OPORTO, 4 Y 5 DE MAYO DE 2004 LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA RESUMEN DE LAS CONFERENCIAS DEL XVI ENCUENTRO CIENTÍFICO DE LALLEMAND LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA PRÓLOGO L os productores de vino deben incrementar sus conocimientos técnicos enológicos y tienen que estar informados de las prácticas innovadoras más recientes. Durante las XVIas Entretiens Scientifiques Lallemand en Oporto, los expertos en bacterias malolácticas presentaron los avances más recientes en este campo. En este libro se encuentran incluidos los sumarios de algunas de las ponencias de este encuentro. Hoy en día, las preocupaciones principales de los enólogos gravitan alrededor de dos polos principales – como mantener las características típicas de un vino mientras se ofrece a los consumidores la máxima calidad. Tim Atkin, Master of Wine y corresponsal de “The Observer” en el Reino Unido, moderador de la mesa redonda, resumió las discusiones sobre el uso de bacterias malolácticas seleccionadas de este modo: “No interesa estandarizar el vino. E incluso si las bacterias seleccionadas tienen una influencia positiva sobre el gusto y el aroma, la fermentación maloláctica representa solamente una parte del trabajo del productor de vino, que comienza mucho antes, en el viñedo mismo”. Este encuentro, que reunió personas clave de más de 15 paises de los cinco continentes, tuvo este año un enfoque más práctico, al dar la bienvenida a una docena de enólogos y winemakers para compartir sus perspectivas sobre el uso de bacterias malolácticas seleccionadas. Representantes del mundo del comercio del vino también hablaron de cómo seleccionan los vinos, de qué es lo que buscan con respecto a la calidad y la estabilidad, y de cómo sus propias elecciones están dictadas por las expectativas de los consumidores. El team técnico de Lallemand, gracias a los varios y diferentes puntos de vista obtenidos durante estos debates y degustaciones de vinos, puede dirigir la investigación de la compañía hacia el ofrecimiento de unas herramientas tecnológicas que se adapten cada vez más a las necesidades del mercado. –2– LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA CONTENIDOS 5. SUMARIO DE PERCEPCIÓN DEL CONSUMIDOR DE VINO DE DEFECTOS ORGANOLÉPTICOS PROVOCADOS POR UNA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA SIN CONTROL ................................25 Antonio Palacios1, Carlos Suárez1, Sibylle Krieger2, Didier Théodore3, Luis Otaño4 y Francisco Peña5 1. Lallemand SA, Península Ibérica 2. Lallemand SA, Alemania 3. Lallemand SA, Francia 4. Universidad de La Rioja, España 5. Catador experto 1. SUMARIO DE BACTERIAS LÁCTICAS INDÍGENAS Y BACTERIAS LÁCTICAS SELECCIONADAS ....................5 Aline Lonvaud-Funel Facultad de Enología de Burdeos Universidad Victor Segalen Bordeaux 2, Francia 2. SUMARIO DE EL ATRIBUTO MANTECOSO DEL VINO – DIACETILO ATRACTIVO, DETERIORO Y MÁS ALLA DE LA MANTEQUILLA O NO MANTEQUILLA 11 Eveline J. Bartowsky y Paul A. Henschke The Australian Wine Research Institute, Australia 3. SUMARIO DE APTITUD DE CEPAS SELECCIONADAS Y SALVAJES DE OENOCOCCUS OENI PARA INDUCIR LA FML EN VINOS CON CONDICIONES DIFÍCILES 17 Francesca Nannelli, Flavia Creatini y Iolanda Rosi, Università degli Studi di Firenze, Italia 6. SUMARIO DE ¿INFLUYEN LAS BACTERIAS MALOLÁCTICAS EN LA CALIDAD DEL VINO? .........29 Sumario del debate de la mesa redonda 4. SUMARIO DE IMPACTO DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS Y DEL GLUTATIÓN SOBRE EL CRECIMIENTO DE OENOCOCCUS OENI Y SOBRE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA .............................21 Doris Rauhut1, Magdalena Gawron-Scibek2, Beata Beisert1, Marta Kondzior2, Ralf Schwarz3, Helmut Kürbel1, Manfred Grossmann1 y Sibylle Krieger4 1. Instituto de Investigación Geisenheim, Alemania 2. Universidad de Warmia y Mazury, Polonia 3. Universidad de Ciencias Aplicadas Wiesbaden, Alemania 4. Lallemand SA, Alemania –3– LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA BACTERIAS LÁCTICAS INDÍGENAS Y BACTERIAS LÁCTICAS SELECCIONADAS Aline LONVAUD-FUNEL Facultad de Enología de Burdeos Universidad Victor Segalen Bordeaux 2 351, Cours de la Libération 33405 Talence CEDEX France aline.lonvaud@oenologie.u-bordeaux2.fr E l mosto y el vino son soporte principal de una gran diversidad de microflora que comprende levaduras y bacterias. Los diferentes microorganismos dominantes, en función de sus capacidades de crecimiento y supervivencia en el medio, mueren o sobreviven a lo largo de todo el proceso de vinificación. Las levaduras invaden el medio ya que su buena adaptación les facilita su multiplicación en el mosto, e inducen la fermentación alcohólica (FA). Mientras tanto, las bacterias lácticas (BL) resisten y se adaptan, más o menos eficazmente, a un ambiente cada vez más hostil. Tiene lugar una selección espontánea. Para una mejor gestión de la fermentación maloláctica (FML) se usan starters malolácticos preparados a partir de cepas indígenas de Oenococcus oeni. Sin embargo, cualquiera que sea la especie, en vinificación es más importante el tipo de cepa. La variabilidad dentro de una especie puede estar relacionada con un fenotipo de interés enológico (producción de compuestos volátiles o de compuestos no deseados). Las BL provienen de las uvas y el nivel de población inicial varía en función del ambiente durante los últimos días de la maduración. Humedad, temperatura y exposición a rayos UV influyen probablemente directa y/o indirectamente en su viabilidad dentro de la compleja microflora epífita, incluyendo las levaduras y los hongos. Normalmente, antes del inicio de la FA, el mosto presenta una población de alrededor de 102 a 104 ufc/mL. El sulfitado, realizado generalmente para prevenir las oxidaciones, limita también el crecimiento precoz de las BL. Al inicio de la FA las levaduras, cuya capacidad de crecimiento en el mosto es mayor, Saccharomyces cerevisiae se multiplican muy activamente y alcanzan una población elevada en pocas horas o en uno o dos días. Al mismo tiempo las BL Oenococcus oeni también presentan un crecimiento transitorio de la población, pero llegan en seguida a un FIGURA 1: Evolucción de máximo de cerca 103Saccharomyces cerevisiae y 104 ufc/mL. La figura 1 Oenococcus oeni inoculados en un muestra la evolución mosto. de ambos tipos de mi- BL indígenas y su evolución a lo largo de la vinificación Casi al principio de la FA, la microflora láctica está constituida por seis, siete o quizás más especies diferentes (Tabla I). TABLA I: Lista de especies de BL aisladas de mostos y vinos Géneros Especies Lactobacillus L. casei, L. plantarum, L. hilgardii, L. brevis, L. nagelii, L. kunkei, L. diolivorans, L. fructivorans Pediococcus P. parvulus, P. damnosus, P. pentosaceus Leuconostoc L. mesenteroides Oenococcus O. oeni –5– LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA da. Un pH más alto favorece las bacterias, pero realmente Días no influye en las levaduras. ESPECIES 0 3 6 10 18 Como consecuencia, las BL Oenococcus oeni nd nd nd 4.3 x 103 3,4 x 106 pueden multiplicarse precoLeuconostoc mesenteroides 2,9 x 102 1,7 x 104 9,6 x 104 3,2 x 103 nd zmente durante el proceso 3,8 x 104 3,7 x 104 4,9 x 103 nd Pedicoccus damnosus 6,0 x 102 induciendo o no una disminu8,0 x 104 4,0 x 104 4,4 x 103 nd Lactobacillus hilgardii 1,1 x 103 ción de la velocidad de la FA 4,5 x 103 nd nd Lactobacillus brevis nd 2,0 x 104 o incluso una parada de fer2,0 x 104 nd nd nd Lactobacillus plantarum 7,5 x 101 mentación. El sulfitado de las 2,0 x 104 nd nd nd Lactobacillus casei 7,7 x 101 uvas previene este problema. Total 2,5 x 103 1,7 x 105 1,5 x 105 1,8 x 104 3,4 x 106 Los factores principales de la nd : no detectados inhibición de las BL por parte de las levaduras son el aumento de la toxicidad y la limitación nutricional transitoria, croorganismos inoculados al mismo tiempo en un mosto mientras que la autolisis de la levadura es crucial para el estéril. El rápido crecimiento de las levaduras coincide crecimiento de las BL que han sobrevivido. En un medio con la regresión de las bacterias que volverán a crecer de cultivo de laboratorio controlado, usando un cultivo sólo durante la fase de declive de las levaduras. puro de Saccharomyces cerevisiae y O. oeni, es evidente La identificación a nivel de especie muestra una continua que las interacciones variarán en función de la cepa. selección de la población bacteriana. De seis o siete esCuando la FML comienza espontáneamente, la población pecies identificadas en el mosto se pasa a la dominancia de BL alcanza 106 ufc/mL. El O. oeni ejerce el dominio exclusiva de la especie O. oeni al final de la FA (Tabla II). y se encuentran presentes numerosas cepas. Durante la Esta selección es el resultado de numerosas interaccioFML se pueden identificar numerosas cepas (figura 2). nes entre las levaduras y las BL. También está influida por Esta diversidad es el resultado de la microflora inicial de la tolerancia de las BL a los cambios de las condiciones O. oeni en las uvas, del ambiente y de su evolución duambientales. Tan pronto como las uvas se encuentran en rante la FA, y por último de interacciones específicas con el tanque, la microflora tiene que hacer frente a nuevas la cepa de levadura dominante. De hecho, esta diversidad condiciones. Está sumergida en un medio ácido, con una es, probablemente, la mejor explicación para la cohabielevada concentración de azúcares y cada vez más pritación de cepas de O. oeni y de bacteriófagos sin que se vada de oxígeno. Mientras las levaduras se multiplican, provoquen alteraciones del proceso de FML. utilizan activamente azúcares pero también aminoácidos y vitaminas y acumulan en el medio los productos de su FIGURA 2: Patrones genómicos de 18 aislados de vino durante la metabolismo, por ejemplo etanol, ácidos grasos, etc. En fermentación maloláctica (restricción por NotI) tales condiciones, las BL que primero sobrevivieron a la $ acidez, e incluso a las condiciones osmóticas del mos& " " % ' # ! to, tienen que enfrentarse a otras constricciones debido a las limitaciones nutricionales de aminoácidos esenciales y a la toxicidad de los metabolitos de las levaduras. El medio se vuelve cada vez más selectivo de forma que sólo sobreviven las cepas mejores. Estas cepas crecerán después del declive de las levaduras. Se trata predominantemente de O. oeni. Otras especies de BL, con menor población, se mantienen viables pero no se multiplican durante la vinificación; pueden inducir la esporulación más adelante durante la conservación. La competición entre cepas de los dos principales microorganismos del Metabolitos principales y secundarios de las BL vino, Saccharomyces cerevisiae y O. oeni, da lugar a la indígenas inhibición sucesiva de las bacterias y a la aceleración de la fase de declive de las levaduras por el crecimiento de La degradación del ácido málico está siempre considerada bacterias. En algunas condiciones, especialmente si el pH como el metabolismo principal, según el punto de vista es demasiado alto, la competición no existe o es reducidel enólogo. Sin embargo, las BL pueden usar numerosos TABLA 2 : Evolución de las especies de BL durante la fermentación alcohólica –6– Bacterias lácticas indígenas y bacterias lácticas seleccionadas componentes del vino como substrato. Mientras un componente se transforma, los productos se van acumulando en el vino y participan en su composición final y, por lo tanto, en la calidad del vino. Los metabolismos de las BL del vino se pueden dividir en: i) metabolismos comunes a todas las especies y cepas bacterianas; ii) metabolismos encontrados frecuentemente; y iii) metabolismos ocasionales y raros. liberado al final de la FA y durante la autolisis de la levadura. Estudios recientes mostraron que, en una colección de varias decenas de O. oeni aisladas del vino, cerca del 74 % de las cepas podía degradar la arginina a