ALCANCES DE LA BIOINGENIERÍA DE TEJIDOS EN ODONTOLOGÍA LILIANA OTERO M. El PGH ha iniciado el cambio en el siglo XXI, la odontología, la medicina, la genética, la biología molecular, la biotecnología y la bioinformática convergen para dar cabida al desarrollo de nuevas disciplinas como la terapia génica, la imagenología, la nanotecnología, la farmacogenómica, la terapia con células madre y la bioingeniería; con el propósito de generar un cambio radical en el diagnóstico y tratamiento actual de las patologías que afectan al hombre. La fusión de la ingeniería con la biología molecular y celular ha dado origen a una nueva disciplina que se denomina: Bioingeniería. La Bioingeniería se encarga de regenerar los tejidos y órganos de los organismos vivos. Los objetivos terapéuticos de la bioiengeniería en odontología están encaminados a aliviar el dolor y restablecer la función, mediante: 1. La regeneración de hueso en patologías que afectan el sistema dentomaxilofacial (traumas, síndromes cráneofaciales, fisura labiopalatina, cáncer, enfermedad periodontal, maloclusiones). 2. La regeneración de cartílagos en patologías que afectan la Articulación Temporo-mandibular. 3. La regeneración de tejidos que afectan las glándulas salivales. 4. La regeneración de tejido nervioso. 5. La regeneración de tejidos dentales y de soporte (pulpa, dentina, ligamento periodontal, cemento, esmalte, mucosa oral) y el diseño y fabricación de dientes completos (dientes perdidos por patologías o traumas, agenesias, implantes, maloclusiones). MODELOS DE ESTUDIO EN BIOINGENIERÍA La demanda de tratamiento médico y odontológico ocasionado por la pérdida de tejidos, o por el daño de órganos en el macizo craneofacial secundarios a trauma, defectos congénitos y enfermedades adquiridas representan un grave problema de salud para la población (1). Aunque en términos generales los tejidos humanos tienen potenciales limitados de regeneración, los recientes hallazgos encontrados en la investigación con células madre e ingeniería de tejidos, proveen nuevas técnicas para ser aplicados en los tejidos dentales y cráneofaciales. Actualmente el objetivo principal del reemplazo y la reconstrucción de tejidos es reestablecer la función mecánica. Las estrategias corrientemente utilizadas en la pérdida de tejidos incluyen la utilización de injertos autógenos, aloinjertos y materiales sintéticos (aloplásticos). Sin embargo estos tratamientos presentan todavía muchas limitaciones. Uno de los mayores problemas de los autoinjertos y los aloinjertos es la poca disponibilidad de sitios donantes que presentan los humanos. Otro problema relacionado con la pérdida de hueso está relacionado con defectos estructurales y anatómicos y con el rechazo de tejidos. Actualmente el mayor problema que enfrentan los aloinjertos es una respuesta inmunológica adversa debida a diferencias genéticas, que pueden ocasionar el rechazo de un implante dental por ejemplo, porque no logran una verdadera oseointegración (2). La isquemia y la reperfusión del tejido, representan también graves problemas en el trasplante de órganos. Para este propósito está siendo evaluada la deleción clonal de las células T, la inducción de quimeras de médula ósea, la manipulación de citoquinas reguladoras y el bloqueo de CD28 ó CD40. Los esfuerzos científicos siguen en la tarea de identificar la forma de prevenir el rechazo del injerto y la trombosis. Las estrategias que utiliza la bioingeniería para crear nuevos tejidos y órganos se fundamentan en la combinación de materiales artificiales con moléculas bioactivas que inducen la formación tisular o el crecimiento de células en un laboratorio. Las moléculas bioactivas usadas más frecuentemente son factores de crecimiento o proteínas de matriz extracelular. Esta combinación puede ser realizada mediante procedimientos conductivos, inductivos y de transplante de células. En odontología las mejores representaciones de los procedimientos conductivos o pasivos (las prótesis utilizadas no incluyen células vivas ni señales biológicas de difusión) utilizados por la ingeniería de tejidos, son el implante dental y la regeneración tisular guiada. Los procedimientos inductivos activan células cercanas al tejido por medio de señales específicas. Estos procedimientos se han fortalecido gracias al descubrimiento de factores de crecimiento osteogénicos y angiogénicos. Las proteínas de la matriz extracelular (MEC), también inducen neoformación ósea cuando son colocadas en el sitio del defecto. Estas proteínas tienen la capacidad de dirigir la función de las células residentes y por lo tanto pueden promover la regeneración tisular. Por ejemplo, una preparación de proteínas del esmalte