sInterleukin-2-Receptor ELISA

Instrucciones de Uso
sInterleukin-2-Receptor
ELISA
Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de
interleucina-2-receptor soluble (sIL-2R) en el sobrenadante de
cultivo celular, suero y plasma humanos.
BE51121
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
Flughafenstrasse 52a
D-22335 Hamburg, Germany
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0
Fax: +49 (0)40-53 28 91-11
G M B H
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www.IBL-International.com
sInterleukin-2-Receptor ELISA (BE51121)
ESPAÑOL
INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO
1.
USO PROPUESTO
2
2.
RESUMEN
2
3.
PRINCIPIO DEL ENSAYO
3
4.
REACTIVOS SUMINISTRADOS
4
5.
INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
4
6.
TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE
4
ALMACENAMIENTO
7.
MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO
5
8.
PRECAUCIONES DE USO
5
9.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
6
10. PROTOCOLO DE ENSAYO
8
11. CALCULO DE RESULTADOS
10
12. LÍMITES
11
13. PRUEBAS FUNCIONALES
12
14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS
14
15. RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS
15
16. RESUMEN DEL PROTOCOLO
16
17. LITERATURA SOBRE EL PRODUCTO
17
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1.
ESPAÑOL
Uso Propuesto
El ELISA sIL-2R humana es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de la sIL-2R
humana.
El ELISA sIL-2R humana es para el diagnóstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos
terapéuticos
2.
Resumen
La interleucina-2 (IL-2) ha sido descrito como un factor que promueve el crecimiento y la proliferación de las
células T humanas jugando de esta manera un papel fundamental en la generación de la respuesta
inmune. Esta proliferación de los linfocitos T se activa mediante la interacción de la IL-2 con su receptor
específico de la superficie celular después de la activación de los linfocitos T. El receptor de la IL-2 está
compuesto de al menos tres subunidades distintas de polipéptidos, la IL-2R α, IL-2R β, y las cadenas de IL2R γ dando lugar a una proteína unida a la membrana de 55-65 kDa.
Los genes que codifican la IL-2 y las tres subunidades del receptor han sido clonado y su estructura
primaria completa ha sido deducido.
Se ha acumulado evidencia que sugiere un papel crítico de la IL-2R β en la transducción de señal de IL-2.
Se cree que las tirosina quinasas acopladas a la IL-2R juegan un papel crucial en dicha transducción de
señales.
Además de la expresión de novo de la IL-2R por la activación de linfocitos T periféricas, se ha detectado
una forma liberada y completamente soluble de IL-2R (sIL-2R). Se ha demostrado que la sIL-2R está
presente en vivo, en niveles bajos en el suero de personas sanas y en niveles notablemente elevados en
diversas condiciones patológicas como enfermedades neoplásicas. Las características estructurales,
funcionales y moleculares de la sIL-2R han sido ampliamente investigadas. En virtud de su capacidad para
unirse a la IL-2, esta molécula soluble juega un papel en la regulación de la respuesta inmune. La detección
y la cuantificación de la sIL-2R proporciona a los médicos un instrumento útil y sencillo para evaluar la
función inmune in vivo como parte de la investigación, el tratamiento y el pronóstico de un amplio espectro
de enfermedades humanas.
- enfermedades malignas hematológica (neoplasias):
Los niveles de la IL-2R soluble son significativamente elevados en el suero de pacientes con leucemia
adulto de células T, leucemia de células peludas, leucemia linfocítica, linfoma de Hodgkin y linfoma noHodgkin, cáncer de mama, hígado y pulmón.
- enfermedades auto-inmunes o inflamatorios:
En los pacientes con lupus eritematoso sistémico, poliartritis reumatoide, esclerosis sistémica progresiva,
polimiositis, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple y la diabetes de tipo I las concentraciones
plasmáticas de sIL-2 receptor son significativamente elevados en comparación con los controles.
- enfermedades infecciosas:
Tanto las infecciones virales como las micobacterias llevan a niveles altos de IL-2R soluble encontrados en
la hepatitis, el VIH-1, mononucleosis infecciosa, el sarampión, la lepra, la tuberculosis, así como en la
malaria.