través de la ruta de la arginina deiminasa. Este metabolismo está implicado en el abastecimiento de energía ya que se produce ATP. Por otra parte, al menos en el ambiente cerrado de la célula, el aumento de pH debido a la desaminación ayuda al contacto con el ambiente ácido. Los productos de la ruta ADI son amonio, citrulina y carbamilfosfato. Este metabolismo aumenta la concentración de los precursores del carbamato de etilo en el vino. No obstante, su implicación es menor e insignificante comparada con la liberación de urea por parte de las levaduras. La descarboxilación del ácido L-málico parece ser una propiedad general de todas las cepas y especies que han sido aisladas del vino. La actividad maloláctica de una cepa depende de la actividad específica de la enzima, que puede ser diferente de una cepa a otra. Sin embargo, las diferentes eficacias de las cepas para realizar la FML son debidas a sus diversas aptitudes para crecer en el vino y formar una biomasa bacteriana importante. La actividad también está estrechamente relacionada con la integridad de la membrana, que garantiza unas condiciones de reacción óptimas dentro de la célula, por lo tanto sólo las bacterias viables tienen actividad. La reacción maloláctica proporciona indirectamente energía a la bacteria a través del intercambio substrato/producto y protones a nivel de la membrana. Respecto a los metabolismos mencionados más arriba, la descarboxilación de los aminoácidos, la degradación del glicerol y la producción de exopolisacáridos, que aumenta la viscosidad del vino, son mucho más ocasionales. Hasta ahora se ha demostrado que no se pueden atribuir a una especie concreta; pueden aparecer en cualquier especie. La descarboxilación de aminoácidos se ha estudiado para la histidina y la tiroxina, que produce las no deseadas histamina y tiramina. Estas rutas de descarboxilación se pueden considerar como una opción muy positiva para las cepas ya que proporcionan fuentes de energía adicionales. Es posible que tales cepas puedan permanecer en el vino más tiempo cuando todos los nutrientes preferenciales ya han sido consumidos totalmente. Como las bacterias de otros ambientes microbiológicos, las BL del vino pueden degradar el glicerol. Existen dos rutas. El glicerol puede ser oxidado después de una fosforilación por la glicerol quinasa a fosfato de hidroxiacetona, que interviene en la glicolisis y produce piruvato, y luego los productos habituales de la última parte del ciclo. La otra ruta usa la glicerol dehidratasa, que produce 1,3-propanodiol. En esta ruta, el 3-hidroxipropionaldehído es un intermediario, del que una cantidad pequeña conduce por deshidratación a la acroleína. Lo general para las BL es la fermentación de los azúcares dejados por las levaduras. Ésta es la principal fuente de energía, especialmente para las bacterias heterofermentativas que fermentan glucosa, fructosa y pentosas. Los azúcares representan una considerable fuente de energía y de compuestos de carbono incluso si están presentes con concentraciones relativamente bajas, en total menos de 1 g/L. Aparte los azúcares y el ácido málico, los otros metabolismos comunes de las BL del vino todavía no se han estudiado. Los metabolismos del ácido cítrico y de la arginina son bastante frecuentes. Según los conocimientos actuales, parece que el ácido cítrico es degradado por todos los cocos heterofermentativos y lactobacilos heterofermentativos. Las cepas de O. oeni usan generalmente el ácido cítrico en una compleja ruta para proporcionar energía a la célula y una fuente de carbono para la síntesis de lípidos. El carbono de las moléculas de ácido cítrico se incorpora a los ácidos grasos necesarios para los fosfolípidos y para la membrana, parte de la ruta está centrada en los compuestos acetoínicos. Aunque la concentración de ácido cítrico es baja (200-300 mg/L), participa, con los otros substratos, en la nutrición y en el crecimiento de las bacterias. Durante la FML se degrada más lentamente que el ácido L-málico, pero continúa incluso después del sulfitado. La arginina, uno de los aminoácidos más importantes del mosto de uva, al principio es usado activamente por la levadura y luego Impacto sobre la calidad sensorial Como resultado de los metabolismos descritos más arriba y de todos los otros que todavía no son conocidos, la composición del vino final cambia. Obviamente la repercusión principal del crecimiento de BL en el vino es la desacidificación a través de las reacciones malolácticas. Su impacto depende de la concentración inicial de ácido málico, que puede variar de 1 g/L a más de 6-7 g/L en los vinos más ácidos. La cantidad de ácido cítrico degradado es mucho menor que la de ácido málico. Sin embargo su incidencia es sig–7– LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA La insuficiente microflora indígena es compensada por la adición masiva de una suspensión muy concentrada de O. oeni. Sin embargo, hoy en día la actitud ha cambiado y los starters malolácticos se agregan cuando el enólogo lo desea. A menudo, se usan todavía después de la FA, cuando los azúcares han sido fermentados por las levaduras. En estas condiciones no hay riesgo de competición con la biomasa activa de levadura y, por lo tanto, existe menos riesgo de producción de acidez volátil a causa de una fermentación heteroláctica. Generalmente se adicionan cuando la separación entre FA y FML se hace demasiado grande. Si el starter se implanta correctamente, las cepas seleccionadas continuarán con la FML y dominarán las BL indígenas. El medio es invadido por el starter, y las bacterias indígenas indeseadas, si están presentes, se encuentran superadas en número. Las cepas esporuladas, aunque realmente no están descartadas, no pueden crecer, lo que limita su impacto negativo. Por otra parte, como en el caso de las LSA (levaduras secas activas) en la FA, está demostrado que el impacto final sobre las calidades sensoriales depende de la cepa de O. oeni elegida para el starter. Por lo tanto, una vez que mejoren los conocimientos sobre producción de aromas por las BL, se espera que el enólogo elija el starter de acuerdo con el tipo de vino. nificativa ya que se produce ácido acético y diacetilo. El diacetilo, con su aroma a mantequilla, desempeña un papel importante en los cambios inducidos por la FML, aumentando la complejidad aromática y gustativa del vino. Su umbral de alarma depende de la estructura del vino, con concentraciones más altas, el aroma a mantequilla no siempre es aceptado por los consumidores. El nivel de diacetilo se supone que depende de la cepa, pero es probablemente más dependiente de las condiciones de la FML, las cuales determinan la velocidad de crecimiento y la población total. A partir del ácido cítrico y de otros substratos, las BL liberan otros compuestos cetónicos en el medio. Son moléculas muy activas que están implicadas en reacciones químicas con aminoácidos libres y que producen rápidamente compuestos con olores fuertes a pH ácidos y temperaturas bajas. (Tabla III). Aunque no ha sido completamente comprobado todavía, es razonable asumir sus contribuciones al aroma del vino. Algunas de estas moléculas tienen un umbral de impacto sensorial muy bajo. TABLA III: Lista de los componentes producidos por reacciones químicas entre cetonas y cisteina Heterociclos: pirazinas, alquil pirazinas, tiazoles, etc.: sulfuroso, palomitas de maíz, almendras, tostado, asado, fruta madura Sin embargo, a diferencia de las LSA, el principal problema con los starters malolácticos es su fiabilidad. Las BL tienen que ser viables para degradar el ácido málico. Cuando el starter es adicionado al vino el estrés es tan grande que sólo una parte de la población puede sobrevivir, por eso a veces la inoculación falla. La eficacia y fiabilidad de los starters malolácticos han mejorado de forma importante en los últimos 10 años, pero siguen siendo imprevisibles en los vinos más difíciles, que es precisamente donde son necesarios. Heterociclos oxidados: 2-furano metanotiol, tiofene-2-tiol café, caucho Más importante: formación de 2-acetil tiazol, 2-acetil-2-tiazolina Fuerte olor a palomitas de maíz, almendras. Entre las numerosas rutas bioquímicas que producen compuestos olorosos, es significativo el metabolismo de la metionina. Los productos finales son compuestos con bajos puntos de ebullición que contienen azufre, tales como metanotiol y dimetil sulfuro, así como metional, 3-metilsulfonilpropanol y ácido 3-metilsulfonilpropiónico, que se caracterizan por olores a chocolate y a asado. Durante la FML, O. oeni aumenta sus concentraciones, las cuales al final superan sus umbrales sensoriales. Los resultados actuales no muestran diferencias significativas en función de la cepa, es necesario evaluar la posible pertenencia de este carácter en la selección. No obstante, se necesita aún más trabajo para identificar las rutas bioquímicas que cambian la composición del vino durante la FML. Hasta ahora, la selección de cepas de O. oeni para los starters ha sido un trabajo que ha llevado mucho tiempo, y que ha consistido en el aislamiento de colecciones de bacterias, seguido de varios pasos para enfocar su adaptabilidad al ambiente del vino y luego el impacto sensorial. Los criterios más importantes son la tolerancia a la acidez y al etanol alto. Obviamente, estos factores de selección no pueden representar completamente las constricciones tan complejas del vino. Esto explica el porqué, incluso cuando las condiciones básicas de temperatura, pH y anhídrido sulfuroso son óptimas, los starters pierden su viabilidad y actividad. Uso y selección de starters malolácticos Los starters malolácticos son la biomasa concentrada de cepas de O. oeni seleccionadas entre colecciones de cepas aisladas. El primer y único motivo para el uso de starters malolácticos en los años 80 era forzar la degradación del ácido málico cuando ésta no ocurría espontáneamente. –8– Bacterias lácticas indígenas y bacterias lácticas seleccionadas La biología molecular aplicada a BL indígenas y starters malolácticos minantes genéticos de la respuesta de la célula y entender la estrategia de la célula. Esto conducirá a los marcadores genéticos pertinentes que serán usados en el screening de los candidatos a la colección de O. oeni. Este enfoque será mucho más rápido y preciso que la cascada de pruebas de laboratorio basadas en la tolerancia hacia los inhibidores mejor conocidos, acidez, etanol y dióxido de sulfuro. Se presume que serían usados varios marcadores genéticos para eliminar las cepas menos interesantes y continuar la selección con un número limitado, todos reconocidos por ser los que mejor sobreviven al estrés de la inoculación. Los métodos usuales de biología molecular, tales como hibridación DNA/DNA, PCR y fingerprinting, han proporcionado nuevas herramientas a la microbiología del vino y especialmente a las BL del vino. Ahora es posible identificar, a nivel de especie y de cepa, las BL aisladas de mostos y vinos. Estos métodos se usan de forma rutinaria para detectar bacterias esporuladas (y levaduras) durante la vinificación y la crianza, y para el análisis microbiológico final antes del embotellado. Son también útiles en la industria de starters malolácticos. Al final, se deberían realizar investigaciones sobre los metabolismos de los substratos del vino que tienen una influencia significativa sobre la composición, también a nivel molecular. En consecuencia, los marcadores genéticos unidos a las relativas rutas bioquímicas serían agregados a los otros, para aumentar no sólo la fiabilidad de los starters, sino también su interés práctico en la elaboración de vinos de calidad (Tabla IV). En el proceso de selección de starters malolácticos, el primer paso es la identificación de los microorganismos aislados después del cultivo en placas nutrientes. Las cepas de O. oeni pueden ser identificadas a través de la hibridación DNA/DNA usando una prueba