derivadas de tejido de cerdos es utilizada para regenerar tejidos periodontales en humanos, la laminina (otra proteína de MEC) está siendo probada por su habilidad para mejorar la adhesión a los implantes dentales (3). Para que la inducción tisular sea exitosa clínicamente, los factores biológicos de inducción deben activarse en los sitios deseados por el tiempo necesario. Por esta razón uno de los objetivos de la bioingeniería es diseñar nuevos sistemas de liberación controlada. Shea y colaboradores (4), demostraron que las células incorporan el DNA liberado y producen cantidades suficientes de proteínas inductivas que promueven la neoformación de tejidos. Comercialmente ya está disponible una nueva clase de biomateriales llamados ADMAT (animal derived extracellular matriz) diseñados en forma de prótesis o templetes que movilizan las células propias del organismo y las inducen a reconstruir el tejido reemplazando gradualmente la prótesis. Este proyecto de bioingeniería pretende cambiar el reemplazo artificial de órganos por la regeneración natural de los mismos. Actualmente se están probando clínicamente en humanos las prótesis periodontales. Esta tecnología puede ser aplicada en muchas formas para problemas médicos y dentales (tejidos periodontales, tejido de articulación temporomandibular, hueso) (5). Una de las limitaciones de los procedimientos inductivos es que aún no se conocen los factores inductivos para todos los tipos de tejido. En estas situaciones el trasplante de células madre resulta muy atractivo. Este procedimiento involucra el transplante de células producidas en el laboratorio. En este procedimiento multidisciplinario el clínico o cirujano, toma una pequeña biopsia del tejido de interés. La biología celular se encarga de multiplicar exponencialmente las células y de mantener su función. Por medio de los tejidos producidos por bioingeniería se llevan las células al sitio del transplante (6). La aplicación más excitante del transplante celular es la ingeniería de órganos completos. Esta aplicación genera la necesidad de desarrollar paralelamente una vasculatura de soporte metabólico para estos órganos. Para este propósito actualmente se están investigando dos procedimientos: el transplante de células endoteliales y la liberación de factores de crecimiento angiogénicos en los tejidos creados por ingeniería (7). Aunque la mayoría de trabajos de investigación en ingeniería de órganos están enfocados al desarrollo de tejidos cuya pérdida pueda ocasionar la muerte del paciente (Hígado, páncreas...) existen otras circunstancias que involucran la pérdida de tejidos donde no se produce la muerte del individuo, pero si se deteriora considerablemente su calidad de vida. A este último grupo pertenecen los pacientes que pierden el parénquima de la glándula salival y por ende la capacidad de producir saliva. Los pacientes que reciben radiación ionizante para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello y los pacientes con Síndrome de Sjogren sufren la pérdida del tejido secretor de la glándula salival. Sin saliva estos pacientes experimentan disfagia, caries rampante infecciones mucosas y otras molestias en la cavidad oral. Baum y colaboradores (8), iniciaron un programa piloto para desarrollar una glándula salival artificial. Esta glándula consta de un tubo ciego con movimiento unidireccional para la secreción de fluido. Este fluido es generado a partir de terapia génica. En un experimento realizado en ratas, se transfirió un gen para la secreción de líquidos mediante el virus AdhAQP1. Las ratas experimentales mostraron incremento en los niveles de fluido cercanos a los niveles normales. La investigación en el área de bioingeniería crece vertiginosamente día a día. Los modelos que se han desarrollado para el estudio de la ingeniería de tejidos comprenden: 1. Modelo endógeno, Distracción osteogénica: El propósito de este modelo es crear nuevo hueso a partir del conocimiento de procesos naturales que ocurren en el desarrollo tisular. Un ejemplo muy común es el estudio del desarrollo óseo en la distracción osteogénica. En la distracción toman lugar la proliferación y la apoptosis celular para lograr una adecuada regeneración tisular. En este proceso intervienen las células residentes, osteoblastos y osteoclastos. Por esta razón este es mecanismo ofrece una gran oportunidad para investigar los procesos de remodelación ósea, las moléculas de señalización y los factores de crecimiento que intervienen en esta regeneración. Este conocimiento está siendo empleado para la bioingeniería de tejidos utilizando células donantes, o en técnicas combinadas de bioingeniería y distracción ósea para la reconstrucción de defectos cráneofaciales, articulares y de los maxilares. 