Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Profesora Patrocinante
Dra. Patricia Burgos
Instituto de Fisiología
Facultad de Medicina
Caracterización bioquímica y funcional del rol de la ubiquitinación y la
maquinaria ESCRT en la degradación endo/lisosomal del fragmento
C99 en células de neuroglioma humano (H4)
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar al
Título profesional de Bioquímico
Hianara Aracelly Bustamante Ruiz
Valdivia-Chile
2013
Por su entrega, confianza y amor
dedico esta tesis a mi querida
familia
Agradecimientos
Quisiera expresar mis más sinceros agradecimientos a la Dra. Patricia Burgos
por hacer posible esta tesis, y enseñarme su pasión por la Biología Celular. Valoro cada
momento de mi entrenamiento, la motivación y el apoyo recibido a lo largo de estos
años.
A mis compañeros de tesis: Viviana, Vanessa, Andrés, Rafael y Alexis por todo el
tiempo que hemos compartido y por su compañía en este camino de aprendizaje.
Al Dr. Gonzalo Mardones por haberme brindado su apoyo y colaboración cada
vez que lo necesité, y de manera especial a sus “muchachos”: Esteban, Breyan, Diego
y Luis, que también formaron parte de esta aventura, aportando con su amistad,
ingenio, bromas y risas, que siempre estarán en mis recuerdos.
También quisiera demostrar mi gratitud a mis padres y a mi hermano querido,
que gracias a su esfuerzo lograron darme una carrera para mi futuro y cumplir mis
sueños de ser profesional, por creer en mí, y brindarme todo su amor. A mi abuela,
cuñada, y mis sobrinas Francisca y Renata, por su cariño. Por todo esto agradezco de
corazón que estén a mi lado.
No puedo terminar sin antes expresarles a mis grandes amigos Esteban Corales
y Viviana Cavieres, que nuestras noches de desvelo sirvieron para disfrutar hoy de los
frutos de nuestro esfuerzo. Les agradezco el haber llegado a mi vida y compartir tan
buenos momentos.
Por último, Marcelo Medina agradezco haberte encontrado antes de terminar
este ciclo. Gracias por amarme y ser parte de este nuevo comienzo.
Este trabajo fue realizado en el Instituto de Fisiología de la Facultad de Medicina
de la Universidad Austral de Chile y financiado por el proyecto FONDECYT número
1100027 a cargo de la Dra. Patricia Burgos Hitschfeld.
"Nunca consideres el estudio como una obligación sino como una oportunidad para penetrar en
el bello y maravilloso mundo del saber."
Gabriel García Márquez
I
ÍNDICE DE CONTENIDOS
ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................................................... I
ÍNDCE DE FIGURAS........................................................................................................................... IV
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................... V
1. RESUMEN ......................................................................................................................................... 1
1.1 SUMMARY .................................................................................................................................. 2
2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 3
2.1. Biología Celular de la enfermedad de Alzheimer .................................................................... 3
2.1.1. Placa senil en Enfermedad de Alzheimer .................................................................... 3
2.1.2. Modulación de la tasa de recambio del APP por procesamiento
proteolítico ....................................................................................................................... 3
2.1.3. Tráfico intracelular del APP ........................................................................................... 5
2.2. Mecanismos celulares y moleculares para la degradación de proteínas ............................. 5
2.2.1. Ubiquitinación ..................................................................................................................... 5
2.2.2. Sistema ubiquitina proteasoma (UPS) ............................................................................. 8
2.2.3. Ruta endo/Lisosomal ......................................................................................................... 9
2.2.3.1. Rol de la maquinaria ESCRT en la biogénesis de MVBs .............................. 10
2.3. Contribución de los mecanismos degradativos en la tasa de
recambio del APP ................................................................................................................... 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................... 17
3.1. MATERIALES........................................................................................................................... 17
3.1.1. Material biológico ......................................................................................................... 17
3.1.2. Anticuerpos ................................................................................................................... 17
3.1.3. siRNA ............................................................................................................................ 18
3.1.4. Reactivos Químicos ..................................................................................................... 18
II
3.1.5. Equipos ......................................................................................................................... 20
3.1.6. Softwares ...................................................................................................................... 21
3.2. MÉTODOS ................................................................................................................................... 21
3.2.1. Cultivo celular de células H4 ....................................................................................... 21
3.2.2. Obtención de líneas celulares estables ..................................................................... 21
3.2.3. Ensayos de estabilidad ................................................................................................ 23
3.2.4. Tratamientos con drogas ............................................................................................. 23
3.2.5. Extracción de proteínas totales para Western Blot ................................................... 24
3.2.6. Ensayo de ubiquitinación ............................................................................................. 24
3.2.6.1. Transfección transciente de DNA plasmidial en células H4 ........................ 24
3.2.6.2. Extracción de proteínas para Ensayo de ubiquitinación .............................. 25
3.2.6.3. Co-inmunoprecipitación de proteínas para ensayo
de ubiquitinación ............................................................................................ 26
3.2.7. Ensayo de biotinilación de proteínas de membrana plasmática .............................. 27
3.2.8. Ensayo de silenciamiento ............................................................................................ 29
3.2.9. Determinación de la concentración de proteínas por el método
de Bradford ................................................................................................................... 30
3.2.10. Análisis electroforético de proteínas en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE) ....................................................................................... 31
3.2.11. Análisis de Western Blot............................................................................................ 32
3.2.11.1 Electrotransferencia ..................................................................................... 32
3.2.11.2. Detección inmunológica ............................................................................. 32
3.2.12. Ensayos de Inmunofluorescencia Indirecta ............................................................. 33
3.2.13. Microscopía ................................................................................................................ 35
3.2.13.1. Microscopía de epifluorescencia ............................................................... 35
III
3.2.13.2. Microscopía confocal de barrido láser ...................................................... 35
3.2.13.3. Procesamiento de imágenes ..................................................................... 35
3.2.13.4. Co-localización............................................................................................ 36
4. RESULTADOS ............................................................................................................................... 37
4.1. Análisis del procesamiento proteolítico del fragmento C99 ................................................. 37
4.2. Estudio de la actividad de los compartimientos acídicos de la
ruta endo/lisosomal en la tasa de recambio del fragmento C99 ........................................ 40
4.3. Estudio del efecto de la actividad proteasomal en la tasa de
recambio del fragmento C99.................................................................................................. 43
4.4. Estudio del efecto de la actividad proteasomal sobre los niveles de APP. ........................ 48
4.5. Rol de los residuos de lisina en la degradación y tráfico del fragmento C99 ..................... 50
4.6. Evaluación de la función lisosomal en la degradación del fragmento
C99 bajo inhibición proteasomal ........................................................................................... 58
4.7. Contribución de la maquinaria ESCRT en la incorporación del
fragmento C99 en MVBs ........................................................................................................ 63
5. DISCUSIÓN..................................................................................................................................... 66
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 71
7. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 72
IV
ÍND,CE DE FIGURAS
Figura 1. Representación esquemática del procesamiento
proteolítico de los fragmentos C99 y C83....................................................................38
Figura 2. C99 es procesado proteolíticamente en diferentes sitios.............................................39
Figura 3. C99 no es sustrato de compartimientos acídicos.........................................................42
Figura 4. La degradación del C99 está asociada a su
redistribución hacia el RE.............................................................................................44
Figura 5. Inhibición de ERAD acumula C99 en RE luego de su
redistribución por BFA..................................................................................................47
Figura 6. C99 se genera en RE...................................................................................................49
Figura 7. C99 es ubiquitinado en residuos de lisina de su dominio citosólico.............................51
Figura 8. La degradación de C99 asociada al RE requiere de ubiquitinación
en residuos de lisina de su dominio citosólico.............................................................53
Figura 9. C99 es resistente a degradación por ERAD en ausencia de
Ubiquitinación...............................................................................................................55
Figura 10. C99 se localiza en el A. Golgi en ausencia de ubiquitinación....................................57
Figura 11. La degradación lisosomal del fragmento C99 es potenciada
bajo inhibición proteasomal........................................................................................59
Figura 12. La degradación del fragmento C99 en lisosomas es
ubiquitina-independiente............................................................................................62
Figura 13. TSG101 participa en la incorporación del fragmento C99
a MVBs independiente de ubiquitinación ............................................................65
V
LISTA DE ABREVIATURAS
A
Péptido beta amiloide
AICD
Dominio
intracelular
derivado
de
la
proteína precursora del amiloide
APP
Proteína precursora del amiloide (amyloid
precursor protein)
ATCC
Colección americana de cultivos tipo
(american type culture collection)
BACE1
Enzima 1 que escinde APP en sitio beta
(beta-site APP-cleaving enzyme 1)
BFA
Brefeldina A
BSA
Albúmina de suero bovino
CFTR
Regulador
de
transmembrana
(cystic
la
de
conductancia
Fibrosis
fibrosis
Quística
transmembrane
conductance regulator)
CHX
Cicloheximida
C31
Fragmento derivado del APP por corte
proteolítico por caspasas
CTF
Fragmento C-terminal  o C83
CTF
Fragmento C-terminal  o C99
CQ
Cloroquina
VI
DUB
Enzima
deubiquitinante (deubiquitinating
enzyme)
DMEM
Medio de cultivo Eagle Modificado por
Dulbecco
DMSO
Dimetil sulfóxido
DTT
1,4-ditiotreitol
EDTA
Ácido etilendiaminotetraacético
EGFP
Proteína fluorescente verde mutagenizada
en F64L
EGFR
Receptor
del
Epidermal
Factor
de
(epidermal
Crecimiento
growth
factor
receptor)
ERAD
Degradación
asociada
a
endoplásmico
(endoplasmic
retículo
reticulum
associated protein degradation)
ESCRT
Complejos
de
destinación
endosomal
requeridos para el transporte (endosomal
sorting complexes required for transport)
GFP
Proteína fluorescente verde
HA
Epítope
de
Hemaglutinina
del
virus
embrionaria
de
riñón
Influenza
HEK 293
Línea
celular
humano (Human Embryonic Kidney 293
VII
cells)
HRD1
Proteína ubiquitina ligasa E3 (HMG-coA
Reductase Degradation 1)
HRP
Enzima
peroxidasa
de
rábano
(Horseradish peroxidase)
HRS
Sustrato de tirosina quinasa regulado por
el factor de crecimiento del hepatocito
(HGF-regulated tyrosine kinase substrate)
Hsp
Proteína de shock térmico (heat shock
protein)
Htt
Huntingtina
H4
Línea celular derivada de neuroglioma de
cerebro humano
Iac
Iodoacetamida
ICD
Dominio intracelular
IgG
Inmunoglobulina G
IP
Inmunoprecipitado
ILVs
Vesículas
intra-luminales
(intraluminal
vesicles)
Ka
Constante de afinidad
MHC-I
Complejo mayor de histocompatibilidad
clase–I (major histocompatibility complex
class-I)
VIII
MVBs
Cuerpos multivesiculares (multi vesicular
bodies)
NEM
N-etilmaleimida
NIH
Institutos Nacionales de Salud, E.E.U.U.
PBS
Buffer fosfato salino
PFA
Paraformaldehído
PrP
Proteína priónica
PSA
Persulfato de amonio
p3
Fragmento derivado del APP por corte
proteolítico por caspasas
RE
Retículo endoplásmico
RIP
Procesamiento intramembrana regulado
RISC
Complejo de silenciamiento inducido por
ARN
RNAi
ARN de interferencia
sAPP
APP soluble 
sAPP
APP soluble 
SDS
Dodecyl sulfato de sodio
SDS-PAGE
Electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones denaturantes
siRNA
ARN pequeño de interferencia (small
interfering RNA)
IX
STAM
Molécula adaptadora de transducción de
señales
(signal
transducing
adaptor
molecule)
TEMED
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina
TGN
Red trans-Golgi (Trans Golgi Network)
TM
Transmembrana
Tris
Tris-(hidroximetil)-aminometano
Tritón X-100
Octil fenoxi polietoxietanol
TSG101
Proteína 101 del gen de susceptibilidad
tumoral (tumor susceptibility gene 101)
Tween-20
Monooleato de polioxietileno sorbitan
Ub
Ubiquitina
UPS
Sistema ubiquitina proteasoma (ubiquitin
proteasome system)
VPS
Proteína
de
clasificación
(vacuolar protein sorting)
WB
Western Blot
vacuolar
1
1. RESUMEN
Introducción: La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la acumulación del
péptido Aobtenido del corte secuencial de la proteína precursora del amiloide (APP).
Se ha postulado que la disponibilidad de C99, producto del corte proteolítico de APP
porBACE1, contribuye a la generación del péptido ASin embargo los mecanismos
moleculares asociados con la regulación de los niveles de C99 son aún desconocidos.
Objetivos: Investigar la contribución de la ruta endo/lisosomal en la degradación de
C99, enfocándonos en el rol de la ubiquitinación y la maquinaria ESCRT. Metodología:
Células de neuroglioma humano (H4) que expresan establemente C99 wild-type, o una
versión mutada en todos sus sitios putativos de ubiquitinación, fueron depletadas de un
componente de la maquinaria ESCRT por técnica de RNA i o tratadas con cloroquina
(CQ).
Resultados: C99
es
degradado
en
lisosomas,
independiente
de
su
poliubiquitinación bajo inhibición proteasomal. Cuando su degradación por lisosomas es
interrumpida por la adición de CQ o por depleción de un componente de la maquinaria
ESCRT, C99 se acumula fuertemente en la superficie celular, evento que es inhibido en
ausencia de poliubiquitinación conduciendo a una fuerte acumulación intracelular que
incrementa su procesamiento por -secretasa. Conclusiones: Los resultados revelaron
que la ruta endo/lisosomal es un mecanismo alternativo a la degradación proteasomal.
Este mecanismo incorpora C99 a MVBs a través de la maquinaria ESCRT para su
degradación en lisosomas de manera independiente de ubiquitina. En este contexto la
poliubiquitinación parece poseer un rol inesperado en el tráfico de C99 desde TGN
hacia la superficie celular.
2
1.1 SUMMARY
Introduction: Alzheimer's disease is characterized by the accumulation of A peptide
formed after sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP). It has been
postulated that the availability of C99, a product of proteolytic cleavage of APP by
BACE1, contributes to Apeptide production. However, the molecular mechanisms of
the down-regulation of C99 remain unclear. Objectives: To investigate the contribution
of the endo/lysosomal pathway in C99 turnover, focusing in the role of ubiquitination and
the ESCRT machinery. Methods: Human Neuroglioma cells (H4) stably expressing
either C99 wild-type or a mutated version in all its putative ubiquitination sites were
depleted of one component of the ESCRT machinery by RNAi or treated with
chloroquine (CQ). Results: C99 is degraded in lysosomes under proteasomal inhibition
independent of its polyubiquitination. When its degradation by lysosomes is disrupted by
addition of CQ or depletion of one component of the ESCRT machinery, C99 is strongly
accumulated at the cell surface, event that is inhibited in the absence of
polyubiquitination, leading to its strong intracellular accumulation that enhances C99
cleavage
by
-secretase.