- trasplante o rechazo:
La IL-2R soluble resultó ser un marcador muy útil para el seguimiento de los pacientes trasplantados que
presentan aumentos significativos de los niveles séricos de IL-2R experimentando episodios de rechazo en
los trasplantes de riñón, pulmón, corazón e hígado.
- insuficiencia renal crónica o diálisis:
La insuficiencia renal eleva la sIL-2R en el suero dado que esta molécula es transportada activamente a la
orina.
- piel:
La sIL-2R es significativamente más elevada en pacientes con lesiones térmicas.
- terapia:
La IL-2 recombinante como medicamento en el tratamiento del cáncer puede provocar la liberación de sIL2R.
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3.
ESPAÑOL
Principio de Ensayo
Figura 1
Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos
anti-sIL-2R humana.
Micropocillos Recubiertos
Anticuerpo para el Recubrimiento
Figura 2
La sIL-2R humana presente en la muestra o el estándar se une a
los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un
anticuerpo anti-sIL-2R humano conjugado a Enzima Peroxidasa
que se une a la sIL-2R humana capturada por los primeros
anticuerpos.
Primera Incubación
Estándar o Muestra
Conjugado HRP
Figura 3
Después de la incubación se elimina los anticuerpos anti-sIL-2R
humana conjugados a HRP no unidos mediante una etapa de
lavado. Una solución de Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa
es agregada en los pocillos.
Segunda Incubación
Substrato
Figura 4
Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la
sIL-2R presente en la muestra o el estándar. La reacción es
terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450
nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones
estándar de sIL-2R y se determina la concentración de sIL-2R
humana en la muestra.
Substrato Reaccionado
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4.
ESPAÑOL
Reactivos Suministrados
1
bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales
anti-sIL-2R humana.
1
vial (70 µL) de Conjuguado HRP (anticuerpos monoclonales anti-sIL-2R humana)
3
viales de Estándar sIL-2R humano liofilizado, 40 ng/mL después de la reconstitución
1
vial (12 mL) de Diluyente de Muestras
1
vial (5 mL) de Solución Buffer de Ensayo Concentrada 20x
(PBS con 1% Tween 20 y 10% BSA)
1
frasco (50 mL) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x
(PBS con 1% de Tween 20)
1
vial (15 mL) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina)
1
vial (15 mL) de Solución de Paro (1M Acido Fosfórico)
2
Tapas para placas, Adhesivas
5.
Instrucciones de Almacenamiento
Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2°C y 8°C.
Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura fría
(2°C y 8°C). En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo
se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan
adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado
en la primera manipulación.
6.
Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento
Sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina) fueron probados con este
ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o
plasma del coágulo o de las células lo antes posible después de la coagulación y separación.
Prestar atención a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentración de las muestras (ver capítulo
11).
Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No
utilizar muestras altamente hemolizadas o lipémicas.
Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20°C para evitar la pérdida de sIL-2R humana
bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2°C y 8°C (para
la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe
alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente.
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7.
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8.
-
-
-
-
ESPAÑOL
Material Requirido Pero No Suministrado
Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL
Micropipetas monocanales de 5 µL a 1000 µL con puntas desechables
Micropipetas multicanales de 50 µL a 300 µL con puntas desechables
Depósito para micropipetas multicanales
Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos
Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación
Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (opcional: 620 nm
longitud de onda de referencia)
Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio
Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión
Precauciones de Uso
Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto,
recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido
entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas
prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de
laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto
con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata
a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de
seguridad para recomendaciones específicas.
Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en
procedimientos terapéuticos.
No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes.
No usar reactivos caducados.
No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación.
No pipetear con la boca.
No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos.
Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.
Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las
muestras y reactivos.
Evitar el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales.
Evitar salpicaduras y la generación de aerosoles.
Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y
muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo
uso.
Usar recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato.
La exposición a los ácidos inactiva el conjugado.
Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos.
La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.
Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si
pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado
durante un mínimo de 1 hora a 121.5ºC.
Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con
hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0% de hipoclorito sódico. Dejar
actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan
ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico.
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9.
ESPAÑOL
Preparación de los Reactivos
Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes
de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado
cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución.
9.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz
aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para
evitar la formación de espuma.
Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2°C y 25°C. La
Solución Buffer de Lavado permanece estable durante 30 días
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Número de Tiras
1-6
1 - 12
Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL)
25
50
Agua Destilada (mL)
475
950
9.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio
aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL.
Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma.
Conserve la solución a una temperatura de entre 2°C y 8°C. La Solución Buffer de Ensayo permanece
estable durante 30 días.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Número de Tiras
1-6
1 - 12
Solución Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL)
2.5
5.0
Agua Destilada (mL)
47.5
95.0
9.3. Preparación de Conjugado HRP
Utilice el Conjugado de Enzima Peroxidasa (HRP) antes de transcurridos 30 minutos desde su
dilución.
Justo antes de utilizar el Conjugado HRP, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la Solución
Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio.
En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado HRP de acuerdo a la siguiente tabla:
Número de Tiras
1-6
1 - 12
Conjugado HRP (mL)
0.03
0.06
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
2.97
5.94
9.4. Estándar sIL-2R Humano
Reconstituir el Estándar sIL-2R humano añadiendo agua destilada.
El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Girar o mezclar
cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar
reconstituido = 40 ng/mL). Permitir que el estándar reconstituido se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar
bien previamente a realizar las diluciones.
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Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados.
Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o
alternativamente en tubos (véase 9.4.1).
9.4.1. Dilución Estándar Externa
Rotular 7 tubos, uno para cada curva estándar.
S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.
Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación:
Pipetear 225 µL de Diluyente de Muestra a todos los tubos.
Pipetear 225 µL de estándar reconstituido (concentración del estándar = 40 ng/mL) en el primer tubo,
etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 20 ng/mL).
Pipetear 225 µL de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como s2, y mezclar completamente antes
de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los
diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 5).
El Diluyente de Muestra sirve como blanco.
Figura 5
Transferir 225 µL
S1
sIL-2R Humano
Estándar Reconstituido
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S2
S3
Diluyente de Muestras
225 µL
S4
-
S7
Descartar
225 µL
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10.
Protocolo de Ensayo
a.
Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y
además añada las tiras para blancos y estándares. Cada muestra, estándar, blancos y la
muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras
sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y
cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8°C.
b.
Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µL de Solución Buffer de Lavado por cada
pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la
Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su
aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos.
Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de
papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de
lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo
15 minutos. No deje secar los pocillos.
c.
Dilución Estándar en la placa de microtitración
(Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos – véase 9.4.1)
Añadir 100 µL de Diluyente de Muestra en duplicado a todos los pocillos estándar.
Pipetear 100 µL de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.4,
concentración = 40.0 ng/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezclar el
contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la
pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 20.0 ng/mL), y transferir 100 µL a los pocillos B1 y B2,
respectivamente. (véase Figura 6). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con
la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones
estándar del human sIL-2R ordenadas des de 20.0 a 0.31 ng/mL. Descartar 100 µL de los
contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados.
Figura 6
Transferir 100 µL
S1
sIL-2R Humano
Estándar Reconstituido
11.11.14 (25)
S2
S3
Diluyente de Muestra
100 µL
S4
-
S7
Descartar
100 µL
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ESPAÑOL
En caso de una dilución estándar externa (véase 9.4.1), pipetear 100 µL de estas diluciones estándares
(S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1.
Tabla 1
Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras
de los micropocillos
A
B
C
D
E
F
G
H
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
l.
m.
