staclot® la - Annar Diagnóstica Import

STACLOT® LA
Detección de los anticoagulantes lúpicos
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Kit para unas 10 pruebas que contiene:
2 viales de Reactivo 1 (Buffer)
2 viales de Reactivo 2 (Phospholipids)
4 viales de Reactivo 3 (Normal Plasma)
2 viales de Reactivo 4 (PTT-LS)
2 viales de Reactivo 5 (Solvent)
(REF 00600)
Mayo 2009
Español 6
1/ UTILIZACIÓN DEL KIT
Prueba de neutralización* mediante fosfolípidos purificados de fase
hexagonal para la detección de anticoagulantes de tipo lúpico (1, 2) en el
plasma.
* Patente concedida
6/ OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
10/ RESULTADOS
La obtención de la muestra debe ajustarse a las recomendaciones para los
exámenes de hemostasis.
• Muestra de sangre en solución de citrato trisódico 0,109 M: 1 vol. de
citrato por 9 vol. de sangre. Utilizar tubos de muestra de plástico o de
vidrio siliconado.
• Centrifugación: Se recomienda eliminar las plaquetas del plasma.
Realizar una primera centrifugación durante 15 minutos a 2000-2500 g.
Separar el sobrenadante plasmático y centrifugarlo una segunda vez
durante 15 minutos a 2000-2500 g. El número de plaquetas residuales
debe ser inferior a 10.109/l (< 10 000/mm3) (7, 10).
• Si se respetan estas condiciones de tratamiento, el plasma puede
conservarse: 4 horas a 20 ± 5 °C
1 mes a −20 °C. Atemperar la muestra a 37 °C el tiempo
necesario y suficiente para que la descongelación sea
completa.
Una disminución del tiempo de coagulación (TC) del plasma del tubo 2
(Reactivo 2) mayor o igual a 8 segundos con relación al del tubo 1
(Reactivo 1) revela una neutralización de los anticuerpos antifosfolípidos
(este valor de 8 segundos se estableció con ayuda de los aparatos D.
Stago modelo ST4/ST art®).
7/ CONSERVACIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
2/ INTERÉS CLÍNICO
Los anticoagulantes lúpicos (AL) están relacionados con numerosos
estados clínicos, en especial: lupus eritematoso diseminado (10), trombosis,
abortos espontáneos repetidos (6), infecciones (10). Su presencia puede
ser persistente o transitoria (9). Determinar la presencia de los AL resulta a
menudo difícil por el hecho, de una parte, de la sensibilidad a los AL, que
varía según los reactivos y, por otra parte, por la propia heterogeneidad de
los AL (4).
Los anticoagulantes lúpicos son anticuerpos dirigidos contra los complejos
fosfolípidos/proteínas (9). Presentan la capacidad de alargar los tiempos de
coagulación de las pruebas dependientes de los fosfolípidos (6). En la
práctica, la adición de plasma normal a un plasma deficitario en factor de la
coagulación permite eliminar la prolongación del APTT y, por consiguiente,
diferenciar mediante esta prueba los anticoagulantes circulantes (AL o
antifactor) de los déficits en factor; por el contrario, se necesitan pruebas
complementarias para distinguir los AL de los anticuerpos antifactor de la
coagulación y/o de la heparina (1).
3/ PRINCIPIO DEL TEST
En solución acuosa a 37 °C, las moléculas de fosfatidiletanolamina
purificadas presentan unas estructuras moleculares hexagonales de fase
HII. Estas estructuras se reconocen por los anticuerpos antifosfolípidos de
tipo lúpico. En una medición de tiempo de cefalina + activador (APTT)
sensibilizada, la aportación de fosfatidiletanolamina en fase HII corrige la
prolongación del APTT debida a la presencia de anticoagulantes de tipo
lúpico (3, 6).
4/ COMPOSICIÓN
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Reactivo 1: vial de 1 ml de tampón.
Reactivo 2: fosfatidiletanolamina en fase hexagonal, liofilizada.
Reactivo 3: plasma humano normal liofilizado que contiene un inhibidor
de la heparina.
Reactivo 4: PTT-LS, cefalina extraída de tejido cerebral de conejo a la
que se le ha añadido un activador sílice, liofilizada.
Reactivo 5: vial de 1,5 ml de diluyente para el Reactivo 4.
Los Reactivos 1 y 5 contienen azida sódica (< 1 g/l) como conservante.
Es preciso eliminar con precaución los reactivos que contienen azida sódica. Si estas
soluciones se vierten en el desagüe del lavabo, enjuagar con abundante agua para evitar la
formación de azidas metálicas que, si están concentradas, pueden provocar explosiones.
Algunos reactivos de este kit contienen productos de origen humano y/o animal. Cuando se
ha utilizado plasma humano en la preparación de estos reactivos, se excluye previamente la
presencia del antígeno HBs, de los anticuerpos anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV 2 con los
correspondientes ánalisis. Sin embargo, ningún test puede garantizar de manera absoluta la
ausencia de agentes infecciosos. Por eso, estos reactivos de origen biológico han de ser
manipulados con las precauciones habituales, ya que se trata de productos potencialmente
infecciosos.