Conclusions:
Our
results
demonstrated
that
the
endo/lysosomal pathway is an alternative mechanism to the degradation of C99 by the
proteasome. This mechanism sorts C99 to MVBs through the ESCRT machinery for its
lysosomal degradation in an ubiquitin-independent manner. In this context, the
polyubiquitination seems to play an unexpected role in the trafficking of C99 from the
TGN to the cell surface.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Biología Celular de la enfermedad de Alzheimer
2.1.1. Placa senil en Enfermedad de Alzheimer 

La enfermedadde Alzheimer, es el desorden neurodegenerativo de aparición
tardía más común en la población humana, afectando a más de 26 millones de
personas en el mundo.
Se ha postulado que una sobreproducción o acumulación del péptido Aen el
cerebroderivado del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del amiloide
conocida como APP, sería la base etiológica principal de la enfermedad, porque
constituye las placas seniles extracelulares, uno de los principales marcadores
histopatológicos de la enfermedad (Selkoe DJ., 2001).
Estas placas están formadas por los péptidos A40 y A42, siendo el A42
altamente propenso a oligomerizar y formar fibrillas, por esta propiedad se cree que el
A42 es un agente citotóxico clave en la patología de Alzheimer (Tang B., 2009). 
2.1.2. Modulación de la tasa de recambio del APP por procesamiento proteolítico 
El APP es una glicoproteína transmembrana de tipo-I, caracterizada por un
dominio extracelular N-terminal largo, de paso simple, y un dominio citosólico C-terminal
corto (Thinakaran G. y Koo EH., 2008). Su tasa de recambio está regulada
constitutivamente por un mecanismo conocido como procesamiento intramembrana
regulado (RIP).
El procesamiento RIP consiste en dos cortes proteolíticos secuenciales de la
proteína transmembrana sustrato; el primer corte resulta en el desprendimiento del
ectodominio de la proteína y el segundo corte ocurre en un dominio transmembrana,
4
resultando en la secreción de un pequeño péptido hacia el lumen de una vesícula o al
espacio extracelular y la liberación del dominio intracelular (ICD) hacia el citosol. Este
mecanismo puede ocurrir en membranas de diferentes compartimientos celulares, que
van desde el retículo endoplásmico (RE), A. Golgi, endosomas y superficie celular
(Lichtenthaler SF. et al., 2011).
El APP es sustrato de dos rutas RIP, una que conduce a la generación del
péptido A(ruta amiloidogénica y otra que lo evita (ruta no-amiloidogénica). En la ruta
amiloidogénica la enzima -secretasa (BACE1) realiza un corte proteolítico en el
ectodominio de APP liberándose un fragmento N-terminal soluble (sAPP) y un
fragmento C-terminal  (CTF o C99) de 99 aminoácidos que contiene la secuencia de
A y permanece asociado a la membrana (Tan J. y Evin G., 2012; Haass C. et al.,
2012). Consecutivamente C99 es procesado por un complejo integrado en la membrana
conocido como complejo -secretasa, dando como resultado AICD y la liberación de
péptidos Aque varían de 38-43 aminoácidos, según el sitio de corte del complejo secretasa, siendo los péptidos de A40 y A42 los más prevalentes (Selkoe DJ., 2001;
Chow VW. et al., 2010; Rajendran L. y Annaert W., 2012), en una proporción de 90%
A40 y 10% A42 (Thinakaran G. y Koo EH., 2008). En la ruta no-amiloidogénica APP
es procesado por -secretasa, lo que genera un fragmento N-terminal (sAPP) y un
fragmento C-terminal  (CTFo C83) de 83 aminoácidos que carece del N-terminal del
dominio A, y luego el corte subsecuente intramembrana del complejo -secretasa
libera un péptido de 3 KDa llamado p3 y AICD (Tan J. y Evin G., 2012; Haass C. et al.,
2012).
5
Por este mecanismo de recambio, el APP existe por un período de tiempo corto
en el interior de la célula. Durante este proceso, el péptido Aes producido y secretado
constitutivamente en células neuronales y no neuronales, sugiriendo que es producido
por una vía común que involucra procesamiento proteolítico por proteasas específicas
de membrana en todos los tipos celulares donde se expresa.
2.1.3. Tráfico intracelular del APP
El APP es una proteína de expresión ubicua sintetizada en el RE, que luego
trafica a través de la ruta secretoria hasta llegar a una distribución en estado
estacionario que incluye el A. Golgi, superficie celular y endosomas (Caporaso GL. et
al., 1994).
La interacción del APP con BACE1 ocurriría en RE, red trans-Golgi (TGN),
superficie celular y endosomas, mientras los sitios de interacción de APP/C99 con el
complejo -secretasa aún permanecen en controversia (Small SA. y Gandy S., 2006;
Prabhu Y. et al., 2012). Debido a que las enzimas que procesan al APP tienen distinta
distribución subcelular una de otra, la ruta intracelular que sigue esta proteína sería
determinante en los niveles del péptido Asecretado.
Por otro lado la disponibilidad de C99 que es procesado por el complejo secretasa, sería otro modulador de la tasa de péptido A generado, proteína que podría
estar siendo modulado por mecanismos celulares de degradación de proteínas.
2.2. Mecanismos celulares y moleculares para la degradación de proteínas
2.2.1. Ubiquitinación
La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos (8,5 KDa) que se encuentra en
todos los tipos celulares eucariotas y puede ser reversiblemente unida a otras proteínas
6
y conformar una elaborada modificación post-traduccional responsable de regular
proteólisis, así como también funciones no degradativas, tales como transducción de
señales (De Boeck M. y Ten Dijke P., 2012), tráfico (Lamb C. et al., 2010), o ciclo
celular (Gu B. y Zhu WG., 2012).
La serie de reacciones enzimáticas en el proceso de unión de una molécula de
ubiquitina a un sustrato es denominada “conjugación de ubiquitina” o “ubiquitinación”
(Bedford L. et al., 2011). La ubiquitinación de una proteína incluye una serie de pasos,
cada uno de los cuales requiere diferentes clases de enzimas. El primer paso es la
activación de ubiquitina por la enzima E1 dependiente de ATP conocida como enzima
“activante”. El ATP es hidrolizado para generar AMP y se forma un enlace de alta
energía del tipo tiol-éster ubiquitina-AMP en el carboxilo terminal de ubiquitina. Luego la
ubiquitina activada es transferida a una enzima E2 denominada “conjugante” por una
reacción de transtiolación. Finalmente E2 recluta a una enzima E3 ubiquitina “ligasa”
que puede transferir una única molécula de ubiquitina (monoubiquitinación) o acoplar
varias moléculas de ubiquitina, para formar una cadena (poliubiquitinación) en un grupo
amino primario de la cadena lateral de un residuo de lisina de la proteína sustrato
(Clague MJ. y Urbé S., 2010; Hedge AN. y Hupadhya SC., 2011; Bedford L. et al.,
2011). La unión entre dos moléculas de ubiquitina puede ocurrir a través de alguno de
sus siete residuos de lisina (K-6, K-11, K-27, K-29, K-33, K-48 y K-63) (Hedge AN. y
Hupadhya SC., 2011), generándose diversos tipos de enlace en la cadena, los cuales
adoptan diferentes estructuras tridimensionales, todos representados en las células
eucariotas (Clague MJ. y Urbé S., 2010; Dammer EB. et al., 2011).
7
Actualmente se acepta que la ubiquitinación cumple un rol clave en el
reconocimiento de sustratos para regular la tasa de recambio de las proteínas a través
de las tres vías más importantes de degradación de proteínas en eucariontes:
proteasoma, ruta endo/lisosomal y autofagia, las que actualmente son consideradas
vías interdependientes (Clague MJ. y Urbé S., 2010). Últimamente ha sido revisado por
MacGurn JA. el año 2012 que este sistema de regulación de sustratos por
ubiquitinación estaría ocurriendo en todos los compartimentos de la ruta secretoria,
donde en RE, A. Golgi, y superficie celular trabajarían secuencialmente para limitar la
acumulación tóxica de proteínas mal plegadas en la superficie celular.
Desde los años 90’s, estudios en CFTR (Regulador de la conductancia
transmembrana de Fibrosis Quística) y MHC-I revelaron que las proteínas que están
siendo sintetizadas en RE con un plegamiento incorrecto son conducidas a degradación
asociada a retículo endoplásmico (ERAD), donde son retrotraslocadas a través de la
membrana del RE hacia el citosol, marcadas con ubiquitina y posteriormente
degradadas por proteasomas citosólicos (Anelli T. y Sitia. R., 2008; Yoshida H., 2007),
mientras los sistemas de mantención de calidad post-RE estarían operando sobre
proteínas mal plegadas o dañadas, marcándolas y conduciéndolas a la ruta
endo/lisosomal. Entre los factores que dirigen a una proteína que ha sido sustrato de
ubiquitinación hacia una particular ruta degradativa se distinguen, longitud de la cadena
de ubiquitina y tipo de enlace entre moléculas de ubiquitina (Clague MJ. y Urbé S.,
2010).
8
2.2.2. Sistema ubiquitina proteasoma (UPS)
Inicialmente se le reconoció a la ubiquitina como una molécula propia del sistema
ubiquitina proteasoma (UPS), donde el término proteasoma es usado para describir a
un complejo proteolítico multiproteico que degrada sustratos ubiquitinados, conformado
por un “core” catalítico cilíndrico 20S y dos partículas regulatorias denominadas 19S
acopladas a los extremos del “core” catalítico que gobiernan el acceso a éste (Hedge
AN. y Hupadhya SC., 2011) donde los sustratos son susceptibles a ser desplegados por
un hexámero de ATPasas asociadas a la base de la partícula regulatoria (Clague MJ. y
Urbé S., 2010). UPS es un importante sistema de control de calidad de proteínas
dañadas o mal plegadas y depende de ubiquitina como elemento señalizador. UPS
actuaría como colaborador de chaperonas moleculares citoplasmáticas Hsp40 y Hsp70
que son la primera línea de defensa contra la agregación y el mal plegamiento de
proteínas. Una disfunción de este sistema puede conducir a la acumulación y
agregación de proteínas ubiquitinadas (Riederer BM. et al., 2011).
Está bien establecido que las proteínas solubles son poliubiquitinadas
principalmente a través de la lisina 48 (K-48) (Clague MJ. y Urbé S., 2010) y en un bajo
porcentaje poliubiquitinadas en K-6, K-11, K-27 y K-29 resultando en degradación por
proteasoma (Dammer EB. et al., 2011). Se ha reportado que la afinidad por este
complejo multiproteico incrementa 100 veces cuando se unen de dos a cuatro
moléculas de ubiquitina en la cadena lateral de un residuo de lisina de la proteína
(Clague MJ. y Urbé S., 2006). Por otro lado, las proteínas integrales de membrana no
están directamente accesibles al proteasoma, y aun así, las células eucariotas han
elaborado mecanismos para monitorear su transporte y degradación desde el RE. Este
9
mecanismo también estaría guiado por ubiquitinación de los sustratos por E3 ubiquitina
ligasas (MacGurn JA. et al., 2012), y la asistencia de una compleja red de chaperonas
citoplasmáticas que incluye a las chaperonas Hsp40 y Hsp70 para interactuar con los
residuos hidrofóbicos de estos sustratos, reteniendo los polipéptidos en forma soluble
para su degradación por ERAD (Nakatsukasa K. y Brodsky JL., 2008).
2.2.3. Ruta endo/Lisosomal
La ruta degradativa endo/lisosomal corresponde a la principal ruta por la cual se
procesan los desechos celulares y se reciclan los componentes básicos para la
mantención celular. Los compartimientos de la ruta endo/lisosomal se caracterizan por
un pH luminal ácido, que es mantenido por una bomba de protones, conocida como
ATPasa vacuolar, y es modulada por activadores e inhibidores de bajo peso molecular
(Nixon RA. et al., 2008); y por contener una amplia variedad de enzimas hidrolíticas
capaces de degradar moléculas biológicas incluyendo proteínas, ácidos nucleicos,
lípidos e hidratos de carbono.
Durante la endocitosis, el material extracelular (factores de crecimiento,
lipoproteínas, etc…) y proteínas de membrana son internalizados por cubiertas de
clatrina y dirigidos a endosomas tempranos, proceso que es regulado por la GTPasa
Rab5. Luego de la internalización, muchas proteínas de superficie celular y lípidos,
desde endosomas tempranos pueden ser devueltos a la membrana plasmática vía
endosomas de reciclaje (Nixon RA. et al., 2008). Ejemplos de proteínas que son
internalizadas por
vesículas cubiertas de
clatrina
son:
Complejo
Mayor
de
Histocompatibilidad Clase-I (MHC-I) (Duncan LM., 2006) y Receptor de Prolactina
(Varghese B., 2008).
10
Las proteínas de transmembrana que van a ser degradadas por la ruta
endo/lisosomal, luego de ser dirigidas a endosomas tempranos, se requiere que sean
finalmente incorporadas en endosomas tardíos para su posterior degradación en el
lumen de los lisosomas, último compartimento de esta ruta celular (Clague MJ. y Urbé
S., 2008; Piper RC. y Lehner P., 2011). Una proteína clásica que sigue esta ruta es el
Receptor del Factor de Crecimiento Epidermal (EGFR). Estudios de este receptor han
permitido establecer que los endosomas tempranos sufren un proceso de maduración
caracterizado por el reemplazo de Rab5 por Rab7, evento que da origen a los
endosomas tardíos o cuerpos multivesiculares (MVBs). Estos últimos se forman por la
invaginación de la membrana endosomal hacia el espacio luminal, originando vesículas
intra-luminales (ILVs) de 60-80 nm que contienen la proteína cargo (Nixon RA. et al.,
2008; Fader CM. y Colombo MI., 2009). Luego diversas hidrolasas se encuentran en
contacto con el material a degradar luego de su fusión con lisosomas (Nixon RA. et al.,
2008).
2.2.3.1. Rol de la maquinaria ESCRT en la biogénesis de MVBs
En detalle, las proteínas cargo ubiquitinadas son reconocidas por una maquinaria
específica y conservada denominada Complejo de destinación endosomal requerido
para el transporte (ESCRT) (Clague MJ. y Urbé S., 2010). Esta maquinaria realiza tres
distintas funciones interconectadas: primero, reconoce la proteína cargo ubiquitinada en
residuos de lisina de su dominio citosólico, previniendo su reciclaje y tráfico retrógrado;
segundo, gatilla el proceso de invaginación de la membrana endosomal para que el
cargo sea destinado a ILVs; y por último, participa en la biogénesis de MVBs. Con
respecto a esta última función, la maquinaria ESCRT cataliza la absición de las
11
invaginaciones endosomales, obteniéndose finalmente la proteína cargo en las
membranas de las ILVs que están contenidas dentro de MVBs, los que finalmente se
fusionarán con los lisosomas (Raiborg C. y Stenmark H., 2009).