específica de hibridación de la colonia, o mediante PCR después de aislar el clon. Una vez creada la coleccion de O. oeni, hay que controlar la posible actividad productora de aminas biógenas de cada cepa. La prueba se realiza con la hibridación DNA/ DNA usando secuencias de las descarboxilasas de aminoácidos (descarboxilasa de la histidina y descarboxilasa de la tirosina), o con PCR utilizando los correspondientes primers. TABLA IV : Futuras investigaciones necesarias sobre Oenococcus oeni CEPAS INDÍGENAS CEPAS INDÍGENAS Ecología: Mejora de la adaptabilidad: Evaluación de la diversidad en las especies de O. Oeni. Selección en función de la tolerancia al vino – marcadoRelación entre diversidad y tecnología de la vid y el vino. res genéticos. Cuando las cepas no deseadas han sido eliminadas, las que han sido conservadas para la colección final se tipifican. El mejor método en el caso de O. oeni es el patrón de restricción obtenido después de la digestión con enzimas de restricción NotI y la electroforesis en gel de campo pulsante. Hasta ahora se admite que cada cepa está caracterizada por su perfil. Esta propiedad se usa también para controlar la eficacia del starter durante la FML. El patrón de restricción de la biomasa obtenido en el vino en fermentación se compara con el perfil del starter. Entonces es posible concluir si la cepa se encuentra implantada o no. Optimización del proceso industrial. Fisiología y metabolismos: Efecto sobre la calidad sensorial: Transformaciones de los componentes del vino (aromas, macromoléculas, polifenoles) a nivel molecular. Genética de los principales mecanismos de adaptación a las condiciones del vino. Por el momento, los conocimientos sobre genética de las BL del vino se utilizan solamente para estas aplicaciones. Sin embargo, las actuales investigaciones sobre los grupos genómicos de O. oeni deberían dar lugar en el futuro a nuevas orientaciones en la selección de cepas. La mayor parte de la investigación realizada actualmente sobre el genoma de O. oeni se centra en la adaptación de las bacterias a las rigurosas condiciones del vino. Por supuesto, en la supervivencia y adaptación de las bacterias después de la inoculación están implicados varios mecanismos. Los objetivos de la investigación son encontrar los deter–9– Selección en función de la producción de compuestos del aroma o precursores –factores asociados a metabolismos y a claves genéticas. LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA EL ATRIBUTO MANTECOSO DEL VINO – DIACETILO. CONVENIENCIA, ALTERACIÓN Y OTROS. MANTEQUILLA O NO MANTEQUILLA Eveline J. BARTOWSKY y Paul A. HENSCHKE The Australian Wine Research Institute PO Box 197 Glen Osmond, SA, 5064 Australie Eveline.Bartowsky@awri.com.au Resumen Aspectos sensoriales del diacetilo El diacetilo es un importante metabolito producido por las bacterias lácticas (BL), incluyendo las BL asociadas al vino, Oenococcus oeni, especie preferida para la inducción de la fermentación maloláctica (FML). El diacetilo aporta aroma y sabor mantecoso a muchos alimentos y bebidas fermentados. En el vino, el diacetilo tiene implicaciones importantes sobre el estilo del mismo. Los factores que pueden afectar la formación y concentración de diacetilo en el vino incluyen las cepas de bacterias presentes, los parámetros físico-químicos del vino (pH, temperatura, ácido cítrico, anhídrido sulfuroso, aireación) y la presencia de lías de levadura. Manejando varias condiciones de la vinificación, es posible manejar la concentración de diacetilo de un vino. Cuando se encuentra en altas concentraciones (que exceden 5-7 mg/L), el diacetilo es considerado por muchos como indeseable en el vino, mientras que alrededor de 1-4 mg/L, y dependiendo del estilo y tipo de vino, se considera que contribuye a un carácter ‘mantecoso’ o de caramelo ‘butterscotch’ deseable (Rankine et al., 1969; Davis et al. 1985). La percepción sensorial del diacetilo en el vino depende también, en gran medida, de la presencia de otros compuestos que encontramos en el vino (Bartowsky et al., 2002a, b). Se ha demostrado que la percepción sensorial del diacetilo está modificada o influenciada por la edad, el estilo y el origen del vino, así como por la presencia de otros compuestos aromáticos del vino. Metabolismo del diacetilo Factores de Vinificación que pueden afectar al contenido de diacetilo El diacetilo, cuyo nombre científico es 2, 3-butanodiona, se asocia al carácter ‘mantecoso’ del vino y se forma como un metabolito intermedio en la descarboxilación reductora del ácido pirúvico a 2,3-butanodiol Las levaduras también contribuyen al contenido de diacetilo del vino, pero debido a las condiciones altamente reductoras que existen al final de la fermentación, la concentración de diacetilo es, a menudo, inferior a su umbral de detección (Martineau et al., 1995a). La formación y degradación del diactetilo están estrechamente ligadas al crecimiento de bacterias ML y al metabolismo del azúcar, del ácido málico y del cítrico. Una variedad de factores, incluyendo algunos de los que están sujetos al control por parte del elaborador, pueden afectar de manera considerable la concentración de diacetilo en el vino. Éstos se resumen en la Tabla 1. Cepa de Bacteria Láctica El desempeño, desarrollo y metabolismo de una cepa O. oeni son muy dependientes de la composición química del vino. No obstante, si nos basamos en las investigaciones llevadas a cabo bajo diferentes condiciones en diversas regiones vitivinícolas, se observa que algunas – 11 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA TABLA 1: Factores que pueden afectar al contenido de diacetilo del vino (adaptado de Martineau et al., 1995b) Factores de Vinificación Efecto sobre la concentración de diacetilo y/o la percepción sensorial Cepa de bacteria láctica La producción de diacetilo varía según la cepa de O. Oeni. Tipo de vino Vino tinto versus vino blanco favorece el diacetilo Tasa de inoculación de las bacterias lácticas Una menor tasa de inoculación (104 vs 106 ufc/ mL) favorece la producción de diacetilo Contacto con el cultivo de levaduras activas (lías) El contacto con las levaduras reduce el contenido de diacetilo del vino Contacto del vino con aire durante la FML El oxígeno favorece la oxidación del (-acetolactato a diacetilo Contenido de Anhídrido sulfuroso • El SO2 se une al diacetilo el cual se vuelve sensorialmente inactivo Tasa de inoculación de las bacterias lácticas La dosis de inoculación de las bacterias afecta notablemente al tiempo para inducir y completar la FML. Los actuales cultivos comerciales proporcionan generalmente 0.5 - 5 x 106 ufc/mL bacterias cuando se preparan y se inoculan como se recomienda. Sin embargo, en el momento de la inoculación se produce, a menudo, una disminución transitoria en la población viable debido a la adaptación retrasada a las condiciones químicamente ‘rigurosas’ del vino (por ejemplo, bajo pH y altas concentraciones de sulfito y etanol). El crecimiento bacteriano puede acercarse a 108 ufc/mL en condiciones favorables. La degradación significativa de malato no se observa hasta que la población viable alcanza 0.5 - 1 x 106 ufc/mL, y una alta tasa de degradación se asocia con un cultivo de rápido crecimiento (Gockowiak and Henschke, 2003). Muchos investigadores han observado (Lonvaud-Funel et al., 1984; Krieger et al., 2000) que una tasa de inoculación más baja, como 104-105 ufc/mL puede dar como resultado una mayor acumulación de diacetilo en el vino. Las observaciones elaboradas a partir de un ensayo realizado en bodega muestran esto con una cepa O. oeni V y un vino Pinot Noir (Figura 2). Después de completada la FML, el vino inoculado con 2 x 104 ufc/mL bacterias tuvo un incremento de ocho veces en el contenido de diacetilo, mientras que el vino inoculado a 2 x 106 ufc/mL el diacetilo sólo se incrementó tres veces. El elevado contenido final de diacetilo del vino inoculado con la dosis más baja se debe, probablemente, al extenso período de crecimiento y de fermentación. • La adición de SO2 inhibe la actividad de levaduras/ bacterias y estabiliza el contenido de diacetilo en el momento de la adición Concentración de ácido cítrico Favorece la producción de diacetilo, sin embargo, también se produce ácido acético Temperatura de la FML 18°C versus 25°C puede favorecer la producción de diacetilo pH del vino al que se lleva a acabo la FML Concentración de azúcar fermentable En este ejemplo, también se muestra el impacto de las lías de levadura y el contacto extendido con el vino sobre la concentración de diacetilo. Puesto que la levadura vínica Un pH más bajo puede favorecer la producción de diacetilo FIGURA 1: El metabolismo del diacetilo con cuatro cepas comerciales de Oenococcus oeni durante la fermentación maloláctica en el vino Cabernet Sauvignon y Chardonnay de similar composición química (12.5-13% v/v de alcohol, pH 3.5, 2.5 g/L de ácido málico, 0.2 g/L de ácido cítrico). Las flechas indican el momento en el cual todo el ácido málico fue metabolizado completamente. Una información conflictiva; el azúcar residual puede reducir la producción de diacetilo Cabernet Sauvignon cepas de bacterias malolácticas (ML) producen una mayor concentración de diacetilo residual en los vinos que otras cepas. En el ejemplo que se muestra en la Figura 1, se ha realizado un seguimiento del metabolismo del diaceilo durante y después de la FML en un vino Cabernet Sauvignon y Chardonnay de similar composición química con cuatro cepas comerciales de O. Oeni. Existe una variación en la concentración máxima de diacetilo con cada una de las cepas de O. oeni. Se constata también que la concentración es mayor en los vinos tintos. Chardonnay Diacetilo (mg/L) 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 30 0 25 10 20 30 Días después de la inoculación Control – 12 – V III VI VII 40 50 60 70 80 El atributo mantecoso del vino – Diacetilo. Conveniencia, alteración y otros. Mantequilla o no mantequilla ento puede no ocurrir hasta después del agotamiento del ácido málico. Concentraciones máximas más elevadas de diacetilo están asociadas, generalmente, a una elevada concentración de ácido cítrico, sin embargo, la magnitud de esta correlación depende de muchos otros factores. La adición de ácido cítrico al mosto de uva o al vino con el objetivo de evaluar la acumulación de diacetilo debería abordarse con cuidado. No obstante, una adición de ácido cítrico al vino puede ser acompañada por un incremento de diacetilo, también es posible que se formen de otros metabolitos gustativos, especialmente ácido acético (Henick-Kling and Park, 1994). La adición de ácido cítrico afectará la acidez titulable (AT) y como algunas levaduras también son capaces de metabolizar este ácido, podrían darse cambios inesperados en la concentración de diacetilo y de AT. FIGURA 2: Contenido de diacetilo del vino Pinot Noir con fermentación maloláctica conducida por una cepa comercial de Oenococcus oeni V con dos tasas de inoculación diferentes (adaptado de Krieger et al., 2000). 