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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGIA Estudio preliminar del potencial solubilizador de fosfato tricálcico por micromicetos saprobios de suelos del estado de Veracruz TESIS Trabajo de Experiencia Recepcional Que presenta: Yamel del Carmen Perea Rojas Directora: Dra. Gabriela Patricia Heredia Abarca Xalapa Ver. Abril, 2013 Agradecimientos A la Dra. Gabriela Patricia Heredia Abarca, por su esfuerzo, dedicación y entusiasmo, en el desarrollo de este trabajo, así como su paciencia y amabilidad para enseñarme este maravilloso mundo microscópico, el cual ha servido en gran parte para mi formación profesional. A los miembros del comité tutorial, Dra. Beatriz Palmeros Sánchez, M. en C. Yadeneyro de la Cruz Elizondo, por sus comentarios y consejos en este trabajo. A mi maestra de experiencia recepcional Dra. Socorro Fernández, por su ayuda y disposición en los trámites de la tesis. A la Dra. Rosa María Arias Mota, por su ayuda en la realización de la parte estadística de este trabajo, así como por los comentarios realizados para el mejoramiento del manuscrito. A la Q. F. Ariadna Martínez Virudez, por su valiosa ayuda en la realización de la parte cuantitativa de fósforo. Al Laboratorio de Micromicetos saprobios del INECOL, por la oportunidad de realizar mi tesis en sus instalaciones, permitirme el uso del inmobiliario, así como la facilitarme las cepas evaluadas en esta tesis. Al CONACYT el apoyo económico proporcionado través del proyecto “Aplicación de las interacciones fúngicas en la restauración y fertilización del suelo” con clave 2011/169124 . El cual fue de gran ayuda para el término del presente manuscrito Dedicatoria A mi abuelo Victor Perea, por nunca dejar de creer en mí, ser mi fuente de inspiración y enseñarme con su ejemplo la virtud del trabajo y esfuerzo. A mis padres Marisa y Xocoyotzin, por su amor, comprensión, ayuda y por nunca dejarme sola. Me han dado todo lo que soy como persona, los amo. A mis hermanitas Ameyallí y Nayeli, con mucho amor por siempre darme la alegría necesaria para que mi vida funcione y porque con ustedes tengo los recuerdos más bellos de mi vida. A mi novio Luis Mariano, por no dejarme caer ante la adversidad, por su amor y su apoyo para terminar esta etapa de mi vida. Índice 1.- Introducción…………………………………………..…………………………………………….………………1 1.1. Ciclo del fósforo en el suelo. ....................................................................................... 1 1.2.Organismos fosfatosolubilizadores………..…………………...…………………………….…………3 1.3. Solubilización de fósforo por micromicetos filamentosos. ......................................... 3 2 . Antecedentes...................................................................................................................... 6 3. Justificación ........................................................................................................................ 5 4. Hipótesis ............................................................................................................................. 6 5. Objetivo general ................................................................................................................. 8 5.1 Objetivos particulares …………………...…….…………………………………………………………..8 6. Materiales y metodología ................................................................................................... 9 6.1. Reactivación de cepas de micromicetos filamentosos saprobios. ................................... 9 6.2. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de fosfato en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. ........................................................................................................... 9 6. 2.1. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de las cepas incluidas en la escala III, mediante el cálculo del índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) ....................................................................................................................................... 11 6.3. Evaluación cuantitativa de la actividad solubilizadora de las cepas con los valores más altos del índice ERS.............................................................................................................. 12 6.3.1. Cuantificación de la biomasa fúngica. ................................................................ 