Se ha descrito que la ubiquitinación de la proteína cargo vía lisina 63 (K-63)
intensifica la eficiencia de su destinación a la ruta endo/lisosomal, a través de MVBs
(Dammer EB. et al., 2011; Piper RC. y Lehner P., 2011), pero esta modificación no sería
un estricto requerimiento para el recambio de proteínas integrales de membrana
mediada por la maquinaria ESCRT (MacGurn JA. et al., 2012).
Existen aproximadamente 20 proteínas conservadas desde levaduras hasta
mamíferos que regulan y conducen la formación de ILVs. Esto incluye componentes de
los cuatro complejos de la maquinaria ESCRT-0, -I, -II y -III, la ATPasa VPS4 y
proteínas asociadas (Hanson P. et al., 2009; Raiborg C. y Stenmark H., 2009; Wollert T.
et al., 2009; Piper RC. y Lehner P., 2011).
El complejo ESCRT-0 es un heterodímero conformado por las subunidades HRS
y STAM ambas con dominios de unión a ubiquitina y clatrina (Raiborg C. y Stenmark H.,
2002). La subunidad HRS tiene la capacidad de reclutarse en dominios de membrana
enriquecidos en el fosfolípido endosomal fosfatidilinositol 3-fosfato (Clague M. et
al.,2009), característica que permite reclutar a HRS, y por ende a ESCRT, a las
membranas endosomales (Hanson P. et al., 2009; Raiborg C. y Stenmark H., 2009). Un
único complejo ESCRT-0 puede unir hasta cinco distintas proteínas ubiquitinadas o en
su defecto a un cargo poliubiquitinado, y esta unión multivalente a cargos ubiquitinados
contribuye a la concentración de cargos en la membrana endosomal (Schmidt O. y Teis
D., 2012). ESCRT-0 recluta a ESCRT-I a las membranas endosomales por interacción
12
directa entre HRS y TSG101. ESCRT-I es un complejo heterotetramérico conformado
por TSG101, MVB12, VPS28 y VPS37 (Stuffers S. et al., 2009; Hanson P., et al., 2009),
en consecuencia en la ausencia de ESCRT-0, ESCRT-I no es reclutada (Raiborg C. y
Stenmark H., 2009). VPS28 recluta a ESCRT-II, un heterotetrámero formado por
VPS36, VPS22 y VPS25 (Hanson P. et al., 2009). ESCRT 0 -I y -II interactúan con
cargos ubiquitinados y conforman una estructura rígida que ayuda a estabilizar el
“cuello” de la ILV naciente, sirviendo como un centro de nucleación para el posterior
ensamblaje de ESCRT-III sobre los endosomas. ESCRT-III recluta enzimas
deubiquitinantes y VPS4, una ATPasa que media la escisión de la vesícula para la
obtención de un MVB y cataliza el desensamblaje de los complejos ESCRT desde la
membrana del MVB hacia el citosol, asegurando la continuidad del proceso (Schmidt O.
y Teis D., 2012).
2.3. Contribución de los mecanismos degradativos en la tasa de recambio del
APP
En el contexto del recambio del APP, existe evidencia que indica que además de
la regulación de sus niveles por RIP, el sistema endo/lisosomal estaría modulando los
niveles de APP, asociándose una disfunción en esta ruta con la sobreproducción de
péptido A extracelular y depósitos intracelulares de la proteína Tau (Nixon RA. et al.,
2008). Sin embargo, si el péptido A es generado en estructuras de esta ruta, podría
llegar a ser secretado en el espacio extracelular en lugar de ser entregado para la
degradación en los lisosomas. Sumado a esto, a pesar de extensos estudios, tampoco
está claro si el procesamiento proteolítico de APP está conectado funcionalmente con
13
su localización en los compartimentos endo/lisosomales, por lo que los sitios
intracelulares exactos donde el péptido A se genera sigue siendo controversial.
El tratamiento de células de neuroglioma humano H4 expresando establemente
APP695 humano con agentes lisosomotrópicos, tales como Cloroquina (CQ) o Cloruro
de amonio, causan la acumulación de CTFs y AICDEstos resultados sugieren que las
proteasas lisosomales participan en la tasa de recambio del APP (Asai M. et al. 2011),
indicando que otras proteasas también son capaces de procesar CTFs y AICDsumado
a la acción bien caracterizada del complejo -secretasa en el metabolismo del APP. Se
describió que Catepsina B, una cisteína-proteasa de la ruta endo/lisosomal participa en
el metabolismo lisosomal del APP (Asai M. et al. 2011), y en ratones hAPP/CatB +/+ se
demostró que Catepsina B es capaz de convertir el péptido A42 en especies menos
amiloidogénicas (Mueller-Steiner S. et al., 2006).
Existen datos que implican al UPS en el recambio del APP y C99, mostrando que
el proteasoma puede directamente influenciar en la producción del péptido A (Nunan J.
et al., 2001; Nunan J. et al., 2003; Kaneko M. et al. 2010), disminuyendo la
disponibilidad del APP y C99 para el procesamiento por el complejo -secretasa (Nunan
J. et al., 2001). Adicionalmente estos investigadores demostraron que la subunidad
catalítica proteasoma 20S es capaz de procesar péptidos homólogos al C99 en una
región que contiene la secuencia aminoacídica (YENPTY), conocida por ser esencial
para la unión de diversas proteínas citosólicas al dominio citosólico del APP (Nunan J.
et al., 2003); también esta secuencia conservada YENPTY contiene una señal canónica
de internalización para la endocitosis mediada por cubiertas de Clatrina (Perez RG. et
al., 1999).
14
Proteínas ubiquitinadas han sido encontradas en varias enfermedades
neurodegenerativas, razón por la cual se ha sugerido intensificar tanto el UPS como la
ruta endo/lisosomal como estrategia para reducir la acumulación de proteínas mal
plegadas en desórdenes neurodegenerativos relacionados al envejecimiento.
Otras investigaciones se han concentrado en los últimos años en la identificación
de las enzimas ubiquitina ligasas, involucradas en la ubiquitinación del APP y C99En
este campo se ha demostrado que la ubiquitina ligasa E3 HRD1 es reducida
significativamente en la corteza cerebral de pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Esta enzima promueve la ubiquitinación y degradación del APP resultando en la
disminución de la producción del péptido AHRD1 se ha involucrado en la degradación
de otras proteínas asociadas a desórdenes neurodegenerativos, tales como Htt y la
proteína priónica (PrP) (Kaneko M. et al., 2010). Otros investigadores, demostraron
recientemente que FBL2 tiene actividad E3 ubiquitina ligasa y promueve la
ubiquitinación de APP en el residuo K-651 de su dominio intracelular, donde su
sobreexpresión en células HEK 293 expresando APP, aceleraron su degradación vía
UPS e inhibe la endocitosis del APP (Watanabe T. et al., 2012).
En nuestro laboratorio se ha demostrado que APP y C99 poseen información
específica dentro de su dominio citosólico correspondiente a un pentapéptido de
secuencia YKFFE que permite su tráfico hacia la ruta endo/lisosomal. Este
pentapéptido interactúa directamente con un complejo adaptador denominado AP-4
quién sería responsable del tráfico de APP y C99 entre TGN y la ruta endo/lisosomal,
transporte que ejercería un rol protectivo evitando la producción del péptido A (Burgos
PV. et al., 2010). Además, datos recientes en nuestro laboratorio utilizando un modelo
15
celular que expresa establemente el fragmento C99 resistente a proteólisis
intramembrana, han demostrado que C99 posee una alta tasa de recambio
independiente de la actividad -secretasa, como ha sido sugerido por Asai M. en el año
2011.
Nuestros datos, sumados a las evidencias que nos muestran que existen
mecanismos alternativos que regulan la disponibilidad de sustratos para la generación
del péptido A, de manera independiente al procesamiento RIP, nos permiten plantear
la siguiente hipótesis:
“La disponibilidad del fragmento C99 para su procesamiento proteolítico por el
complejo -secretasa es regulada por la ubiquitinación en residuos de lisina de su
dominio citosólico y por su destinación a MVBs para su posterior degradación en
lisosomas.”
16
Objetivos generales:
1. Investigar la contribución de la ruta lisosomal en la disponibilidad del fragmento C99
para su procesamiento proteolítico por el complejo -secretasa.
2. Determinar si el dominio citosólico del fragmento C99 es blanco de ubiquitinación y
determinar su rol en la destinación del C99 hacia MVBs.
Objetivos específicos:
1. Estudiar el efecto de la función lisosomal sobre la tasa de recambio del fragmento
C99.
2. Determinar si el dominio citosólico del fragmento C99 es blanco de ubiquitinación en
residuos de lisina.
3. Evaluar la participación de la maquinaria ESCRT en la tasa de recambio del
fragmento C99 modulando la expresión de TSG101, un componente del complejo
ESCRT-I.
17
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. Material biológico
La línea celular H4 se obtuvo de ATCC (número HTB-148™). Estas células son
adherentes de morfología epitelial, derivadas de neuroglioma de cerebro humano.
3.1.2. Anticuerpos
Molecular Probes: anti-IgG de conejo, anticuerpo producido en cabra conjugado a
Alexa Fluor 594.
GE Healthcare Life Sciences: anticuerpos secundarios anti-IgG de ratón y anti-IgG de
conejo.
AbD Serotec: anti-TGN46 humano, anticuerpo policlonal purificado producido en cabra.
Millipore: anti--amiloide (clon WO2), anticuerpo monoclonal purificado producido en
ratón, reconoce la secuencia de aminoácidos del 4 al 10 del péptido -amiloide humano.
Sigma-Aldrich: anti-Beta Actina (clon AC-74), anticuerpo monoclonal producido en
ratón, reconoce el extremo C-terminal de Beta-Actina.
BD Transduction Laboratories: anti-TSG101, anticuerpo purificado producido en
ratón, reconoce la secuencia de aminoácidos del 229-319 de TSG101.
HOMEMADE, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK: Suero de
conejo anti-GFP para reconocer a APP-EGFP e intermediarios proteolíticos: C83-EGFP,
C99-EGFP y AICD-EGFP
Invitrogen: anti-Receptor de Transferrina, anticuerpo monoclonal producido en ratón,
reconoce los aminoácidos del 3-28 del dominio citosólico del Receptor de Transferrina
humano.
18
Macs Molecular: anti GFP-HRP, anticuerpo monoclonal conjugado a HRP producido
en ratón, reconoce proteínas acopladas a epítope GFP y mutantes EGFP, CFP, YFP,
BFP y anti-HA-HRP, anticuerpo monoclonal conjugado a HRP producido en ratón,
reconoce proteínas con epítope HA (YPYDVPDYA).
3.1.3. siRNA
El siRNA fue adquirido de ThermoScientific Dharmacon. La secuencia del siRNA
5'- CCU CCA GUC UUC UCU CGU C -3' está dirigida contra el mRNA que codifica para
TSG101.
3.1.4. Reactivos Químicos
Los reactivos empleados en esta tesis fueron adquiridos de las siguientes
compañías:
Sigma-Aldrich: Solución Ponceau S, 2-Mercaptoetanol, N-[N-(3,5-Difluorofenilacetil)-Lalanil]-S-fenilglicina t-butil éster (DAPT), Cloroquina (CQ), Cicloheximida (CHX),
Cloranfenicol, Brefeldina A (BFA), 1,4-ditiotreitol (DTT), Poli-L-lisina, Bicarbonato de
Sodio (NaHCO3), Gelatina tipo A de piel de porcino, Cóctel de Inhibidor de proteasas,
Tween 20, Tritón X-100 Sigma Ultra, Azida de Sodio Sigma Ultra, Iodoacetamida Sigma
Ultra (Iac).
Daigger: Portaobjetos de vidrio.
Winkler: N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED), Buffer Fosfato Salino (PBS),
Acrilamida: Bisacrilamida 21:9, Persulfato de Amonio (PSA) , Tris, Azul de Bromofenol.
KDMedical:
Buffer
Tris-(hidroximetil)-aminometano
Etilendiaminotetraacético (EDTA), Cloruro de Sodio (NaCl).
Biosource: Buffer separador 4x, Buffer espaciador 4x.
(Tris),
Ácido
19
ThermoScientific: Sustrato quimioluminiscente West Pico, Sustrato quimioluminiscente
West Dura, estándar de proteínas, Biotina EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin y resina
NeutrAvidin Agarose.
Electron Miroscopy Sciences: Fluoromount-G, Paraformaldehído (PFA).
Fisherbrand: Coverslips de vidrio.
Merck: Isopropanol, Ácido Clorhídrico (HCl).
Equilab: Metanol absoluto (MeOH), Etanol absoluto (EtOH), filtro de nitrocelulosa 0.2
m.
USBiological: Glicina, Dimetil Sulfóxido (DMSO), Dodecyl Sulfato de Sodio (SDS).
BIORAD: Reactivo para cuantificar proteínas BIORAD Protein assay.
BioLabs: DNAsa I.
Invitrogen: Estándar de proteínas BenchMark, Oligofectamina, Lipofectamina 2000.
Gibco Laboratories Life Technologies, Inc: Tripsina, Medio de cultivo Eagle
Modificado
por
Dulbecco
(DMEM),
antibiótico
de
selección
Geneticina/G418,
Antibióticos Estreptomicina-Penicilina (Penstrep), Medio Opti-MEM, Agua ultrapura.
Rockland: Albúmina de Suero Bovino (BSA).
Calbiochem: N-Etilmaleimida (NEM), MG132.
Quality Biological: Cloruro de Calcio (CaCl2), Cloruro de Magnesio (MgCl 2), agua
ultrapura.
Whatman International Ltd.: Papel de cromatografía, Nitrocelulosa Optitran BA-S 83.
Zeiss: Aceite de inmersión para microscopía Inmersol 518F.
Kodak: Film fotográfico Blue XB, Líquido revelador GBX, Líquido fijador GBX.
20
El suero bovino fetal fue adquirido en Frigorífico Osorno (Osorno, X región, Chile) y se
inactivó en el laboratorio a 56°C por 30 minutos con posterior filtración.