2. Estrategia de recombinación con bases proteicas: El mayor esfuerzo realizado en esta estrategia se basa en la colocación de factores de crecimiento exógenos, para aumentar la inducción de hueso o la cicatrización de un tejido. En modelos animales, los factores de crecimiento han sido administrados localmente para aumentar la reparación de defectos craneofaciales de tejido óseo en cráneo, proceso zigomático, procesos alveolares, periodontales y mandibulares. Entre las numerosas proteínas osteogénicas y angiogénicas que han sido investigadas se encuentra: el factor de crecimiento tranformante ßs (TGF-ßs), la activina A, las proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs), el factor de crecimiento fibroblastico 1 y 2 (FGF–1, FGF–2), factores de crecimiento parecidos a la insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y hormonas de crecimiento (GH). También se han utilizado factores de crecimiento añadidos directamente a los materiales biodegradables para la fijación ósea en cirugías craneofaciales. Para imitar el tejido nativo se debe crear un molde tridimensional que simule la matriz del tejido que se quiere regenerar. Debe además simular las propiedades químicas y físicas del tejido y promover la diferenciación, proliferación y adherencia entre las células del tejido progenitor y el tejido implantado. Este molde puede ser fabricado en material sintético como polímeros, material biológico, o un híbrido entre los dos tipos de materiales (9). Actualmente las técnicas de bioingeniería agregan factores de crecimiento (10), secuencias peptídicas específicas (11) y sistemas multicelulares a estas matrices de tejido (12). Los factores de crecimiento y diferenciación que han demostrado participar más activamente en el desarrollo de las estructuras cráneofaciales son el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), Sonic Hedgehog (SHH), Las Proteínas morfogenéticas de hueso (BMP), algunos genes homeóticos (Msx, Dlx), y el factor de transcripción RUNX2 producido por el gen Cbfa1, entre otros. Aunque la formación de esmalte en tejidos adultos parece una tarea muy difícil de lograr, los hallazgos recientes de Thesleff y colaboradores (13), quienes reportaron células madre de origen endotelial con capacidad de transdiferenciarse en ameloblastos en ratones, permiten suponer que es posible regenerar esmalte. Este estudio sugiere que el Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF) (14), es el responsable de inducir la diferenciación de estas células mediante la regulación de la vía de señalización mediada por Notch (15). 3. Estrategias basadas en genes: El objetivo de este recurso es iniciar la cascada de expresión génica para permitir el reclutamiento celular, la diferenciación, la producción de matriz y el ensamblaje ordenado de estructuras para la regeneración de tejidos. Las estrategias genéticas se han mejorado durante los últimos años y los modos de transmisión se pueden dividir en virales y no virales. Dentro de los modos virales, los adenovirus ha sido utilizado para los métodos basados en la transferencia genética como medio de transporte para los genes ya que presenta gran habilidad para infectar las células con los nuevos genes, además de presentar una alta eficiencia de transfección y su gran capacidad transgénica. Por ejemplo, algunos investigadores han utilizado los adenovirus para transportar potentes factores angiogénicos (VEGF) y osteoinductores (BMPs) en ratas. Los modos no virales como la transferencia génica mediada por genes liposómicos han sido muy poco utilizados hasta ahora, ya que presentan una baja eficiencia en la transferencia de genes. En la Bioingeniería de tejidos la terapia génica ha sido utilizada para la formación de hueso nuevo in vivo e in Vitro, mediante la inserción de proteínas morfogenéticas (BMP). La electroporación o sonoporación han sido usados para transferir el gen Gdf11 (que codifica para la proteína BMP11) para amputar pulpa dental, estimular la formación y reparación de dentina. En estos métodos se aíslan las células madres de la pulpa dental con genes que codifican para las BMP, y luego se implantan las células dentro de la pulpa injuriada. Este procedimiento ex vivo para transferir genes podría estimular la reparación y formación de dentina más rápidamente (16). 