13 6. 4. Análisis estadísticos...................................................................................................... 14 7. Resultados......................................................................................................................... 15 7.1. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de Ca3(PO4)2 en medio sólido. .. 15 7.2. Índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) de las cepas incluidas en la escala III de solubilización. ............................................................................................................. 23 7.3. Dinámica de crecimiento y valores del índice de ERS de las especies con más alta capacidad de solubilización. ................................................................................................. 25 7. 4. Evaluación cuantitativa de las cepas con mejor respuesta solubilizadora según el índice de ERS. ...................................................................................................................... 28 7.4.1. Relación entre el pH del medio y la solubilización de fósforo en los cultivos líquidos de las tres especies seleccionadas. ................................................................... 29 7.4.2. Relación entre la biomasa fúngica total de las cepas y la solubilización de fósforo en los cultivos líquidos de las tres especies seleccionadas. .............................. 32 8. Discusión .......................................................................................................................... 33 9. Conclusiones……………………………………………...………..…………………………………….…….….38 10. Pespectivas…………………………………………………………………………………..……………………39 11. Bibliografía ..................................................................................................................... 40 Anexo 2 ................................................................................................................................ 47 Anexo 3 ................................................................................................................................ 48 Anexo 4 ................................................................................................................................ 50 Resumen El fósforo (P) es uno de los elementos vitales en los organismos por su participación como constituyente primario de los sistemas de almacenamiento y transferencia de energía. A pesar de que existe un alto contenido de P total en los suelos, generalmente no se encuentra disponible para las plantas, por lo cual puede llegar a ser una de las principales limitantes en la producción agrícola. El objetivo central de esta investigación fue valorar la capacidad solubilizadora de fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2) de micromicetos filamentosos saprobios nativos de suelos del centro del estado de Veracruz. Lo anterior con la finalidad de seleccionar cepas con capacidad solubilizadora alta de fosfato Ca3(PO4)2 que pudieran ser utilizadas en investigaciones futuras encaminadas a mejorar la fertilidad de los suelos agrícolas de la región central veracruzana. Paralelamente se analizó la relación del pH y la producción de biomasa fúngica con la capacidad solubilizadora de fosfato de las cepas con mejor respuesta solubilizadora. El trabajo consistió de cuatro etapas; en la primera se reactivaron las cepas, las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio de micromicetos del Instituto de Ecología A. C.; en la segunda etapa se realizaron pruebas cualitativas mediante la detección de halos solubilizadores, para lo cual se empleó medio de cultivo revelador con fosfato tricálcico. En esta etapa se establecieron tres escalas según el ancho del halo, las cepas con mayor grosor en el halo (escala III) fueron seleccionadas para la siguiente etapa. En la tercera etapa a las especies seleccionadas se les calculó diariamente el índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) diariamente, durante un periodo de 10 días de incubación. Las cepas con los valores más altos del ERS fueron seleccionadas para la siguiente etapa. La cuarta etapa consistió en el desarrollo de un ensayo para la evaluación