3.1.5. Equipos
Baño termoregulado Memmert, Agitador de temperatura controlada Elmeco (The
Hot Rock), Fuente de poder Bio-Rad (PowerPAC 300 y PowerPAC 1000), Pipeteador
automático Matrix (CellMate II), Agitador magnético Corning (Stirrer), Agitador Thomas
(Clinical Rotator), Homogeneizador Ultrasónico Cole Parmer Instrument (4710 Series),
pHmetro WTW, Balanza electrónica Shimadzu (Libror EB-2800), Balanza analítica
Sartorius (LA230S), Centrifuga eppendorf (Centrifuge 5415D), Centrífuga refrigerada
eppendorf (5415R), Centrífuga Tomy (Capsulefuge PMC-060), Centrífuga refrigerada
Scilogex (D3024R), Espectrofotómetro Shimadzu doble haz (UV-150-02), Bomba de
vacío Thomas (1636), Cámara de flujo laminar HealForce, Estufa de cultivo con CO2
ThermoScientific (Series II Water Jacket), Microscopio invertido Carl Zeiss Germany
(Telaval 31), Microscopio de fluorescencia Carl Zeiss Germany (Axioskop, lámpara de
mercurio HBO 50), Cámara microscópica digital Carl Zeiss (AxioCam ICm1 Rev.1),
Unidad de barrido láser Olympus (FLUOVIEW 1000; FV1000), Microscopio invertido
Olympus (IX81), Objetivo de inmersión Olympus (PlanApo 60X), Sistema de
electroforesis y electrotransferencia Bio-Rad (Mini Protean® III y Mini Trans Blot®),
Mezclador termoregulado eppendorf (Thermomixer 5436), Micropipetas de volumen
ajustable Gilson (Pipetman classicTM P1000, P200, P100, P20, P10), Refrigerador
Fensa, Freezer Electrolux.
21
3.1.6. Softwares
Se utilizó el software ImageJ versión 1.47g, software de dominio público obtenido
de NIH, USA para el procesamiento de imágenes obtenidas por microscopía.
3.2. MÉTODOS
3.2.1. Cultivo celular de células H4
Se realizaron cultivos de la línea celular H4, las células fueron expandidas en
placas de 10 cm de diámetro y se mantuvieron en medio de cultivo Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM). Este medio se presenta en polvo y contiene 4.5 g/L D-glucosa,
584 mg/L L-glutamina, y 110 mg/L piruvato de sodio, pero no posee NaHCO3. Para su
preparación se disuelve 1 sobre de medio de cultivo adicionando 3.7 grs de NaHCO3,
se ajusta pH a 7.2-7.4 con 1 M HCl y luego se completa a 1 L para inmediatamente
filtrar usando una unidad de filtración que contiene un filtro de nitrocelulosa de 0.2 m.
Las células se mantienen hasta alcanzar la densidad deseada, a 37ºC con atmósfera
húmeda y 5 % de CO2. Todos los medios fueron suplementados con 10 % v/v de suero
bovino fetal previamente inactivado por calor y filtrado, 100 U/ml de Penicilina y 100
g/ml de Estreptomicina. Cada 2 ó 3 días las células se sub-cultivaron utilizando
Tripsina (0.05 % Tripsina, 1 mM EDTA en PBS pH 8.0) a 37 °C. En su defecto, se
congelaron en 1 ml o más dependiendo de la cantidad de células en medio para
congelar conteniendo 10 % v/v DMSO, 50 % v/v Suero Bovino Fetal y 40 % v/v células
en medio DMEM. Se almacena en criotubos a -80°C.
3.2.2. Obtención de líneas celulares estables
En esta tesis se utilizó como modelo de estudio células H4 que expresan
establemente la proteína C99 mutagenizada en el sitio de corte de -secretasa y
22
caspasas con el objetivo de estudiar los mecanismos moleculares que están implicados
en la tasa de recambio de la proteína, independientes al procesamiento proteolítico
descrito como RIP por Lichtenthaler SF. el año 2012.
El cDNA codifica para la proteína C99 fusionada al extremo N-terminal de EGFP
(C99-EGFP), como se describe en Burgos PV. et al., 2010 y todas las sustituciones
aminoacídicas fueron introducidas por mutagénesis sitio-dirigida como se describe en
Burgos PV. et al., 2010 y Prabhu Y. et al., 2012.
Los siguientes residuos aminoacídicos de la proteína C99 fueron sustituidos,
considerándose la secuencia del APP695 como referencia (Número de acceso GenBank:
CAA31830.1):
 F615P: Sitio de corte proteolítico de-secretasa.
 D664A: Sitio de corte proteolítico de caspasas.
 K649R, K650R, K651R, K676R, K688R (5K/R): Residuos de lisina del dominio
citosólico del fragmento C99.
Con estos cDNAs se obtuvieron líneas celulares estables que expresan las
siguientes versiones del C99 en células H4: C99-F/P-D/A-EGFP y C99-5K-F/P-D/AEGFP. Estas líneas celulares fueron generadas previamente en el laboratorio por
transfección de los respectivos cDNAs usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de
acuerdo a las instrucciones del fabricante, mantenidas en las condiciones especificadas
en la sección 3.2.1. Cultivo celular de células H4 y seleccionadas con 1 mg/ml
Geneticina/G418. Aquellos clones con expresión comparable de la proteína C99 fueron
empleados en los experimentos mostrados en este trabajo.
23
3.2.3. Ensayos de estabilidad
Para analizar la vida media del fragmento C99, se realizaron ensayos de caza en
las líneas celulares C99-F/P-D/A-EGFP y/o C99-5K-F/P-D/A-EGFP.
Los ensayos de caza se realizaron en presencia de una combinación de 150
g/ml Cicloheximida (CHX) y 40 g/ml Cloranfenicol a diferentes tiempos para inhibir la
síntesis proteica, en presencia o ausencia de 5 g/ml de Brefeldina A (BFA) para inhibir
el tráfico vesicular desde el RE hacia el A. Golgi. Transcurrido los tiempos de caza las
células fueron analizadas según la sección 3.2.5. Extracción de proteínas totales para
Western Blot.
3.2.4. Tratamientos con drogas
Tratamientos con 100 M CQ y 1 M MG132, o la combinación de estas drogas
fueron realizados por 16 horas. Mientras los análisis de dosis/respuesta se realizaron
en presencia de 1 M MG132 por 4 horas.
Tratamientos con 1 M DAPT y 5 g/ml BFA, o las combinaciones de 1 M
MG132 y 5 g/ml BFA, 1M DAPT y 100 M CQ o 1 M MG132 y 1 M DAPT fueron
realizados por 16 horas. Luego las células fueron analizadas según la sección 3.2.5.
Extracción de proteínas totales para Western Blot.
En este trabajo se utilizó DAPT como inhibidor del procesamiento proteolítico por
el complejo -secretasa, por tratarse de una enzima que procesa al APP/C99 de
manera heterogénea en múltiples sitios (Small DH. et al., 2010). Con el uso de este
inhibidor se pueden evaluar factores distintos al procesamiento por el complejo secretasa que estén influenciando en la tasa de recambio de la proteína C99.
24
En nuestros ensayos se utilizó BFA, por ser una droga que induce una
redistribución de proteínas desde A. Golgi hacia el RE, conduciendo una acumulación
de proteínas dentro del RE (Lippincott-Schwartz J. et al., 1989).
Además, CQ fue usado como agente lisosomotrópico que causa la inhibición de
las enzimas hidrolíticas lisosomales y MG132 fue usado por ser un inhibidor reversible
del proteasoma.
3.2.5. Extracción de proteínas totales para Western Blot
A partir de una placa sembrada con células, se extrajo el medio de cultivo con la
ayuda de una bomba de vacío y se realizó un lavado con PBS Ca++/Mg++ (PBS 1x, 0.1
mM CaCl2, 1 mM MgCl2) con 500 l-1000 l de PBS Ca++/Mg++ frío 1x por las paredes
de los pocillos de la placa. Se preparó 200-300 l de Buffer de lisis (50 mM Tris-HCl, 1
% v/v Tritón X-100 , 150 mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.4) por pocillo (Según el número de
pocillos de la placa) con 4 l/ml buffer del cóctel de Inhibidor de proteasas 250x. Luego,
la placa se mantuvo en agitación constante durante 30 minutos a 140 R.P.M. a 4°C, se
tomó todo el volumen de lisado y se centrifugó a 13.200 R.P.M. (16.100 x g) durante 20
minutos a 4°C, se tomaron 150 l de extracto de la porción soluble y se mezclaron con
50 l de buffer de carga 4x (200 mM Tris Buffer, 8 % p/v SDS, 40 % v/v Glicerol, 120
mg Azul Bromofenol, 10 % v/v -Mercaptoetanol, pH 6.8), finalmente las muestras se
calentaron a 95°C por 5 minutos en mezclador termoregulado.
3.2.6. Ensayo de ubiquitinación
3.2.6.1. Transfección transciente de DNA plasmidial en células H4
Este ensayo se realizó con las líneas celulares C99-F/P-D/A-EGFP y C99-5KF/P-D/A-EGFP con DNA plasmidial para sobreexpresar ubiquitina-HA, las células se
25
mantuvieron en cultivo hasta una confluencia del 70 % en placa de 35 mm de diámetro
y se transfectaron con DNA haciendo uso del reactivo comercial de transfección por
liposomas Lipofectamina 2000 y se siguió las instrucciones del fabricante. Las células
permanecieron 1 hora con la mezcla de liposomas en medio Opti-MEM (GIBCO) a
37°C, luego éste se remplazó por medio DMEM suplementado con 10 % v/v de suero
bovino fetal estéril, 100 U/ml de Penicilina y 100 g/ml de Estreptomicina y transcurridas
12 horas se procedió a la extracción de proteínas descrita en la sección 3.2.6.2.
Extracción de proteínas para Ensayo de ubiquitinación.
3.2.6.2. Extracción de proteínas para Ensayo de ubiquitinación
Para la extracción de proteínas con el objetivo de inmunoprecipitar la proteína
C99 covalentemente unida a ubiquitina, se debió tomar en cuenta que esta unión es de
naturaleza inestable, por esta razón se realiza el ensayo suplementando con:
 N-etilmaleimida (NEM), un potente inhibidor irreversible de cisteína proteasas y
enzimas deubiquitinantes (DUBs).
 Iodoacetamida (Iac), bloquea los grupos sulfidrilo (–SH) de las cisteína para
evitar que se formen puentes disulfuro entre las proteínas del extracto celular.
 1,4-ditiotreitol (DTT), rompe los puentes disulfuro establecidos entre las cisteínas.
Se eliminó el medio de cultivo con ayuda de una bomba de vacío a cada uno de
los pocillos sembrados con células que fueron previamente transfectadas de forma
transciente con ubiquitina-HA según la sección 3.2.6.1. Transfección transciente de
DNA plasmidial en células H4 y se hizo un lavado con PBS 1x frío, luego con ayuda de
un rastrillo se removieron las células por fricción de éste sobre la placa 1 ml PBS
Ca++/Mg++ (PBS 1x, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) frío con inhibidor de proteasas 1x,
26
siempre manteniendo la placa en el hielo. El contenido celular se centrifugó a 4°C x 5
minutos a 1.000 R.P.M. (100 x g) y el pellet de células se resuspendió en 100 l de
Buffer Denaturante (1 % p/v SDS, 50 mM Tris Buffer pH 7.4, 5 mM EDTA, 10 mM DTT,
10 mM Iac, 5 mM NEM, 15 U/ml DNAasa I, Inhibidor de proteasas 250x, agua ultrapura)
mantenido a 4°C y las muestras fueron calentadas a 95°C x 10 minutos a 1400 R.P.M.
en mezclador termoregulado. Se adicionaron 900 l de Buffer de lisis (1 % v/v Tritón X100, 50 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) suplementado con 10 mM Iac
y 5 mM NEM, las muestras se rotaron durante 30 minutos en pieza fría a 4°C. Para
eliminar material insoluble del lisado celular las muestras se centrifugaron a 13.200
R.P.M. (16.100 x g) por 15 minutos. Sólo se conserva el sobrenadante para realizar el
ensayo de la sección 3.2.6.3. Co-inmunoprecipitación de proteínas para ensayo de
ubiquitinación.
3.2.6.3. Co-inmunoprecipitación de proteínas para ensayo de ubiquitinación
Este ensayo se basa en concentrar al máximo la proteína de interés, que en este
trabajo son respectivamente C99-F/P-D/A-EGFP y C99-5K-F/P-D/A-EGFP para
posteriormente desarrollar el WB usando un anticuerpo anti-HA que reconocerá la
ubiquitina transfectada previamente según la sección 3.2.6.1. Transfección transciente
de DNA plasmidial en células H4, de tal forma que el número de bandas inespecíficas
obtenidas disminuya considerablemente. Para poder concentrar las proteínas de
interés, primero se añade un anticuerpo primario anti-GFP a una concentración
saturante, que reconocerá a ambas versiones de la proteína, para que toda la proteína
presente en el extracto celular se una al anticuerpo, además se incorpora a la reacción
la proteína A de Staphilococcus aereus que tiene la capacidad de unirse a anticuerpos,
27
especialmente a IgG, interaccionando con la cadena pesada y uniéndose a la porción
Fc de ésta. Esta proteína interacciona fuertemente con IgG de conejo y comercialmente
se encuentra inmovilizada en beads de sefarosa, lo que le confiere un carácter insoluble
al complejo proteína A/sefarosa, con lo que resulta fácil separarlos por centrifugación.
En este ensayo para cada condición, se hizo en un volumen final de 940 l de
solución (900 l de extracto soluble obtenido en la sección 3.2.6.2. Extracción de
proteínas para ensayo de ubiquitinación, 30 l beads de Proteína A/sefarosa 50 % v/v,
5 l de anticuerpo anti-GFP y 5 l de albúmina de suero bovino (BSA) 10 % p/v, para
reducir uniones no específicas). Las reacciones se mantuvieron en rotación a 4°C en
pieza fría por un período de 1 hora, luego se lavaron dos veces en 1 ml de Buffer de
lisis suplementado con 10 mM Iac y 5 mM NEM, se eliminó el buffer de lisis
sobrenadante y sobre las beads se agregó 60 l de Buffer de carga 4x (200 mM Buffer
Tris, 8 % p/v SDS, 120 mg Azul Bromofenol, 40 % v/v Glicerol, 10 % v/v Mercaptoetanol, pH 6.8), se mezcló el Buffer de carga con las beads y se calentaron las
muestras a 95°C por 5 minutos en mezclador termoregulado.
3.2.7. Ensayo de biotinilación de proteínas de membrana plasmática
Este ensayo se realizó con las líneas celulares C99-F/P-D/A-EGFP, C99-5K-F/PD/A-EGFP y HA-APP-F/P-D/A-EGFP, las células fueron tratadas y mantenidas en
placas de 35 mm de diámetro hasta una confluencia aproximada de un 90 % para dar
curso a la biotinilación de las proteínas de membrana. Este ensayo se basa en la alta
afinidad de avidina por biotina (Vitamina H), que es una de las interacciones nocovalente más fuertes conocida entre una proteína y un ligando (Ka= 1015 M-1), esta
propiedad permite conjugar avidina a moléculas marcadas con biotina en una mezcla
28
compleja, y una vez formado el enlace no es afectado por pH extremo, temperatura,
solventes orgánicos o agentes denaturantes. Comercialmente el tipo de agente de
biotinilación más común es un éster de biotina en N-Hidroxi-sulfosuccinimida (SulfoNHS) que reacciona con aminas primarias (-NH2) para formar un enlace amida estable.