5 3 2 x 10 4 Inoculo 2 x 10 6 (ufc/mL) 2 1 0 Antes FML Final FML Después contacto sobre lias Saccharomyces cerevisiae es capaz de sintetizar el diacetilo así como de degradarlo, la presencia de lías de levadura, especialmente cuando están en agitación, puede reducir más el contenido de diacetilo del vino. Temperatura de la FML A pesar de que las bacterias ML tienen una temperatura óptima de desarrollo en el laboratorio, de aproximadamente 27ºC, el crecimiento en el vino es restringido a un rango de 15 - 25ºC con una temperatura óptima para la mayoría de las cepas de O. oeni alrededor de 20 - 22ºC. La FML conducida a temperaturas más bajas, como 18ºC en lugar de 25ºC, tiende a ser más lenta pero los vinos acumulan una concentración más alta de diacetilo (Figura 3). Impacto del aire (oxígeno) sobre la formación de diacetilo La fermentación maloláctica en el vino es un proceso esencialmente anaeróbico, sin embargo, la conversión del _-acetolactato en diacetilo es una descarboxilación no enzimática, que es acelerada por la presencia de oxígeno. A pesar de que la degradación de los ácidos málico y cítrico y el crecimiento celular, no son muy afectados por la exposición limitada al aire, la cantidad de diacetilo que puede acumularse en el vino con o sin exposición al aire puede variar mucho (formación de 2 mg/L de diacetilo bajo condiciones anaeróbicas y de 12 mg/L bajo condiciones semi-anaeróbicas; Nielsen and Richelieu, 1999). FIGURA 4: Duración de la fermentación maloláctica (días) y su efecto sobre la concentración final de diacetilo en tres vinos Cabernet Sauvignon (2000) provenientes de regiones vitícolas diferentes e inoculados con la cepa VII de O. oeni (McCarthy, 2000) (A) y en un vino Chardonnay (Langhorne Creek, 2001; pH 3.3, AT 5.8 g/L, 12.5% v/v alcohol, 2.1 g/L de ácido málico, 0.2 g/L de ácido cítrico) con cinco tratamientos de FML (B). Contenido de ácido cítrico del vino 43 El ácido cítrico, un ácido orgánico derivado de la uva, está comúnmente presente en el vino en un rango de 0.10.7 g/L y la mayoría de las cepas de O. oeni son capaces de metabolizar este ácido durante la FML. El metabolismo del ácido cítrico es normalmente retrasado en relación con el del ácido málico, y en consecuencia su agotami- A Diacetilo (mg/L) Diacetilo (mg/L) 4 FIGURA 3: Concentración de diacetilo en un vino químicamente definido (11% v/v etanol, pH 3.5) durante una FML conducida por cepas VII y VIII de O. oeni (Hart, 1997). 7 14 20 24 0 3 7 14 20 Diacetilo (mg/L) Diacetilo (mg/L) B 3 24 Días después de la inoculación Temperatura de fermentación 18°C 22 Eden Valley Coonawarra Swan Hill pH 3,5, TA 7,1 g/L alcohol 12,2% acido málico 1,9 g/L pH 3,4, TA 8,0 g/L alcohol 13,5% acido málico 2,4 g/L pH 3,4, TA 8,9 g/L alcohol 13,7% acido málico 1,7 g/L Cepa VIII Cepa VII 7 6 5 4 3 2 1 0 0 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 35 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 9 14 9 no-MLF 25°C – 13 – 35 MLF natural I II Cepas ML III IV LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA suficiente SO2 para prevenir una actividad microbiana adicional. El uso de ácido cítrico para aumentar el contenido de diacetilo involucra el riesgo de producción de ácido acético, y el contacto limitado con el aire también requiere un gran cuidado. Puesto que es difícil alcanzar el nivel deseado de impacto a través del proceso de FML, realizar un corte con una porción de vino elaborado con alto contenido de diacetilo facilitaría alcanzar el nivel requerido. Un bajo contenido de diacetilo puede alcanzarse utilizando una cepa adecuada inoculada durante la última etapa de la fermentación alcohólica, y si es necesario manteniendo el vino con las lías en agitación hasta que el diacetilo se vuelva indetectable. Anhídrido sulfuroso y diacetilo El anhídrido sulfuroso (SO2) tiene funciones complejas en el proceso de elaboración del vino, que incluyen las propiedades antioxidantes y antimicrobianas. Es capaz de interactuar con los compuestos carbonilos incluyendo el acetaldehido y el diacetilo de una manera reversible. En presencia de SO2, la concentración de diacetilo libre en el vino disminuye, sin embargo, mientras el contenido de SO2 decrece, como por ejemplo durante el añejamiento, la proporción de diacetilo libre se incrementará nuevamente, incrementando de esta manera su impacto sensorial (Nielsen and Richelieu, 1999). Duración de la FML Reconocimientos La duración de la FML depende de numerosos factores incluyendo la cepa de bacteria, la composición química del vino y la temperatura del vino. Los vinos que sobrellevan una FML prolongada, por cualquier razón, tienden a tener un mayor contenido de diacetilo. Tres vinos Cabernet Sauvignon provenientes de diferentes regiones vitícolas de Australia fueron inoculados para la FML con cepas comerciales de O. oeni VII y el contenido de diacetilo fue determinado al final de la FML (Figura 4A). Un vino Chardonnay que sufrió una FML con cinco cepas de bacterias ML diferentes, mostró una variación en la duración de la FML, así como diferentes concentraciones finales de diacetilo (Figura 4B) (Bartowsky et al, 2002a). En ambos ejemplos, la concentración más elevada de diacetilo se observó en los vinos que tuvieron la duración de FML más larga. Este artículo ha sido adaptado de una revisión reciente sobre este tema [Bartowsky, E.J. and Henschke, P.A. (2004) The ‘buttery’ attribute of wine - diacetyl - desirability, spoilage and beyond. Int. J. Food Microbiol. 96, 235252]. Es asimismo una versión condensada de los procedimientos de un artículo presentado en la 16th Entretiens Scientifiques Lallemand en Porto, 2004. Agradecemos a Jane McCarthy, Dr Peter Costello, Tim Burvill, Allen Hart y Helen McCarthy por sus contribuciones al programa FML del AWRI. Al Prof. Peter Høj se le agradece por apoyar este proyecto y al Prof. Sakkie Pretorius por sus valiosos comentarios en este manuscrito. Este proyecto es apoyado por elaboradores de vino y viticultores de Australia mediante su cuerpo de inversión, la Grape and Wine Research and Development Corporation, con fondos del Gobierno Australiano. Resumen Bibliografía Hay numerosos factores que pueden influenciar el contenido de diacetilo y, en consecuencia, el carácter ‘mantecoso’ del vino. Por lo tanto, para lograr un nivel determinado de ‘mantecoso’, es necesario combinar un número de factores que son favorables o no para el contenido de diacetilo. El punto de partida es elegir las cepa de bacteria ML más apropiada para llevar a cabo la FML, y considerar, a continuación, la composición del vino y las condiciones de la FML. Bartowsky, E. J., P. J. Costello and P. A. Henschke. 2002a. Management of malolactic fermentation – wine flavour manipulation. Aust. & N. Z. Grapegrower and Winemaker. 461a:7-12. Bartowsky, E. J., I. L. Francis, J. R. Bellon and P. A. Henschke. 2002b. Is buttery aroma perception in wines predictable from diacetyl concentration? Aust. J. Grape Wine Res. 8:180-185. Bartowsky, E. J. and P. A. Henschke. 2004. The “buttery” attribute of wine – diacetyl – desirability, spoilage and beyond. Int. J. Food Microbiol. 96, 235-252. El incremento del impacto del diacetilo ‘mantecoso’ de un vino puede lograrse utilizando un inóculo en concentración más baja de lo normal de una cepa altamente productora de diacetilo en ausencia de levaduras activas, como por ejemplo después del trasiego del vino. Luego, el contenido de diacetilo debe ser estabilizado mediante filtración para remover las bacterias (y levaduras si las hay) a fin de prevenir un remetabolismo, y la adición de Davis, C. R., D. Wibowo, R. Eschenbruch, T. H. Lee and G. H. Fleet. 1985. Practical implications of malolactic fermentation: a review. Am. J. Enol. Vitic. 36:290-301. Hart, A. 1997. The influence of malolactic fermentation on the concentration of diacetyl by individual strains of – 14 – El atributo mantecoso del vino – Diacetilo. Conveniencia, alteración y otros. Mantequilla o no mantequilla Oenococcus oeni. Oenology Honours thesis. Adelaide, Australia: The University of Adelaide. Henick-Kling, T. and Y. N. Park. 1994. Considerations for the use of yeast and bacterial starter cultures: sulfur dioxide and timing of inoculation. Am. J. Enol. Vitic. 45:464469. Gockowiak, H. and P. A. Henschke. 2003. Interaction of pH, ethanol concentration and wine matrix on induction of malolactic fermentation with commercial “direct inoculation” starter cultures. Aust. J. Grape Wine Res. 9:186193. Krieger, S. A., E. Lempere and M. Ernst. 2000. Management of malolactic fermentation with regard to flavour modification. Session 3B, Flavour modification in the winery: Microbiological. In: Proceedings of 5th International Symposium on Cool Climate Viticulture and Oenology 1620 January, 2000, Melbourne, Australia. Lonvaud-Funel, A., C. Zmirou and F. Larue. 1984. Le métabolisme de l’acide citrique par les bactéries lactiques de la fermentation malolactiques des vins. Sci. Aliments. 4:81-85. Martineau, B., T. E. Acree and T. Henick-Kling. 1995a. Effect of wine type on the detection threshold for diacetyl. Food Res. In. 28:139-143. Martineau, B., T. Henick-Kling and T. E. Acree. 1995b. Reassessment of the influence of malolactic fermentation on the concentration of diacetyl in wines. Am. J. Enol. Vitic. 46:385-388. Nielsen, J. C. and M. Richelieu. 1999. Control of flavor development in wine during and after malolactic fermentation by Oenococcus oeni. Appl. Environ. Microbiol. 65:740-745. Rankine, B. C., J. C. M. Fornachon and D. A. Bridson. 1969. Diacetyl in Australian dry red wines and its significance in wine quality. Vitis. 8:129-134. – 15 – – 16 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA APTITUD DE CEPAS SELECCIONADAS Y SALVAJES DE OENOCOCCUS OENI PARA INDUCIR LA FML EN VINOS CON CONDICIONES ADVERSAS Francesca NANNELLI, Flavia CREATINI, Iolanda ROSI1 Departamento de Biotecnología Agraria Università degli Studi di Firenze Via Donizetti, 6, 50144 Firenze, Italia 1Autor de referencia: rosiol@unifi.it Introducción La fermentación maloláctica (FML) tiene importantes consecuencias sobre la calidad del vino, y es por ello que los esfuerzos de los enólogos están dirigidos a tener un mayor control del cómo y cuándo tiene lugar la fermentación. La introducción del uso directo de bacterias Oenococcus oeni en el vino ha simplificado de forma importante la gestión de esta fermentación [1, 2]. No obstante, las cepas de bacterias inoculadas no siempre son capaces de adaptarse a las difíciles condiciones fisico-químicas y nutricionales presentes en el vino. La selección de cepas de bacterias capaces de tolerar mejor las adversas propiedades fisicoquímicas del vino continúa en evolución. os y macromoléculas) que pueden, en general, estimular, inhibir o tener un efecto insignificante sobre el metabolismo de las bacterias ML [3-5]. Protocolo experimental Un mosto de uva obtenido con Sangiovese del 2003 se inoculó con tres diferentes cepas de S. cerevisiae : 25 g/hL de BM45 y de la levadura SLO rehidratada y 2% (v/v) de un cultivo de la cepa RP (de nuestra colección de levaduras del vino) preparada 24 horas antes. Las cepas salvajes de O. oeni se hicieron crecer durante cinco días a 28°C en un medio líquido de mosto de uva, pH 4.5; se uso el 2% (v/v) del cultivo para inocular los vinos. La cepa Alpha (Uvaferm) de bacterias malolácticas O. oeni fue usada como testigo. Ácido sucínico (g/L) Ácido cítrico (g/L) Ácido málico (g/L) Nitrógeno a-amínico (mg/L) SO2 libre (mg/L) SO2 total (mg/L) pH Etanol (%) Fructosa (g/L) Glucosa (g/L) En nuestro estudio, se evaluó la capacidad de 10 cepas salvajes de O. oeni para llevar a cabo la FML en condiciones adversas. Estas cepas pertenecen a nuestra coResultados lección de bacterias lácticas, aisladas a lo largo de cerca 20 años de vinos de variedades y areas de producción Los vinos se caracterizaron, en función de la cepa de lediferentes. Se incluyó también en este estudio un cultivadura, por presentar diferentes condiciones fisico-quívo comercial de O. oeni con fines comparativos. Los micas y nutricionales (Tabla 1), más o menos inhibidoras vinos utilizados fueron obtenidos del mismo mosto de de las bacterias ML. Los vinos, de hecho, eran fundamenuva fermentado con tres diferentes TABLA1: Análisis químico de los vinos Sangiovese en el momento de la inoculación de bacterias malolácticas cepas de Saccharomyces cerevisiae, por lo que se pudo obtener también información sobre la compatibilidad VINOS entre bacterias malolácticas y levaduras del vino. Las levaduras pueden RP 0,25 0,47 14,00 3,50 27,50 6,80 96,00 1,20 0,47 1,51 reducir los nutrientes y los factores de crecimiento requeridos por las SLO 0,07 0,55 15,40 3,50 24,30 5,00 69,00 1,00 0,30 1,56 bacterias ML y pueden liberar meta- BM45 0,13 0,89 15,20 3,50 35,80 7,70 55,00 1,24 0,40 1,52 