SlCESA2 y SlCESA3 serían genes ortólogos de StCESA1, StCESA2 y StCESA3 respectivamente. Este resultado permite inferir el rol de los tres genes SlCESA en la síntesis de celulosa en la pared primaria en tomate. 82 Resultados – Capítulo III Fig. 26. Comparación de la secuencia aminoacídica de los ‘motivos U’ (U-2 y U-3) y regiones específicas de clase (CSR) entre CESA de tomate (Solanum lycopersicum) y papa (Solanum tuberosum). (a) Alineamiento de las sequencias StCESA1 (AY221086), StCESA2 (AY221089), StCESA3 (AY221087) y StCESA4 (AY221088) de papa, y SlCESA1 (SGN-U315440), SlCESA2 (SGN-U316878) y SlCESA3 (SGN-U315138) de tomate. El alineamiento fue generado utilizando los programas ClustalX 1.81 y GeneDoc 2.5.010. Los cuadros negros indican residuos idénticos o conservados en las 7 secuencias, cuadros gris oscuro indican residuos idénticos o conservados en 6 secuencias y recuadros gris claro residuos conservados o idénticos en 5 ó 4 secuencias. Aminoácidos no conservados se encuentran sin resaltar. Los números indican posición aminoacídica para las secuencias a comparar. Un guión (-) indica la inserción de un espacio para optimizar el alineamiento. (b) Porcentaje de identidad entre las secuencias aminoacídicas de CSR deducidas a partir de los genes CESA de tomate y papa. 83 Resultados – Capítulo III Se analizó el efecto del NO sobre la expresión de genes SlCESA mediante experimentos de RT-PCR semicuantitativa. Se extrajo RNA a partir de raíces de tomate tratados con diferentes concentraciones de SNP durante 1 día. La Fig. 27a muestra que los tres transcriptos SlCESA se expresan en raíces. El análisis densitométrico indica que no existen diferencias significativas en los niveles de CESA como resultado de tratamientos con bajas dosis de SNP (Fig. 27a y b). Un leve descenso en los niveles de transcriptos de SlCESA1 y SlCESA3 fue detectado en tratamientos con altas concentraciones de SNP (Fig. 27a y b). Fig. 27. Análisis de los niveles de transcriptos CESA en raíces de tomate tratadas con SNP. Plántulas de tomate de 2 días fueron tratadas con concentraciones crecientes de SNP por 1 día. (a) Se extrajo el RNA total de las raíces y se realizó el análisis de los niveles de transcriptos de SlCESA mediante RT-PCR semicuantitativa. Las sondas específicas fueron marcadas con digoxigenina. Los productos de amplificación presentaron el tamaño esperado de 539 pb, 376 pb y 513 pb correspondientes a LeCESA1, LeCESA2 y LeCESA3 respectivamente. (b) Análisis densitométrico de los niveles de SlCESA presentes en las autoradiografías corrigiendo las diferencias de carga en función del transcripto de actina (Matrox Inspector Inc.). Los valores son el promedio y las barras representan el error estándar de 2 experimentos independientes. 84 Resultados – Capítulo III III.3.- DISCUSIÓN El NO es una molécula involucrada en la regulación de varios procesos fisiológicos que controlan el crecimiento y desarrollo en plantas, la mayoría de estos han sido reportados en raíces. En este capítulo hemos demostrado que el NO modula la síntesis de celulosa en raíces de tomate. Tratamientos con bajas dosis de NO aumentan la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa en raíces. Los resultados indican que las concentraciones que modulan positivamente la síntesis de celulosa se encuentran en el rango de picomoles de NO. La adición de CPTIO inhibe el efecto del SNP indicando que el efecto es causado por la liberación de la molécula de NO por parte del dador. En concordancia con estos resultados, el contenido de celulosa en raíces de tomate tratadas con SNP 10-2 µM se encuentra aumentado respecto al contenido presente en el tratamiento control. Los resultados también indican que concentraciones más elevadas de SNP (200 µM, que liberan aproximadamente 200 nM NO) provocan una reducción en el contenido de celulosa en raíces. Este resultado se correlaciona con una inhibición en la elongación de células de la raíz y en la incorporación de 14C-glucosa a celulosa. Pacoda y col. (2004) mostraron una reducción en la incorporación absoluta de 14 C-glucosa en celulosa en células BY2 de tabaco tratadas con SNP. Sin embargo, cuando los valores eran expresados relativos al total de radioactividad incorporada (cpm en celulosa / cpm total) no observan diferencias respecto del control. Los autores sugieren que el descenso en la incorporación de 14 C-glucosa a celulosa podría deberse a una reducción en los niveles de UDP-glucosa. Esta discrepancia con nuestros resultados puede explicarse como resultado de las diferentes concentraciones de SNP utilizadas [500 µM en Pacoda y col. (2004); 200 µM en nuestro trabajo], el tiempo de incubación [3 horas en Pacoda y 85 Resultados – Capítulo III col. (2004); 24 horas en nuestro trabajo] o el sistema experimental utilizado [cultivo de células en Pacoda y col. (2004); raíces en nuestro trabajo]. Nuestro estudio indica que el efecto del tratamiento con SNP 200 µM es transiente y reversible. Es interesante destacar que la inhibición transiente en la incorporación de 14 C-glucosa en celulosa puede sostenerse por adición de una solución de SNP fresco. Sin embargo, el aumento producido en la incorporación de 14 C-glucosa en celulosa por el tratamiento con bajas dosis de una solución de SNP no pudo ser mantenido por adición de SNP fresco. Esto puede ser debido a una pérdida de sensibilidad del mecanismo regulatorio del complejo celulosa sintasa que modula el aumento de síntesis de celulosa y dónde el NO actúa. Las proteínas CESA están codificadas por una familia de genes en todas las plantas estudiadas hasta el momento, incluyendo algodón (Pear y col. 1996), maíz (Appenzeller y col. 2004), cebada (Burton y col. 2004), papa (Oomen y col. 2004), Populus tremuloides (Joshi 2003) y Arabidopsis (Richmond y Somerville 2000). A partir de bases de datos de cDNA, hemos identificado tres secuencias CESA de tomate. De acuerdo al porcentaje de identidad de las CSRs, sugerimos que los genes de tomate SlCESA1, SlCESA2, SlCESA3 serían ortológos a StCESA1, StCESA2 y StCESA3 de papa respectivamente y participarían de la síntesis de celulosa en la pared primaria. El análisis de expresión muestra que los 3 genes se expresan en raíces de tomate. El tratamiento con SNP 200 µM inhibe levemente la expresión de CESA1 y CESA3. Este resultado indica que la inhibición del contenido de celulosa e incorporación de 14 C- glucosa en celulosa por tratamiento con SNP 200 µM puede ser debida en parte a una disminución en los niveles de transcriptos de CESA1 y CESA3. El mecanismo molecular del efecto estimulatorio de la síntesis de celulosa por tratamiento con bajas dosis de SNP no se conoce aún en detalle. El análisis de 86 Resultados – Capítulo III transcriptos CESA indicaría que la regulación no sería a nivel transcripcional. Sin embargo no se puede descartar la posibilidad de la regulación de otros genes CESA no evaluados en este trabajo. Bajas dosis de SNP no rescata el tratamiento con inhibidores de la síntesis de celulosa IXB y DCB. Kurek y col. (2002) han demostrado que la dimerización de subunidades catalíticas de CESA ocurre por oxidación de sus motivos de unión a Zn. El modelo postula que la oxidación de los dominios Zn por H2O2 provoca la liberación de iones Zn con la consecuente formación del puente disulfuro intermolecular. La liberación de Zn de proteínas es un mecanismo de acción del NO descripto en animales para la regulación de la actividad de factores de transcripción (Kröncke y Carlberg 2000), canales de voltaje (Wang y col. 2007) y metalotioneínas (Katakai y col. 2001, Spahl y col. 2003). Sería interesante evaluar entonces la capacidad del NO de interrumpir la unión de Zn a los motivos específicos de CESA, lo cual conduciría a la dimerización de las subunidades y por lo tanto a una regulación positiva del complejo CESA a nivel postraduccional. La relevancia fisiológica de la inhibición de la síntesis de celulosa también es interesante ya que varios estreses bióticos y abióticos desencadenan un estallido de NO localizado en la zona afectada. La acumulación de NO funciona como señal en los mecanismos de respuesta de las plantas al ataque de patógenos, daño mecánico y estrés por sequía (Lamattina y col. 2003, Neill y col. 2003). Por otro lado, estudios recientes indican que la inhibición de la síntesis de la pared celular desencadena respuestas de defensa en plantas. Se ha reportado que el mutante cev1 en CESA3 de Arabidopsis con niveles reducidos de celulosa en raíces posee expresión constitutiva de genes de respuesta a estrés y una producción incrementada de ácido jasmónico y etileno (Ellis y col. 2002). Consistente con estos resultados, otro mutante en CESA3, eli1, presenta 87 Resultados – Capítulo III raíces lignificadas y respuestas de defensa incrementadas (Caño-Delgado y col. 2003). Mutaciones en CESA8 confieren resistencia a varios patógenos (Hernandez-Blanco y col. 2007) y un aumento de la tolerancia a estrés osmótico por sequía (Chen y col. 2005). Estos resultados indican que una inhibición de la síntesis de celulosa tanto en pared primaria como en secundaria sería suficiente para desencadenar respuestas de defensa en plantas. Sería interesante evaluar si existe una relación entre la inhibición de la síntesis de celulosa por NO y los mecanismos postulados por los cuales el NO regula respuestas de defensa en plantas. 