Las proteínas generalmente disponen de aminas primarias en la cadena lateral de
residuos lisina (K) y grupos -NH2 terminales expuestos a la superficie celular
disponibles para ser marcadas con biotina-NHS. Luego las proteínas marcadas con
biotina, pueden ser separadas de una mezcla compleja con el uso de resinas de
afinidad adsorbidas de avidina, comercialmente se adquieren resinas de avidina
modificada para disminuir la probabilidad de uniones no específicas.
Una vez que se trataron las células con las respectivas drogas, los ensayos
fueron realizados según Prabhu Y. et al., 2012. Las células fueron lavadas 2 veces con
PBS Ca++/Mg++ (PBS 1x, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) frío, luego con precaución de no
dejar secas las células se incorporó por las paredes de la placa 800 l de Biotina 1 mM
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, ThermoScientific) que se une a los grupos -NH2
terminales expuestos a la superficie celular, las placas se dejaron en agitación suave
durante entre 30 minutos y 1 hora a 4°C en pieza fría. Se lavó 1 vez con 1 ml de PBS
Ca++/Mg++, y se bloqueó la Biotina libre con el uso de solución Bloqueadora (PBS 1x, 50
mM Tris Buffer pH 7.4), se utilizó 1 ml por placa, se mantuvo en agitación suave durante
10 minutos a 4°C en pieza fría, luego se lavó 1 vez con 1 ml de PBS Ca++/Mg++, y se
procedió al análisis de las células con 400 l de Buffer de lisis, obteniéndose la porción
soluble según el método de la sección
3.2.5. Extracción de proteínas totales para
Western Blot. Con el extracto soluble se normalizaron los niveles de proteínas totales
29
mediante el método de la sección 3.2.9. Determinación de la concentración de
proteínas por el método de Bradford. Una vez normalizados los niveles de proteínas, un
volumen de 60 l de extracto soluble total se mezcló con 20 l de buffer de carga 4x y
un volumen de extracto soluble se hizo interaccionar con una resina de alta afinidad a
Biotina en un volumen total de 1 ml (290 l de extracto soluble, 30 l Beads de avidina
inmovilizada en agarosa al 50 % v/v (NeutrAvidin Agarose, ThermoScientific), 10l BSA
10 % y 670 l de Buffer de lisis). Las reacciones se dejaron en rotación suave por 2
horas a 4°C en pieza fría, luego las beads se lavaron 2 veces con 1 ml de Buffer de
lisis. Se eliminó el buffer de lisis de lavado hasta dejar el mínimo volumen, y se agregó
60 l de buffer de carga 1x. Se homogeneizaron las muestras tanto las que contenían
beads como extractos totales y se calentaron a 95°C por un periodo de 5 minutos en
mezclador termoregulado.
3.2.8. Ensayo de silenciamiento
Este ensayo tiene como objetivo reducir la expresión de TSG101, con el uso de
oligonucleótidos cortos de ácido ribonucleico (ARN) con una secuencia complementaria
al ARN mensajero (ARNm). La unión del oligonucleótido al ARNm, es reconocida por
una enzima conocida como Dicer, que corta el ARN de doble hebra (dsARN),
incorporándose a un complejo con múltiples componentes, denominado complejo de
silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde utiliza la hebra antisentido para el
reconocimiento del sustrato, promoviendo el corte y posterior destrucción del ARNm
diana, provocando la supresión de la expresión del gen de interés.
Se transfectaron los oligonucleótidos mediante el uso de liposomas, y
considerando que las proteínas de la maquinaria ESCRT son de larga vida media, el
30
ensayo requirió ser hecho 72 horas antes de ver los resultados y finalmente para
optimizar la eficiencia de la transfección, se realizó con una baja densidad celular.
 Secuencia oligonucleótido dirigido a TSG101: 5'- CCU CCA GUC UUC UCU
CGU C -3'
El ensayo se realizó con la línea celular C99-5K-F/P-D/A-EGFP. Las células se
mantuvieron en cultivo hasta una confluencia del 10 % en placa de 35 mm de diámetro
y se transfectaron los oligonucleótidos haciendo uso del reactivo comercial de
transfección por liposomas Oligofectamina (Invitrogen) y se siguió las instrucciones del
fabricante. Las células permanecieron 16 horas con la mezcla de liposomas en medio
Opti-MEM a 37°C, luego éste se remplazó por medio DMEM suplementado con 10 %
v/v de suero bovino fetal estéril, 100 U/ml Penicilina y 100 g/ml Estreptomicina y
transcurridas 48 horas desde la transfección se procedió al análisis de las células.
3.2.9. Determinación de la concentración de proteínas por el método de Bradford
La concentración de proteínas en las distintas muestras se determinó con una
solución Protein assay (Bio-Rad), basado en el método de Bradford MM., 1976. Este
ensayo se basa en la unión de un colorante a proteínas solubilizadas en el cual se
genera una diferencia en el color de la solución en respuesta a cambios en las
concentraciones de proteínas. La determinación se realiza espectrofotométricamente a
595 nm, debido al corrimiento del máximo de absorbancia de la solución que contiene
Azul de Coomassie (Coomassie®Brilliant Blue G-250) desde 465 a 595 nm, cuando el
colorante se une a las proteínas. El reactivo Protein assay 5x, se diluye en agua
destilada a 1x. Se mide con 1 ml de reactivo 1x por cubeta y 10 l de extracto soluble a
595 nm.
31
Luego se procede a normalizar los niveles de proteínas entre las diferentes
muestras de la siguiente manera: la absorbancia más pequeña obtenida en una
determinada muestra se toma como absorbancia limitante, por lo tanto todas las demás
absorbancias son divididas por la absorbancia limitante, generándose un factor superior
a 1. Con este factor se calcula el volumen de buffer de lisis que se debe incorporar a las
muestras para que finalmente todas las muestras lleven igual concentración de
proteínas.
3.2.10. Análisis electroforético de proteínas en geles de poliacrilamida (SDSPAGE)
La electroforesis se efectuó en geles de poliacrilamida al 10 % y al 12 % de
acuerdo al procedimiento descrito por Laemmli UK., 1970 en el sistema de
electroforesis Mini Protean® III (Bio-Rad). Las medidas del gel fueron 8,5 cm de ancho,
5 cm de alto y 1.5 mm de grosor. Tanto el gel separador como el gel espaciador se
prepararon a partir de una solución de Acrilamida: Bis-Acrilamida 29:1. Según el tamaño
de la proteína que se pretende analizar, se prepararon geles separadores al 10 % y al
12 %. La concentración final de poliacrilamida de un gel al 10 % contiene 0.375 mM
Tris-HCl pH 8.8, 3.5 mM SDS, 0.07 % v/v Persulfato de amonio (PSA) y 0.13 % v/v
TEMED. Por otro lado, el gel espaciador se preparó a una concentración final de
poliacrilamida de 5 %, que incluía 0.125 M Tris-HCl pH 6.8, 3.5 mM SDS, 0.08 % v/v
PSA y 0.16 % v/v TEMED.
La electroforesis se llevó a cabo a una intensidad de corriente constante de 30
mA por 2 horas aproximadamente en buffer de corrida (25 mM Tris-HCl, 200 mM Glicina
y 0,1 % v/v SDS, pH 8.3).
32
3.2.11. Análisis de Western Blot
3.2.11.1 Electrotransferencia
Después de finalizada la separación electroforética según lo descrito en la
sección 3.2.10. Análisis electroforético de proteínas en geles de poliacrilamida (SDSPAGE), las proteínas del gel se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Optitran BAS 83 (Whatman International Ltd.), según lo descrito por Tsang VC. et al., 1983 en el
sistema de Mini Trans Blot® (Bio-Rad). Para lo cual, sobre una esponja embebida en
buffer de transferencia (25 mM Tris-HCl, 200 mM Glicina, 20 % v/v Metanol, pH 8.3) se
depositaron tres trozos de papel de cromatografía (Whatman International Ltd.), luego el
gel a transferir, el papel de Nitrocelulosa, y otros tres trozos de papel de cromatografía,
todo lo cual se cubre con otra esponja embebida en la misma solución. Este “sandwich”
se colocó en la cámara de electrotransferencia conteniendo el buffer de transferencia
antes mencionado, y se aplicó una intensidad de corriente constante de 450 mA por 1
hora. Transcurrido el tiempo de electrotransferencia la membrana se tiñe con solución
de Ponceau S (Sigma-Aldrich) para verificar el buen resultado de la transferencia de
proteínas a la membrana de Nitrocelulosa. Luego la solución de Ponceau S es
eliminada de la membrana con 3 lavados de 5 minutos con PBS-Tween 20 (0.25 % v/v
Tween 20 en PBS 1x).
3.2.11.2. Detección inmunológica
Las membranas se incubaron con 5-10 ml de solución de bloqueo PBS-Leche
(PBS 1x, 5 % p/v leche descremada), por 30 minutos. Luego cada membrana fue
incubada con 7-10 ml del anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo que
contenía el anticuerpo específico para el epítope o proteína de interés, todos diluidos
33
1:1000 en agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente las
membranas fueron lavadas 3 veces con PBS-Tween 20 (0.25 % v/v Tween 20 en PBS
1x) a temperatura ambiente por 5 minutos cada vez. Luego se incubaron a temperatura
ambiente por 1 hora con 7-10 ml de solución de bloqueo que contenía el segundo
anticuerpo anti Ig de conejo o mouse según sea el anticuerpo primario, conjugado con
Peroxidasa (GE Healthcare UK Limited) diluido 1:5000 en solución de bloqueo . El
exceso de anticuerpo se eliminó con 3 lavados con PBS-Tween 20 (0.25 % v/v Tween
20 en PBS 1x) por 5 minutos cada uno en agitación a temperatura ambiente.
Finalmente
las
membranas
se
expusieron
usando
un
método
de
quimioluminiscencia, el cual se basa en la emisión de luz no radiactiva . Este método
detecta antígenos inmovilizados unidos directa o indirectamente con anticuerpos
conjugados con Peroxidasa de rábano. El resultado se obtiene mezclando partes
iguales de dos reactivos, una solución de peróxido de hidrógeno y otra de Luminol
(West Dura, Thermo Scientific), que se vierte sobre las membranas, dejándose actuar
por 5 minutos y secando el exceso con papel absorbente, para exponer en un film
fotográfico (Kodak) el resultado de la excitación del Luminol en una sala en oscuridad.
La reacción se detiene al retirar la película de la membrana y se revela con una
solución de revelado GBX (Kodak) y se fija con una solución de fijación GBX (Kodak).
Finalmente los films fueron secados a temperatura ambiente.
3.2.12. Ensayos de Inmunofluorescencia Indirecta
Este ensayo se realizó para detectar proteínas asociadas a organelos con el uso
de anticuerpos y facilitar el análisis de la distribución subcelular del C99.
34
Se sembraron las células sobre coverslips de 25 mm de diámetro (previamente
tratados por 2 horas con 0.1 mg/ml colágeno) en placas de poliestireno de 24 pocillos
usando medio DMEM suplementado con 10 % v/v de suero bovino fetal estéril, 100
U/ml de Penicilina y 100 g/ml de Estreptomicina y mantenidas en las condiciones
especificadas en la sección 3.2.1. Cultivo celular de células H4. Una vez que las células
alcanzaron una confluencia aproximada del 80 %, se procedió a su fijación como se ha
descrito previamente por Burgos PV. et al., 2010. Los coverslips se lavaron en PBS
Ca++/Mg++ (PBS 1x, 0.1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2) y el exceso de líquido se eliminó con
papel absorbente, luego las células fueron fijadas en 1 ml de 4 % v/v paraformaldehído
(PFA) preparado en PBS Ca++/Mg++ por un período de 30 minutos a temperatura
ambiente. Para eliminar el exceso de PFA los coverslips se lavaron en PBS Ca++/Mg++
para luego permeabilizar las células en 1 ml de 0.2 % v/v Triton X-100 preparado en
PBS Ca++/Mg++ por un período de 10 minutos a temperatura ambiente. Los coverslips
se lavan nuevamente y se bloquea en 1 ml de 0.2 % p/v gelatina preparada en PBS
Ca++/Mg++, por 10 minutos a temperatura ambiente. La incubación con el anticuerpo
primario se realiza en una cámara húmeda con 30 l de la dilución del anticuerpo
preparado en la solución de bloqueo, el que es incorporado sobre una superficie
hidrofóbica y los coverslips se ponen con las células orientadas hacia la gota, se incuba
a 37°C por 30 minutos, se lavan los coverslips en un rack de porcelana con 100 ml de
PBS 1x por 5 minutos a temperatura ambiente y luego la incubación del anticuerpo
secundario conjugado a Alexa Fluor se hace de la misma manera que el anticuerpo
primario. Finalmente se montaron los coverslips en portaobjetos con 20 l de
35
Fluoromount-G (Electron Miroscopy Sciences). Se aspiró el exceso de solución de
montaje con bomba de vacío y se secaron a 65°C en estufa por 15 minutos.
3.2.13. Microscopía
3.2.13.1. Microscopía de epifluorescencia
Se utilizó un microscopio de epifluorescencia Axioskop (Carl Zeiss Germany),
equipado con una lámpara de mercurio HBO 50 y el siguiente filtro para visualizar la
distribución subcelular de la proteína C99 en sus diferentes versiones acoplado a GFP.
 GFP/Alexa 488 (set 10). BP 450 – 490; FT 510; BP 515 – 565
Las imágenes se obtuvieron con una cámara microscópica digital AxioCam
ICm1 Rev.1 (Carl Zeiss Germany) y su procesamiento se describe en la sección
3.2.13.3. Procesamiento de imágenes.
3.2.13.2. Microscopía confocal de barrido láser
Para la evaluación de la distribución subcelular de la proteína C99 en sus
diferentes versiones acoplada a GFP, se adquirieron las imágenes de células fijadas
con una unidad de barrido láser FLUOVIEW FV1000 (Olympus) acoplada a un
microscopio invertido IX81 (Olympus) equipado con un láser multilínea de iones de
Argón de 458, 488 y 515 nm, que excita la proteína fluorescente verde. Se utilizó un
objetivo de inmersión PlanApo 60X (NA 1.40; Olympus). Las imágenes obtenidas fueron
procesadas como se describe en la sección 3.2.13.3 Procesamiento de imágenes.
3.2.13.3. Procesamiento de imágenes
Todo el procesamiento de imágenes se realizó mediante el software ImageJ
versión 1.47g. Las imágenes registradas en el microscopio de epifluorescencia (16 bit)
fueron transformadas a escala de grises con una profundidad de 8 bit con la función
36
Image/Type/8 bit, y luego se les ajustó el mejor despliegue de intensidades mediante la
función Image/Adjust/Brightness/Contrast.
3.2.13.4. Co-localización.
El análisis de co-localización por microscopía confocal de barrido láser se realizó
con las imágenes digitales capturadas con cada uno de los fluorocromos por separado,
excitando cada uno de ellos con la longitud de onda óptima y solapando las imágenes
de cada canal en una imagen única con posterioridad. Las imágenes fueron solapadas
mediante el uso del software ImageJ versión 1.47g. Las imágenes digitales por
separado fueron ajustadas con las funciones Process/Filters/Gaussian Blur y
Process/Filters/Unsharp Mask y luego fueron solapados en una única imagen con la
función Image/Color/Merge Channels.