bolitos bioactivos (SO2, ácidos gras– 17 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA resistencia a las condiciones adversas de los vinos). En efecto, se comportan como los cultivos comerciales de O. oeni, cuya producción prevé la inducción de la síntesis de proteínas de estrés, para dar una mayor resistencia a las células inoculadas directamente en el vino [6]. talmente diferentes a causa del etanol (iban desde 14 a 15.4 %), del SO2 total y del tenor de nitrógeno ␣-amínico. Por lo tanto, los cultivos de bacterias encontraron composiciones diferentes en el medio, lo que influyó sobre su desarrollo y sobre su actividad metabólica. Los vinos fermentados con cepas de levadura BM45 eran particularmente diferentes. La evolución de las células viables y la degradación del ácido L-málico mostraron que en los vinos RP, existían varias combinaciones (cambios en la viabilidad y en la degradación del ácido málico) en función de las diferentes cepas bacterianas. Los vinos obtenidos con las levaduras SLO y BM45 inhibieron de forma más importante la mayoría de las cepas inoculadas. Esta inhibición se advirtió a través de una progresiva e importante pérdida de viabilidad de las células. Sólo cuatro cepas y la Alpha mantuvieron un nivel de viabilidad de 106-105 ufc/mL. Según trabajos precedentes [4], estos resultados confirman que el tenor de etanol es el factor discriminante de la viabilidad temprana de las células después de la inoculación, de la capacidad de crecimiento y de la actividad maloláctica de las cepas estudiadas. FIGURA 1: Células viables (%) de diferentes cepas de O. oeni 30 minutos después de la inoculación en el vino BM45 SLO BM45+AA 95 Bacterias viables (%) 90 85 80 75 70 65 60 In A o cf c u l u/ u m m L 6x10 6 B C D E F G H I L Alfa 8x10 6 2x106 Cepa 4x10 6 4x10 6 6x106 6x10 6 2x10 6 8x106 6x10 6 8x10 6 Para comprender si, junto con la inhibición causada por el etanol y el SO2 total, las cepas bacterianas sufrieron el efecto negativo de otros metabolitos producidos por las células de levadura durante la fermentación alcohólica, se determinó en los vinos el tenor de algunos compuestos volátiles. La composición de los vinos en compuestos volátiles fue relacionada con la degradación del ácido Lmálico por las bacterias ML, mediante la aplicación de un análisis de regresión PLS (Figura 2). Los resultados, expresados como “loadings” del modelo PLS, muestran En función de la cepa bacteriana y del vino en el que fue inoculada, se pudo observar una caída inmediata de la población de bacterias. Sin embargo, la supervivencia bacteriana después de la inoculación fue independiente del número de células viables adicionadas con la inoculación (Figura 1) – 18 – Ácido decanoico Ácido octanoico 2-feniletanol Ácido hexanoico Laurato de etilo Acetato de 2-feniletilo Ácido butírico Decanoato de etilo Octanoato de etilo Hexanoato de etilo Acetato de isoamilo En el vino obtenido con la cepa de levadura RP, 10 de las 11 cepas de FIGURA 2: Relación entre los compuestos volátiles del vino antes de la FML y el tenor de ácido L-málico bacterias mantuvieron elevados niresidual después de la FML:“loadings” del PLS veles de viabilidad (90-100%). Por 1,2 otra parte, en los vinos obtenidos con BM45 y con las levaduras SLO, 1 caracterizados por tener una com0,8 posición más inhibidora, la viabilidad celular de las cepas bacterianas 0,6 mostró un amplio rango de variación: seis cepas de las 11 manifes0,4 taron una disminución inmediata y drástica de la viabilidad celular. 0,2 La adición de aminoácidos al vino BM45 pareció estimular la supervi0 vencia de aquellas cepas que habían sido inhibidas en mayor medida por -0,2 su contacto con el vino. Esto lleva a la hipótesis de que las cepas salva-0,4 jes que presentan mayor viabilidad (cinco de las 11 son capaces de sin-0,6 tetizar de forma natural factores de Ácido L-málico RP 100 Aptitud de cepas seleccionadas y salvajes de Oenococcus oeni para inducir la FML en vinos con condiciones adversas Bibliografía que un tenor más alto en los vinos de acetato de isoamilo, acetato de 2-feniletilo, ácidos octanoico y decanoico y 2-feniletanol son el resultado de una reducción de la capacidad de las bacterias ML para transformar el ácido L-málico. [1] Krieger, S. 1993. The use of active dry malolactic starter cultures. Australian and New Zealand Wine Industry Journal. 8:56-62. [2] Nielsen, J. C., E. Pilatte and C. Prahl. (1996) Maîtrise de la fermentation malolactique par l’ensemencement direct du vin. Revue Française d’Œnologie. 160:12-15. Otro aspecto que puede estar implicado en los fenómenos de interacción entre levaduras y bacterias está relacionado con la composición nitrogenada de los vinos examinados. Los aminoácidos son importantes para el crecimiento de las cepas de O. oeni, como fuente de nitrógeno y carbono [7], en particular isoleucina, ácido glutámico, triptófano y arginina. Las tres cepas de levadura tienen diferentes necesidades en relación a la nutrición nitrogenada. Al comparar el perfil aminoacídico de los vinos antes del inóculo de bacterias ML, se observa que el vino BM45, de acuerdo con su menor tenor de nitrógeno amínico, presenta el más bajo tenor de aminoácidos. [3] Lonvaud-Funel, A., A. Joyeux and C. Dessens. 1988. Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabolism. Journal of the Science of Food and Agriculture. 44:183-191. [4] Capucho, I. and M. V. San Romao. 1994. Effect of ethanol and fatty acids on malolactic activity of Leuconostoc oenos. Applied Microbiology and Biotechnology. 42:391-395. [5] Alexandre, H., P. J. Costello, F. Remize, J. Guzzo and M. Guillox-Benatier. 2004. Saccharomyces cerevisiae Oenococcus oeni interactions in wine: current knowledge and perspectives. International Journal of Food Microbiology. 93:2, 141-154. Considerando los requisitos nutricionales de las cepas de O. oeni, se adicionó una solución de aminoácidos al vino BM45. Se pudo notar en todas las cepas una ligera estimulación del crecimiento bacteriano. Al mismo tiempo tuvo lugar también una estimulación de la degradación del ácido málico. [6] Guzzo, J., M. P. Jobin, F. Delmas, L. C. Fortier, D. Garmyn, R. Tourdot-Marechal, B. Lee and C. Diviès. 2000. Regulation of stress response in Oenococcus oeni as a function of environmental changes and growth phase. International Journal of Food Microbiology. 55:27-31. Conclusión Este estudio ha confirmado que la aptitud para llevar a cabo la FML en condiciones adversas está estrechamente relacionada con las propiedades fisiológicas de las cepas de O. oeni inoculadas. Entre las 11 cepas estudiadas, sólo una fue capaz de permanecer viable y activa incluso en condiciones fisico-químicas y nutricionales muy difíciles. [7] Saguir, F. M. and M. C. Manca de Nadra. 1997. Growth and metabolism of Leuconostoc oenos in synthetic media. Microbiol. Aliment. Nutr. 15:131-138. [8] Arnink, K., L. Conterno and T. Henick-Kling. 2002. Studies on yeasts - bacteria interaction in wine. Lallemand Technical Meetings Symposium 10, Biarritz, April 2002. 5-14. Las otras cepas de este estudio estuvieron influidas de forma importante por la producción de metabolitos bioactivos de las levaduras y por un tenor de nitrógeno insuficiente provocado por las cepas de levadura. Por otra parte, algunas cepas realizaron la FML sin crecimiento en el vino, sólo manteniéndolo, como previamente había ya sido observado por otros autores [8]. Están en marcha más trabajos para buscar nuevas cepas de bacterias malolácticas y para estudiar su compatibilidad con las cepas de levadura usadas en la conducción de la fermentación alcohólica, con el objetivo de mejorar los resultados de la FML incluso en vinos con condiciones difíciles. – 19 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA IMPACTO DE LOS AMINOÁCIDOS AZUFRADOS Y DEL GLUTATIÓN SOBRE EL CRECIMIENTO DE OENOCOCCUS OENI Y SOBRE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Doris RAUHUT1, Magdalena GAWRON-SCIBEK2, Beata BEISERT1, Marta KONDZIOR2, Ralf SCHWARZ3, Helmut KÜRBEL1, Manfred GROSSMANN1 y Sibylle KRIEGER4 1Departamento de Microbiología y Bioquímica Instituto Público de Investigación Geisenheim Von Lade Strasse 1, D-65366 Geisenheim, Alemania Doris.Rauhut@fa-gm.de 2Universidad de Warmia y Mazury, Facultad de Ciencias de los Alimentos, Instituto de Biotecnología de los Alimentos, Heweliusza 1, PL-10-724 Olsztyn, Polonia 3División de Enología y Tecnología de las Bebidas, Universidad de Ciencias Aplicadas Wiesbaden, Von-Lade-Strasse 1, D-65366 Geisenheim, Alemania 4Lallemand SA, Am Alten Sportplatz 4/2, D-71272 Renningen, Alemania Introducción. La causa del aumento de olores desagradables a reducido, a sulfhídrico después de la FML o después de la conservación del vino puede ser atribuida al aumento del pH que puede cambiar el equilibrio químico o desencadenar otras reacciones químicas. La adición de SO2 o de ácido ascórbico, por otra parte, puede reducir los disulfuros a tioles, compuestos más activos desde el punto de vista del olor. Además, que el metabolismo de las bacterias lácticas sea causa del desarrollo de olores desagradables a sulfhídrico en el vino es discutible. Es bien sabido que las bacterias lácticas pueden metabolizar aminoácidos azufrados como metionina y que varios compuestos con aroma a azufre como metionol, metional y ácido 3-(metilsulfonil) propiónico se pueden formar por degradación de este aminoácido (Dias y Weimer, 1998; Bonnarme y otros, 2000; Pripis-Nicolau y otros., 2004). La fermentación maloláctica (FML) llevada a cabo por Oenococcus oeni es conocida por la transformación en el vino del áspero ácido málico en el delicado ácido láctico y en el bióxido de carbono. Recientemente ha sido demostrado que la FML mejora las características organolépticas, el ataque en boca y la estructura y proporciona estabilidad biológica al vino final (Henick-Kling, 1993; Krieger y Hammes, 1988; Lonvaud-Funel y otros, 1998). Por otra parte, después de la FML, en algunos vinos, pueden ser detectados olores desagradables a reducido, a sulfhídrico. Los compuestos volátiles que contienen azufre juegan un papel importante en el olor de los vinos, que está relacionado con su elevada volatilidad, reactividad e impacto a bajísimas concentraciones. Algunas de las sustancias que contienen azufre son necesarias para la calidad del vino, mientras otras son la causa de olores muy desagradables (huevos podridos, col cocida, coliflor, caucho quemado, etc.), incluso a concentraciones extremadamente bajas (p.e., H2S, metanotiol [MeSH], etanotiol [EtSH]). Ciertos tioles contribuyen a la típica nota sensorial de variedades de uva como Chenin blanc, Sauvignon blanc, Scheurebe, etc. Por consiguiente, la primera fase del trabajo de investigación se centró en la influencia de metionina, cisteína y glutatión (también en combinación) sobre el crecimiento de Oenococcus oeni y sobre la duración de la FML (Schwarz, 2003; Kondzior, 2004). – 21 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Procedimiento experimental y resultados Sin embargo, así como la adición de estos compuestos estimuló el crecimiento (cisteína, glutatión), esto no tuvo ningún impacto sobre la FML. La degradación del L-malato no estuvo influida por estos complementos y tampoco las cepas de levadura produjeron efectos perceptibles. Los ensayos de investigación fueron conducidos con mostos de variedades de uva diferentes para demostrar el impacto de los aminoácidos azufrados y de glutatión sobre el crecimiento de cepas de Oenococcus oeni. En los dos ensayos siguientes, con Riesling y con una variedad tinta alemana, Dornfelder, se utilizó para ello la microvinificación. El mosto Riesling fue dividido en dos partes iguales y la fermentación alcohólica fue llevada a cabo con las cepas de levadura Uvaferm CM y Lalvin EC 1118. Los vinos testigo sin FML fueron conservados en las mismas condiciones. En este ensayo se uso también la cepa Oenococcus oeni OoA (Lallemand) para realizar la FML. Los aminoácidos con azufre y el glutatión fueron adicionados individualmente o utilizando combinaciones de concentraciones igual que en el ensayo con el mosto Dornfelder. Se usaron las mismas concentraciones de cisteína y metionina. Solamente se redujo a 20 mg/L la cantidad de glutatión añadida. El mosto Dornfelder fue dividido en dos y fermentado con dos cepas de levadura, Lalvin Rhone 2056 y Lalvin BM 45. Se conservaron en las mismas condiciones testigos sin FML de cada uno de los vinos fermentados. La cepa O. oeni OoA (Lallemand) fue usada para iniciar la FML. Los aminoácidos azufrados y el glutatión fueron adicionados separadamente o combinando las concentraciones excepto en el vino testigo. Los dos vinos fermentados tenían bajísimos niveles de nitrógeno asimilable. La degradación del L-malato dependió de la cepa de levadura usada para fermentar el vino y del complemento adicionado. La adición de metionina aceleró la FML en los vinos fermentados con EC 1118. En contraste con esto, la adición de cisteína pareció retrasar la degradación del L-malato. Mientras que la adición de glutatión ayudó un poco la FML en el vino fermentado con Uvaferm CM. La adición de cisteína (20 mg/L) o de glutatión (40 mg/L), provocó un aumento del crecimiento de bacterias lácticas en los dos vinos. Mientras que la adición de metionina supuso una leve disminución del crecimiento de bacterias, especialmente en la variante que fue fermentada con Lalvin BM 45. FIGURE 1 : Crecimiento de una cepa de Oenococcus Oeni tras la adición de cisteína (20 mg/l), de metionina (40 mg/l) y de glutatión (40 mg/l) en dos vinos fermentados con dos cepas de levadura distintas (Rhône 2056 -Rh- y BM45 -BM) comparado con el testigo (sin adición)”. Cisteina, metionina, glutation 8.0E+07 7.0E+07 6.0E+07 Los resultados preliminares mostraron que la adición a un vino fermentado de cisteína y glutatión después de la fermentación alcohólica puede promover el desarrollo de bacterias lácticas y la FML. Este efecto parece estar influido por la concentración de nutrientes adicionada y por su composición en el vino, la cual también se ve afectada por la demanda de nutrientes por parte de la cepa de levadura elegida para la fermentación alcohólica y por la cepa de Oenococcus oeni utilizada. Por otra parte, se presupone la existencia de reacciones del grupo SH- de la cisteína y del glutatión con otros ingredientes del vino, lo que probablemente varía el efecto de su adición a los diferentes vinos. Rh control 5.0E+07 [cfu/mL] Discusión y Conclusiones Rh cys+met+ GSH 4.0E+07 BM control 3.0E+07 BM cys+met+ GSH 2.0E+07 1.0E+07 0.0E+00 0 2 4 6 8 10 Tiempo (dia) La influencia sobre el desarrollo de las bacterias lácticas después de la adición combinada de cisteína, metionina y glutatión está ilustrada en la Figura 1. En el vino fermentado con Lalvin Rhone 2056, la adición conjunta de metionina, cisteína y glutatión dio lugar a una ligera disminución del crecimiento de bacterias. La combinación de los tres compuestos aceleró el desarrollo de bacterias lácticas en el vino fermentado con Lalvin BM 45. 12 El próximo trabajo de investigación estará orientado hacia los cambios organolépticos después de la adición de aminoácidos que contienen azufre y de glutatión, así como hacia el desarrollo de compuestos del aroma que contienen azufre, ya que los resultados iniciales indican que – 22 – Impacto de los aminoácidos azufrados y del glutatión sobre el crecimiento de Oenococcus oeni y sobre la fermentación maloláctica la composición cualitativa y cuantitativa de sustancias con azufre en los vinos pueden sufrir cambios durante la FML. Bibliografía Bonnarme, P., L. Psoni and H. E. Spinnler. 2000. Diversity of L-methionine catabolism pathways in cheese-ripening bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 66,12:5514-5517. Dias, B. and B. Weimer. 1998. Conversion of methionine and thiols by Lactococci, Lactobacilli, and Brevibacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64,9:33203326. Henick-Kling, T. 1993. Malolactic fermentation. In Wine Microbiology and Biotechnology, ed. G. H. Fleet. 289326. Switzerland: Harwood Academic Publishers. Kondzior, M. 2004. Diploma thesis, University of Warmia and Mazury, Olsztyn, Poland (in preparation). Krieger, S. A. and W. P. Hammes. 1988. Biologischer Säureabbau im Wein unter Einsatz von Starterkulturen. Der Deutsche Weinbau. 25-26:1152-1154. Lonvaud-Funel, A., A. Joyeux and C. Desens. 1998. Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabolism. J. Sci. Food Agric. 44:183-191. Pripis-Nicolau, L., G. de Revel, A. Bertrand and A. Lonvaud-Funel. 2004. Methionine catabolism and production of volatile sulphur compounds by Oenococcus oeni. Journal of Applied Microbiology. 96:1176-1184. Schwarz, R. 2003. Einfluss schwefelhaltiger Aminosäuren und der Nährstoffversorgung auf den biologischen Säureabbau bei der Rotweinbereitung. Diplomarbeit (diploma thesis), Universidad de Ciencias Aplicadas, Wiesbaden, Alemania. – 23 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA INDÍGENA LOS CONSUMIDORES DE VINO PUEDEN DETECTAR PROBLEMAS DE SABOR CAUSADOS POR LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA Resumen del trabajo original de: Antonio PALACIOS1, Carlos SUÁREZ1, Sibylle KRIEGER2, Didier THÉODORE3, Luis OTAÑO4 y Francisco PEÑA5 1Lallemand Spain ; Ctra. Logroño-Vitoria Nº 14 ; 26360 Fuenmayor, La Rioja ; apalacios@lallemand.com 2Lallemand SA, Am Alten Sportplatz 4/2, D-71272, Renningen, Germany 3Lallemand SA, 19, rue des Briquetiers, Blagnac, Cedex 31702, France 4Universidad 5Degustador del Dpto. Agricultura y Alimentación, Calle Madre de Dios, Logroño, La Rioja Experto. CISCUS13@terra.es Generalmente, los elaboradores de vino buscan asegurar que la fermentación maloláctica se produzca durante el proceso de vinificación. Esto previene problemas que pueden ocurrir cuando se produce después del embotellamiento. Las bacterias lácticas transforman el ácido málico en ácido láctico. La transformación reduce la acidez del vino, produciendo, asimismo, muchos otros compuestos que se clasifican como metabolitos secundarios. Estos metabolitos secundarios pueden crear complejidad, e incluyen lactato de etilo, diacetilo u otros compuestos aromáticos. Los vinos que han sufrido una fermentación maloláctica adquieren, generalmente, caracteres descritos como lácticos, ahumados, especiados y reminiscencias a frutas secas, con más cuerpo, taninos más intensos y mejor duración de tiempo en el paladar. bles generados por el desarrollo de microorganismos pueden producir caracteres similares a yogur ácido, mantequilla rancia y sudor. A menudo, se pueden formar olores que se asemejan a una cuadra en vinos tintos y antiséptico en blancos, debidos a la presencia de fenoles volátiles. Estos caracteres pueden ser, a veces, acompañados por un amargo en el paladar. El desarrollo espontáneo de bacterias puede causar, asimismo, una pérdida significativa del color de los vinos tintos, debido a la actividad enzimática y a un aumento del pH. El crecimiento no controlado de los microorganismos puede generar también compuestos secundarios que son nocivos para el consumidor - alergénicos, tales como aminas biógenas (histamina, putrescina, cadaverina), y cancerígenos potenciales como carbamato de etilo y ocratoxina A. Sin embargo, en lugar de mejorar el vino, las bacterias lácticas pueden provocar, a veces, cambios indeseables. En realidad, durante la fermentación maloláctica indígena llevada a cabo por Lactobacillus y Pediococcus se puede producir un deterioro sensorial. Se puede formar, especialmente, acidez volátil excesiva o diacetilo. Es probable que estos compuestos no sólo enmascaren los sabores primarios del vino, sino que también puedan aportar caracteres indeseables al bouquet. El ácido acético es picante en la nariz y causa acidez. El diacetilo aporta un aroma que, en bajas concentraciones, se asemeja a la mantequilla. En concentraciones superiores, el diacetilo aporta sabores de nuez o caracteres similares al caramelo, levadura e incluso pelo mojado de animales! Los aromas y sabores indesea- ¿Puede un consumidor normal de vino detectar los defectos sensoriales causados por una contaminación microbiana?. Para estudiar esta pregunta a fondo, Lallemand ha llevado a cabo pruebas sensoriales en España en colaboración con la Universidad de Rioja. Se estableció un panel de degustación conformado por 24 consumidores. Los consumidores degustaron vinos tintos elaborados a partir de Tempranillo y vinos blancos elaborados a partir de Viura. Se degustaron dos vinos testigos sin ninguna adición y 20 vinos a los que se les agregó diacetilo, aminas biógenas volátiles (putrescina y cadaverina) y fenoles volátiles (2-etil-fenol y 2-etil-guayacol). Estos compuestos, efectivamente, son capaces de provocar un deterioro en la calidad del vino cuando se produce una contamina– 25 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA por la adición de 2-etil-fenol, comparado con 31% para el 2-etil-guayacol. El primero de estos compuestos recordaba, a los degustadores, cuadra, cuero, boñiga, caballos y betún. El segundo compuesto les recordaba moho, medicina y humo. ción microbiana durante la fermentación maloláctica indígena. Las cantidades agregadas fueron variables, partiendo de bajas concentraciones equivalentes al umbral de detección hasta niveles equivalentes a la máxima concentración encontrada en algunos vinos. Las muestras, ordenadas al azar, fueron degustadas a ciegas. Los degustadores tuvieron la libertad de elegir los términos para describir los caracteres que observaron. Defectos aromáticos en vinos blancos FIGURA 1: Frecuencia de detección de los defectos por los degustadores. DB = Diacetilo en vino blanco : 0,1 ppm – 5 ppm – 10 ppm DT = Diacetilo en vino tinto : 0,1 ppm – 10 ppm – 30 ppm P = Putrescina (P) y cadaverina (C) = aminas biógenas en el vino tinto: cada uno a 1, 10, 50 y 100 ppm EF = 2-etil-fenol y EG = 2-etil-guayacol en el vino tinto: 425, 800 y 1000 µg/L Cerca de la tercera parte de los consumidores de vino encontraron un defecto en el vino blanco, pero no pudieron describirlo. Los términos más utilizados para el diacetilo fueron almendra, mantequilla y queso. Se descubrió que el diacetilo agregado aportaba caracteres similares a aquellos causados por la oxidación. FIGURA 3: Descriptores para los vinos blancos que contienen diacetilo agregado 2% 2% 5% 3% 29% 7% 12% 14% ¿Puede el consumidor de vino detectar realmente componentes aromáticos desagradables? Los aromas inducidos por fenoles son fácilmente identificables en tintos En los tintos, sólo 7% de los degustadores no pudieron encontrar términos para describir los caracteres causados FIGURA 2: Descriptores para vinos tintos que contienen 2-etil-fenol agregado. 5% 2% 2% 2% Queso Oxidación Fermentación 14% 5% 3% 35% 2% 2% 2% 2% 2% 30% 7% 9% 12% No identificado 35% Boñiga 5% Madera m ojada 2% 21% 12% 19% 7% 12% 2% Mantequilla Detergente Vainilla FIGURA 4: Descriptores del vino tinto que contiene putrescina agregada. El 30% de los degustadores encontraron un defecto pero no pudieron identificarlo. 2% 2% 2% 5% 7% 12% 26% 7% 2% Por otro lado, los degustadores fueron menos sensibles a las aminas biógenas agregadas. Además, la concentración parece tener un impacto diferente: los defectos debidos a la putrescina no se identificaron mejor al aumentar las concentraciones en las muestras. Sin embargo, 30% de los degustadores notaron un defecto sin tratar de identificarlo. Los términos utilizados para describir la presencia de putrescina fueron muy negativos: olores a fruta podrida, sensación de fermentación, olores y sabores rancios y sucios. La cadaverina fue identificada relativamente mejor en concentraciones más elevadas y señalada como contribuyente de caracteres avinagrados, sucios y carne. Los resultados de estas pruebas indican que los defectos más fáciles de identificar fueron aquellos causados por los agregados de fenoles volátiles al vino tinto o de diacetilo al blanco. Los degustadores detectaron estos compuestos más rápidamente cuando sus concentraciones eran altas. 