88 Discusión Final y Conclusiones Discusión Final y Conclusiones DISCUSIÓN FINAL Y CONCLUSIONES En la última década, numerosos reportes acerca de los efectos del NO en plantas han sido reportados. Los primeros trabajos evidenciaban el efecto antioxidante del NO, aliviando las consecuencias del estrés oxidativo generado por ataque de patógenos, exposición a luz UV y tratamientos con herbicidas metilviológenos. Sin embargo, un poco más tarde, surgió una segunda línea de investigaciones acerca del efecto del NO como regulador del crecimiento y desarrollo en plantas. En este trabajo hemos demostrado que el NO está involucrado en la regulación de la morfología y arquitectura radical en plantas. 1.- La formación de raíces laterales. Rol del NO. La mayor parte del crecimiento y diferenciación de las plantas ocurre postembriónicamente. Las plantas germinan con un rudimentario sistema radical y tallo (una raíz primaria simple y dos hojas embrionarias). El crecimiento y desarrollo del sistema radical y aéreo implica que nuevas raíces y hojas son adicionadas a medida que la planta crece. El sistema radical es formado a través de un programa reiterativo en el cual RLs son formadas a lo largo de otras raíces. La formación de RLs consiste en 4 pasos: i) estimulación y activación de células fundadores en el periciclo, ii) entrada al ciclo celular y divisiones asimétricas para dar lugar al primordio, iii) emergencia de la RL por expansión celular y iv) activación del meristema de la RL (Malamy y Benfey 1997). El correcto desarrollo de cada uno de los pasos mencionados se encuentra controlado fundamentalmente por las auxinas. La Fig. 28 muestra los avances que 89 Discusión Final y Conclusiones hemos realizado durante el desarrollo de este trabajo sumado al conjunto de conocimientos que se tenían al inicio esta tesis respecto de la regulación del desarrollo de RLs por hormonas y factores ambientales. En este trabajo hemos demostrado que el NO, al igual que las auxinas, promueve la iniciación de primordios de RLs en tomate. Esta promoción se debería a la activación del ciclo celular en células fundadoras de RLs en el periciclo de la raíz. El NO estaría río abajo de las auxinas y sería requerido para la inducción de genes reguladores del ciclo celular durante la formación de RLs. La participación del NO río abajo de las auxinas ya ha sido demostrada para otros procesos en raíces como la formación de raíces adventicias (Pagnussat y col. 2002), pelos radicales (Lombardo y col. 2006) y gravitropismo (Hu y col. 2005). Hemos visto además, que plantas depletadas de NO por tratamiento con CPTIO exhiben una drástica reducción en la formación de primordios de RLs. Este efecto ocurriría por inhibición de la transición de la fase G1 a S del ciclo celular. De acuerdo a esta observación, desarrollamos un sistema inducible de formación de RLs basado en la depleción de NO endógeno. El traspaso de estas plántulas a auxinas o NO reducen drásticamente los niveles del transcripto de KRP2 y aumenta los niveles del transcripto de CYCD3, provocando de esta manera la inducción sincronizada de la formación de RLs (Fig. 28). Este trabajo constituye el primer reporte de la participación del NO en la regulación del ciclo celular en raíces de plantas. En el capítulo II se describen los avances en el conocimiento de la relación entre las auxinas y NO y en las fuentes de producción de NO en raíces. La formación de RLs en respuesta a tratamientos con NO descripta en tomate es reproducible en otra especie como Arabidopsis thaliana, aunque esta respuesta es de menor intensidad. Varios reportes indican que existe una regulación ambiental en la formación de RLs. 90 Discusión Final y Conclusiones Analizamos el efecto del NO bajo condiciones que afectan negativamente la formación de RLs tales como el estrés osmótico y exceso de nitrato, las cuales causan una inhibición de la emergencia de RLs. El NO fue capaz de desbloquear el efecto inhibitorio de formación de RLs en las dos condiciones analizadas (Fig. 28). Se ha señalado que las respuestas a ambos estreses se encuentran mediadas por mensajeros secundarios que participan en la vía de señalización por ABA (Signora y col. 2001, De Smet y col. 2003, Deak y Malamy 2005). Por otro lado, se cree que el ABA estaría actuando además, en etapas bien tempranas del desarrollo del primordio (Fig. 28; Wang y col. 1998, De Smet y col. 2006b). Analizamos la adición conjunta de auxinas y NO, detectando un aumento en la respuesta de formación de RLs. Este resultado indicaría que el NO aumenta la sensibilidad de las raíces a auxinas. Por otro lado, existen reportes indicando que ciertas hormonas tales como etileno y brasinosteroides afectan el contenido de auxinas en raíces (Fig. 28; Bao y col. 2004, Stepanova y col. 2005). Estas evidencias nos llevaron a analizar el contenido de auxinas en plantas tratadas con NO, detectando un aumento en el contenido de auxinas. Esta observación resulta muy interesante ya que brinda indicios sobre la existencia de una retroalimentación positiva entre auxinas y NO que podría estar relacionada con el aumento de sensibilidad a auxinas mediada por NO. Las auxinas cumplen un papel muy importante no sólo durante el crecimiento de las plantas, sino durante el desarrollo y respuestas a cambios ambientales. La capacidad de aumentar el contenido de auxinas es de gran importancia agronómica. Futuros experimentos serán necesarios para definir a través de qué mecanismos el NO es capaz de inducir la biosíntesis de auxinas en plantas. 91 Discusión Final y Conclusiones Fig. 28. Participación de NO durante la formación de raíces laterales (RLs). Las auxinas inducirían la activación del ciclo celular en raíces mediante una vía que depende de NO. Una actividad de tipo óxido nítrico sintasa (NOS) estaría involucrada en la producción de NO mediada por auxinas durante la formación de RLs. El signo de interrogación significa que la proteína aún no ha sido identificada en plantas. En cada una de las etapas de la formación de RLs, se indica la participación del NO y hormonas clave. P: periciclo, En: endodermis, Co: corteza, Epi: epidermis. BR: brasinosteroides, ABA: ácido abscísico, −ı: inhibición. Figura adaptada de Nibau y col. (2008). 2.- Mecanismos moleculares involucrados en la vía de señalización inducida por auxinas. Participación del NO. Evidencias recientes avalan la presencia de dos mecanismos de acción de las auxinas: i) una vía dependiente del receptor de auxinas TIR1 y ii) una vía independiente de TIR1. En el mecanismo TIR1-dependiente, las auxinas se unen a la proteína F-box TIR1 promoviendo la degradación específica de los represores Aux/IAA estimulando de esta manera la transcripción de genes involucrados en la respuesta primaria a auxinas (Dharmasiri y col. 2005, Kepinski y Leyser 2005). Por otro lado, el mecanismo TIR1independiente fue recientemente reportado durante el análisis de mutantes de Arabidopsis de la fosfatasa IBR5. Los mutantes ibr5 presentan resistencia a auxinas 92 Discusión Final y Conclusiones pero no presentan alteraciones en la respuesta a TIR1 ni cambios en la estabilidad de los represores transcripcionales Aux/IAA (Strader y col. 2008). En una colaboración de nuestro laboratorio con el laboratorio de la Dra. Claudia Casalongué (IIB,UNMdP), se ha avanzado en relación al rol molecular del NO en la vía de transducción de auxinas. Se ha observado que el NO promueve la degradación de Aux/IAA mediante un incremento en la interacción entre dichas proteínas y TIR1 (Tesis de Doctorado, MC Terrile 2008). Además el tratamiento con el secuestrante de NO CPTIO inhibe la expresión de genes que codifican para Aux/IAA inducida por tratamiento con auxinas (Tesis de Grado, N Correa-Aragunde 2004). Por lo tanto se podría concluir que el NO participa de una vía TIR1-dependiente. Futuros estudios permitirán obtener avances en el entendimiento de cómo las auxinas y el NO actúan coordinadamente para controlar diversos procesos del crecimiento y desarrollo en plantas. En particular, nuestro laboratorio posee especial interés en estudiar: i) la capacidad del NO de S-nitrosilar TIR1 y regular de esta forma su actividad y ii) estudiar el patrón de proteínas Snitrosiladas en raíces tratadas con auxinas. Nuevos estudios deberán ser abordados para determinar otros componentes en la red de señales durante la organogénesis de raíces como también para descifrar el rol específico del NO en la vía de señalamiento desencadenada por auxinas. 3.