5/ PRECAUCIONES
El estuche intacto se debe conservar a 2-8 °C. Estos reactivos se destinan
exclusivamente a un uso in vitro y deben ser manipulados por personal del
laboratorio. Utilizar únicamente reactivos de un mismo kit o de un mismo
lote. Los residuos se eliminarán con arreglo a la reglamentación local
vigente. Tener cuidado en el manejo de estos reactivos y las muestras.
Conservados a 2-8 °C en su embalaje original, los reactivos se mantienen
estables hasta la fecha de caducidad que figura en el estuche.
• Reactivo 1
Listo para su uso.
Estabilidad tras su abertura:
8 horas a 20 ± 5 °C
24 horas a 2-8 °C.
No congelar.
• Reactivo 2
Reconstituir cada vial con 0,250 ml de agua destilada. Agitar
suavemente hasta su completa disolución. Dejar que la solución se
estabilice durante unos 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C) y
homogeneizar antes de su uso.
Estabilidad tras la reconstitución: 8 horas a 20 ± 5 °C
24 horas a 2-8 °C.
No congelar.
• Reactivo 3
Reconstituir cada vial con 0,5 ml de agua destilada. Agitar suavemente
hasta su completa disolución. Dejar que la solución se estabilice durante
unos 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C) y homogeneizar
antes de su uso.
Estabilidad tras la reconstitución: 8 horas a 20 ± 5 °C.
No congelar.
• Reactivo 4
Reconstituir cada vial con 1 ml de Reactivo 5 (R5). Dejar que la solución
se estabilice durante unos 30 minutos a temperatura ambiente
(18-25 °C) antes de su uso. Agitar de modo intermitente.
Estabilidad tras la reconstitución: 8 horas a 20 ± 5 °C
24 horas a 2-8 °C.
No congelar.
Reactivo
5
•
Listo para su uso.
Cuando estén almacenados a 2-8 °C, atemperar los reactivos durante
30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C).
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• Plasma puro (paciente o control) . . . . . . . . . .
• Reactivo 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
• Reactivo 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
• Mezclar, incubar durante . . . . . . . . . . . . . . . .
• Reactivo 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
• Mezclar, incubar durante . . . . . . . . . . . . . . . .
• Reactivo 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
• Mezclar, incubar durante . . . . . . . . . . . . . . . .
• Poner en marcha el cronómetro, añadir el
STA® - CaCl2 0,025 M preincubado a 37 °C . .
Mezclar. Anotar los tiempos de coagulación (TC).
Tubo 1
El método propuesto se muestra insensible a los índices de heparina
inferiores a 1 UI/ml de plasma.
La presencia de anticuerpos antifactor de la coagulación ofrece
normalmente un resultado negativo. No obstante, vista la
heterogeneidad de estos anticuerpos, algunos de ellos pueden interferir
en la prueba. De igual modo, si se sospecha de su presencia, proceder
a realizar una prueba específica para confirmarlo (8).
Los inhibidores de la trombina (ej. hirudina, argatrobán...) presentes en
la muestra a analizar pueden interferir en esta prueba y mostrar unos
resultados falsamente positivos.
13/ CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
•
•
Sensibilidad
El Staclot® LA ha demostrado una elevada sensibilidad frente a los
plasmas positivos en AL (5). Se sometieron a prueba con los reactivos
Staclot® LA veinte plasmas procedentes de enfermos conocidos en los
que se había confirmado la presencia de AL. Los veinte plasmas fueron
positivos (TC1 - TC2 ≥ 8 segundos).
Especificidad
Debido al hecho de la presencia de un inhibidor de la heparina en el
Reactivo 3, la prueba se revela insensible a los índices de heparina
inferiores a 1 UI por ml de plasma.
La presencia de plasma normal en la prueba debe permitir evitar la
prolongación de los tiempos de coagulación debido a los déficits de
factor de la coagulación.
El resultado del test ha sido negativo en los plasmas pertenecientes a
enfermos tratados con antivitaminas K (n = 29) o con heparina (n = 10)
así como en los plasmas deficientes en factor de la coagulación (n = 21).
Reproducibilidad
– Intra-serie
Se probaron un plasma normal y dos plasmas positivos en AL en una
misma serie con los reactivos de Staclot® LA sobre ST4/ST8. En la
tabla mostrada a continuación se indican los resultados obtenidos:
Plasma normal
Tubo 2
50 µl
50 µl
−
50 µl
−
50 µl
X (s)
DS (s)
En los plasmas normales no es habitual encontrar anticoagulantes de tipo
lúpico.
•
En un tubo de hemólisis de vidrio o una cubeta
a 37 °C:
Negativo
Positivo
12/ VALOR USUAL
STA - CaCl2 0.025 M (REF 00367).
STA® - Control LA 1 + 2 (REF 00201): controles negativo y positivo en
AL.
Baño de María a 37 ± 0,5 °C o instrumento similar al ST art®.