cuantitativa en medio líquido; para cada especie y para el tratamiento control se prepararon 5 repeticiones, las mediciones se efectuaron cada tercer día durante un periodo de 10 días de incubación. La valoración del P soluble fue por el método de reducción del ácido ascórbico a una absorbancia de 880 nm. En cada muestreo se midió el pH del medio y al final del ensayo se obtuvo la biomasa fúngica total de las 3 cepas evaluadas. De 375 cepas que se intentó reactivar solamente 151 crecieron, de las cuales 120 tuvieron una respuesta positiva en la prueba de solubilización en medio sólido. Algunos de los aislamientos que dieron positivo no habían sido registrados en la literatura como fosfato solubilizadores. Un total de 25 cepas fueron ubicadas en la escala III, entre las cuales sobresalieron especies de los géneros Penicillium y Aspergillus. En los resultados del índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) se detectó que el periodo de crecimiento para la respuesta óptima de cada hongo fue variable. Las especies con mayor índice de ERS, fueron: Penicillium waksmanii, P. brevicompactum C103 y Sagenomella diversispora. En los resultados de la cuarta etapa, los valores máximos de solubilización para cada una de las tres cepas variaron según el tiempo de incubación. En los cultivos de P. waksmanii se cuantificó la mayor concentración de P soluble (98.26 mg/L) al sexto día, le siguió P. brevicompactum C103 (70.74 mg/L) al cuarto día y S. diversispora (51.46 mg/L) al décimo día. La acidificación del medio en los cultivos de las cepas estudiadas fue baja, únicamente en P. waksmanii se encontró que a mayor solubilización se presentó mayor acidificación en el medio. En ninguna de las cepas la producción de biomasa estuvo relacionada con la solubilización de fosfato. Tomando en cuenta los resultados obtenidos, la presente contribución aporta las bases para la realización de estudios futuros con cepas nativas adaptadas a las condiciones edafoclimáticas de la región y pone en relieve la importancia de conocer la diversidad específica y fisiológica de la micobiota edáfica. Lo anterior con la finalidad de valorar su conservación y evaluar su potencial biotecnológico para restaurar y mejorar la fertilidad de los suelos mediante estrategias biológicas que sean de bajo costo y amigables con el medio ambiente. 1. Introducción El P es uno de los elementos vitales para los organismos por su participación como constituyente primario de los sistemas responsables del almacenamiento y transferencia de energía. Además, es uno de los componentes básicos en la estructura de macromoléculas de interés crucial en las células, tales como ácidos nucleicos y fosfolípidos, por lo que se puede decir que su papel está generalizado en todos los procesos fisiológicos (Fernández, 2007; Domínguez, 1997). 1.1. Ciclo del fósforo en el suelo. El ciclo del P es un sistema dinámico (Figura 1), en el que tanto la estructura físico-química del suelo como la microbiota edáfica compuesta por bacterias, actinomicetos y hongos, juegan un papel importante en su almacenamiento y disponibilidad para la vegetación. En el sistema edáfico mediante el proceso de meteorización se degrada la roca ígnea y son liberados fosfatos inorgánicos; mientras que en el proceso de mineralización, los microorganismos del suelo realizan la conversión del P orgánico a P inorgánico (Stevenson, 1986; Domínguez, 1997). En la naturaleza el fósforo puede encontrarse de las siguientes formas: a. Fósforo orgánico: Los fosfatos orgánicos provienen de los restos de plantas, animales, hongos y bacterias. La materia orgánica constituye una reserva importante de P en los suelos, formando de un 30-50% de P en la mayoría de los suelos, aunque esta cantidad es más alta en áreas tropicales (Pérez, 2009; Cabala, 1970). Las formas orgánicas fosfatadas presentes en los suelos están representadas por el fosfato de inositol (IP) y los ácidos nucleicos (Bobadilla y Rincón, 2008). 