- Fuentes enzimáticas de producción de NO durante el desarrollo de raíces. En el capítulo II observamos que inhibidores de la enzima NOS (análogos de arginina) causan una inhibición de la inducción de RLs mediada por auxinas. Este resultado sugiere la participación de una actividad de tipo NOS (dependiente de arginina) 93 Discusión Final y Conclusiones involucrada en la formación de RLs mediada por auxinas. Dado que la proteína NOS en plantas no ha sido aún identificada, utilizamos mutantes de la enzima arginasa (mutantes argah) con la idea de aumentar el pool endógeno de arginina, sustrato de una NOS putativa de plantas. Estas mutantes presentan mayores niveles de NO en raíces y una aumentada sensibilidad al tratamiento por auxinas. Por otro lado, la producción de NO también podría ser producto de la actividad ADC, vía la formación de espermina (Tun y col. 2006). Las evidencias refuerzan la hipótesis del requerimiento de una actividad dependiente de arginina para la producción de NO en respuesta a auxinas. La contribución de una actividad dependiente de arginina se suma a la actividad NR ya reportada durante la formación de RLs mediada por auxinas (Kolbert y col. 2008). Sin embargo, nuestros experimentos, utilizando inhibidores de la actividad NR, no apoyan los resultados observados por Kolbert y col. (2008). En este trabajo, observamos un efecto inhibitorio en la promoción de RLs inducido por auxina cuando utilizamos tres inhibidores de la actividad NOS (LNAME, LNNA, LNMMA). Hemos visto que el tratamiento con LNMMA 100 µM es capaz de causar una drástica inhibición de la formación de RLs y longitud de la raíz primaria. Kolbert y col. (2008) mostraron que raíces tratadas con LNMMA 1 mM presentan producción de NO (detectados con la sonda fluorescente DAF-2 DA) en los primordios de RLs. Estas diferencias pueden deberse a que Kolbert y col. (2008) utilizaron plantas de 3 semanas de edad con raíces completamente desarrolladas, mientras que en nuestro trabajo utilizamos plántulas de 4 días de edad. Podemos especular que, durante distintas etapas del desarrollo de la plantas, distintas fuentes enzimáticas de NO sean requeridas para el desarrollo de RLs. 94 Discusión Final y Conclusiones 4.- Óxido nítrico y síntesis de celulosa en raíces. Finalmente, en el capítulo III describimos el efecto del NO en la síntesis de celulosa en raíces de tomate. Hemos visto que el tratamiento con bajas concentraciones de NO (pmoles) induce la incorporación de 14C-glucosa a celulosa mientras que el tratamiento con concentraciones más altas de NO (nmoles) la inhiben. La inhibición de la síntesis de celulosa ocurriría a nivel de pared primaria. Tres cDNA diferentes LeCESA1, LeCESA2, LeCESA3 que codifican para celulosas sintasas (CESA) de tomate fueron identificados a partir de bases de datos, probablemente involucrados en la síntesis de celulosa en la pared primaria. Los niveles de trascriptos de LeCESA demostraron ser afectados por tratamientos con dosis altas de NO, sugiriendo que el NO podría afectar la síntesis de celulosa en parte a nivel transcripcional. El efecto del NO en la modulación de la síntesis de celulosa en raíces se agrega a la lista creciente de los efectos fisiológicos del NO descriptos en plantas. A pesar de la importancia de la celulosa para el crecimiento y desarrollo de las plantas sumado al valor económico de la producción industrial de este biopolímero, el conocimiento de los mecanismos de regulación de la síntesis de celulosa permanece incompleto. Hasta el momento las evidencias se encuentran principalmente focalizadas a la regulación de la síntesis de celulosa durante el desarrollo de las plantas (Somerville 2006, Taylor 2008). Sin embargo, existen pocas evidencias sobre la regulación ambiental y la participación de moléculas señales en la síntesis de celulosa. Nuestro trabajo contribuye un importante avance en el conocimiento de moléculas señales involucradas en la regulación de la síntesis de celulosa en plantas. 95 Discusión Final y Conclusiones 5.- Importancia del estudio de la participación del NO en el crecimiento y desarrollo del sistema radical. Conclusiones y perspectivas. El desarrollo de un sistema radical adecuado es necesario para la absorción de agua y nutrientes además de un correcto anclaje al suelo. Una apropiada regulación y plasticidad en respuesta a cambios ambientales son factores críticos en la supervivencia de las plantas durante el crecimiento en condiciones de estrés o ambientes adversos. En consecuencia, cambios en la morfología de la raíz tienen un fuerte impacto en el rendimiento, calidad, estado hídrico, resistencia a enfermedades y tiempo de floración de los cultivos (de Dorlodot y col. 2007). La manipulación genética con el objeto de lograr un desarrollo adecuado del sistema radical para diferentes condiciones ambientales puede significar una herramienta importante para el cultivo de plantas con valor comercial. Durante décadas, la manipulación de la morfología del sistema radical en plantas de valor agronómico ha sido producto de tareas de domesticación y mejoramiento genético de cultivares. En los últimos años, la búsqueda de loci de rasgos cuantitativos (QTLs) se ha constituido en un campo de estudio para la identificación de las variaciones genéticas asociadas a la morfología del sistema radical (Kamoshita y col. 2002, Fitz Gerald y col. 2006). Estos estudios deberán complementarse con otros que aborden el desarrollo del sistema radical integrando aproximaciones bioquímicas, metabólicas y fisiológicas. El entendimiento del desarrollo del sistema radical será importante para la optimización del rendimiento de los cultivos bajo diferentes condiciones ambientales. Experimentos a campo han demostrado que cultivos inoculados con la bacteria promotora del crecimiento (PGPR, del inglés `plant growth promoting rhizobacteria´) 96 Discusión Final y Conclusiones Azospirillum spp. generan un incremento en la producción y rendimiento de cultivares acompañado de un aumento en la absorción de agua y nutrientes y cambios positivos en la morfología de la raíz (Okon y Labandera-Gonzalez 1994, Creus y col. 2004). Los efectos beneficiosos de Azospirillum en plantas han sido originalmente adjudicados a la capacidad de producir fitohormonas, tales como auxinas, citoquininas y giberelinas (Garcia de Salamone y col. 2001, Somers y col. 2005). Sin embargo se ha observado que Azospirillum produce NO el cual es requerido para la promoción de RLs y RAs mediado por esta bacteria (Creus y col. 2005, Molina-Favero y col. 2008). En conclusión, la integración de la información proveniente de las diferentas áreas de estudio, fisiología, genética, biología molecular, agronomía y disciplinas relacionadas con la rizósfera resulta fundamental para desarrollar estrategias que permitan optimizar el desarrollo del sistema radical y en consecuencia el rendimiento de los cultivos. Este trabajo es un aporte al conocimiento del rol del NO en el crecimiento y desarrollo de las raíces. El desarrollo y optimización de estrategias a partir de los conocimientos generados en esta tesis podrían derivar en nuevas herramientas mejorar el crecimiento de plantas en distintas calidades de suelo. 97 Trabajos Presentados Trabajos presentados TRABAJOS PRESENTADOS Los resultados que se describen en este trabajo de tesis han dado origen a los siguientes artículos y comunicaciones científicas: PUBLICACIONES EN REVISTAS CON REFERATO - Flores T, Todd CD, Tovar-Mendez A, Dhanoa PK, Correa-Aragunde N, Hoyos ME, Brownfield DM, Mullen RT, Lamattina L, Polacco JC. (2008) Arginase-negative mutants of Arabidopsis exhibit increased NO signaling in root development. Plant Physiology 147: 1936-1946. - Correa-Aragunde N, Lombardo C, Lamattina L (2008) Nitric oxide: an active nitrogen molecule that modulates cellulose synthesis in tomato roots. New Phytologist 179: 386-396. - Molina-Favero C, Creus CM, Lanteri M L, Correa-Aragunde N, Lombardo MC, Barassi CA, Lamattina L (2007) Nitric oxide and plant growth promoting rhizobacteria: common features influencing root growth and development. Advances in Botanical Research 47: 1-33 - Correa-Aragunde N, Graziano M, Chevalier C, Lamattina L (2006) Nitric oxide modulates the expression of cell cycle regulatory genes during lateral root formation in tomato. Journal of Experimental Botany 57: 581-588. - Correa-Aragunde N, Graziano M, Lamattina L (2004) Nitric oxide plays a central role in determining lateral root development in tomato. Planta 218: 900-905. CAPÍTULOS DE LIBRO 98 Trabajos presentados - Correa-Aragunde N, Lanteri L, García-Mata C, ten Have A, Laxalt A, Lamattina L (2007) Nitric oxide functions as intermediate in auxin, abscisic acid and lipid signaling pathways. En: Nitric Oxide in Plant Growth, Development and Stress Physiology (Lamattina L, Polacco J, Eds). Springer-Verlag, pp 113-130. - Lanteri ML, Graziano M, Correa-Aragunde N, Lamattina L (2006) From cell division to organ shape: Nitric oxide is involved in auxin-mediated root development. En: Communication in Plants (Baluska F, Mancuso S, Volkmann D, Eds). SpringerVerlag, pp 125-137. - Lamattina L, Lanteri L, García-Mata C, Graziano M, Correa-Aragunde N (2004) Nitric oxide is required as intermediate in hormone signaling pathways in higher plants. En: Proceedings of XII Biennial Meeting, Society for Free Radical Research International (Puntarulo S and Boveris A, Eds) Medimond, pp 357-363. PUBLICACIONES EN CONGRESOS CONGRESOS NACIONALES - Lanteri M L, Correa-Aragunde N, Lombardo MC, Laxalt A, Lamattina L (2008) Nitric oxide is downstream of auxin in regulating root growth and developmental processes. XXVII Reunión Nacional de Fisiología Vegetal (SAFV). Rosario, Santa Fe. - Correa-Aragunde N, Lamattina L (2007) Enzymatic sources required for nitric oxide production during lateral root formation in Arabidopsis. XLIII Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). Mar del Plata, Buenos Aires. - Correa-Aragunde N, Lamattina L (2006) El óxido nítrico modula la actividad celulosa sintasa en raíces de tomate (Lycopersicon esculentum) XXVI Reunión Nacional de Fisiología Vegetal (SAFV). Chascomús, Buenos Aires. 