1
2
Estándar 1
(20.0 ng/mL)
Estándar 2
(10.0 ng/mL)
Estándar 3
(5.0 ng/mL)
Estándar 4
(2.5 pg/mL)
Estándar 5
(1.25 ng/mL)
Estándar 6
(0.63 ng/mL)
Estándar 7
(0.31 ng/mL)
Estándar 1
(20.0 ng/mL)
Estándar 2
(10.0 ng/mL)
Estándar 3
(5.0 ng/mL)
Estándar 4
(2.5 pg/mL)
Estándar 5
(1.25 ng/mL)
Estándar 6
(0.63 ng/mL)
Estándar 7
(0.31 ng/mL)
Blanco
Blanco
3
4
Muestra 1
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 7
Muestra 8
Muestra 8
Añadir 100 µL de Diluyente de Muestra en duplicado a los pocillos del blanco.
Añadir 50 µL de cada Dilyente de Muestra a los pocillos con la muestra.
Añadir 50 µL de cada muestra en duplicado a los pocillos con la muestra.
Prepare el Conjugado HRP (véase la preparación del Conjugado HRP 9.3).
Añada 50 µL el Conjugado HRP a todos los pocillos.
Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25°C) durante 3 horas en un
agitador mecánico a 400 rpm, si es posible.
Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 3 veces de acuerdo al
punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso.
Pipetee 100 µL de la Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos.
Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25°C) durante aproximadamente
10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa.
Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato
(véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar
correctamente los pocillos positivos.
La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de
forma individual para cada ensayo.
Se recomienda añadir la solución de paro cuando el estándar más alto presente un color azul
oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de
ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una
DO entre 0.9 y 0.95.
Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µL de la Solución de Paro en cada
pocillo. Es importante dispensar la Solución de Paro de forma rápida y uniforme en todos los pocillos
para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir
la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una
temperatura entre 2-8°C en un lugar oscuro.
11.11.14 (25)
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n.
ESPAÑOL
Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de
onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores
comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el
blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la
absorbancia de las muestras y de los estándares.
Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados más
abajo. De todas formas los resultados siguen siendo válidos.
11.
-
-
-
-
CALCULO DE RESULTADOS
Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y
muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio
Construir una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada
estándar frente a la concentración de sIL-2R humana con el valor de absorbancia en el eje-y y la
concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics.
Para determinar la concentración de la sIL-2R humana circulante para cada muestra, primero
encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva
estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la
concentración la sIL-2R humana.
Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µL de
muestra + 50 µL de Diluyente de Muestras (1x)), la concentración leída a partir de la curva
estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (2x).
Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a
concentraciones incorrectas, bajas en sIL-2R humana (efecto gancho). Estas muestras
requieren más predilución externa según los valores esperados de sIL-2R humana con el
Diluyente de Muestras para cuantificar con precisión la concentración real de sIL-2R humana.
Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones
conocidas de sIL-2R humana y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores
obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no
válidos.
En la figura 7 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para
obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo
de tiras ensayadas.
Figura 7
Representativa curva estándar para el ELISA sIL-2R humano. Se diluyó la sIL-2R humana en serie de 2
etapas en el Diluyente de Muestras (1x). No use esta curva estándar para obtener resultados de las
pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas.
sInterleukine-2R ELISA
DO (450 nm)
10
1
0.1
0.01
0
1
10
100
ng/m L
11.11.14 (25)
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ESPAÑOL
Tabla 2
Datos típicos del ELISA sIL-2R humana
Longitud de onda: 450 nm
Longitud de onda de referencia: 620 nm
1
Concentración
sIL-2R humano
(ng/mL)
20.00
2
10.00
3
5.00
4
2.50
5
1.25
6
0.63
7
0.31
Blanco
0.00
Estándar
D.O.
(450 nm)
D.O. Media
(450 nm)
C.V.
(%)
2.239
2.193
1.366
1.354
0.710
0.747
0.403
0.410
0.204
0.219
0.120
0.122
0.071
0.074
0.010
0.012
2.216
3.25
1.360
0.85
0.729
2.62
0.407
0.49
0.212
1.06
0.121
0.14
0.073
0.21
0.011
0.14
Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo
(por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura).
Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad
de color. Los valores medidos siguen siendo válidas.
12.
LÍMITES
-
Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva
estándar para cada prueba.
-
La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada
entre los reactivos puede dar resultados erróneos.