4% 26% No identifcado Evolucionado Jabón 29% 12% 2% Cuadra Caballo Brett 19% 4% No identificado 21% Fruta podrida Ferm entación 9% Rancio 7% Laca 5% Madera podrida 2% Quím ico 2% Vóm ito 2% Medicam ento 2% Cárnico 2% Evolución 2% Animal 2% Agua sucia 2% Jabón 30% Cuero Betún 12% 2% Animal Laca – 26 – 12% Fermentación Maloláctica Indígena – Los consumidores de vino pueden detectar problemas de sabor causados por la contaminación microbiana FIGURA 5: Descriptores del vino tinto que contiene cadaverina agregada 4% 4% 4% 2% 2% 2% 2% 2% 36% 4% 8% 30% 36% 4% 2% No identificado Fermentacion Reducción 30% 4% 2% Guiso de carne Medicina Humedad 8% 4% 2% Vinagre Caza Animal 4% 2% 2% Fruta podrida Mantequilla Fósforo Los mismos 22 vinos fueron sometidos a un degustador experto en una evaluación a ciegas. Como podría esperarse, el profesional fue capaz de detectar los defectos más rápidamente, dando como resultado una mejor frecuencia de detección de los defectos que el grupo de consumidores. Sin embargo, sus descripciones detalladas coinciden con las de los degustadores novatos1. De esta manera, es evidente, a partir de este estudio, que los consumidores de vino informados son capaces de detectar los defectos sensoriales que disminuyen la calidad de los vinos contaminados por microorganismos. En consecuencia, es importante que los elaboradores de vino sean conscientes de estos temas. El elaborador debe ser capaz de detectar problemas sensoriales lo más temprano posible. Es mejor aún prevenir cualquier tipo de contaminación microbiana del vino controlando la fermentación maloláctica. Esto es posible gracias al mantenimiento de una buena limpieza e higiene en la bodega, pero también utilizando bacterias seleccionadas para llevar a cabo la fermentación maloláctica. Estas simples medidas ayudan a prevenir la presencia de contaminantes microbianos en el vino y, en consecuencia, su deterioro. Lallemand propone como una herramienta educativa para los enólogos y los expertos vinculados al vino, un kit de degustación llamado: «fermentación maloláctica no controlada: las máscaras ...». Es una herramienta que ayuda a los profesionales del vino a reconocer defectos aromáticos debidos a la contaminación microbiana, a fin de evitar la elaboración de vinos con defectos evidentes y reconocidos por los consumidores. 1 Extractos provenientes de los apuntes del degustador profesional 3 DB: Nariz intensa con dominancia de la mantequilla, aromas de levadura, miga de pan de molde, bollo de leche, corteza de pan y grasa de mantequilla. Tonos de trigo y aromas de oxidación con sensación olfativa de laca. En boca mantecoso, con recuerdo de tocino, torrezno. Retronasal muy láctea. 3C: Yeso seco en nariz. Aromas muy cocineros, garbanzo cocido. Carne pasada, mucha humedad, polvo de barrer, suciedad. Sensación de agua sucia en boca, con tanicidad terrosa y agresiva. La intensidad del problema se percibe cada vez más en boca. Retronasal de laca y fijador de pelo. – 27 – ¿INFLUYEN LAS BACTERIAS MALOLÁCTICAS EN LA CALIDAD DEL VINO? DEBATE DE LA MESA REDONDA LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA ¿INFLUYEN LAS BACTERIAS MALOLÁCTICAS EN LA CALIDAD DEL VINO? Tim ATKIN Master of Wine, Reino Unido Moderador www.observer.guardian.co.uk Tim es uno de los más destacados escritores británicos sobre vino y un experto en la materia, reconocido internacionalmente. Es el corresponsal de vino de “The Observer”. Escribe también para “Decanter”, “WINE International”, “Woman and Home” y “Observer Food Monthly”. Participantes Hélène Mingot Gruppo Matura, Italia www.matura.net Pedro Aibar Viñas Del Vero, España www.vinasdelvero.es David Molina Viniteca, España david.molina@lycospro.es Edmund Bordeu Pontificia Universidad Católica (PUC), Chile www.puc.cl François Naudé L’Avenir Winery, Sudáfrica lavenir@adept.co.za Jeff Brinkman Husch Vineyards, EEUU www.huschvineyards.com Jacques Réjalot Oenologist Consultant, Francia Rejalot.jacques@wanadoo.fr Joao Correia Companhia das Quintas, Portugal www.companhiadasquintas.pt Rui Reguinga Consultoria em Enologia, Portugal rui.reguinga@mail.telepac.pt Dominique Delteil Institut Coopératif du Vin (ICV), Montpellier, Francia www.icv.fr Oliver Schmidt Weinsberg Wine Institute, Alemania www.landwirtschaft-mlr.baden-wuerttemberg.de Sam Harrop Marks and Spencer, Reino Unido www.marksandspencer.com Fernando Zamora Universitat Rovira y Virgili and Clos Mogador, España fzm@astor.urv.es Glen James Penfolds, Australia www.penfolds.com.au Gernot Limbach Henkell-Söhnlein, Alemania www.henkell-soehnlein.de – 31 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA ¡Avance del Entretiens Scientifiques Lallemand! asesor privado: “La fermentación maloláctica en barrica es cada vez más popular, y el obtener complejidad, y alcanzar un buen equilibrio durante el coupage de diferentes estilos de vinos es todo cuestión de cepajes.” Durante la segunda mitad del XVIes Entretiens Scientifiques Lallemand en Oporto, Portugal, tuvo lugar una reunión de dieciséis enólogos y winemakers de todo el mundo que compartieron sus experiencias y filosofías con respecto a la fermentación maloláctica y su influencia en la calidad del vino en el mercado actual. Se intercambiaron opiniones del Nuevo y Viejo Mundo referentes a prácticas especiales durante las fermentaciones malolácticas, y al desarrollo de las mismas con el tiempo. ¿Cómo son utilizadas las bacterias malolácticas seleccionadas en las diversas situaciones y por qué razones? Desde el punto de vista del consumidor, dos comerciantes minoristas explicaron el procedimiento para la adquisición del vino; incluyendo criterios de adquisición y cómo este procedimiento afecta a los enólogos con los que tratan. Se discutió sobre todas estas ideas y cuestiones y a continuación tuvo lugar un interesante y apasionado debate, dirigido por el extraordinario moderador, Tim Atkin. Jacques Réjalot continuó explicando que la fermentación maloláctica se puede dejar durar más tiempo a temperaturas más bajas, lo que produce un efecto importante sobre el aroma pero no parece afectar a la degradación del ácido málico. Thomas Henick-Kling advirtió, sin embargo, con respecto a las fermentaciones malolácticas largas y a su contribución al aroma del vino, “La contribución al aroma puede llegar no sólo de O. oeni, sino de otras bacterias, así como de Brettanomyces, especialmente en vinos con pH altos.” En cuanto a Dominique Delteil, explicó que la fermentación maloláctica puede ser controlada en diferentes tipos de vinos para diferentes tipos de mercados. Por ejemplo, en el caso del Sauvignon blanc, la FML puede ser realizada con uvas maduras para obtener un vino que tenga un cierto nivel de calidad, determinado por el enólogo y el comprador de vino. La importancia de la fermentación maloláctica es obvia si se considera que el ácido málico, que no es degradado cuando no hay FML, es seco y áspero, y se percibe incluso más con niveles más altos de alcohol, tales como 13-14%. El Punto de Vista Alemán Los delegados alemanes, Gernot Limbach y Oliver Schmidt, son ambos defensores del uso de bacterias seleccionadas durante la fermentación maloláctica. Para Limbach, el uso de bacterias malolácticas ha tenido implicaciones económicas importantes en la producción de vinos espumosos en Henkell; se cambiaron las prácticas de vinificación, de una inoculación de bacterias en mitad de la fermentación alcohólica a una co-inoculación (levaduras y bacterias). Con este método el tiempo de la fermentación maloláctica (FML), de cuatro o seis meses, se redujo a tres o cuatro semanas. Con este método, el ahorro de tiempo es considerable, y se soluciona un problema técnico, la duración de la FML. En el pasado, O. Schmidt permitía las fermentaciones espontáneas, pero ahora prefiere utilizar bacterias seleccionadas. Para él, es una cuestión de estilo, para ser competitivo e internacional. Delteil acabó concluyendo que una fermentación maloláctica ayuda también a controlar los problemas de Brettanomyces, especialmente en condiciones de pH elevados. Derechos al Sur “La mentalidad cambia si se va al sur,” según dijo Pedro Aibar. “En España, la fermentación maloláctica espontánea es fácil. Puede comenzar fácilmente debajo del sombrero durante la fermentación alcohólica. En la mayoría de los tintos se estimula por seguridad biológica.” En su bodega, no usan bacterias malolácticas seleccionadas y controlan con atención la fermentación maloláctica, y raramente tienen problemas con el inicio de dicha fermentación. Sólo se usan bacterias seleccionadas cuando existen problemas con el arranque de la fermentación maloláctica. No obstante, esto crea otros problemas como el precio de las bacterias malolácticas, que a veces es un factor limitativo, especialmente en algunas regiones vinícolas españolas muy sensibles a este factor. Incluso los Franceses lo están aplicando Los enólogos franceses son tan variados como los vinos en ese país. Sin embargo, tanto Jacques Réjalot, anteriormente de la cooperativa Buzet y actualmente asesor, como Dominique Delteil, anteriormente director científico del ICV y actualmente asesor privado, adoptan el uso de bacterias seleccionadas. Réjalot es un fuerte defensor de las bacterias seleccionadas para obtener vinos más aromáticos y taninos más suaves, lo que a menudo es difícil de obtener en el sudoeste de Francia para algunos varietales tintos. Sus comentarios fueron reiterados por Sam Harrop, antes tecnólogo del vino en Marks & Spencer y ahora Antonio Palacios, también de España, coincidió en señalar que en algunas regiones las bodegas a veces no se pueden permitir el comprar bacterias malolácticas. Sin embargo, Fernando Zamora, profesor de enología y enólogo en Clos Mogador en España, no está tan convencido de la cues– 32 – ¿Influyen las bacterias malolácticas en la calidad del vino? tión precio, especialmente cuando el riesgo de perder el vino es alto. Precisó que el uso de bacterias seleccionadas no debería ser curativo sino preventivo. aumento de la concentración de diacetilo, seguido de un coupage de vinos con y sin maloláctica. Las bacterias malolácticas no son usadas porque la fermentación maloláctica es fácil y el coste de las bacterias lácticas se considera elevado. En los vinos premium, sin embargo, lo aconsejan para controlar el riesgo de olores desagradables. Palacios continuó diciendo que no tienen ningún problema con el arranque de la fermentación maloláctica espontánea, pero que los problemas llegan más adelante. Cuando el nivel de alcohol es alto (incluso 16%), a menudo es difícil controlar la FML. Un pH elevado (sobre 3.7) complica todavía más el asunto. Si la fermentación maloláctica comienza de forma espontánea, tendrá lugar debajo del sombrero y puede provocar problemas de acidez volátil. El Profesor Zamora, igual que Aibar, no siempre utiliza la fermentación maloláctica seleccionada porque la fermentación espontánea se inicia muy fácilmente. Sin embargo, esto no es para mantener la tipicidad sino más bien una cuestión de hábito. Admite que la fermentación maloláctica espontánea tiene que ser controlada con atención para evitar desviaciones aromáticas. “En condiciones difíciles, si la fermentación espontánea no tiene lugar, el uso correctivo de bacterias seleccionadas no siempre funciona,” dijo Mingot, reiterando los comentarios hechos por algunos enólogos. “Si las condiciones para la fermentación espontánea son muy adversas, las bacterias seleccionadas tendrán que sobrevivir también en estas condiciones difíciles”, respondió Sibylle Krieger. “Las bacterias malolácticas son muy sensibles, y si las condiciones son particularmente difíciles, es crucial elegir la cepa bacteriana adecuada con la