99 Trabajos presentados - Correa-Aragunde N, Lamattina L (2005) Nitric oxide induces cellulose synthesis in tomato. XLI Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). Pinamar, Buenos Aires. - Correa Aragunde N, Lamattina L (2004) Nitric oxide regulates cell cycle progression during lateral root development. XL Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). Iguazú, Misiones. - Correa Aragunde N, Graziano M, Lamattina L (2004) El óxido nítrico está involucrado en el control de la progresión del ciclo celular durante la formación de raíces laterales inducida por auxinas. XII Reunión Latinoamericana de Fisiología vegetal (SAFV). Santa Rosa, La Pampa. CONGRESOS INTERNACIONALES - Lamattina L, Correa-Aragunde N, Lanteri L, Lombardo C, Graziano M (2006) Nitric oxide: a critical signal molecule that functions in plant root development. 1st Plant NO Group Meeting. Verona, Italia. - Lamattina L, Lanteri L, Correa-Aragunde N, Graziano M (2005) Nitric oxide and auxin interactions in root formation. The First Symposium on Plant Neurobiology. Florencia, Italia. - Lamattina L, Lanteri L, García-Mata C, Graziano M, Correa-Aragunde N (2004) Nitric oxide is required as intermediate in hormone signaling pathways in higher plants. Society for Free Radical Research International (SFRR). XII Biennial Meeting, Buenos Aires, Argentina. 100 Referencias Bibliográficas Referencias Bibliográficas REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Abergs B (1947) On the mechanism of the toxic action of chlorates and some related substances upon young wheat plants. Royal Agric Coll Sweden 15: 37-107. 2. Abraham RT, Acquarone M, Andersen A, Asensi A, Belle R, Berger F, Bergounioux C, Brunn G, Buquet-Fagot C y Fagot D (1995) Cellular effects of olomoucine, an inhibitor of cyclin-dependent kinases. Biol Cell 83: 105-120. 3. Alderton WK, Cooper CE y Knowles RG (2001) Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J 357: 593-615. 4. Aloni R y Zimmermann MH (1983) The control of vessel size and density along the plant axis. A new hypothesis. Differentiation 24: 203-208. 5. Amor Y, Mayer R, Benziman M y Delmer D (1991) Evidence for a cyclic diguanylic acid-dependent cellulose synthase in plants. Plant Cell 3: 989-995. 6. Appenzeller L, Doblin M, Barreiro R, Wang H, Niu X, Kollipara K, Carrigan L, Tomes D, Chapman M y Dhugga KS (2004) Cellulose synthesis in maize: isolation and expression analysis of the cellulose synthase (CesA) gene family. Cellulose 11: 287-299. 7. Arioli T, Peng L, Betzner AS, Burn J, Wittke W, Herth W, Camilleri C, Hofte H, Plazinski J, Birch R, Cork A, Glover J, Redmond J y Williamson RE (1998) Molecular analysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis. Science 279: 717-720. 8. Arnold WP, Mittal CK, Katsuki S y Murad F (1977) Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proc Natl Acad Sci U S A 74: 3203-3207. 9. Baluska F, Samaj J y Menzel D (2003) Polar transport of auxin: carrier-mediated flux across the plasma membrane or neurotransmitter-like secretion? Trends Cell Biol 13: 282285. 10. Bao F, Shen J, Brady SR, Muday GK, Asami T y Yang Z (2004) Brassinosteroids interact with auxin to promote lateral root development in Arabidopsis. Plant Physiol 134: 16241631. 101 Referencias Bibliográficas 11. Barroso JB, Corpas FJ, Carreras A, Sandalio LM, Valderrama R, Palma JM, Lupianez JA y del Rio LA (1999) Localization of nitric-oxide synthase in plant peroxisomes. J Biol Chem 274: 36729-36733. 12. Belenghi B, Romero-Puertas MC, Vercammen D, Brackenier A, Inze D, Delledonne M y Van Breusegem F. (2007) Metacaspase activity of Arabidopsis thaliana is regulated by Snitrosylation of a critical cysteine residue. J Biol Chem 282: 1352-1358. 13. Beligni MV (2001) Functions of nitric oxide in plants: antioxidant effect and participation in light responses. Tesis para optar por el título de Dr. en Ciencias Biológicas. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. 14. Beligni MV y Lamattina L (1999) Nitric oxide protects against cellular damage produced by methylviologen herbicides in potato plants. Nitric Oxide 3: 199-208. 15. Beligni MV y Lamattina L (2000) Nitric oxide stimulates seed germination and deetiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three light-inducible responses in plants. Planta 210: 215-221. 16. Beligni MV y Lamattina L (2002) Nitric oxide interferes with plant photo-oxidative stress by detoxifying reactive oxygen species. Plant Cell Environ 25: 737-748. 17. Bethke PC, Badger MR y Jones RL (2004) Apoplastic synthesis of nitric oxide by plant tissues. Plant Cell 16: 332-341. 18. Bhalerao RP, Eklof J, Ljung K, Marchant A, Bennett M y Sandberg G (2002) Shootderived auxin is essential for early lateral root emergence in Arabidopsis seedlings. Plant J 29: 325-332. 19. Blakely LM, Blakely RM, Colowit PM y Elliott DS (1988) Experimental studies on lateral root formation in radish seedling roots. II. Analysis of the dose-response to exogenous auxin. Plant Physiol 87: 414-419. 20. Blanchard-Fillion B, Souza JM, Friel T, Jiang GC, Vrana K, Sharov V, Barron L, Schoneich C, Quijano C, Alvarez B, Radi R, Przedborski S, Fernando GS, Horwitz J y Ischiropoulos H (2001) Nitration and inactivation of tyrosine hydroxylase by peroxynitrite. J Biol Chem 276: 46017-46023. 102 Referencias Bibliográficas 21. Boerjan W, Cervera MT, Delarue M, Beeckman T, Dewitte W, Bellini C, Caboche M, Van Onckelen H, Van Montagu M y Inze D (1995) Superroot, a recessive mutation in Arabidopsis, confers auxin overproduction. Plant Cell 7: 1405-1419. 22. Boniotti MB y Gutierrez C (2001) A cell-cycle-regulated kinase activity phosphorylates plant retinoblastoma protein and contains, in Arabidopsis, a CDKA/cyclin D complex. Plant J 28: 341-350. 23. Bowler C, Neuhaus G, Yamagata H y Chua NH (1994) Cyclic GMP and calcium mediate phytochrome phototransduction. Cell 77: 73-81. 24. Bright J, Desikan R, Hancock JT, Weir IS y Neill SJ (2006) ABA-induced NO generation and stomatal closure in Arabidopsis are dependent on H2O2 synthesis. Plant J 45: 113122. 25. Burton RA, Shirley NJ, King BJ, Harvey AJ y Fincher GB (2004) The CesA gene family of barley. Quantitative analysis of transcripts reveals two groups of co-expressed genes. Plant Physiol 134: 224-236. 26. Caño-Delgado A, Penfield S, Smith C, Catley M y Bevan M (2003) Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. Plant J 34: 351-362. 27. Caro A y Puntarulo S (1999) Nitric oxide generation by soybean embryonic axes. Possible effect on mitochondrial function. Free Radic Res 31 Suppl: S205-S212. 28. Casimiro I, Beeckman T, Graham N, Bhalerao R, Zhang H, Casero P, Sandberg G y Bennett MJ (2003) Dissecting Arabidopsis lateral root development. Trends Plant Sci 8: 165-171. 29. Casimiro I, Marchant A, Bhalerao RP, Beeckman T, Dhooge S, Swarup R, Graham N, Inze D, Sandberg G, Casero PJ y Bennett M (2001) Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell 13: 843-852. 30. Chen Z, Hong X, Zhang H, Wang Y, Li X, Zhu JK y Gong Z (2005) Disruption of the cellulose synthase gene, AtCesA8/IRX1, enhances drought and osmotic stress tolerance in Arabidopsis. Plant J 43: 273-283. 103 Referencias Bibliográficas 31. Cheng CL, Acedo GN, Dewdney J, Goodman HM y Conkling MA (1991) Differential expression of the two Arabidopsis nitrate reductase genes. Plant Physiol 96: 275-279. 32. Claussen M, Lüthe H, Blatt M y Böttger M (1997) Auxin-induced growth and its linkage to potassium channels. Planta 201: 227-234. 33. Cooney RV, Harwood PJ, Custer LJ y Franke AA (1994) Light-mediated conversion of nitrogen dioxide to nitric oxide by carotenoids. Environ Health Perspect 102: 460-462. 34. Corpas FJ, Barroso JB y del Rio LA (2001) Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends Plant Sci 6: 145-150. 35. Corpas FJ, del Rio LA y Barroso JB (2007) Need of biomarkers of nitrosative stress in plants. Trends Plant Sci 12: 436-438. 36. Correa-Aragunde N (2004) Rol del óxido nítrico en la determinación de la arquitectura del sistema radical en tomate. Tesis para optar por el título de Lic. en Ciencias Biológicas. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. 37. Correa-Aragunde N, Graziano M, Chevalier C y Lamattina L (2006) Nitric oxide modulates the expression of cell cycle regulatory genes during lateral root formation in tomato. J Exp Bot 57: 581-588. 38. Correa-Aragunde N, Graziano M y Lamattina L (2004) Nitric oxide plays a central role in determining lateral root development in tomato. Planta 218: 900-905. 39. Creus C, Sueldo RJ y Barassi CA (2004) Water relations and yield in Azospirilluminoculated wheat exposed to drought in the field. Can J Bot 82: 273-281. 40. Creus CM, Graziano M, Casanovas EM, Pereyra MA, Simontacchi M, Puntarulo S, Barassi CA y Lamattina L (2005) Nitric oxide is involved in the Azospirillum brasilenseinduced lateral root formation in tomato. Planta 221: 297-303. 41. Criqui MC, Parmentier Y, Derevier A, Shen WH, Dong A y Genschik P (2000) Cell cycle-dependent proteolysis and ectopic overexpression of cyclin B1 in tobacco BY2 cells. Plant J 24: 763-773. 104 Referencias Bibliográficas 42. Cueto M, Hernandez-Perera O, Martin R, Bentura ML, Rodrigo J, Lamas S y Golvano MP (1996) Presence of nitric oxide synthase activity in roots and nodules of Lupinus albus. FEBS Lett 398: 159-164. 43. D'Ambrogio de Argüeso A (1986) Manual de Técnicas en Histología Vegetal. Ed. Hemisferio Sur, Buenos Aires. 44. de Dorlodot S, Forster B, Pages L, Price A, Tuberosa R y Draye X (2007) Root system architecture: opportunities and constraints for genetic improvement of crops. Trends Plant Sci 12: 474-481. 45. De Smet I, Vanneste S, Inze D y Beeckman T (2006a) Lateral root initiation or the birth of a new meristem. Plant Mol Biol 60: 871-887. 46. De Smet I, Zhang H, Inze D y Beeckman T (2006b) A novel role for abscisic acid emerges from underground. Trends Plant Sci 11: 434-439. 47. De Smet I, Signora L, Beeckman T, Inze D, Foyer CH y Zhang H (2003) An abscisic acid-sensitive checkpoint in lateral root development of Arabidopsis. Plant J 33: 543-555. 48. De Veylder L, Beeckman T, Beemster GT, Krols L, Terras F, Landrieu I, Van Der SE, Maes S, Naudts M y Inze D (2001) Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell 13: 1653-1668. 49. Deak KI y Malamy J (2005) Osmotic regulation of root system architecture. Plant J 43: 17-28. 50. Debolt S, Gutierrez R, Ehrhardt DW y Somerville C (2007) Nonmotile cellulose synthase subunits repeatedly accumulate within localized regions at the plasma membrane in Arabidopsis hypocotyl cells following 2,6-dichlorobenzonitrile treatment. Plant Physiol 145: 334-338. 51. Delledonne M, Xia Y, Dixon RA y Lamb C (1998) Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Nature 394: 585-588. 52. Delmer DP (1999) CELLULOSE BIOSYNTHESIS: Exciting times for a difficult field of study. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 245-276. 53. Dewitte W y Murray JA (2003) The plant cell cycle. Annu Rev Plant Biol 54: 235-264. 105 Referencias Bibliográficas 54. Dharmasiri N, Dharmasiri S y Estelle M (2005) The F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 435: 441-445. 55. Distéfano AM, Garcia-Mata C, Lamattina L y Laxalt AM (2008) Nitric oxide-induced phosphatidic acid accumulation: a role for phospholipases C and D in stomatal closure. Plant Cell Environ 31: 187-194. 56. Dubois M, Gilles K, Hamilton JK, Rebers PA y Smith F (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 38: 350-361. 57. Dubrovsky JG, Rost TL, Colon-Carmona A y Doerner P (2001) Early primordium morphogenesis during lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Planta 214: 30-36. 58. Durner J, Gow AJ, Stamler JS y Glazebrook J (1999) Ancient origins of nitric oxide signaling in biological systems. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 14206-14207. 59. Durner J, Wendehenne D y Klessig DF (1998) Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1032810333. 60. Ellis C, Karafyllidis I, Wasternack C y Turner JG (2002) The Arabidopsis mutant cev1 links cell wall signaling to jasmonate and ethylene responses. Plant Cell 14: 1557-1566. 61. Ellis C y Turner JG (2001) The Arabidopsis mutant cev1 has constitutively active jasmonate and ethylene signal pathways and enhanced resistance to pathogens. Plant Cell 13: 1025-1034. 62. Fagard M, Desnos T, Desprez T, Goubet F, Refregier G, Mouille G, McCann M, Rayon C, Vernhettes S y Hofte H (2000) PROCUSTE1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of Arabidopsis. Plant Cell 12: 2409-2424. 63. Fitz Gerald JN, Lehti-Shiu MD, Ingram PA, Deak KI, Biesiada T y Malamy JE (2006) Identification of quantitative trait loci that regulate Arabidopsis root system size and plasticity. Genetics 172: 485-498. 64. Flores T, Todd CD, Tovar-Mendez A, Dhanoa PK, Correa-Aragunde N, Hoyos ME, Brownfield DM, Mullen RT, Lamattina L y Polacco JC (2008) Arginase-negative mutants 106 Referencias Bibliográficas of Arabidopsis exhibit increased nitric oxide signaling in root development. Plant Physiol 147: 1936-1946. 65. Floryszak-Wieczorek J, Milczarek G, Arasimowicz M y Ciszewski A (2006) Do nitric oxide donors mimic endogenous NO-related response in plants? Planta 224: 1363-1372. 66. Foissner I, Wendehenne D, Langebartels C y Durner J (2000) In vivo imaging of an elicitor-induced nitric oxide burst in tobacco. Plant J 23: 817-824. 67. Gabaldon C, Gomez Ros LV, Pedreño MA y Ros Barcelo A (2005) Nitric oxide production by the differentiating xylem of Zinnia elegans. New Phytol 165: 121-130. 68. García de Salamone I, Hynes RK y Nelson LM (2001) Cytokinin production by plant growth promoting rhizobacteria and selected mutants. Can J Microbiol 47: 404-411. 69. García-Mata C, Gay R, Sokolovski S, Hills A, Lamattina L y Blatt MR (2003) Nitric oxide regulates K+ and Cl- channels in guard cells through a subset of abscisic acidevoked signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 11116-11121. 70. García-Mata C y Lamattina L (2001) Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress. Plant Physiol 126: 1196-1204. 71. García-Mata C y Lamattina L (2007) Abscisic acid (ABA) inhibits light-induced stomatal opening through calcium- and nitric oxide-mediated signaling pathways. Nitric Oxide 17: 143-151. 72. Genschik P, Criqui MC, Parmentier Y, Derevier A y Fleck J (1998) Cell cycle dependent proteolysis in plants: Identification of the destruction box pathway and metaphase arrest produced by the proteasome inhibitor MG132. Plant Cell 10: 2063-2076. 73. Giasson BI, Duda JE, Murray IV, Chen Q, Souza JM, Hurtig HI, Ischiropoulos H, Trojanowski JQ y Lee VM (2000) Oxidative damage linked to neurodegeneration by selective alpha-synuclein nitration in synucleinopathy lesions. Science 290: 985-989. 74. Glab N, Labidi B, Qin LX, Trehin C, Bergounioux C y Meijer L (1994) Olomoucine, an inhibitor of the cdc2/cdk2 kinases activity, blocks plant cells at the G1 to S and G2 to M cell cycle transitions. FEBS Letters 353: 207-211. 107 Referencias Bibliográficas 75. Gouvea CMCP, Souza JF, Magalhaes ACN y Martins IS (1997) NO-releasing substances that induce growth elongation in maize root segments. Plant Growth Regul 21: 183-187. 76. Granato TC y Raper CDJr (1989) Proliferation of maize (Zea mays L.) roots in response to localized supply of nitrate. J Exp Bot 40: 263-275. 77. Graziano M, Beligni MV y Lamattina L (2002) Nitric oxide improves internal iron availability in plants. Plant Physiol 130: 1852-1859. 78. Graziano M y Lamattina L (2007) Nitric oxide accumulation is required for molecular and physiological responses to iron deficiency in tomato roots. Plant J 52: 949-960. 79. Gupta KJ, Stoimenova M y Kaiser WM (2005) In higher plants, only root mitochondria, but not leaf mitochondria reduce nitrite to NO, in vitro and in situ. J Exp Bot 56: 26012609. 80. Hager A (2003) Role of the plasma membrane H+-ATPase in auxin-induced elongation growth: historical and new aspects. J Plant Res 116: 483-505. 81. Hanfrey C, Sommer S, Mayer MJ, Burtin D y Michael AJ (2001) Arabidopsis polyamine biosynthesis: absence of ornithine decarboxylase and the mechanism of arginine decarboxylase activity. Plant J 27: 551-560. 82. He Y, Tang RH, Hao Y, Stevens RD, Cook CW, Ahn SM, Jing L, Yang Z, Chen L, Guo F, Fiorani F, Jackson RB, Crawford NM y Pei ZM (2004) Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition. Science 305: 1968-1971. 83. Heim DR, Skomp JR, Tschabold EE y Larrinua IM (1990) Isoxaben inhibits the synthesis of acid insoluble cell wall materials in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 93: 695-700. 84. Hemerly AS, Ferreira P, de Almeida Engler J, Van Montagu M, Engler G y Inze D (1993) cdc2a expression in Arabidopsis is linked with competence for cell division. Plant Cell 5: 1711-1723. 85. Hernandez-Blanco C, Feng DX, Hu J, Sanchez-Vallet A, Deslandes L, Llorente F, Berrocal-Lobo M, Keller H, Barlet X, Sanchez-Rodriguez C, Anderson LK, Somerville S, Marco Y y Molina A (2007) Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell 19: 890-903. 