¿COMO PODEMOS USAR LOS RAYOS X PARA VER LOS ÁTOMOS DENTRO DE UN CRISTAL? Andrés Vega Departamento de Química Facultad de Ciencias Universidad de Tarapacá email: avegac@uta.cl Resumen Los cristales representan una forma del estado sólido caracterizada por el ordenamiento periódico de los átomos o moléculas en su estructura, lo que les confiere propiedades muy interesantes, ya sea en su aspecto (como su asombrosa regularidad y armonía geométrica) como en sus propiedades físicas. Una de las propiedades más notables de un cristal es su capacidad para difractar los rayos X. Esta propiedad ha permitido desentrañar los aspectos estructurales más íntimos de la geometría molecular, la forma de las moléculas dentro del cristal. El acabado conocimiento de los factores que determinan la conformación de las moléculas dentro de un cristal ha permitido establecer sólidamente cual es la estrecha relación que existe entre la estructura molecular y las propiedades de la materia. En el presente artículo se discute cuales son las metódicas empleadas para conocer la estructura molecular de un cristal a partir de su patrón de difracción de rayos x. Además se analiza las principales dificultades tanto prácticas como analíticas que se encuentra normalmente durante este proceso. Finalmente se muestra un ejemplo en los que la información obtenida a partir de la difracción de rayos-X puede encontrar aplicaciones en la solución de problemas del mundo que nos rodea a diario. 25 Los cristales y los rayos-X Un cristal es una forma del estado sólido de la materia que por su belleza llamó poderosamente la atención del hombre desde tiempos inmemoriales. La forma de un cristal normalmente incluye poliedros, de caras regulares y lustrosas que forman ángulos bien definidos. En otras palabras, una sinfonía de geometría, perfección y armonía (ver Figura 1). Esta marcada atracción pronto derivó en materia de estudio: la cristalografía, rama del conocimiento que se dedicó en forma sistemática a estudiar las relaciones entre los distintos parámetros geométricos propios de cada cristal: números de caras, ángulos definidos por estas, etc. A pesar del gran éxito de la cristalografía en cuanto a la sistematización del conocimiento sobre los cristales, pronto resultó obvio que no podía responder a la más importante de todas las preguntas, ¿Qué es lo que hace a un determinado sólido tomar la forma de cristal? ¿Qué es lo que existe a escala atómica tras esta enigmática belleza? Figura 1. Cristales de Cuarzo (SiO2). La respuesta a esta pregunta claramente no estaba al alcance de los cristalógrafos que la formularon, más aún, la respuesta solo vino a encontrarse hacia fines del siglo XIX, que justamente corresponde a una de las etapas más brillantes en el desarrollo de la Física. Hacia fines del siglo XIX y mientras realizada experiencias con “tubos de descarga” (ver Nota (a)), Wilhelm C. Roentgen descubrió un tipo de radiación desconocido, de alto poder penetrante y capaz de ennegrecer una placa fotográfica, a la que bautizó con la “X”, símbolo reservado por los matemáticos para identificar a la incógnita. Una de las propiedades más desconcertantes de los “rayos X” resultó ser la capacidad de un cristal para difractarlos, es decir desviarlos en direcciones bien definidas del espacio (Figura 2). 26 Figura 2. Difracción de los rayos X por un cristal Esta interesante propiedad contribuyó a aclarar la naturaleza tanto de los “rayos X” como la de los sólidos cristalinos: a comienzos del siglo XX, Max Von Laue sugirió que la difracción de los rayos X por los cristales era consecuencia que los átomos del cristal (ver Nota (b)) están organizados de forma ordenada y repetitiva en el espacio, de forma que pueden actuar como una suerte de “rendijas de difracción” para los rayos X, que en esta interpretación no son otra cosa que una forma de la ya conocida radiación electromagnética, cuya longitud de onda es semejante a las distancias entre los átomos en el cristal. De este forma, el patrón de difracción (el conjunto de haces de rayos X producidos) debe ser entendido como el producto de la interacción de la radiación con la materia y de la naturaleza ordenada de un cristal. Aunque esta explicación para el fenómeno de la difracción permite entenderlo de forma satisfactoria, sugiere nuevas y más interesantes preguntas: ¿serán iguales los patrones de difracción de dos cristales distintos?. De no ser así, ¿será posible obtener información del ordenamiento de los átomos en el espacio dentro del cristal a partir del patrón de difracción de éste? La respuesta a la primera cuestión es afortunadamente no, distintas sustancias cristalinas producen distintos patrones de difracción. La segunda interrogante equivale a preguntarse si la sombra de un cuerpo al ser expuesto a la luz nos puede dar alguna información sobre éste. La respuesta es claramente sí, aunque bajo algunas condiciones. El procedimiento por el cual podemos obtener información de la geometría de un compuesto a nivel atómico mediante el análisis cuidadoso de su patrón de difracción posee algunas complejidades matemáticas, las cuales no se pretende abarcar en esta Charla. En las secciones siguientes introduciremos algunos conceptos útiles para describir un sólido cristalino y discutiremos algunos aspectos, tanto teóricos como experimentales del proceso de difracción, su aplicabilidad, sus limitaciones y la interpretación de la información obtenida. 