-
Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los
frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser
eliminados por un enjuague minucioso.
-
Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a
resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes
de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se
especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo
o que se secan.
-
Por la aplicación de radioinmunoterapia, el número de pacientes con los anticuerpos humanos IgG
antiratón (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen
anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos
negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden
todavía ser ensayadas en ensayos de este tipo si se añaden inmunoglobulinas murinas (suero, líquido
ascítico o anticuerpos monoclonales no específicos) a la muestra.
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sInterleukin-2R ELISA (BE51121)
13.
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Pruebas Funcionales
13.1. Sensibilidad
El límite de detección de sIL-2R humano definido como la concentración del analito resultando en una
absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar),
se determinó de ser 0.27 ng/mL (media de 6 ensayos independientes).
13.2. Recuperación
13.2.1. Intra-ensayo
La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a
cabo con 6 repeticiones de 6 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de sIL-2R
humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la
concentración media de sIL-2R humana y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3). El
calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 7.2%.
Tabla 3
La concentración media de sIL-2R humana y el coeficiente de variación para cada muestra
Muestra
Experimento
1
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
2
3
4
5
6
11.11.14 (25)
Concentración Media
sIL-2R humano (ng/mL)
2.60
2.53
2.01
1.47
1.54
1.32
1.47
1.54
1.30
1.72
1.80
1.64
1.43
1.52
1.33
3.05
3.42
2.67
Coefficiente de
Variación (%)
11
7
3
10
7
5
9
7
9
2
7
7
8
11
4
10
5
4
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13.2.2. Inter-ensayo
La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en tres experimentos independientes.
Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 6 muestras de suero que contienen diferentes
concentraciones de sIL-2R humana. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a
continuación muestran la concentración media de sIL-2R humana y el coeficiente de variación calculado en
18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de interensayo fue del 9.8%
Tabla 4
La concentración media de sIL-2R humana y el coeficiente de variación para cada muestra
Concentración Media de
sIL-2R Humano (ng/mL)
2.381
1.440
1.443
1.803
1.430
3.048
Muestra
1
2
3
4
5
6
Coefficiente de
Variación (%)
13.6
8.1
9.1
9.2
6.5
12.3
13.3. Recuperación después del Enriquecimiento
La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de sIL-2R humana en
muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en tres experimentos
independientes con 4 repeticiones cada uno. La concentración de la sIL-2R humana endógena en el suero
no enriquecido se restó de los valores del enriquecimiento. La recuperación total fue del 75%.
13.4. Dilución en Paralelo
Cuatro muestras de suero con diferentes concentraciones de sIL-2R humana fueron analizadas mediante
2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno.
La recuperación varió entre 77% a 107%, con una recuperación total de 86% (ver Tabla 5).
Tabla 5
Muestra
1
2
3
4
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Dilución
Concentración
Expectada de sIL-2R
Humano (pg/mL)
Concentración
Observada de sIL-2R
Humano (pg/mL)
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
1:2
1:4
1:8
1:16
-6.37
3.18
1.59
-8.50
4.25
2.13
-9.30
4.65
2.33
-8.36
4.18
2.09
1.27
5.92
2.58
1.28
17.0
9.08
3.83
1.86
18.6
8.35
3.69
1.78
16.72
6.79
3.49
1.84
Recuperación de
Concentración
Expectada de sIL-2R
Humano(%)
-93
81
81
-107
90
87
-90
79
77
-81
83
88
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13.5. Estabilidad de Muestras
13.5.1. Estabilidad Congelación - Descongelación
Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20°C y
posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del sIL-2R humana. No
hubo pérdidas significativas de la inmunoreactividad de sIL-2R humana por la congelación y
descongelación.
13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento
Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20°C, 2-8°C,
temperatura ambiente (TA) y a 37°C, y la concentración de sIL-2R humana fue determinada después de las
24, 48 y 96 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del sIl-2R humana
durante el almacenamiento en condiciones descritos anteriormente.
13.6. Especificidad
La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a
concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de sIL-2R humana. No se ha detectado
reactividad cruzada.