nutrición apropiada, y en algunos casos, puede ser incluso mejor trabajar con un pie de cuba para la aclimatación.” Mingot estuvo particularmente preocupado por la producción de aminas biógenas durante la fermentación maloláctica espontánea, así como por la producción de carbamato de etilo. Para el mercado de exportación, el control de la producción de estos compuestos se está volviendo crucial, visto que varios países importadores controlan rigurosamente sus concentraciones. Las bacterias seleccionadas, que son consideradas como reductoras de la producción de aminas biógenas en los vinos, comparadas con las bacterias espontáneas, podrían llegar a ser cada vez más importantes, incluso en bodegas donde la fermentación espontánea es la regla general. Vinos Limpios y Estables en Portugal En Portugal, la situación es similar a la española, pero la mentalidad está cambiando lentamente, y así lo señaló Rui Reguinga, asesor vinícola. Cuando él asesora bodegas de regiones diferentes en Portugal, se interesa sobre todo por las cuestiones de demanda de mercado. Y los mercados de hoy en día prefieren vinos maduros, afrutados, con un tanino suave. La fermentación maloláctica le preocupa en el sentido que le interesa realizarla lo más rápidamente posible para mantener los vinos limpios y afrutados. Si tiene un vino de gran calidad, lo inocula con bacterias seleccionadas. Una cosa es cierta; Reguinga no quiere correr riesgos con los vinos de gran calidad y en tal caso utiliza sin duda alguna bacteria seleccionada. El Nuevo Mundo - Cómo Manejar los Riesgos La filosofía del nuevo mundo es absolutamente diferente. Con la mayoría de sus vinos, Glen James, de Penfolds en Australia, utiliza bacterias seleccionadas. Es necesaria una fermentación maloláctica limpia y rápida, que tarde más o menos un mes, para evitar problemas con Brettanomyces. La fermentación maloláctica es inducida en función de consideraciones climáticas y del precio del vino, de modo que serán los vinos más costosos los que realizarán la dicha fermentación. Otras variedades, como Viognier, Riesling y Semillon, realizan sólo una fermentación maloláctica parcial. Joao Correia de Portugal hizo consideraciones similares. En Portugal, el uso de bacterias seleccionadas se considera costoso. Él no las utilizaría en los vinos menos caros, pero no correría riesgos con los vinos de calidad premium. Disminución de Aminas Biógenas y Bacterias Seleccionadas “La situación de la fermentación maloláctica en Italia es como en España,” comentó Hélène Mingot, del Gruppo Matura. En el caso de los vinos blancos, los enólogos italianos prevén la fermentación maloláctica espontánea para mantener el equilibrio, la frescura y la fruta fresca en sus vinos. En algunos casos, la fermentación maloláctica se realiza para alcanzar complejidad, en particular con el Como principal enólogo en L’Avenir Winery, François Naudé, de Sudáfrica, quiere controlar la fermentación. Para ello utiliza bacterias seleccionadas porque el riesgo de fermentaciones espontáneas con Lactobacillus y Pediococcus es muy alto. La fermentación maloláctica se realiza, por lo tanto, en tintos para una mayor estabilidad. – 33 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Sam Harrop piensa que desde la perspectiva de un minorista, la estabilidad microbiológica es un punto crítico. Por lo tanto, es crucial realizar correctamente la fermentación maloláctica. Aunque ve una mayor aceptación entre sus proveedores del Nuevo Mundo, anima a todos sus productores de vino, incluyendo los de Europa, a que utilicen bacterias seleccionadas por la velocidad, la estabilidad y la limpieza. “Estilo y calidad son dos factores críticos,” dijo Harrop. “Busco fermentaciones malolácticas rápidas y complejidad para los vinos premium obtenidos con esta fermentación. Sinceramente, creía que la fermentación espontánea me daría esta complejidad, pero después de degustar los vinos fermentados con y sin bacterias seleccionadas, estoy cambiando opinión y recomiendo las bacterias seleccionadas para los vinos premium,” dijo Harrop. Naudé está seguro de los resultados cuando se usan BML puesto que obtiene vinos limpios, y no quiere correr el riesgo de perder un tanque o una barrica por la producción de aromas indeseables si la FML espontánea va mal. Riendo comentó, “No quiero perder mi trabajo, mi mujer y mi casa si el vino se echa a perder”. En blancos, realizan la fermentación maloláctica sólo con Chardonnay. Usan bacterias seleccionadas para disminuir la concentración del ácido málico y realizar una fermentación maloláctica parcial, en función de la vendimia. No les interesa que el Chenin blanc haga la fermentación maloláctica puesto que no quieren perder el carácter afrutado ya moderado. En vez de eso, trabajan con la desacidificación química. Por la misma razón, no aplican la fermentación maloláctica al Sauvignon blanc. Jeff Brinkman, el enólogo de Husch Vineyards en California, quiere que todos sus tintos pasen la fermentación maloláctica utilizando bacterias seleccionadas. Con el Pinot noir, usa barricas durante la fermentación maloláctica, mientras que el resto de los tintos realizan el proceso en tanques. Con sus blancos, realiza la fermentación maloláctica sólo con Chardonnay y, dependiendo del equilibrio y del estilo previsto de afrutado y de etiqueta, lo realiza variando las cantidades: “Estoy utilizando Enoferm Alpha como bacteria seleccionada, que me ayuda a controlar las notas de mantequilla al tiempo que mantiene la redondez y el paso de boca” dijo Jeff. David Molina, sommelier y comprador de vino en Vila Viniteca en Barcelona, está de acuerdo con Harrop. La bodega debe considerar a qué consumidor está dirigido el vino. Una vez definido esto, estará definido también el estilo del vino. “Me gusta un vino que esté limpio, y la fermentación maloláctica ayuda a conseguirlo”, dijo Molina. El enólogo tiene que conocer qué es lo que desea el consumidor, y el consumidor desea calidad cada vez que compra vino. Último pero Fundamental: Debate sobre Tipicidad “La situación en Chile por lo que respecta al uso de bacterias seleccionadas es bastante parecida a España e Italia,” comentó Edmund Bordeu. La cuestión es que el precio medio de los vinos es bajo, de modo que el precio de las bacterias seleccionadas se convierte en un problema. “Los enólogos chilenos piensan, en general, que no es una gran idea gastar dinero en algo que ocurre de forma espontánea.” En cuanto a los tintos, no supone una gran preocupación porque éstos tienen un valor de alcohol alto que controla las poblaciones bacterianas y, además, la fermentación maloláctica tiene lugar rápidamente; donde sí tienen problemas es con lotes específicos de vinos, para los que compran cultivos seleccionados. No puede existir un verdadero debate sobre vino sin una degustación. En ella se presentó un Riesling alemán producido con bacterias seleccionadas inoculadas en diversos momentos y las diferencias sorprendieron a todos. La creencia que la fermentación maloláctica induce a una pérdida del afrutado en algunas variedades fue descartada enseguida, al mostrar claramente una co-inoculación bien realizada de levaduras y bacterias seleccionadas que el carácter frutal se mantiene en el Riesling sin la producción de acidez volátil. Sin embargo, esto no puede ser realizado en todos los vinos, y algunas condiciones deben ser controladas con atención. En el caso del coupage francés de Merlot/Cabernet Sauvignon con seis semanas de micro-oxigenación de las pruebas de Jacques Réjalot, un vino estaba producido con fermentación maloláctica espontánea y otro con la bacteria seleccionada VP41. Hubo consenso : todos prefirieron el segundo vino fermentado con VP41. Fermentación Maloláctica y Calidad del Vino: El Punto de Vista del Mercado Finalmente, el consumidor - sea un experto en vinos o no - busca un buen vino. Si el vino de un enólogo encuentra un mercado, entonces el enólogo ha hecho bien su trabajo. ¿El uso de bacterias seleccionadas nos da la seguridad de que el vino es “apto” para el mercado? Cada uno de los minoristas de vino tiene sus opiniones. A continuación, fueron presentados vinos Tempranillo de La Rioja. El primero había experimentado la fermentación maloláctica espontánea y algunos enólogos opinaron que – 34 – ¿Influyen las bacterias malolácticas en la calidad del vino? era demasiado mantecoso, cubriendo la expresión frutal. El segundo vino, que fue preferido respecto al vino con FML espontánea, fue sometido a la fermentación maloláctica con la ayuda de la bacteria seleccionada Uvaferm Beta. El tercer vino, fermentado con la bacteria seleccionada VP41, fue el preferido en general por su agradable paso de boca, persistencia y textura. maloláctica y a las bacterias malolácticas seleccionadas son obtener vinos limpios y estables, la disminución de compuestos indeseables tales como las aminas biógenas, el control del riesgo, conducir un vino a un mercado que venda, y, por último, la calidad del vino. Es fácil concluir que existe una tendencia clara: el Viejo Mundo es más reacio que el Nuevo Mundo al uso de bacterias seleccionadas. Sin embargo, los enólogos europeos, que se están volviendo cada vez más innovadores y les preocupa el hecho de preservar la calidad de sus productos, dicen que están abiertos al control de todas las etapas del proceso de vinificación, sin dejar nada al azar y así poder obtener lo mejor de la uva. Según David Molina, el Tempranillo fermentado espontáneamente tenía el típico carácter varietal, mientras que los otros dos representaban más la manera moderna de producir tempranillo. Finalmente, se planteó la cuestión referente la tipicidad, la región, la uva. En última instancia, pasa a ser una decisión enológica, pero Molina opina que los enólogos no deberían perder la tipicidad. “¿Cómo comportarse en un mercado que cambia? ¿La evolución de los estilos?” se preguntó Tim Atkin. Según la opinión de Rui Reguinga, si el vino está limpio, es más fácil de vender, y los dos últimos tempranillos eran un reflejo de vinos limpios. Molina contestó que básicamente la respuesta se reduce a qué tipo de vino se desea producir. El vino es cultura, ése es su sentido, y se puede perder este carácter con el uso de nuevas tecnologías. Reflejó la reticencia del Viejo Mundo al uso de nuevos métodos, frente a la actitud generalmente más receptiva de los productores del Nuevo Mundo a las nuevas vías para producir vinos mejores. “No debemos olvidar que aunque se utilicen bacterias seleccionadas, hay todavía una población indígena activa en el vino que podría influir en las propiedades sensoriales del vino,” comentó el Profesor Henick-Kling. Todas las bacterias seleccionadas una vez fueron indígenas. Varios enólogos opinan que prefieren producir vinos elegantes y que llegarán a eso a través de los coupages. La pérdida de tipicidad y el miedo a la estandarización son preocupaciones reales, y todos convienen en que la estandarización del vino debe ser evitada. Así Tim Atkin comentó “Creo que la discusión sobre estandarización no está en el uso de bacterias seleccionadas para la fermentación maloláctica. La fermentación maloláctica no es el único factor que define si el vino presenta tipicidad o no. Cuando se trata de una cuestión de estilo, no existe una respuesta correcta o equivocada. Si el vino se vende, no hay más cuestiones.” Conclusiones La fermentación maloláctica es una parte esencial de la vinificación y un control atento es fundamental, tanto si se usan las bacterias malolácticas como si no. Las principales preocupaciones por lo que respecta a la fermentación – 35 – LA CALIDAD DEL VINO Y LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Cover Design: Bruno Loste – Layout and Printing: MODULI INC. © LALLEMAND S.A.S. – 2005. LALLEMAND S.A.S. – 19, rue des Briquetiers - B.P. 59 - 31702 Blagnac Cedex – Tel. : +33 (0)5 62 74 55 55 – Fax : +33 (0)5 62 74 55 00 www.lallemandwine.com – 36 –