1 b. Fósforo inorgánico: El P inorgánico se clasifica en tres fracciones dependiendo de cómo se encuentre en el suelo: i. Fosfatos solubles: son los que se encuentran de manera disponible para las plantas. Las concentraciones normales de P soluble en el suelo varían de 0,1 a 1 µg g-1 (Paul y Clark, 1996). ii. Fosfatos intercambiables: son los que forman enlaces con el limo y la arcilla del suelo. iii. Fosfatos insolubles: se forman mediante enlaces fuertes con iones metálicos, en suelos ácidos existe una mayor afinidad del P a formar enlaces con los iones de calcio (Ca2+) y aluminio (Al3+), mientras que en suelos alcalinos el P suele formar enlaces con los iones de fierro (Fe3+) y magnesio (Mg2+) (Bobadilla y Rincón, 2008). Los enlaces de Ca3(PO4)2 son los más fáciles de romper con la ayuda de microorganismos, mientras que los fosfatos de Al3+ y Fosfato de Fe3+, debido a que se presentan como películas adheridas en las superficies de arcilla y limo, tienen una baja solubilidad (Domínguez, 1997). Los fosfatos inorgánicos en el suelo son absorbidos por las plantas cuando se encuentran en estado soluble como iones ortofosfatos. Los ortofosfatos que no son absorbidos por el sistema rizosférico, forman rápidamente enlaces con partículas del suelo como arcillas, limos o iones metálicos, lo que impide que las raíces de las plantas puedan absorberlos e incorporarlos a su metabolismo. De esta forma, el P atrapado queda como depósito en el suelo y solo puede ser reincorporado al ciclo por acción de organismos fosfato solubilizadores, capaces de romper los enlaces con iones metálicos y dejar el P nuevamente en forma soluble (Montecinos, 1997; Domínguez, 1997). Figura 1.- Dinámica y reciclaje del fósforo en el suelo. Tomado de Dominguez (1997). 2 1.2.-Organismos fosfato solubilizadores. La comunidad microbiana es el componente funcional más importante de la biota del suelo, participa en el flujo de energía, la transformación de nutrientes y el reciclaje de elementos, por lo que tiene una influencia directa en la fertilidad y productividad de los ecosistemas (Moratto et al., 2005). Los hongos, en particular los micromicetos filamentosos y las bacterias, tienen la habilidad de solubilizar el P en el suelo (Vera et al., 2002; Khan et al., 2009). Diversos estudios han determinado, que los hongos filamentosos del suelo poseen una habilidad mayor para solubilizar la roca fosfórica que las bacterias (Goméz-Guiñán y Zabala, 2001), por lo cual estos microorganismos podrían representar una alternativa para incrementar la disponibilidad del P en suelos ácidos como los de muchas zonas tropicales y semitropicales, en donde la mayor parte del P se encuentra atrapado en complejos insolubles de Ca3(PO4)2. Diversos estudios con micromicetos han mostrado la capacidad solubilizadora de fosfatos en especies de los géneros Aspergillus, Penicillium, Scleortium, Fusarium, Trichoderma, Mucor, Cladosporium y Paecilomyces (Montecinos, 1997; Vassilev et al., 1997), entre los cuales, se ha comprobado que los dos primeros presentan un mayor potencial solubilizador sobre los demás (Reddy et al., 2002; Varsha y Patel, 2000; Vassilev et al., 1997). 1.3. Solubilización de fósforo por micromicetos filamentosos. La ruta principal de los micromicetos para la solubilización del P es la producción de ácidos orgánicos, en la que el grupo anión del ácido reacciona con el ion metálico haciendo un enlace más estable que en el complejo formado con el P, tomando el anión del ácido el lugar del P en el enlace (Sayer et al., 1995). La eficacia de la solubilización mediante ácidos orgánicos depende de la naturaleza y fuerza de los mismos (Walpola y Yoon, 2012), puesto que los ácidos con grupos funcionales como el carboxilo e hidroxilo actúan como agentes quelantes de los iones metálicos, con los cuales el P forma complejos insolubles; la producción de estos agentes quelantes provocan un descenso del pH en la solución (Yadav y Verma, 2012). Se ha reportado que los ácidos orgánicos más usados en el proceso de solubilización son el ácido glucónico y el 2-ketoglucónico, aunque se conocen también a los ácidos oxálico, acético, cítrico, láctico, malónico, fumárico y tartárico (Walpola y Yoon, 2012). 