37
4. RESULTADOS
4.1. Análisis del procesamiento proteolítico del fragmento C99.
En la ruta amiloidogénica, el fragmento C99 es generado por la acción de BACE1
en el dominio extracelular del APP. El C99 contiene la secuencia amiloidogénica
completa, el dominio transmembrana (TM) y el dominio citosólico del APP, y
consecutivamente puede ser procesado proteolíticamente por el complejo-secretasa
en el dominio transmembrana, correspondiendo al paso final para la liberación del
péptido A, que está contenido en el espacio intraluminal/extracelular y el dominio
transmembrana del fragmento C99 (Figura 1).
En vista que la proteína C99 es procesada además por otras enzimas, se
caracterizaron todas las especies proteolíticas generadas en células H4 expresando en
forma transiente la proteína C99-EGFP, y además para facilitar los análisis se
expresaron
transientemente
versiones de
la
proteína
C99-EGFP que llevan
sustituciones que suprimen el corte por -secretasa (F615P) y caspasas (D664A), o
ambas actividades proteolíticas (D/A-F/P). Se analizó el procesamiento del C99 en
ausencia o presencia de DAPT, un inhibidor específico del complejo -secretasa, y los
extractos celulares fueron analizados por WB (Figura 2).
En las células que expresan la versión C99-EGFP (WT) se detectaron con
claridad las especies AICD-EGFP y C31-EGFP, productos del procesamiento por secretasa y caspasas respectivamente, tal como estas especies fueron caracterizadas
para el APP previamente por Prabhu Y. et al., 2012. Al tratar estas células con DAPT
los niveles de C99-EGFP fueron aumentados con respecto a las células no tratadas, lo
38
Figura 1. Representación esquemática del procesamiento proteolítico de los
fragmentos C99 y C83. Se indica la topología de la proteínas C99 y C83 fusionadas a
EGFP, sus dominios transmembrana (TM) y citosólico, la posición del péptido A, el
péptido p3, el fragmento C31, fragmento AICD y los sitios de corte ( ) de las enzimas
-secretasa, -secretasa y caspasas.
39
Figura 2. C99 es procesado proteolíticamente en diferentes sitios. Células H4
transfectadas transientemente con cDNA codificante para C99-EGFP (WT) o C99EGFP con sustituciones en los sitios de corte de -secretasa (F615P) y caspasas
(D664A). Las células fueron incubadas en ausencia (-) o presencia (+) del inhibidor de
-secretasa DAPT por 16 horas, y luego los extractos celulares fueron analizados por 10
% SDS-PAGE, seguido de WB con anticuerpo anti-GFP para reconocer las diversas
especies proteolíticas.
40
cual demuestra que la disponibilidad del C99-EGFP es potentemente regulada por la
actividad -secretasa (Figura 2, carriles 1 y 2). Las especies C31-EGFP y C83-EGFP
resultaron ser anuladas eficientemente con las mutaciones D664A (Figura 2, carriles 3
y 4) y F615P (Figura 2, carriles 5 y 6), respectivamente. Adicionalmente, el doble
mutante C99-F/P-D/A-EGFP resultó ser un buen sustrato para -secretasa, generando
AICD-EGFP en la ausencia de DAPT. En la presencia de DAPT AICD-EGFP está
ausente mientras los niveles de C99 se ven incrementados (Figura 2, carriles 7 y 8).
Esta droga resultó ser un eficaz inhibidor de la actividad -secretasa reduciendo los
niveles de AICD-EGFP en todas las versiones del C99.
La incorporación de las sustituciones F615P y D664A originó una proteína que
facilita el estudio de los fenómenos involucrados en la tasa de recambio del C99, de
manera independiente al procesamiento, al menos por -secretasa y caspasas. Por
esta razón para facilitar los siguientes ensayos se generó la línea celular H4 que
expresa establemente C99-F/P-D/A-EGFP.
4.2. Estudio de la actividad de los compartimientos acídicos de la ruta
endo/lisosomal en la tasa de recambio del fragmento C99.
Para estudiar los mecanismos que regulan la tasa de recambio del fragmento
C99 se procedió primeramente a probar la posibilidad de que el C99 fuera sustrato de
los compartimientos acídicos de la ruta endo/lisosomal, ya que en estudios recientes se
ha reportado que proteasas lisosomales participan en el metabolismo del APP (Asai M.
et al., 2011). Para este propósito, se estudió el efecto de CQ, una droga que aumenta el
pH luminal de organelos acídicos en la ruta secretoria tardía alterando la maduración
endosomal y la función lisosomal. Las células H4 expresando establemente la proteína
41
C99-F/P-D/A-EGFP (Figura 3) fueron tratadas con CQ por 16 horas en ausencia (-) o
presencia (+) del inhibidor DAPT y los extractos celulares fueron analizados por WB con
anticuerpo anti-GFP (Figura 3A).
Se confirmó que el fragmento C99-F/P-D/A-EGFP es buen sustrato para el
complejo -secretasa y que los niveles de la proteína son fuertemente regulados por su
procesamiento proteolítico, a través de la considerable disminución de los niveles de
AICD-EGFP en presencia del inhibidor DAPT, con un consecuente incremento en los
niveles de C99-F/P-D/A-EGFP (Figura 3A, carriles 2 y 4), tal como se había observado
en la Figura 2. Sorprendentemente en aquellas células que fueron tratadas con CQ los
niveles del fragmento C99-F/P-D/A-EGFP no fueron afectados (Figura 3A, carriles 1 y
3). Además, por microscopía se observó que el fragmento C99-F/P-D/A-EGFP se
localiza principalmente en A. Golgi, con una difusa fluorescencia GFP citoplasmática
correspondiente a AICD-EGFP (Figura 3B, Control), localización que permaneció
inalterada frente al tratamiento con CQ (Figura 3B, CQ).
Estos
resultados
compartimientos acídicos.
indican
que
el
fragmento
C99
no
es
sustrato
de
42
Figura 3. C99 no es sustrato de compartimientos acídicos. (A) Células H4
expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP fueron tratadas por 16 horas con 1 M
DAPT, 100 M CQ, o con una combinación de 1 M DAPT y 100 M CQ. Los extractos
celulares fueron analizados por 10 % SDS-PAGE, seguido de WB con anticuerpo antiGFP para reconocer las especies proteolíticas generadas. (B) Análisis por microscopía
confocal de fluorescencia de células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP
no tratadas (Control) y tratadas con 100 M CQ por 16 horas (CQ). Barra, 10 m.
43
4.3. Estudio del efecto de la actividad proteasomal en la tasa de recambio del
fragmento C99.
En consideración que no se observó degradación del fragmento C99 en
compartimientos de la ruta endo/lisosomal, se decidió estudiar si su tasa de recambio
es dependiente de la degradación proteasomal, apoyándonos en reportes que
proponen que el proteasoma regula el recambio del fragmento C99 e inhibe la
producción del péptido A (Nunan J. et al., 2001).
Para estudiar el rol de la actividad proteasomal en la tasa de recambio del
fragmento C99, células H4 expresando establemente la proteína C99-F/P-D/A-EGFP
(Figura 4), fueron tratadas con concentraciones crecientes del inhibidor proteasomal
MG132 por 4 horas y los extractos celulares fueron analizados por WB.
Sorprendentemente, se detectó que tanto los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP como de
AICD-EGFP fueron acumulados de manera dosis dependiente (Figura 4A, carriles 1 al
5) y la máxima acumulación de estas especies se observó con una concentración de
1M MG132 (Figura 4A, carril 5), por esta razón se seleccionó esta concentración de
MG132 para ensayos posteriores. Luego se procedió a analizar el efecto de la inhibición
proteasomal sobre el procesamiento por -secretasa con el uso del inhibidor DAPT. En
células pretratadas con DAPT se detectó potenciado el efecto de MG132 sobre los
niveles de C99-F/P-D/A-EGFP. Además el tratamiento con DAPT confirmó la identidad
del fragmento AICD-EGFP en respuesta a MG132 (Figura 4B, carril 4).
44
Figura 4. La degradación del C99 está asociada a su redistribución hacia el RE.
Células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP fueron incubadas como
sigue: (A) MG132 a concentraciones crecientes por 4 horas. (B) MG132 por 4 horas en
ausencia (-) o presencia (+) de pre tratamiento con DAPT por 16 horas. (C) MG132 por
4 horas en ausencia (-) o presencia (+) de BFA. (D) Ensayo de caza en presencia de
150 g/ml CHX y BFA por 0-60 minutos en células control y pretratadas con MG132 por
4 horas. Los extractos celulares fueron analizados por 10 % SDS-PAGE, seguido de
WB con anticuerpo anti-GFP para reconocer las especies proteolíticas generadas (A-D).
Los niveles de -actina fueron usados como control de carga (A-D).
45
Estos resultados demuestran que el C99-F/P-D/A-EGFP es sustrato de
degradación proteasomal, actuando como una ruta adicional al procesamiento por el
complejo -secretasa. Adicionalmente, se demostró que el inhibidor proteasomal
MG132 no inhibe la actividad -secretasa, sino más bien al inhibir la degradación
proteasomal se proporciona más sustrato disponible para su procesamiento por esta
enzima.
Luego, se procedió a investigar si la acumulación de C99-F/P-D/A-EGFP con
MG132 estaba conectada a ERAD. Para evaluarlo, se estudió el efecto de BFA sobre el
C99-F/P-D/A-EGFP, una droga que causa la redistribución de proteínas localizadas en
el A. Golgi hacia el RE (Lippincott-Schwartz J. et al., 1989). Células expresando C99F/P-D/A-EGFP fueron tratadas con BFA en presencia o ausencia de MG132 (Figura
4C). En células tratadas con BFA hubo una reducción en los niveles de C99-F/P-D/AEGFP y AICD-EGFP en comparación con las células no tratadas (Figura 4C, carriles 1
y 2), mientras al co-incubar MG132 con BFA resultó en una potente acumulación del
C99-F/P-D/A-EGFP (Figura 4C, carriles 3 y 4), en contraste a los niveles de AICDEGFP se vieron reducidos en estas condiciones comparado a las células tratadas sólo
con MG132 (Figura 4C, carriles 3 y 4).
Estos resultados sugieren que cuando el C99-F/P-D/A-EGFP es redistribuido
hacia el RE se podría intensificar su degradación por ERAD, con una consecuente
reducción en su procesamiento por el complejo -secretasa, lo que explicaría los
reducidos niveles de AICD-EGFP en células tratadas con BFA (Figura 4C, carriles 2 y
4).
46
Para
evaluar la
degradación del
C99-F/P-D/A-EGFP asociada al
RE,
examinamos la cinética de degradación del C99. Para esto, realizamos un ensayo de
caza, en presencia de CHX y BFA por un período de 60 minutos en células pretratadas
con MG132 (Figura 4D). En las células control los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP
declinaron a partir de los 30 minutos (Figura 4D, carriles 1 al 3), mientras en aquellas
células pretratadas con MG132, el tratamiento con BFA retardó considerablemente el
recambio de C99-F/P-D/A-EGFP (Figura 4D, carriles 4 al 6). Mediante análisis por
microscopía de fluorescencia se confirmó la redistribución del fragmento C99-F/P-D/AEGFP hacia el RE en células tratadas con una combinación de MG132 y BFA (Figura
5B).
En conjunto, estos resultados indican que el fragmento C99-F/P-D/A-EGFP es
eficientemente degradado por un mecanismo dependiente de la actividad proteasomal
denominado ERAD.
47
Figura 5. Inhibición de ERAD acumula C99 en RE luego de su redistribución por
BFA. Análisis por microscopía confocal de fluorescencia de células H4 expresando
establemente C99-F/P-D/A-EGFP tratadas con: (A) 5 g/ml BFA o (B) una combinación
de 5 g/ml BFA y 1 M MG132 por 4 horas. Barra, 10 m.
48
4.4. Estudio del efecto de la actividad proteasomal sobre los niveles de APP.
Se ha propuesto que el procesamiento del APP por BACE1 en el RE es un
evento poco probable (Martin BL. et al., 1995). Para evaluar si el C99 generado del APP
es degradado por ERAD, se repitió la estrategia experimental en una línea celular que
expresa establemente HA-APP-F/P-D/A-EGFP, modelo previamente validado por
Prabhu Y. et al., 2012 para el estudio de la generación de C99 por procesamiento de
BACE1 endógena. Las células fueron tratadas con 5 g/ml BFA en ausencia (-) o
presencia (+) de 1 M MG132 por 4 horas y los extractos celulares fueron analizados
por WB con anticuerpo anti-GFP y con el anticuerpo monoclonal clon WO2 que
reconoce en forma específica el fragmento C99 (Figura 6).
En aquellas células tratadas con BFA con el anticuerpo anti-GFP se detectó al
HA-APP-F/P-D/A-EGFP como una sola banda intensa, y no como un doblete, como se
puede apreciar en la condición control (Figura 6A, Panel superior, carriles 1 y 2),
indicando que el APP sufre un proceso de maduración post-RE (Prabhu Y. et al., 2012).
Adicionalmente, en las células tratadas con BFA en combinación con MG132 no se
alteraron los niveles del HA-APP-F/P-D/A-EGFP (Figura 6A, Panel superior, carril 3).
Con el anticuerpo WO2 se detectó que en células tratadas con BFA disminuyen los
niveles de C99 (Figura 6A, Panel inferior, carriles 1 y 2), mientras al co-incubar las
células con MG132 y BFA se restauraron los niveles de C99 hasta niveles cercanos a la
condición control (Figura 6A, Panel inferior, carriles 1 y 3).
La cuantificación de los niveles de C99 generados del HA-APP-F/P-D/A-EGFP
del experimento antes mostrado en células tratadas con BFA, en presencia o ausencia
49
Figura 6. C99 se genera en RE. (A) Células H4 expresando establemente HA-APPF/P-D/A-EGFP fueron incubadas con 5 g/ml BFA en ausencia (-) o presencia (+) de 1
M MG132 por 4 horas. Los extractos celulares fueron analizados por 10 % SDSPAGE, seguido de WB con anticuerpo anti-GFP para reconocer al APP (Panel superior)
y anticuerpo monoclonal anti--amiloide (clon WO2) que reconoce específicamente al
C99 (Panel inferior). (B) Cuantificación densitométrica de los niveles de C99. La barra
representa la media ± SD (n=4). *P < 0.05.
50
de MG132, muestra un incremento de aproximadamente 3.5 veces en los niveles de
C99 bajo inhibición proteasomal (Figura 6B).
Estas observaciones nos indican que HA-APP-F/P-D/A-EGFP no es sustrato del
proteasoma, y que el C99 puede ser producido en el RE y desde este compartimiento
celular ser eficientemente degradado por el proteasoma, lo que reduciría su
disponibilidad para procesarse por el complejo -secretasa.