27 La celda unitaria. Según se ha comentado anteriormente, un cristal no es otra cosa que un ordenamiento atómico repetitivo y periódico en las tres dimensiones del espacio. De esta forma para describir completamente un cristal no es necesario describir los miles de millones de átomos que hay en su interior, si no solo una pequeña fracción de éstos, la cual se conoce como celda unitaria (ver Nota (c)). El cristal completo puede ser descrito como una red formada por la repetición de esta celda unitaria en cada una de las tres dimensiones del espacio. Una comparación apropiada para comprender este concepto puede ser un piso con baldosas: el piso en su totalidad no es más que la repetición de la palmeta básica. Los elementos que definen a la celda unitaria son seis, tres longitudes de celda, a, b, c y tres ángulos α , β y γ definidos por los ejes de la celda, tal como se ve en la Figura 3. Figura 3. Celda unitaria Los distintos valores posibles para los parámetros de celda definen un total de 7 tipos distintos de sistemas cristalinos, según se detalla en el siguiente listado: - Triclínico: a ≠ b ≠ c , α≠ β ≠ γ - Monoclínico: a ≠ b ≠ c , α = γ = 90°; β ≠ 90° - Ortorrómbico: a ≠ b ≠ c , α = β = γ = 90° - Tetragonal: a = b ≠ c , α = β = γ = 90° - Cúbico: a = b = c , α = β = γ = 90° - Trigonal a = b = c , α = β = γ ≠ 90° (γ >120°) - Hexagonal: a = b ≠ c , α = β = 90°, γ =120° 28 La adición de elementos de simetría a la celda conduce a un total de 234 grupos espaciales de simetría, que corresponden a todas las formas posibles en que un compuesto químico puede cristalizar. La Ley de Bragg. La ley de Bragg representa la condición matemática para la ocurrencia de la difracción. Para que ésta se produzca, la diferencia de distancia recorrida por dos rayos X que inciden en el ángulo de Bragg (θ) y que son difractados por planos sucesivos (ver Nota (d)) separados por la distancia d debe ser un múltiplo entero (n) de la longitud de onda λ de la radiación-X, pues de otra forma se producirá interferencia destructiva y cancelación (Figura 4): 2d sen θ = n λ (Ley de Bragg) Figura 4. Representación esquemática de la ley de Bragg La ley de Bragg representa la condición en la cual se produce difracción por un cristal, pero por sí misma no entrega información detallada acerca de cómo están ordenados los átomos en la intimidad del cristal. La obtención de esta información requiere de algunas consideraciones adicionales, específicamente la introducción del “factor de estructura” (F). El Factor de Estructura y el Problema de la Fase. En términos físicos, la difracción de los rayos X es un fenómeno producido por los electrones de un átomo. El aporte que puede realizar un átomo dentro de un cristal en términos de producir un haz de rayos difractados depende de su naturaleza (en principio de cuantos electrones tiene) y de su ubicación dentro de este. En términos matemáticos esto se resume a través de lo que se conoce como “factor de estructura” (F), cuya forma es: 29 en donde fi y xi, yi, zi representan, respectivamente, el factor de dispersión (naturaleza) y las coordenadas del átomo i (ubicación) dentro de la celda unitaria. Normalmente la forma del factor de estructura puede ser más compacta debido a la existencia de relaciones de simetría entre los átomos en una celda unitaria. El factor de estructura es un número complejo, es decir, posee un módulo y una fase. Desde el punto de vista experimental, no es posible medir directamente el factor de estructura F completo, sólo es posible relacionar el cuadrado de su modulo, |F|2, con la intensidad difractada por cada familia de planos hkl dentro del cristal. La imposibilidad experimental de determinar el factor de estructura completo se conoce como “problema de la fase”, y es la principal dificultad a resolver por quien quiera determinar qué es lo que existe dentro de una celda unitaria y dónde esto está ubicado. Las estrategias para la solución del problema de la fase son básicamente dos: • El método de Patterson o del átomo pesado: Emplea como aproximación el hecho que