108 Referencias Bibliográficas 86. Herth W (1983) Arrays of plasma-membrane rosettes involved in cellulose microfibril formation of Spirogyra. Planta 159: 347-356. 87. Hess DT, Matsumoto A, Kim SO, Marshall HE y Stamler JS (2005) Protein Snitrosylation: purview and parameters. Nat Rev Mol Cell Biol 6: 150-166. 88. Himanen K, Boucheron E, Vanneste S, de Almeida Engler J, Inze D y Beeckman T (2002) Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell 14: 2339-2351. 89. Himanen K, Vuylsteke M, Vanneste S, Vercruysse S, Boucheron E, Alard P, Chriqui D, Van Montagu M, Inze D y Beeckman T (2004) Transcript profiling of early lateral root initiation. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5146-5151. 90. Hu X, Neill S, Tang Z y Cai W (2005) Nitric oxide mediates gravitropic bending in soybean roots. Plant Physiol 137: 663-670. 91. Huang X, Stettmaier K, Michel C, Hutzler P, Mueller MJ y Durner J (2004) Nitric oxide is induced by wounding and influences jasmonic acid signaling in Arabidopsis thaliana. Planta 218: 938-946. 92. Hummel I, Gouesbet G, El AA, Ainouche A y Couee I (2004) Characterization of the two arginine decarboxylase (polyamine biosynthesis) paralogues of the endemic subantarctic cruciferous species Pringlea antiscorbutica and analysis of their differential expression during development and response to environmental stress. Gene 342: 199-209. 93. Illingworth C, Mayer MJ, Elliott K, Hanfrey C, Walton NJ y Michael AJ (2003) The diverse bacterial origins of the Arabidopsis polyamine biosynthetic pathway. FEBS Lett 549: 26-30. 94. Inze D y De Veylder L (2006) Cell cycle regulation in plant development. Annu Rev Genet 40: 77-105. 95. Jacob-Wilk D, Kurek I, Hogan P y Delmer DP (2006) The cotton fiber zinc-binding domain of cellulose synthase A1 from Gossypium hirsutum displays rapid turnover in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 12191-12196. 109 Referencias Bibliográficas 96. Jasid S, Simontacchi M, Bartoli CG y Puntarulo S (2006) Chloroplasts as a nitric oxide cellular source. Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins. Plant Physiol 142: 1246-1255. 97. Jasinski S, Riou-Khamlichi C, Roche O, Perennes C, Bergounioux C y Glab N (2002) The CDK inhibitor NtKIS1a is involved in plant development, endoreduplication and restores normal development of cyclin D3; 1-overexpressing plants. J Cell Sci 115: 973982. 98. Joshi CP (2003) Xylem-specific and tension stress-responsive expression of cellulose synthase genes from aspen trees. Appl Biochem Biotechnol 105: 17-25. 99. Joubes J, Chevalier C, Dudits D, Heberle-Bors E, Inze D, Umeda M y Renaudi JP (2000) CDK-related protein kinases in plants. Plant Mol Biol 43: 607-620. 100. Kaiser W, Gupta K y Planchet E (2007) Higher plant mitochondria as a source for NO. En: Nitric Oxide in Plant Growth, Development and Stress Physiology. Springer-Verlag. 1-14. 101. Kamoshita A, Wade J, Ali L, Pathan S, Zhang J, Sarkarung S y Nguyen T (2002) Mapping QTLs for root morphology of a rice population adapted to rainfed lowland conditions. Theor Appl Genet 104: 880-893. 102. Katakai K, Liu J, Nakajima K, Keefer LK y Waalkes MP (2001) Nitric oxide induces metallothionein (MT) gene expression apparently by displacing zinc bound to MT. Toxicol Lett 119: 103-108. 103. Kepinski S y Leyser O (2005) The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 435: 446-451. 104. Kimura S, Laosinchai W, Itoh T, Cui X, Linder CR y Brown RMJr (1999) Immunogold labeling of rosette terminal cellulose-synthesizing complexes in the vascular plant Vigna angularis. Plant Cell 11: 2075-2086. 105. Klepper L (1990) Comparison between NO(x) evolution mechanisms of wild-type and nr(1) mutant soybean leaves. Plant Physiol 93: 26-32. 106. Klepper LA (1979) Nitric oxide (NO) and nitrogen dioxide (NO2) emissions from herbicide-treated soybean plants. Atmos Environ 13: 537-542. 110 Referencias Bibliográficas 107. Klessig DF, Ytterberg AJ y van Wijk KJ (2004) The pathogen-inducible nitric oxide synthase (iNOS) in plants is a variant of the P protein of the glycine decarboxylase complex. Cell 119: 445 108. Kolbert Z, Bartha B y Erdei L (2007) Exogenous auxin-induced NO synthesis is nitrate reductase-associated in Arabidopsis thaliana root primordia. J Plant Physiol 165: 967975. 109. Koshland DE, Jr. (1992) The molecule of the year. Science 258: 1861 110. Kröncke KD (2001) Cysteine-Zn2+ complexes: unique molecular switches for inducible nitric oxide synthase-derived NO. Faseb J 15: 2503-2507. 111. Kröncke KD y Carlberg C (2000) Inactivation of zinc finger transcription factors provides a mechanism for a gene regulatory role of nitric oxide. Faseb J 14: 166-173. 112. Krumpelman PM, Freyermuth SK, Cannon JF, Fink GR y Polacco JC (1995) Nucleotide sequence of Arabidopsis thaliana arginase expressed in yeast. Plant Physiol 107: 14791480. 113. Kuo WN, Ku TW, Jones DL y JN-Baptiste J (1995) Nitric oxide synthase immunoreactivity in baker's yeast, lobster, and wheat germ. Biochem Arch 11: 73-78. 114. Kurek I, Kawagoe Y, Jacob-Wilk D, Doblin M y Delmer D (2002) Dimerization of cotton fiber cellulose synthase catalytic subunits occurs via oxidation of the zinc-binding domains. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 11109-11114. 115. Lamattina L, Garcia-Mata C, Graziano M y Pagnussat G (2003) Nitric oxide: the versatility of an extensive signal molecule. Annu Rev Plant Biol 54: 109-136. 116. Lanteri M, Graziano M, Correa-Aragunde N y Lamattina L (2006) From cell division to organ shape: Nitric oxide is involved in auxin-mediated root development. En: Communication in Plants. Springer-Verlag. 123-136. 117. Lanteri ML, Laxalt AM y Lamattina L (2008) Nitric oxide triggers phosphatidic acid accumulation via phospholipase D during auxin-induced adventitious root formation in cucumber. Plant Physiol 147: 188-198. 111 Referencias Bibliográficas 118. Laxalt AM, Beligni MV y Lamattina L (1997) Nitric oxide preserves the level of chlorophyll in potato leaves infected by Phytophthora infestans. Eur J Plant Pathol 103: 643-651. 119. Laxalt AM, Raho N, Have AT y Lamattina L (2007) Nitric oxide is critical for inducing phosphatidic acid accumulation in xylanase-elicited tomato cells. J Biol Chem 282: 21160-21168. 120. Leshem YY, Wills RBH y Ku VV-V (1998) Evidence for the function of the free radical gas -- nitric oxide (NO-) -- as an endogenous maturation and senescence regulating factor in higher plants. Plant Physiol Biochem 36: 825-833. 121. Li G y Xue HW (2007) Arabidopsis PLDzeta2 regulates vesicle trafficking and is required for auxin response. Plant Cell 19: 281-295. 122. Li X, Mo X, Shou H y Wu P (2006) Cytokinin-mediated cell cycling arrest of pericycle founder cells in lateral root initiation of Arabidopsis. Plant Cell Physiol 47: 1112-1123. 123. Lindermayr C, Saalbach G, Bahnweg G y Durner J (2006) Differential inhibition of Arabidopsis methionine adenosyltransferases by protein S-nitrosylation. J Biol Chem 281: 4285-4291. 124. Lindermayr C, Saalbach G y Durner J (2005) Proteomic identification of S-nitrosylated proteins in Arabidopsis. Plant Physiol 137: 921-930. 125. Ljung K, Bhalerao RP y Sandberg G (2001) Sites and homeostatic control of auxin biosynthesis in Arabidopsis during vegetative growth. Plant J 28: 465-474. 126. Lombardo MC, Graziano M, Polacco J y Lamattina L (2006) Nitric oxide functions as a positive regulator of root hair development. Plant Signaling & Behaviour 1: 28-33. 127. Lopez-Bucio J, Cruz-Ramirez A y Herrera-Estrella L (2003) The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol 6: 280-287. 128. Ludidi N y Gehring C (2003) Identification of a novel protein with guanylyl cyclase activity in Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 278: 6490-6494. 112 Referencias Bibliográficas 129. Maeda H, Akaike T, Yoshida M y Suga M (1994) Multiple functions of nitric oxide in pathophysiology and microbiology: analysis by a new nitric oxide scavenger. J Leukoc Biol 56: 588-592. 130. Malamy JE (2005) Intrinsic and environmental response pathways that regulate root system architecture. Plant Cell Environ 28: 67-77. 131. Malamy JE y Benfey PN (1997) Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana. Development 124: 33-44. 132. Mannick JB y Schonhoff CM (2002) Nitrosylation: the next phosphorylation? Arch Biochem Biophys 408: 1-6. 133. Mathieu C, Moreau S, Frendo P, Puppo A y Davies MJ (1998) Direct detection of radicals in intact soybean nodules: presence of nitric oxide-leghemoglobin complexes. Free Radic Biol Med 24: 1242-1249. 134. Millar AH y Day DA (1996) Nitric oxide inhibits the cytochrome oxidase but not the alternative oxidase of plant mitochondria. FEBS Lett 398: 155-158. 135. Mironov V, De Veylder L, Van Montagu M y Inze D (1999) Cyclin-dependent kinases and cell division in plants-The nexus. Plant Cell 11: 509-522. 136. Molina-Favero C, Creus CM, Simontacchi M, Puntarulo S y Lamattina L (2008) Aerobic nitric oxide production by Azospirillum brasilense Sp245 and its influence on root architecture in tomato. Mol Plant Microbe Interact 21: 1001-1009. 