13.7. Valores Esperados
Se ensayaron grupos de 40 muestras de suero, así como de plasma EDTA, citrato y heparina de donantes
aparentemente sanos (hombres y mujeres) seleccionados al azar. Los niveles medidos pueden variar con
la colección de la muestra utilizada. Los niveles de sIL-2R humana detectados se detallan en la Tabla 6
Tabla 6
Matriz de
Muestra
Suero
Plasma (EDTA)
Plasma (Citrato)
Plasma (Heparina)
14.
Número de Muestras
Evaluadas
40
40
40
40
Intervalo
(ng/mL)
1.9-13.1
0.9-8.1
1.8-7.8
2.12-8.0
Media
(ng/mL)
4.7
2.4
3.8
4.0
Deviación Estándar
(ng/mL)
2.6
1.3
1.65
1.7
INFORMACIÓN DE PEDIDOS
Para los pedidos póngase en contacto con:
Véase la última página.
Para preguntas técnicas comuníquese con:
e-mail: IBL@IBL-International.com
www.IBL-International.com
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15.
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Resumen: Preparación de Reactivos
15.1. Solución Buffer de Lavado (1x)
Añadir 50 mL de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada.
Número de
Tiras
1-6
1-12
Solución Buffer de Lavado
Concentrada (mL)
25
50
Agua Destilada
(mL)
475
950
15.2. Solución Buffer de Ensayo (1x)
Añadir 5 mL Solución Buffer de Ensayo Concentrado (20x) a 95 mL de agua destilada.
Número de
Tiras
1-6
1-12
Solución Buffer de Ensayo
Concentrada (mL)
2.5
5.0
Agua Destilada
(mL)
47.5
95.0
15.3. Conjugado HRP
Hacer una dilución 1:100 del Conjugado HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x):
Número de Tiras
1-6
1-12
Conjugado HRP (mL)
0.03
0.06
Solución Buffer de Ensayo (1x) (mL)
2.97
5.94
15.4. Estándar sIL-2R Humano
Reconstituir el estándar liofilizado sIL-2R humano con agua destilada.
(El volumen de reconstitución se indica en la etiqueta del frasco estándar.)
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Resumen de Protocolo de Ensayo
1.
Determinar el número requirido de tiras de la placa de microtitulación.
2.
Lavar las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado.
3.
Dilución estándar en la placa de microtitración: Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras (1x), por
duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetear 100 µL de estándar preparado en los primeros
pocillos y crear diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µL de pocillo a pocillo.
Deseche 100 µL de los últimos pocillos.
Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.4.1): Pipetear 100 µL de estas diluciones
estándares en las tiras de los micropocillos.
4.
Añadir 100 µL de Diluyente de Muestras (1x), por duplicado, a los pocillos blancos.
5.
Añadir 50 µL de Diluyente de Muestras (1x) a los pocillos de muestra.
6.
Añadir 50 µL de muestras por duplicado a los pocillos respectivos.
7.
Preparar el Conjugado HRP.
8.
Añadir 50 µL de Conjugado HRP a todos los pocillos.
9.
Cubrir las tiras e incubar 3 horas a temperatura ambiente (18-25°C).
10.
Vaciar y lavar los pocillos 3 veces con Solución Buffer de Lavado.
11.
Añadir 100 µL de Solución Substrato TMB a todos los pocillos.
12.
Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25°C).
13.
Añadir 100 µL de Solución de Paro a todos los pocillos.
14.
Ajustar el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm.
Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2
(50 µL de muestra, 50 µL de Diluyente de Muestras (1x)), la concentración leída de la curva estándar
debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2).
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17 Literatura sobre el Producto
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purified human interleukin-2 to patients with cancer: development of interleukin-2 receptor positive cells and
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receptor as a tumor marker in patients with hairy cell leukemia. Blood 1988; 71:1304-1309.
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Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα
REF
Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT
Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: /
Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: /
Αριθµός εξετάσεων:
CONC
LYO
IVD
Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα
Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In
Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos
para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. /
Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να
φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση
στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:
Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
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