el factor de estructura puede aproximarse por la componente del átomo más pesado (con mayor número de electrones). • Los métodos directos: utilizan relaciones de desigualdad entre las intensidades difractadas por varios planos para establecer un conjunto aproximado de fases. La densidad electrónica Cualquiera sea el caso, la resolución del problema de las fases permite construir un mapa de densidad electrónica dentro de la celda unitaria (por ende dentro del cristal) mediante la expresión de la densidad electrónica: donde V es el volumen de la celda unitaria y α hkl es la fase del plano hkl. La función de densidad electrónica posee máximos en las coordenadas x,y,z (ver Figura 5) que corresponden a los átomos de una molécula, de forma que encontrando matemáticamente estos máximos puede deducirse las posiciones de cada átomo dentro del cristal. 30 Figura 5. Mapa de Densidad electrónica en un compuesto de cobre. Ver los átomos La información que se puede extraer a partir de las coordenadas para cada átomo dentro del cristal es múltiple: las distancias de existentes entre los átomos, los ángulos que éstos definen, los ángulos definidos por agrupaciones específicas de átomos, etc. Esto equivale a “ver” o “tomar una fotografía” de una molécula. La información extraíble a partir de los resultados del experimento de difracción en un cristal es la forma más completa de indagar la geometría de una molécula particular. La utilización de esta información como contraparte de la “teoría cuántica del enlace” ha permitido sentar las bases del conocimiento que hoy existe en torno a cuáles son las bases fundamentales que determinan la geometría de una molécula. ¿Cuál es la importancia de conocer en detalle la geometría de una molécula dentro de un cristal?. Básicamente, las propiedades físicas y químicas de todo tipo de un compuesto dependen de cuál es su estructura. De esta forma, un acabado conocimiento de esta relación entre estructura y propiedades permite, en último caso, el diseño de moléculas con propiedades “a la medida”. Esta aproximación ha sido empleada con mucho éxito a nivel farmacéutico, en donde la información estructural de ciertas proteínas permite, por ejemplo, diseñar inhibidores específicos para sus sitios activos, que pueden tener valor medicinal, tal como se discute más adelante. 31 Preparación de cristales La completa información estructural que entrega la experiencia de rayos X sobre una molécula se encuentra normalmente con un obstáculo no menor: preparar “cristales apropiados” de una sustancia para el experimento de difracción es en parte importante de los casos muy difícil. Por cristales apropiados se entiende cristales del orden de las décimas de milímetro y que sean “únicos”, es decir, que correspondan a una sola operación de traslación de la celda unitaria. Es frecuente encontrar que, antes que cristales, muchas sustancias tienden a convertirse en polvo en el estado sólido. Las más modernas técnicas de cristalización de proteínas se realizan en el espacio a bordo de los transbordadores espaciales, en donde la ausencia de gravedad facilita el proceso (Figura 6 y ver Nota (d)). Figura 6. Cristales de una Proteína obtenidos en el espacio Twins o Maclas Aún cuando se obtengan cristales adecuados, en muchas ocasiones, esto no garantiza el éxito del experimento de difracción, pues tampoco es infrecuente encontrar casos en que los cristales se descomponen en tiempos más cortos que el necesario para realizar un experimento de difracción (que en general está en el rango de las horas). Otro problema frecuentemente hallado es lo que se conoce como “maclado”, en inglés twin (gemelo). Esta situación consiste en la obtención de cristales que no son del tipo único, sino que más bien corresponden a dos cristales unidos que aparentan ser uno. La figura 7a muestra la fotografía de un cristal aparentemente normal, pero cuyo patrón de difracción muestra reflexiones provenientes de dos cristales distintos (colores distintos, Figura 7b) 32 a b Figura 7. a) Un cristal de compuesto de cobre y fosfato. b) El diagrama de difracción de este compuesto muestra reflexiones pertenecientes a dos cristales, marcadas intencionadamente en blanco y rosado. Ya que toda la sistemática expuesta para obtener las coordenadas atómicas a partir del patrón de difracción de un cristal se basa en que éste sea monocristalino, el fenómeno de maclado, en general, impide la extracción de la información estructural. Sin embargo, la situación puede ser salvada cuando los dos o más componentes en un cristal único pueden separarse completamente e identificarse las reflexiones que pertenecen a cada cristal. La relación matemática que une a los dos componentes de un twin se conoce como ley de twin. Otros