137. Morot-Gaudry-Talarmain Y, Rockel P, Moureaux T, Quillere I, Leydecker MT, Kaiser WM y Morot-Gaudry JF (2002) Nitrite accumulation and nitric oxide emission in relation to cellular signaling in nitrite reductase antisense tobacco. Planta 215: 708-715. 138. Morris DA (2000) Transmembrane auxin carrier systems − dynamic regulators of polar auxin transport. Plant Growth Regul 32: 161-172. 139. Mueller SC y Brown RMJr (1980) Evidence for an intramembrane component associated with a cellulose microfibril-synthesizing complex in higher plants. J Cell Biol 84: 315326. 113 Referencias Bibliográficas 140. Nakagami H, Kawamura K, Sugisaka K, Sekine M y Shinmyo A (2002) Phosphorylation of retinoblastoma-related protein by the cyclin D/cyclin-dependent kinase complex is activated at the G1/S-phase transition in tobacco. Plant Cell 14: 1847-1857. 141. Navarre DA, Wendehenne D, Durner J, Noad R y Klessig DF (2000) Nitric oxide modulates the activity of tobacco aconitase. Plant Physiol 122: 573-582. 142. Neill SJ, Desikan R, Clarke A y Hancock JT (2002) Nitric oxide is a novel component of abscisic acid signaling in stomatal guard cells. Plant Physiol 128: 13-16. 143. Neill SJ, Desikan R y Hancock JT (2003) Nitric oxide signalling in plants. New Phytol 159: 11-35. 144. Nibau C, Gibbs DJ y Coates JC (2008) Branching out in new directions: the control of root architecture by lateral root formation. New Phytol 179: 595-614. 145. Ninnemann H y Maier J (1996) Indications for the occurrence of nitric oxide synthases in fungi and plants and the involvement in photoconidiation of Neurospora crassa. Photochem Photobiol 64: 393-398. 146. Okon Y y Labandera-Gonzalez CA (1994) Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soil Biol Biochem 26: 1591-1601. 147. Oomen RJ, Tzitzikas EN, Bakx EJ, Straatman-Engelen I, Bush MS, McCann MC, Schols HA, Visser RG y Vincken JP (2004) Modulation of the cellulose content of tuber cell walls by antisense expression of different potato (Solanum tuberosum L.) CesA clones. Phytochem 65: 535-546. 148. Osmont KS, Sibout R y Hardtke CS (2007) Hidden Branches: Developments in root system architecture. Annu Rev Plant Biol 58: 93-113. 149. Ötvös K, Pasternak TP, Miskolczi P, Domoki M, Dorjgotov D, Szucs A, Bottka S, Dudits D y Feher A (2005) Nitric oxide is required for, and promotes auxin-mediated activation of, cell division and embryogenic cell formation but does not influence cell cycle progression in alfalfa cell cultures. Plant J 43: 849-860. 150. Pacoda D, Montefusco A, Piro G y Dalessandro G (2004) Reactive oxygen species and nitric oxide affect cell wall metabolism in tobacco BY-2 cells. J Plant Physiol 161: 11431156. 114 Referencias Bibliográficas 151. Pagnussat GC, Lanteri ML y Lamattina L (2003) Nitric oxide and cyclic GMP are messengers in the indole acetic acid-induced adventitious rooting process. Plant Physiol 132: 1241-1248. 152. Pagnussat GC, Simontacchi M, Puntarulo S y Lamattina L (2002) Nitric oxide is required for root organogenesis. Plant Physiol 129: 954-956. 153. Paris R, Lamattina L y Casalongue CA (2007) Nitric oxide promotes the wound-healing response of potato leaflets. Plant Physiol Biochem 45: 80-86. 154. Paveto C, Pereira C, Espinosa J, Montagna AE, Farber M, Esteva M, Flawia MM y Torres HN (1995) The nitric oxide transduction pathway in Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 270: 16576-16579. 155. Pear JR, Kawagoe Y, Schreckengost WE, Delmer DP y Stalker DM (1996) Higher plants contain homologs of the bacterial celA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12637-12642. 156. Peng L, Hocart CH, Redmond JW y Williamson RE (2000) Fractionation of carbohydrates in Arabidopsis root cell walls shows that three radial swelling loci are specifically involved in cellulose production. Planta 211: 406-414. 157. Persson S, Paredez A, Carroll A, Palsdottir H, Doblin M, Poindexter P, Khitrov N, Auer M y Somerville CR (2007) Genetic evidence for three unique components in primary cellwall cellulose synthase complexes in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 1556615571. 158. Pharmawati M, Billington T y Gehring CA (1998) Stomatal guard cell responses to kinetin and natriuretic peptides are cGMP-dependent. Cell Mol Life Sci 54: 272-276. 159. Potikha TS, Collins CC, Johnson DI, Delmer DP y Levine A (1999) The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers. Plant Physiol 119: 849-858. 160. Reed RC, Brady SR y Muday GK (1998) Inhibition of auxin movement from the shoot into the root inhibits lateral root development in Arabidopsis. Plant Physiol 118: 13691378. 115 Referencias Bibliográficas 161. Reggiani R (1997) Alteration of levels of cyclic nucleotides in response to anaerobiosis in rice seedlings. Plant Cell Physiol 38: 740-742. 162. Reichheld JP, Chaubet N, Shen WH, Renaudin JP y Gigot C (1996) Multiple A-type cyclins express sequentially during the cell cycle in Nicotiana tabacum BY2 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 13819-13824. 163. Ribeiro EA, Cunha FQ, Tamashiro WM y Martins IS (1999) Growth phase-dependent subcellular localization of nitric oxide synthase in maize cells. FEBS Lett 445: 283-286. 164. Richmond TA y Somerville CR (2000) The cellulose synthase superfamily. Plant Physiol 124: 495-498. 165. Riou-Khamlichi C, Huntley R, Jacqmard A y Murray JA (1999) Cytokinin activation of Arabidopsis cell division through a D-type cyclin. Science 283: 1541-1544. 166. Rockel P, Strube F, Rockel A, Wildt J y Kaiser WM (2002) Regulation of nitric oxide (NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro. J Exp Bot 53: 103-110. 167. Romero-Puertas MC, Campostrini N, Matte A, Righetti PG, Perazzolli M, Zolla L, Roepstorff P y Delledonne M (2008) Proteomic analysis of S-nitrosylated proteins in Arabidopsis thaliana undergoing hypersensitive response. Proteomics 8: 1459-1469. 168. Romero-Puertas MC, Laxa M, Matte A, Zaninotto F, Finkemeier I, Jones AM, Perazzolli M, Vandelle E, Dietz KJ y Delledonne M (2007) S-nitrosylation of peroxiredoxin II E promotes peroxynitrite-mediated tyrosine nitration. Plant Cell 19: 4120-4130. 169. Römling U, Gomelsky M y Galperin MY (2005) C-di-GMP: the dawning of a novel bacterial signalling system. Mol Microbiol 57: 629-639. 170. Schmidt HH y Walter U (1994) NO at work. Cell 78: 919-925. 171. Schnittger A, Weinl C, Bouyer D, Schobinger U y Hulskamp M (2003) Misexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor ICK1/KRP1 in single-celled Arabidopsis trichomes reduces endoreduplication and cell size and induces cell death. Plant Cell 15: 303-315. 172. Segers G, Gadisseur I, Bergounioux C, de Almeida Engler J, Jacqmard A, Van Montagu M y Inze D (1996) The Arabidopsis cyclin-dependent kinase gene cdc2bAt is preferentially expressed during S and G2 phases of the cell cycle. Plant J 10: 601-612. 116 Referencias Bibliográficas 173. Sen S y Cheema IR (1995) Nitric oxide synthase and calmodulin immunoreactivity in plant embryonic tissue. Biochem Arch 11: 221-227. 174. Shaul O, Mironov V, Burssens S, Van MM y Inze D (1996) Two Arabidopsis cyclin promoters mediate distinctive transcriptional oscillation in synchronized tobacco BY-2 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 4868-4872. 175. Signora L, De S, I, Foyer CH y Zhang H (2001) ABA plays a central role in mediating the regulatory effects of nitrate on root branching in Arabidopsis. Plant J 28: 655-662. 176. Simontacchi M, Jasid S y Puntarulo S (2004) Nitric oxide generation during early germination of sorghum seeds. Plant Sci 167: 839-847. 177. Somers E, Ptacek D, Gysegom P, Srinivasan M y Vanderleyden J (2005) Azospirillum brasilense produces the auxin-like phenylacetic acid by using the key enzyme for indole3-acetic acid biosynthesis. Appl Environ Microbiol 71: 1803-1810. 178. Somerville C (2006) Cellulose synthesis in higher plants. Annu Rev Cell Dev Biol 22: 5378. 179. Spahl DU, Berendji-Grün D, Suschek CV, Kolb-Bachofen V y Kröncke KD (2003) Regulation of zinc homeostasis by inducible NO synthase-derived NO: nuclear metallothionein translocation and intranuclear Zn2+ release. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 13952-13957. 180. Stals H y Inze D (2001) When plant cells decide to divide. Trends Plant Sci 6: 359-364. 181. Stamler JS, Singel DJ y Loscalzo J (1992) Biochemistry of nitric oxide and its redoxactivated forms. Science 258: 1898-1902. 182. Stepanova AN, Hoyt JM, Hamilton AA y Alonso JM (2005) A link between ethylene and auxin uncovered by the characterization of two root-specific ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Plant Cell 17: 2230-2242. 183. Stohr C, Strube F, Marx G, Ullrich WR y Rockel P (2001) A plasma membrane-bound enzyme of tobacco roots catalyses the formation of nitric oxide from nitrite. Planta 212: 835-841. 117 Referencias Bibliográficas 184. Strader LC, Monroe-Augustus M y Bartel B (2008) The IBR5 phosphatase promotes Arabidopsis auxin responses through a novel mechanism distinct from TIR1-mediated repressor degradation. BMC Plant Biol 8: 41- 55. 