4.5. Rol de los residuos de lisina en la degradación y tráfico del fragmento C99.
Es bien aceptado que la ubiquitinación en residuos de lisina es una señal en los
dominios citosólicos de las proteínas transmembrana, que es reconocida por todas las
rutas degradativas para modular el recambio de ciertas proteínas (Clague MJ. y Urbé S.
2010). Además recientemente se ha demostrado que el APP puede ser ubiquitinado in
vitro (Watanabe T. et al., 2012) e in vivo (El Ayadi A. et al., 2012). Se investigó si el C99
también podría ser sustrato de ubiquitinación, ya que el C99 dispone de los mismos
cinco residuos de lisina en su dominio citosólico (Figura 7A).
Para determinar si el dominio citosólico del fragmento C99 es sustrato de
ubiquitinación se realizó un ensayo para la detección de la ubiquitinación y se evaluó el
patrón de ubiquitinación obtenido por células H4 que expresan establemente la versión
de C99 con sustituciones de los cinco residuos de lisina de su dominio citosólico por
cinco residuos de arginina C99-5K-F/P-D/A-EGFP, y se comparó con la versión de la
proteína que potencialmente es sustrato de ubiquitinación en residuos de lisina C99F/P-D/A-EGFP (Figura 7A). Las células fueron transfectadas con ubiquitina-HA,
tratadas con MG132 y luego los lisados celulares se inmunoprecipitaron para su
posterior análisis por WB (Figura 7B).
51
Figura 7. C99 es ubiquitinado en residuos de lisina de su dominio citosólico. (A)
Representación esquemática del C99 fusionado a EGFP indicando las sustituciones
aminoacídicas en los cinco residuos de lisina del dominio citosólico (subrayado), y el
sitio de corte de -secretasa ( ). (B) Células H4 expresando establemente C99-F/P-D/AEGFP (WT) o C99-5K-F/P-D/A-EGFP (5K/R) fueron transfectadas transientemente con
cDNA codificante para ubiquitina-HA e incubadas en ausencia (-) o presencia (+) de
MG132. Los extractos celulares fueron denaturados e inmunoprecipitados (IP) con
anticuerpo anti-GFP y analizados por 10 % SDS-PAGE, seguido de Western Blot (WB)
con anti-HA-HRP para reconocer al C99-Ub (Panel superior) y anticuerpo anti-GFPHRP para reconocer al C99-F/P-D/A-EGFP y AICD-EGFP de los extractos totales
(Panel intermedio). Los niveles de -actina fueron usados como control de carga (Panel
inferior).
52
Con el uso del anticuerpo dirigido contra el epítope HA se pudo resolver
claramente un patrón de poliubiquitinación en las células que expresan C99-F/P-D/AEGFP, sólo en condiciones en que la degradación de proteínas fue inhibida por MG132
(Figura 7B, Panel superior, carriles 1 y 2), y fue suprimida totalmente en ausencia de
residuos de lisina en el dominio citosólico (Figura 7B, Panel superior, carriles 3 y 4). No
se observó acumulación de C99-5K-F/P-D/A-EGFP en respuesta a MG132 (Figura 7B,
Panel intermedio, carriles 3 y 4) y adicionalmente, cuando se analizó el corte proteolítico
por el complejo -secretasa, el tratamiento con MG132 incrementó los niveles de AICDEGFP incluso en la ausencia de ubiquitinación, apoyando la noción de que este corte
proteolítico es favorecido por inhibición proteasomal (Figura 7B, Panel intermedio,
carriles 2 y 4).
Estos resultados indican que los residuos de lisina del dominio citosólico del
fragmento C99 son efectivamente diana de poliubiquitinación, y que la poliubiquitinación
es necesaria para la degradación proteasomal.
Habiendo demostrado que C99 es ubiquitinado, para examinar el rol de los
residuos de lisina en la cinética de degradación de la proteína se realizó un ensayo de
caza, en presencia de CHX por un periodo de 30 minutos comparando las células que
expresan C99-F/P-D/A-EGFP con aquellas que expresan C99-5K-F/P-D/A-EGFP, y
transcurrido el tiempo de caza, los extractos celulares fueron analizados por WB
(Figura 8A).
Los niveles del C99-F/P-D/A-EGFP declinaron a partir de los 15 minutos (Figura
8A, Panel izquierdo), mientras que en la ausencia de los residuos citosólicos de lisina el
53
Figura 8. La degradación de C99 asociada al RE requiere de ubiquitinación en
residuos de lisina de su dominio citosólico. Ensayo de caza en células H4
expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP o C99-5K-F/P-D/A-EGFP en presencia
de 150 g/ml CHX por los tiempos indicados, en ausencia (A), o en presencia (B) de
BFA. Los extractos celulares fueron analizados por 10 % SDS-PAGE, seguido de WB
con anticuerpo anti-GFP. Los niveles de -actina fueron usados como control de carga.
54
C99 se mantiene más estable en los tiempos analizados (Figura 8A, Panel derecho).
Luego para estudiar el rol de la ubiquitinación del C99 en la degradación
asociada al RE, se repitió el ensayo de caza en presencia de BFA (Figura 8B), y bajo
estas condiciones en la ausencia de los residuos citosólicos de lisina se recapituló el
efecto de MG132 sobre los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP de la Figura 4D (Figura 8B,
Panel derecho).
Estos datos indican que la ubiquitinación en residuos citosólicos de lisina es una
modificación necesaria para la degradación del C99 asociada al RE.
Considerando que la inhibición proteasomal altera la ruta ERAD (Hebert DN. et
al., 2009), se trataron las células con concentraciones crecientes del inhibidor
proteasomal MG132 por 4 horas para estudiar su efecto sobre los niveles del C99-F/PD/A-EGFP, en comparación con la versión del C99 no ubiquitinable C99-5K-F/P-D/AEGFP (Figura 9).
En aquellas células que expresan el C99-F/P-D/A-EGFP, la proteína se acumula
de manera dosis dependiente (Figura 9, carriles 1-6), mientras que la versión C99-5KF/P-D/A-EGFP no responde con acumulación al incremento de las dosis del inhibidor,
sino que a altas concentraciones el C99 disminuye a medida que aumenta el AICDEGFP(Figura 9, carriles 7-12).
La resistencia a MG132 de la versión del C99 no ubiquitinable corrobora que la
ubiquitinación del fragmento C99 es un requisito fundamental para su degradación en
proteasoma por ERAD. Además estos resultados sugieren que la proteína al evadir esta
ruta degradativa es consecuentemente procesada por el complejo -secretasa.
55
Figura 9. C99 es resistente a degradación por ERAD en ausencia de
ubiquitinación. Células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP o C99-5KF/P-D/A-EGFP fueron tratadas con concentraciones crecientes de MG132 por 4 horas.
Los extractos celulares fueron analizados por 10 % SDS-PAGE, seguido de WB con
anticuerpo anti-GFP que reconoce al C99 y AICD. Los niveles de -actina fueron
usados como control de carga.
56
Con la premisa de que el fragmento C99-5K-F/P-D/A-EGFP al no contener
residuos de lisina en su dominio citosólico esquiva la ruta degradativa ERAD, se
procedió al análisis de su distribución subcelular post-RE. Células expresando
establemente C99-F/P-D/A-EGFP o C99-5K-F/P-D/A-EGFP fueron permeabilizadas
para detectar TGN46, una proteína integral de membrana del TGN, y se analizaron por
microscopía confocal de epifluorescencia (Figura 10).
El análisis por microscopía confocal de fluorescencia sugiere que el C99-F/PD/A-EGFP se localiza en el A. Golgi (Figura 10A-C), sin embargo los niveles
observados en este compartimento cualitativamente son menores que los observados
con C99-5K-F/P-D/A-EGFP, donde se observa una mayor superposición con este
marcador (Figura 10D-F). Estos resultados se correlacionan con los altos niveles de
C99-5K-F/P-D/A-EGFP en células no tratadas, mediante WB (Figuras 7B, carril 3 y 8A,
Panel derecho, carril 1).
Estas observaciones sumadas a los resultados anteriores permiten proponer que
la ubiquitinación del fragmento C99 en su dominio citosólico además parece ser señal
de tráfico desde el A. Golgi y que al suprimirla el C99 permanece en este
compartimiento donde puede ser procesado por el complejo -secretasa.
57
Figura 10. C99 se localiza en el A. Golgi en ausencia de ubiquitinación. Células H4
expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP (WT) o C99-5K-F/P-D/A-EGFP (5K/R)
fueron fijadas, permeabilizadas y marcadas con anti-TGN46 seguido de anti-IgG
conjugado con Alexa-Fluor 594 (canal rojo) y examinadas por microscopía confocal de
fluorescencia. Superponiendo las imágenes de los canales verde (C99) y rojo (TGN46)
se generó una tercera imagen en cada fila; el color amarillo indica superposición de los
canales verde y rojo. Barra, 10 m.
58
4.6. Evaluación de la función lisosomal en la degradación del fragmento C99 bajo
inhibición proteasomal.
Debido a que el proteasoma es parte de la maquinaria ERAD, se ha propuesto
que la inhibición proteasomal puede causar acumulación de proteínas de membrana en
el RE (Hebert DN. et al., 2009), por lo que el inhibidor MG132 y otros inhibidores
proteasomales serían agentes inductores de estrés de RE (Khan S. et al., 2012; Park
HS. et al., 2011).
Se procedió a investigar el destino del C99 evaluando si bajo estas condiciones
podría ser degradado alternativamente en lisosomas. Para ello se utilizó CQ, una
conocida droga lisosomotrópica que tiene la propiedad de alcalinizar el pH luminal
conduciendo a la inhibición de enzimas hidrolíticas de los lisosomas, droga que se
adicionó en combinación con el inhibidor proteasomal MG132.
El efecto de ambos inhibidores sobre la tasa de recambio del fragmento C99 se
estudió en células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP, las cuales se
trataron con 100 M CQ y/o 1 M MG132 por 16 horas. Previo a la lisis, las proteínas
de superficie celular fueron biotiniladas a 4°C, luego las proteínas de superficie celular
junto a los extractos totales fueron analizadas por WB (Figura 11).
Aquellas células que sólo fueron incubadas con CQ no revelaron alteraciones en
los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP y AICD-EGFP, (Figura 11A, Panel superior, carriles
1 y 2)reproduciéndose los resultados de la Figura 3AEn contraste CQ causó un fuerte
incremento en los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP cuando la degradación
59
Figura 11. La degradación lisosomal del fragmento C99 es potenciada bajo
inhibición proteasomal. (A) Células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP
fueron incubadas con 100 M CQ y/o 1M MG132 por 16 horas. Las proteínas de
superficie celular fueron biotiniladas a 4°C y los extractos celulares fueron recuperados
por afinidad a beads de agarosa adsorbidas de avidina. Las proteínas totales y
biotiniladas fueron analizadas por 10 % SDS-PAGE, seguido de WB con anticuerpo
anti-GFP que reconoce al C99 y AICD. Los niveles de -actina fueron usados como
control de carga y los niveles de TfR fueron usados como control de proteínas de
superficie celular. (B) Análisis por microscopía confocal de fluorescencia de células H4
expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP tratadas por 16 horas con 1 M MG132 o
con una combinación de 100 M CQ y 1M MG132. Barra, 10 m.
60
proteasomal fue inhibida con MG132 (Figura 11A, Panel superior, carriles 3 y 4) . Esto
indica que la degradación del C99 en lisosomas, puede estar acoplada al estado de la
ruta ERAD. Adicionalmente, el tratamiento con CQ en combinación con MG132 resultó
en un significativo aumento de los niveles de C99-F/P-D/A-EGFP en la superficie
celular, demostrado mediante ensayo de biotinilación (Figura 11A, Panel inferior, carril
4) y por análisis de microscopía confocal de fluorescencia (Figura 11B). Este efecto
parece ser específico de C99, porque bajo las mismas condiciones, no se detectaron
cambios en los niveles del receptor de transferrina (TfR) en la superficie celular, una
proteína que recicla constitutivamente (Figura 11A, Panel inferior, carriles 1-4).
El efecto sinérgico de estas drogas en la acumulación del fragmento C99
evidencia primeramente que el proteasoma es el encargado de la degradación de C99
en etapas tempranas de la ruta secretoria, y en condiciones en que este mecanismo
degradativo se encuentra inhibido por la adición de MG132, se potenciaría una ruta
alternativa de degradación a nivel endo/lisosomal, la cual sería altamente sensible al
tratamiento por CQ; evidenciando una posible comunicación entre estas maquinarias
degradativas.
El transporte de proteínas transmembrana hacia lisosomas para su posterior
degradación, es a menudo dependiente de ubiquitinación en sus dominios citosólicos,
se fue a investigar el rol de la ubiquitinación del dominio citosólico del fragmento C99 en
el transporte de la proteína hacia la ruta endo/lisosomal, durante la inhibición
proteasomal por MG132. Para este fin células H4 expresando establemente C99-5KF/P-D/A-EGFP fueron tratadas con CQ durante la inhibición proteasomal por MG132.
61
Previo a la lisis celular, las proteínas de superficie celular fueron biotiniladas a 4°C,
luego las proteínas de superficie celular junto a los extractos totales fueron analizados
por WB y comparados con células H4 que expresan establemente C99-F/P-D/A-EGFP
(Figura 12A).
Aquellas células que expresan C99-F/P-D/A-EGFP cuando fueron incubadas con
CQ, al igual que en la Figura 11 no revelaron alteraciones en los niveles de C99-F/PD/A-EGFP (Figura 12A, Panel izquierdo, carriles 1 y 2), mientras las células que
expresan la versión del C99 no ubiquitinable C99-5K-F/P-D/A-EGFP cuando fueron
incubadas con esta droga, se detectó un leve incremento en los niveles de la proteína
(Figura 12A, Panel superior, carriles 5 y 6). Con el tratamiento con MG132 en las
células que expresan el C99-5K-F/P-D/A-EGFP se detectó el mismo efecto de la Figura
7, observándose incrementados los niveles de AICD-EGFP con respecto a los niveles
del C99-5K-F/P-D/A-EGFP (Figura 12A, Panel superior, carril 7) sin una acumulación
en los niveles de C99, como ocurre al utilizar la versión del C99 que se ubiquitina C99F/P-D/A-EGFP (Figura 12A, Panel superior, carril 3). Cuando las células que expresan
C99-5K-F/P-D/A-EGFP se co-incubaron con MG132 y CQ resultó en un incremento de
los niveles de C99 en la superficie celular (Figura 12A, Panel superior, carril 8),
obteniéndose un efecto sinérgico de las drogas comparable al visto en las células que
expresan la versión del C99 que se ubiquitina (Figura 12A, Panel superior, carril 4).