4. Estrategias basadas en células madre: La investigación en este campo está dirigida a la búsqueda de células madre, sus características, su presencia en tejidos embriónicos y adultos y su utilidad terapéutica en humanos. En este modelo se utilizan bloques de células vivas cuando un tejido es incapaz de cicatrizar un defecto, o cuando se quiere diseñar un tejido u órgano in Vitro. Para que una célula sea funcional en la ingeniería de tejidos craneofaciales, debe seguir ciertos criterios: *Capacidad de formar múltiples tejidos *Baja inmunogenicidad *Rapidez y facilidad de expansión en cultivos *Accesible con mínima morbilidad para el sitio donante. La progenie de las células madre contenidas en la medula ósea y en la pulpa dental parece tener un perfil genético muy similar, en cuánto a la expresión de factores de transcripción, factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelular, moléculas de adhesión A. y marcadores moleculares característicos de fibroblastos. Por esta razón estas células tendrían la posibilidad de diferenciarse en células endoteliales, células nerviosas, células de músculo liso, células óseas, células cartilaginosas y células específicas de tejidos dentales; dependiendo de la inducción guiada por factores biológicos o sintéticos dentro del cultivo (17). 5. Construcción compleja de tejidos/órganos: Depende del sitio donde se va a fabricar el tejido u órgano. a. Biorreactivos In Vitro: utiliza moldes tridimensionales con complejos celulares para trasplantes eventuales. b. Recipientes heterotópicos: utiliza células propias para trasplantes heterotópicos. c. Donador exógeno: utiliza animales como donantes de órganos o tejidos (18). BIOINGENIERÍA PERIODONTALES: DE LOS TEJIDOS Se refiere a la ingeniería de cemento dental hueso alveolar y ligamento periodontal. Debido a su origen embriónico las células de los tejidos periodontales responden a diferentes estímulos. Las células ectomesenquimatosas indiferenciadas (SCLPD) están siendo ampliamente estudiadas por su potencial en bioingeniería de tejidos y regeneración del ligamento periodontal. Otras células que vienen siendo empleadas para la regeneración periodontal, son las células de mucosa oral producidas con ingeniería de tejidos (19), los cementoblastos clonados (20) y los fibroblastos de piel tratados con BMP-7 mediante ingeniería genética (21). Los factores de crecimiento IGF-1 (factor de crecimiento parecido a la insulina) (22), TGF-1 (factor de crecimiento de transformación) (23), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) (24), FGF2 (factor de crecimiento fibroblástico) (25), BMP-2 (25), BMP-4 (27), BMP-7 (28), BMP-12 (67) y EMD (derivado de la matriz del esmalte) (29), han demostrado resultados positivos en la regeneración periodontal cuando son añadidos a las matrices biológicas utilizadas en ingeniería de tejidos. El mayor potencial clínico terapéutico está representado por las BMP usadas en forma combinada con IGF-1 y PDGF (30). Por otra parte el factor rhBMP ha demostrado ser útil no solamente en regeneración periodontal, sino también en la cicatrización de defectos óseos cráneofaciales (31). El FGF-2 ó bFGF (factor de crecimiento fibroblástico básico) ha demostrado tener un alto potencial para aumentar la actividad angiogénica y para inducir el crecimiento de las células inmaduras del ligamento periodontal (32). EMD también ha demostrado tener efecto angiogénico (33). Sin embargo estos efectos no son estables in vivo. Por esta razón se viene investigando en técnicas con ingeniería genética de VEFG combinada con PDGF, para estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos cuando son añadidos al templete de la matriz biológica del tejido que se quiere regenerar (34). Aunque los avances de los últimos años han sido muy importantes para el progreso de la terapia regenerativa periodontal mediante bioingeniería, aún faltan muchas investigaciones que ayuden a establecer esta terapia en forma cotidiana para los tratamientos odontológicos. BIOINGENIERÍA DE TEJIDOS DENTALES Y DIENTES COMPLETOS: Los procesos de morfogénesis dental se han reproducido en varios laboratorios utilizando células madre adultas para diferenciarse en varios tejidos. Gronthos y col (2.000) (35), aislaron células de pulpa dental y demostraron la capacidad de estas células para producir grandes cantidades de dentina. Por otra parte Harada y col (1999) han investigado la regulación molecular de la proliferación y diferenciación de las células madre en el epitelio del órgano del esmalte (36). La matriz dentinal contiene BMP que pueden estimular la formación de dentina en pulpa (odontoblastos) y la formación de hueso en el tejido muscular (osteoblastos) (37). Thesleff y col han descubierto “centros de Señalización” en el epitelio del germen dental llamados nudos del esmalte, que producen más de 10 factores de crecimiento y diferenciación y son los encargados de la formación de las cúspides dentales. Este mismo grupo de investigación ha descubierto hasta el