casos problemáticos Adicionalmente a lo expuesto en los párrafos anteriores, existen algunas otras situaciones que dificultan la extracción de la información estructural desde un sólido cristalino. Las dos más importantes son • Compuestos que son sensibles a los rayos X, o que se descomponen rápidamente por algún motivo. • Muestras con una celda unitaria de gran tamaño (mayor de 25 Å, 1 Å = 10-10 m) y con un bajo nivel de simetría. La solución de ambos problemas en general pasa por el uso de radiación de sincrotrón (ver Nota (e)) y de detectores de área (ver Nota (f)). En el Mundo Real Un interesante ejemplo acerca del uso de la información obtenida del proceso de difracción de rayos-X por cristales de proteína en la búsqueda de medicamentos se da para 33 un mal que es muy común y que constituye un problema de salud pública en muchas regiones de América latina. Se trata del temido Mal de Chagas, causante de numerosas incomodidades e incluso la muerte en quienes están infectados. El mal es causado por un pequeño parásito: el trypanosoma, que es transmitido a través de la mordida de la vinchuca. El tratamiento farmacéutico existente en las primeras etapas de la enfermedad posee desagradables efectos secundarios que le hacen la mayoría de las veces intolerables. En las etapas más avanzadas del mal simplemente no se conoce terapia efectiva. Desde 1995 un conjunto de grupos científicos latinoamericanos ha estado trabajando en este problema con el siguiente enfoque: un conocimiento adecuado de la estructura de ciertas enzimas (proteínas) vitales para el parasito, permitiría desarrollar inhibidores adecuados que pudiesen frenar su proliferación dentro del cuerpo. Las principales dificultades experimentales de este enfoque están en la dificultad que existe para obtener cantidades significativas y puras de la enzima y una vez que esto se ha logrado, en obtener cristales adecuados para la experiencia de difracción. Este obstáculo ha sido superado mediante la cristalización en el espacio, posible por la cooperación de la Nasa y su programa de transbordadores. La ausencia de gravedad en el espacio permite obtener cristales prácticamente libres de defectos, de los cuales se puede extraer la información estructural de la enzima y luego diseñar los fármacos adecuados en base a la información obtenida. Observaciones finales La difracción de rayos X por un sólido cristalino resulta ser una poderosa herramienta que permite conocer en detalle la estructura de la materia a nivel molecular. Este conocimiento puede ser empleado con diversos objetivos, que van desde la tecnología computacional al diseño de nuevos fármacos. Notas (a) Un tubo de descarga es básicamente un tubo de vidrio sellado dentro del cual se ha hecho alto vacío. Dentro del tubo se ubican dos electrodos metálicos entre los cuales al aplicar una gran diferencia de potencial se genera una corriente de electrones (descarga). (b) La hipótesis de que la materia está compuesta por átomos se remonta al tiempo de los griegos (siglo V A.C.), algunos de cuyos pensadores decidieron que la materia no podía ser subdividida en partes más pequeñas en forma indefinida, sino que debía haber un límite al que llamaron “átomo” (indivisible). Más aún y, solo sobre la base del pensamiento, llegaron a afirmar que distintos tipos de materia estaban compuestos por distintos tipos de átomos, estableciendo por primera vez la idea de que las propiedades macroscópicas de la 34 materia no son sino el resultado de su composición microscópica, concepto que cruza transversalmente la ciencia moderna. (c) La celda unitaria constituye la más simple unidad repetitiva dentro de un cristal. (d) Normalmente se utiliza el concepto de planos cristalinos. Estos se identifican con las letras hkl o Índices de Miller. Se les utiliza para identificar familias de planos dentro del cristal de la forma siguiente: un plano de índices hkl corresponde a aquel que intercepta con la unitaria en 1/h, 1/k y 1/l. (e) El sincrotrón es un acelerador de partículas del cual se puede obtener (entre otras cosas) una fuente de radiación-X muy potente, de longitud de onda “sintonizable” y de la cual se pueden programar pulsos. (f) Un detector de área es un dispositivo electrónico capaz de medir a un mismo tiempo varios haces de rayos X difractados. Bibliografía 1. Giacovazzo, C. (Ed.). “Fundamentals of Crystallography” 2nd edition. Oxford University press, New York, 2002. 2. Glusker, J. P., Lewis, M., Rossi, M..” Crystal Structure Analysis for Chemists and Biologists (Methods in Stereochemical Analysis)” Wiley VCH Inc, USA, 1994. 3. Massa, W., Gould, R. (Traductor) ”Crystal Structure Determination” 2nd edition, Springer, USA 2004. 4. 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