Bajo estas mismas condiciones por ensayo de biotinilación (Figura 12A, Panel inferior)
y análisis de microscopía confocal de fluorescencia (Figura 12B) se observó una
reducción en los niveles del C99-5K-F/P-D/A-EGFP en la superficie celular (Figura 12A,
Panel inferior, carril 4) en comparación con la versión de la proteína que se ubiquitina
62
Figura 12. La degradación del fragmento C99 en lisosomas es ubiquitinaindependiente. (A) Células H4 expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP o C995K-F/P-D/A-EGFP fueron incubadas con CQ y/o MG132 por 16 horas. Las proteínas de
superficie celular fueron biotiniladas a 4°C y los extractos celulares fueron recuperados
por afinidad a beads de agarosa adsorbidas de avidina. Las proteínas totales y
biotiniladas fueron analizadas por 10 % SDS-PAGE, seguido de WB con anticuerpo
anti-GFP que reconoce al C99 y AICD. Los niveles de -actina fueron usados como
control de carga y los niveles de TfR fueron usados como control de proteínas de
superficie celular. (B) Análisis por microscopía confocal de fluorescencia de células H4
expresando establemente C99-F/P-D/A-EGFP o C99-5K-F/P-D/A-EGFP tratadas con
una combinación de 1 M MG132 y 100 M CQ por 16 horas. Barra, 10 m.
63
(Figura 12A, Panel inferior, carril 8), lo que se complementa con los resultados por
microscopía de la Figura 11.
Estos datos muestran que en condiciones en que la ruta ERAD se encuentra
inhibida, la proteína C99 puede dirigirse hacia los lisosomas para su degradación, de
manera independiente de su ubiquitinación, pero bajo estas mismas condiciones la
ubiquitinación podría tener un rol en el tráfico hacia la superficie celular.
4.7. Contribución de la maquinaria ESCRT en la incorporación del fragmento C99
en MVBs.
La maquinaria ESCRT es un reconocido multicomplejo de proteínas que se
ensambla de modo secuencial y participa en la biogénesis de los MVBs promoviendo la
invaginación y abscisión de membranas endosomales, para obtener finalmente las
proteínas cargo dentro de MVBs, los que finalmente se fusionarán con los lisosomas,
para su posterior degradación en estos compartimentos (Raiborg C. y Stenmark H.,
2009).
Finalmente, se investigó la participación de la maquinaria ESCRT-I en la
incorporación del fragmento C99 en MVBs, para ser degradado por la ruta
endo/lisosomal en condiciones en que la ruta ERAD se encuentra inhibida, y si el C99
requiere ser ubiquitinado para ser reconocido por esta maquinaria.
Para investigar esto, células que expresan establemente C99-5K-F/P-D/A-EGFP
fueron tratadas con MG132 para inhibir la ruta ERAD y potenciar su tráfico hacia la ruta
endo/lisosomal, y se compararon células que expresan TSG101 (ESCRT-I) con células
64
que tienen una reducida expresión de esta proteína por técnica de RNAi y se evaluó el
impacto de la supresión de TSG101 en los niveles de C99 (Figura 13).
En aquellas células depletadas de TSG101 (KD TSG101) comparadas con
células que expresan la proteína (Mock) no tratadas con MG132 se detectaron niveles
similares de C99-5K-F/P-D/A-EGFP y AICD-EGFP (Figura 13, Panel superior, carriles
1 y 3). Cuando se las células Mock y KD TSG101 con MG132 sufrieron un aumento
similar en los niveles del C99-5K-F/P-D/A-EGFP (Figura 13, Panel superior, carriles 2 y
4), pero con un potente aumento de AICD-EGFPen las células KD TSG101 (Figura
13, Panel superior, carriles 2 y 4). Adicionalmente, por ensayo de biotinilación se
detectó una disminución de C99 en la superficie celular en las células KD TSG101 en
comparación con las células Mock (Figura 13, Panel inferior, carriles 2 y 4). Los efectos
al depletar TSG101, reproducen el efecto de CQ en condiciones de estrés de RE de la
Figura 12.
Estas observaciones indican que se requiere de la maquinaria ESCRT para
cargar el C99 en los MVBs para su posterior degradación en los lisosomas, bajo
condiciones de estrés de RE, y que esta maquinaria no requiere que el C99 se
encuentre ubiquitinado para su reconocimiento. Además, al impedir esta ruta, entonces
sería incrementado su procesamiento por el complejo -secretasa.
65
Figura 13. TSG101 participa en la incorporación del fragmento C99 a MVBs
independiente de ubiquitinación. Células H4 expresando establemente C99-5K-F/PD/A-EGFP fueron transfectadas con siRNA dirigido contra TSG101 por 16 horas e
incubadas con 1 M MG132 por otras 16 horas previo a su análisis. Las proteínas de
superficie celular fueron biotiniladas a 4°C y los extractos celulares fueron recuperados
por afinidad a beads de agarosa adsorbidas de avidina. Las proteínas totales y
biotiniladas fueron analizadas por 10% SDS-PAGE, seguido de WB con anticuerpo antiGFP que reconoce al C99 y AICDy anticuerpo anti-TSG101 que controla la eficiencia
del Knock Down. Los niveles de TfR fueron usados como control de proteínas de
superficie celular.
66
5. DISCUSIÓN
En este estudio se demostró que en células H4, el fragmento C99 es degradado
por al menos dos rutas distintas. La ruta más eficiente para la degradación del
fragmento C99 es una ruta proteasoma-dependiente, que funciona de manera
independiente al procesamiento proteolítico por el complejo -secretasa. Estudios
previos en neuronas, han reportado que el proteasoma estaría involucrado en la
degradación del APP (Skovrosky DM. et al., 2000; Kumar P. et al., 2007), pero el
presente estudio ha aportado evidencia directa que el proteasoma también estaría
participando en la regulación de los niveles del fragmento C99, un intermediario clave
en la generación del péptido A. Aunque no se puede excluir la posibilidad de que la
degradación de esta proteína por el proteasoma podría ser un artefacto resultante de la
sobreexpresión del fragmento C99, estos hallazgos están en fuerte acuerdo con un
estudio previo en neuronas corticales de ratón que se centró en el rol del proteasoma
en la tasa de recambio del fragmento C99 y estudios que sugieren que la pérdida de la
actividad del proteasoma pueden elevar los niveles del péptido A en cerebros con la
patología de Alzheimer (Nunan J. et al., 2001; Nunan J. et al., 2003).
En este trabajo quedó demostrado que el proteasoma influye directamente en la
disponibilidad del fragmento C99 para la producción del péptido ASin embargo, aún
quedan detalles por dilucidar de este mecanismo proteasoma-dependiente, ya que se
trata de una proteína de transmembrana. Considerando que el proteasoma se
encuentra distribuido en citosol y en la superficie citosólica del RE, es posible que una
vez que BACE1procesa al APP en el lumen del RE se puede desencadenar la escisión
67
por el proteasoma en el lado citosólico de la membrana de este compartimiento. Podría
tratarse de un mecanismo tipo ERAD, que monitorea el plegamiento y ensamble de las
proteínas recién sintetizadas en el RE, donde proteínas plegadas de manera incorrecta
son retenidas en RE por chaperonas residentes del RE, para luego ser retrotraslocadas
al citosol, ubiquitinadas y degradadas por el proteasoma (Shimizu Y. et al., 2010). Esta
idea está respaldada en este estudio tanto por la disminución de la producción de C99,
en condiciones en que el APP se encuentra retenido en el RE por tratamientos con
BFA, como por la acelerada tasa de recambio de C99 bajo estas mismas condiciones.
Esto se interpretó como consecuencia de una efectiva degradación proteasomal del
C99, luego de la redistribución de proteínas hacia el RE, evento que estaría implicando
a la ruta ERAD.
HRD1 es una proteína integral de membrana que es esencial para la
ubiquitinación de los sustratos de ERAD en residuos de lisina y cisteína (Shimizu Y. et
al., 2010). Estudios de Knock Down de HRD1 han mostrado que causa acumulación de
APP y un incremento en los niveles del péptido A (Kaneko M. et al., 2010). En este
estudio se demostró por primera vez que el fragmento C99 es poliubiquitinado en
residuos de lisina de su dominio citosólico, y que es un requisito para su degradación
por el proteasoma. Esta evidencia da luces de que el fragmento C99 podría ser un
potencial sustrato de HRD1, tal como es el APP, que resultó ser sustrato de HRD1,
mediando su degradación proteasomal (Kaneko M. et al., 2010).
La secuencia aminoacídica del fragmento C99 contiene cinco residuos de lisina
en el dominio citosólico (K-649, K-650, K-651, K-676 y K-688), que son los mismos que
68
están contenidos en la secuencia aminoacídica del APP, y hasta el momento en la
literatura sólo se ha reportado que el residuo de lisina K-688 del APP es sustrato de
poliubiquitinación no degradativa, constituyendo una señal que suprime la maduración
del APP y su degradación proteasomal (El Ayadi A. et al., 2012). El presente estudio se
mutagenizaron los cinco residuos del dominio citosólico del fragmento C99, y aún
queda caracterizar los residuos específicos involucrados en su poliubiquitinación.
En el transcurso de este trabajo se reveló la existencia de una segunda ruta
degradativa que dirige el fragmento C99 hacia lisosomas, íntimamente asociada a
condiciones de estrés de RE, independiente de ubiquitinación y del corte proteolítico por
el complejo -secretasa. Consideramos que esta ruta estaría constituyendo un
mecanismo compensatorio en respuesta a una acumulación de proteínas en RE, y para
asegurar el decaimiento del C99 tan pronto como es generado.
Las respuestas a estrés de RE se concentran en inhibir la síntesis de proteínas,
expresión de chaperonas moleculares e incrementar la actividad de las rutas
degradativas, donde la primera ruta en activarse es ERAD. También el estrés de RE
induce
autofagia,
asumiendo
un
rol protectivo, induciendo la
formación
de
autofagosomas. Recientemente se ha reportado que la chaperona BI-1, una proteína
conservada que protege a las células del estrés de RE, también es capaz de inducir
aumento de la actividad de la V-ATPasa lisosomal constituyendo un nuevo mecanismo
de respuesta a estrés de RE (Lee GH. et al., 2011). En el presente estudio quedó
demostrado que en la medida en que se induce estrés de RE con MG132, en segunda
69
instancia la ruta endo/lisosomal pasa a regular los niveles de C99, lo cual también
sugiere que estas dos rutas degradativas están comunicadas.
Este estudio además contribuye con evidencia original de la participación de la
maquinaria ESCRT en la incorporación del fragmento C99 en MVBs para ser
subsecuentemente degradado en lisosomas. Hasta el momento sólo se había reportado
en células HEK293 que expresaban establemente APP 695, que la depleción de ESCRT0 y -I, retiene al APP en compartimentos endosomales, retardándose su transporte
hacia MVBs y lisosomas (Choy R. et al., 2012).
Otro aporte de este trabajo en el contexto de la ruta endo/lisosomal es que de
forma extraordinaria, el fragmento C99 no requiere ser previamente ubiquitinado en su
dominio citosólico para ser reconocido como cargo para su incorporación a MVBs por
TSG101 (ESCRT-I) de la maquinaria ESCRT. Se ha descrito que la ubiquitinación vía
K-63 es necesaria y suficiente para la destinación a MVBs y degradación lisosomal de
proteínas cargo (Dammer EB. et al., 2011; Piper RC. y Lehner P., 2011), pero esto no
sería un requerimiento estricto para que la maquinaria ESCRT medie el recambio de
proteínas integrales de membrana (MacGurn J. et al., 2012). Un ejemplo es HRS,
componente del complejo ESCRT-0, capaz de interaccionar con el receptor de
interleucina-2 (IL-2R) a través de la región C-terminal de HRS, y envía a IL-2R a una
eficiente degradación lisosomal, sin ser necesaria la unión al cargo por el dominio de
unión a ubiquitina por el cual convencionalmente se une a las proteínas cargo cuando
se ensambla la maquinaria ESCRT (Yamashita Y. et al., 2008; Amano Y. et al., 2010).
70
En nuestro modelo de estudio observamos que cuando se suprime un
componente de la maquinaria ESCRT-I, se promueve el corte proteolítico del fragmento
C99 por el complejo-secretasa. Es posible que debido a que esta maquinaria actúa en
diferentes etapas de la formación de un MVB, la depleción de sus subunidades puede
diferencialmente afectar el tráfico y la distribución de la proteína cargo.
Las modificaciones post-traduccionales afectan la respuesta de las proteínas en
distintos procesos intracelulares, incluyendo ERAD (Shimizu Y. et al., 2010), endocitosis
desde la superficie celular (Polo S., 2010), y entrada a MVBs (Dammer EB. et al., 2011;
Piper RC. y Lehner P., 2011). Por lo tanto el estado de ubiquitinación de una proteína
transmembrana puede generar impacto en su distribución, degradación y actividad
resultante.
En el presente trabajo se describe por primera vez el rol de la ubiquitinación del
dominio citosólico del fragmento C99 como modulador de su degradación y tráfico. Se
demostró que el fragmento C99 debe ser previamente ubiquitinado para ser degradado
por el proteasoma, y que el tráfico desde el A. Golgi hacia la superficie celular está
favorecido por ubiquitinación. De no ser ubiquitinado, el tráfico es retardado y se
favorece el corte proteolítico por el complejo -secretasa probablemente en el A. Golgi,
lo cual está respaldado por el enriquecimiento en TGN de las proteínas PS1, Nicastrina,
Aph1 y Pen-2 que conforman el complejo-secretasa, que procesa proteolíticamente
los fragmentos C99, C89 y C83 para generar el AICDy péptido ABaulac S. et al.,
2003).
71
6. CONCLUSIONES
1. El fragmento C99 puede ser generado en RE por el procesamiento proteolítico del
APP por BACE1.
2. Desde el RE el fragmento C99 es enviado a degradación por ERAD, proceso
dependiente de la poliubiquitinación en los residuos de lisina de su dominio
citosólico.
3. Cuando las células están sometidas a condiciones que afectan la función ERAD
como inhibición proteasomal, se potencia la degradación del fragmento C99 en
lisosomas.
4. El inhibidor proteasomal MG132 conduce el fragmento C99 por una ruta que
involucra el tráfico de la proteína desde el A. Golgi hacia la superficie celular y
luego a compartimientos endocíticos y lisosoma.
a. La poliubiquitinación en residuos de lisina del dominio citosólico
contribuye al tráfico del C99 desde el A. Golgi hacia la superficie celular.
b. El fragmento C99 es cargado en MVBs dependiente de la participación
de la maquinaria ESCRT-I, pero independiente de su ubiquitinación.
5. El corte proteolítico del fragmento C99 por el complejo -secretasa en el TGN es
favorecido por:
a. La depleción de la maquinaria ESCRT-I.
b. La ausencia de los residuos de lisina de su dominio citosólico.
Constituyéndose la maquinaria ESCRT y la ubiquitinación como dos moduladores
de la disponibilidad de la proteína para su procesamiento por el complejo secretasa.
72
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