Equipamiento habitual en los laboratorios de análisis clínicos
(centrifugadora, cronómetro, pipetas, agua destilada…).
Respetar escrupulosamente los tiempos de incubación indicados. Los
plasmas de los pacientes y los controles se han probado en estado puro.
< 8 segundos
≥ 8 segundos
_n
X (s)
DS (s)
Plasma normal
_n
11/ LIMITACIONES
®
9/ PROCEDIMIENTO
Resultados
En ciertas ocasiones TC2 puede ser superior a TC1 y por tanto TC1 – TC2
dar un valor negativo. Este valor no es erróneo y el resultado de la
muestrase hade considerar negativo.
Se recomienda que cada laboratorio compruebe con arreglo a sus propias
condiciones operativas este valor límite de 8 segundos en al menos 20
plasmas normales. El resultado debe interpretarse en función del estado
clínico y biológico del paciente.
Para establecer la presencia de AL en un paciente, se recomienda seguir las
recomendaciones del Comité Científico y de Estandarización de los AL (7).
Comprobar que los resultados obtenidos para los controles STA® - Control
LA 1 y 2 son respectivamente negativo y positivo en AL. Si estos
resultados no son obtenidos, asegurarse del buen funcionamiento de todo
el sistema: condiciones operativas, reactivos, plasmas a analizar, etc. Si es
necesario, repetir las muestras.
8/ REACTIVOS Y MATERIALES AUXILIARES
•
•
TCTubo 1 - TCTubo 2
– Inter-series
Se probaron un plasma normal y dos plasmas positivos en AL sobre
ST4 en días distintos con los reactivos de Staclot® LA. Los resultados
obtenidos fueron los siguientes:
Plasma positivo a Plasma positivo b
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 1
Tubo 2
30
48,2
1,3
30
48,5
1,2
30
98,7
2,9
30
54,2
1,3
30
64,1
2,1
30
49,6
0,9
En estos estudios de reproducibilidad intra- e inter-series, el plasma
normal ha sido siempre negativo y los plasmas que contienen AL ha sido
siempre positivos.
BIBLIOGRAFÍA
1. RAUCH J., TANNENBAUM M., JANOFF A.S.:
“Distinguishing plasma lupus anticoagulants from anti-factor antibodies
using hexagonal (II) phase phospholipids”. Thromb. Haemostasis, 62,
3, 892-896, 1989.
2. RAUCH J., JANOFF A.S.:
“Phospholipid in the hexagonal II phase is immunogenic: evidence for
immunorecognition of nonbilayer lipid phases in vivo”. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 4112-4114, 1990.
3. ROISIN J.-P., CONTANT G., MARTINOLI J.L.:
“Detection of lupus-like anticoagulants (LA). Use of hexagonal
phosphatidylethanolamine and of an APTT reagent sensitive to LA”.
Thromb. Haemostasis, 65, 6, abstract 2023, 1991.
4. TRIPLETT D.A., HANNAH D., BARNA L.:
“Hexagonal (II) phase phospholipid neutralization of lupus
anticoagulants: a specific and sensitive confirmatory procedure”.
Thromb. Haemostasis, 65, 6, abstract 2021, 1991.
5. MIGAUD M., ROISIN J.P., MOREL S., MARTINOLI J.L.:
“Diagnosis of lupus anticoagulants using three new standardized
reagents” in “Vth International Symposium on Antiphospholipid
Antibodies”, San Antonio, USA, 9-12 September 1992, abstract P3-02,
1992.
6. TRIPLETT D.A., BARNA L.K., UNGER G.A.:
“A hexagonal (II) phase phospholipid neutralization assay for lupus
anticoagulant identification”. Thromb. Haemostasis, 70, 5, 787-793,
1993.
7. BRANDT J.T., TRIPLETT D.A., ALVING B., SCHARRER I.:
“Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update”. Thromb.
Haemostasis, 74, 4, 1185-1190, 1995.
8. BLANCO A.N., CARDOZO M.A., CANDELA M., SANTARELLI M.T.,
BIANCO R.P., LAZZARI M.A.:
“Anti-factor VIII inhibitors and lupus anticoagulants in haemophilia A
patients”. Thromb. Haemostasis, 77, 4, 656-659, 1997.
9. ARNOUX D., BOUTIERE B., SANMARCO M.:
“Les anticorps “antiphospholipides” : intérêt clinique et diagnostic
biologique”. Ann. Biol. Clin., 58, 5, 557-574, 2000.
10. GREAVES M., COHEN H., MACHIN S.J., MACKIE I.:
“Guidelines on the investigation and management of the
antiphospholipid syndrome”. Br. J. Haematol., 109, 4, 704-715, 2000.
Plasma positivo 1 Plasma positivo 2
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 1
Tubo 2
30
42,9
0,5
30
42,5
1,3
30
103,5
2,6
30
54,2
2,6
30
59,9
1,1
30
43,5
1,4
9 min
50 µl
50 µl
1 min
100 µl
100 µl
5 min
100 µl
100 µl
Los cambios significativos son indicados por las líneas punteadas en el margen.
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