185. Subczynski WK, Lomnicka M y Hyde JS (1996) Permeability of nitric oxide through lipid bilayer membranes. Free Radic Res 24: 343-349. 186. Tatusova TA y Madden TL (1999) BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett 174: 247-250. 187. Taylor NG (2008) Regulation of cellulose synthesis - aNOther player in the game? New Phytol 179: 251-256. 188. Taylor NG, Howells RM, Huttly AK, Vickers K y Turner SR (2003) Interactions among three distinct CesA proteins essential for cellulose synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1450-1455. 189. Taylor NG, Laurie S y Turner SR (2000) Multiple cellulose synthase catalytic subunits are required for cellulose synthesis in Arabidopsis. Plant Cell 12: 2529-2540. 190. Taylor NG, Scheible WR, Cutler S, Somerville CR y Turner SR (1999) The irregular xylem3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase required for secondary cell wall synthesis. Plant Cell 11: 769-780. 191. Teale WD, Paponov IA y Palme K (2006) Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 847-859. 192. Tenu JP, Lepoivre M, Moali C, Brollo M, Mansuy D y Boucher JL (1999) Effects of the new arginase inhibitor N(omega)-hydroxy-nor-L-arginine on NO synthase activity in murine macrophages. Nitric Oxide 3: 427-438. 193. Terrile MC (2008) Participación de las auxinas en las respuestas de las plantas frente a estres. Rol del óxido nítrico en su mecanismo de acción. Tesis para optar por el título de Dr. en Ciencias Biológicas. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. 194. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F y Higgins DG (1997) The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucl Acids Res 25: 4876-4882. 118 Referencias Bibliográficas 195. Tun NN, Holk A y Scherer GF (2001) Rapid increase of NO release in plant cell cultures induced by cytokinin. FEBS Lett 509: 174-176. 196. Tun NN, Santa-Catarina C, Begum T, Silveira V, Handro W, Floh EI y Scherer GF (2006) Polyamines induce rapid biosynthesis of nitric oxide (NO) in Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Cell Physiol 47: 346-354. 197. Turner SR y Somerville CR (1997) Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall. Plant Cell 9: 689-701. 198. Turner SR, Taylor N y Jones L (2001) Mutations of the secondary cell wall. Plant Mol Biol 47: 209-219. 199. Updegraff DM (1969) Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem 32: 420-424. 200. Valderrama R, Corpas FJ, Carreras A, Fernandez-Ocana A, Chaki M, Luque F, GomezRodriguez MV, Colmenero-Varea P, del Rio LA y Barroso JB (2007) Nitrosative stress in plants. FEBS Lett 581: 453-461. 201. van der Weele CM, Spollen WG, Sharp RE y Baskin TI (2000) Growth of Arabidopsis thaliana seedlings under water deficit studied by control of water potential in nutrientagar media. J Exp Bot 51: 1555-1562. 202. Vergara CE y Carpita NC (2001) Beta-D-glycan synthases and the CesA gene family: lessons to be learned from the mixed-linkage (1-->3),(1-->4)beta-D-glucan synthase. Plant Mol Biol 47: 145-160. 203. Verkest A, Manes CL, Vercruysse S, Maes S, Van Der Schueren E, Beeckman T, Genschik P, Kuiper M, Inze D y De Veylder L (2005) The cyclin-dependent kinase inhibitor KRP2 controls the onset of the endoreduplication cycle during Arabidopsis leaf development through inhibition of mitotic CDKA;1 kinase complexes. Plant Cell 17: 1723-1736. 204. Vissenberg K, Feijo JA, Weisenseel MH y Verbelen JP (2001) Ion fluxes, auxin and the induction of elongation growth in Nicotiana tabacum cells. J Exp Bot 52: 2161-2167. 205. Wang G, Strang C, Pfaffinger PJ y Covarrubias M (2007) Zn2+-dependent redox switch in the intracellular T1-T1 interface of a Kv channel. J Biol Chem 282: 13637-13647. 119 Referencias Bibliográficas 206. Wang H, Qi Q, Schorr P, Cutler AJ, Crosby WL y Fowke LC (1998) ICK1, a cyclindependent protein kinase inhibitor from Arabidopsis thaliana interacts with both Cdc2a and CycD3, and its expression is induced by abscisic acid. Plant J 15: 501-510. 207. Weingartner M, Pelayo HR, Binarova P, Zwerger K, Melikant B, de la Torre C, HeberleBors E y Bogre L (2003) A plant cyclin B2 is degraded early in mitosis and its ectopic expression shortens G2-phase and alleviates the DNA-damage checkpoint. J Cell Sci 116: 487-498. 208. Werner-Felmayer G, Golderer G, Werner ER, Grobner P y Wachter H (1994) Pteridine biosynthesis and nitric oxide synthase in Physarum polycephalum. Biochem J 304 ( Pt 1): 105-111. 209. Wilkinson JQ y Crawford NM (1991) Identification of the Arabidopsis CHL3 gene as the nitrate reductase structural gene NIA2. Plant Cell 3: 461-471. 210. Wilkinson JQ y Crawford NM (1993) Identification and characterization of a chlorateresistant mutant of Arabidopsis thaliana with mutations in both nitrate reductase structural genes NIA1 and NIA2. Mol Gen Genet 239: 289-297. 211. Williamson RE, Burn JE, Birch R, Baskin TI, Arioli T, Betzner AS y Cork A (2001) Morphology of rsw1, a cellulose-deficient mutant of Arabidopsis thaliana. Protoplasma 215: 116-127. 212. Xiong L, Wang RG, Mao G y Koczan JM (2006) Identification of drought tolerance determinants by genetic analysis of root response to drought stress and abscisic acid. Plant Physiol 142: 1065-1074. 213. Yamasaki H, Sakihama Y y Takahashi S (1999) An alternative pathway for nitric oxide production in plants: new features of an old enzyme. Trends Plant Sci 4: 128-129. 214. Zemojtel T, Frohlich A, Palmieri MC, Kolanczyk M, Mikula I, Wyrwicz LS, Wanker EE, Mundlos S, Vingron M, Martasek P y Durner J (2006) Plant nitric oxide synthase: a never-ending story? Trends Plant Sci 11: 524-525. 215. Zhang C, Hein TW, Wang W, Miller MW, Fossum TW, McDonald MM, Humphrey JD y Kuo L (2004) Upregulation of vascular arginase in hypertension decreases nitric oxidemediated dilation of coronary arterioles. Hypertension 44: 935-943. 120 Referencias Bibliográficas 216. Zhang H y Forde BG (1998) An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrientinduced changes in root architecture. Science 279: 407-409. 217. Zhang H, Jennings A, Barlow PW y Forde BG (1999) Dual pathways for regulation of root branching by nitrate. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 6529-6534. 218. Zhong R, Morrison WH, Freshour GD, Hahn MG y Ye ZH (2003) Expression of a mutant form of cellulose synthase AtCesA7 causes dominant negative effect on cellulose biosynthesis. Plant Physiol 132: 786-795. 219. Zumft WG (1993) The biological role of nitric oxide in bacteria. Arch Microbiol 160: 253-264. 121 In the present work, we have studied the role of nitric oxide (NO) in the regulation of the plant root architecture. The treatment with NO promotes the development of lateral root (LR) primordia in tomato (Solanum lycopersicum), in a similar way as auxin does. The NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5tetrametilimidazolin-1 oxil -3 oxide (CPTIO) inhibits the auxin-induced LR primordia formation. These results suggest that NO acts downstream auxin during LR formation. NO is able to regulate the expression of cell cycle regulatory genes, especially those involved in the G1-S phase transition. This work constitutes the first report of the participation of NO during cell cycle regulation in plant roots. Furthermore, NO-depleted plants show a drastic repression of LR primordia formation as a result of the arrest of pericycle cells in G1 phase. This result allowed the development of an inducible system for LR formation based in NO depletion. The shift of NO-depleted plants to fresh solutions containing auxin or NO induces a synchronized process of LR formation. In addition, we found that NO induces LR formation in Arabidopsis thaliana, even in repressive conditions as those produced by osmotic stress and high nitrate concentration in soil. NO was able to increase auxin sensitivity during LR development in Arabidopsis. The auxin content increases in Arabidopsis plants treated with NO, suggesting the existence of a positive feedback between auxin and NO. The use of pharmacological and genetic approaches, allowed us to demonstrate that an L-arginine-dependent pathway is required for the auxin-induced NO synthesis in Arabidopsis roots during LR formation. We also studied the effect of NO on cellulose synthesis in tomato roots. The treatments with low doses of NO (pmoles) 14 induce C-glucose incorporation into cellulose while higher doses (nmolar) inhibit it. The inhibition of cellulose synthesis might occur at the level of the primary cell wall cellulose synthesis. The tomato cellulose synthase transcripts LeCESA1 y LeCESA3 are affected by the treatment with nmolar concentration of NO, suggesting that NO might inhibit cellulose synthesis by repression of some CESA gene expression. In summary, this work contributes with original results to the knowledge of the NO function during root growth and developmental processes. Universidad Nacional de Mar del Plata