momento más de 250 genes relacionados con el desarrollo dental. Aunque aún no se puede fabricar totalmente un diente completo utilizando la bioingeniería y la terapia con células madre, debido a que se desconocen algunos mecanismos de interacción entre las células, las moléculas de señalización y los factores de crecimiento, Chai y Slavkin proponen este procedimiento para la bioingeniería de tejidos dentales (38): BIOINGENIERÍA CRÁNEOFACIALES: DE TEJIDOS Las BMP han demostrado tener la capacidad de aumentar la densidad ósea en experimentos realizados in Vitro y en primates (39). Estas proteínas junto con el VEGF, TGF y FGF producen crecimiento óseo en el cráneo de animales jóvenes, cuando son liberados en el organismo utilizando terapia génica con vectores virales y no virales (40). Sin embargo actualmente se están empleando implantes biodegradables tratados con ingeniería genética, llamadas matrices activadas por genes (GAM). Estas matrices aún no han sido empleadas clínicamente en los huesos cráneofaciales, pero este y otros modelos de matrices que emplean ingeniería genética para liberar en el medio los genes responsables de la inducción ósea, están siendo actualmente objeto de investigación (41). . BIOINGENIERÍA DE PIEL, MUCOSA Y GLÁNDULAS SALIVALES: demostrado ser una herramienta novedosa en la regeneración de la ATM. Kim y col generaron cartílago de formas triangulares, cuadradas y transversales utilizando condrocitos embebidos en matrices de ácido poliglicólico con estas formas específicas (44). Ciertas formas de corales naturales contienen poros y una estructura tridimensional similar a la de los huesos humanos, por esta razón estas formas han sido utilizadas como moldes de matriz para ingeniería de tejidos óseos y periodontales (45). Actualmente la bioingeniería del cóndilo y de los defectos óseos de la ATM se está realizando mediante la utilización de matrices tridimensionales creadas exactamente para cada paciente con diseños asistidos por computador. CONCLUSIONES . Los productos comerciales de piel creada mediante bioingeniería fueron los primeros reglamentados por la FDA para el uso clínico (42). Un producto similar está siendo probado como sustituto de mucosa oral, pero aún no ha sido lanzado al mercado. Sin embargo las aplicaciones terapéuticas de estos dos productos en odontología son enormes. La bioingeniería de las glándulas salivales representa una buena oportunidad para aliviar las secuelas producidas por el trauma, el cáncer o el síndrome de Sjogren. Los pacientes que reciben radiación ionizante para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello y los pacientes con Síndrome de Sjogren sufren la pérdida del tejido secretor de la glándula salival. Sin saliva estos pacientes experimentan disfagia, caries rampante infecciones mucosas y otras molestias en la cavidad oral. Baum y colaboradores (43), iniciaron un programa piloto para desarrollar una glándula salival artificial. Esta glándula consta de un tubo ciego creado con polímeros y células epiteliales que tiene un movimiento unidireccional para la secreción de fluido. Este fluido es generado a partir de terapia génica. En un experimento realizado en ratas, se transfirió un gen para la secreción de líquidos mediante el virus AdhAQP1. Las ratas experimentales mostraron incremento en los niveles de fluido cercanos a los niveles normales. Este experimento ofrece una gran expectativa para el tratamiento de este tipo de pacientes. . BIOINGENIERÍA DE LA ARTICULACIÓN TEMPORO MANDIBULAR (ATM). Aunque muchas patologías congénitas y adquiridas afectan la ATM, existen pocas alternativas terapéuticas para estos pacientes. La bioingeniería de tejidos ha Antes implementar la bioingeniería de tejidos en la práctica clínica, es necesario seguir investigando en: *Los mecanismos de iniciación, diferenciación y proliferación de las células madre adultas. *La identificación de tejidos adultos que puedan ser usados como fuente de células madre o como recipientes de injertos autólogos en la bioingeniería de estructuras dentales y cráneofaciales. *Desarrollar métodos para caracterizar y cultivar las células madre adultas provenientes de tejidos humanos. *Identificar las matrices biológicas ideales para la ingeniería de tejidos periodontales, pulpa, dentina, esmalte, cartílago, hueso y dientes completos. *Definir protocolos clínicos para el transplante de tejidos humanos creados por bioingeniería, que aseguren el éxito y la estabilidad del implante. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Kaigler D, Mooney D. Tissue engineering´s Impact on dentistry. J Dental Educat. 2.001; 65(5): 456-462. 2. 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