3 Otro mecanismo de solubilización del P es mediante la producción de enzimas fosfatasas, las cuales al romper el enlace éster de las formas insolubles de P, liberan los iones de ortofosfato asimilables para las plantas y unen el ion metálico con un grupo hidróxilo (Sayer et al., 1995). La producción de fosfatasas por hongos esta mediada por la disponibilidad de P y el pH en el suelo; un pH óptimo para el funcionamiento de una fosfatasa ácida es de 5,0 y para la fosfatasa alcalina de 9,0 (Bobadilla y Rincón, 2008). El presente trabajo se enfoca en la evaluación de la capacidad de cepas de micromicetos saprobios edáficos para solubilizar fosfato tricálcico, con la finalidad de seleccionar especies nativas para efectuar futuros estudios encaminados en la restauración y mejoramiento de la fertilidad de suelos de zonas tropicales y semitropicales del centro del estado de Veracruz en donde las concentraciones de P soluble son muy bajas. 4 2. Antecedentes Entre los trabajos pioneros enfocados en la temática de solubilización de fosfatos por micromicetos se encuentran los de Ramos et al. (1968) y Sethi y Subba-Rao (1968); los primeros autores realizaron aislamientos de micromicetos en suelos agrícolas de la región de Andalucía en España y reportaron especies de los géneros Aspergillus y Penicillium como las más frecuentemente aisladas y con mayor poder de solubilización de fosfatos de calcio. Los segundos autores trabajaron con suelos de Dehi y Ludhiana en la India y reportaron los géneros de Acrothecium, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Mortierella, Paecilomyces, Penicillium, Phoma y Rhizoctonia como solubilizadores de Ca3(PO4)2 y de fitato de calcio. Múltiples estudios posteriores han confirmado la capacidad fosfato solubilizadora de los géneros mencionados y destacado el potencial de diversas especies de Penicillium y Aspergillus (Thomas et al., 1985; Nahas, 1996; Vassilev et al., 1997). En cuanto a los factores que influyen en la capacidad solubilizadora de los hongos, Barroso et al. (2006), reportan que las fuentes de carbono, galactosa, sacarosa y maltosa pueden influir positivamente en la eficiencia de la solubilización de fosfato de aluminio y de calcio. Para México son pocos los trabajos sobre microorganismos solubilizadores de P, entre los cuales se le ha brindado mayor atención al estudio de las bacterias solubilizadoras de P (Pérez, 2012; Rivera-Cruz et al., 2011; Paredes, 2010) más que a las especies fúngicas. Recientemente se han sido publicadas las investigaciones de Hernández-Leal et al. (2011), quienes evaluaron la actividad solubilizadora de fosfato en complejos de Ca3(PO4)2 y FePO4 de la cepa nematófaga de Paecilomyces lilacinus aislada del Cofre de Perote, y la de Posada et al. (2012), quienes trabajaron con micromicetos de suelos de cafetales de Colombia y México, estos autores reportan como especies solubilizadoras de fosfato a Penicillium janthinelum, Paecilomyces marquandii, Cylindrocarpon didymum y C. obtusisporum. 5 3. Justificación A pesar de que existe un alto contenido de P total en los suelos generalmente no se encuentra de manera disponible para las plantas, por lo cual puede llegar a ser una de las limitantes principales en la producción agrícola (Vázquez et al., 1998). En suelos ácidos como es el caso de los suelos tropicales, la adsorción de P está generalmente asociada a los óxidos e hidróxidos de Ca+2, Al+3 y Fe3+, así como al porcentaje de limo y arcilla del suelo (Vázquez y Morales, 2000; Montecinos, 1997). La deficiencia de P disponible generalmente es atendida mediante la aplicación de fertilizantes comerciales, sin embargo estas prácticas son costosas y poco efectivas por la conversión rápida del P soluble a insoluble (Moratto et al., 2005; Finck, 1988; Mikanová y Nováková, 2002). A nivel nacional en el estado de Veracruz más del 96% de los agricultores utilizan fertilizantes en los cultivos, siendo los fertilizantes fosfatados los que ocupan el segundo lugar en su uso (Ávila, 2001). La importancia de conocer la capacidad solubilizadora de la micobiota nativa de los suelos radica en la necesidad de plantear alternativas económicas y amigables con el ambiente, que permitan mejorar la disponibilidad del P para las plantas (Ramos et al., 1968; Mikanová y Nováková, 2002), lo que podría ser una alternativa para reducir la aplicación de los productos químicos de uso convencional. Por otro lado si consideramos que las reservas mundiales de fósforo son limitadas, no es difícil prever problemas masivos de sustentabilidad a corto y mediano plazo, ya sea por el encarecimiento de la fertilización fosfatada o directamente por agotamiento de los depósitos de este nutriente (Montecinos, 1997). 6 4. Hipótesis - Dentro del Reino Fungi los micromicetos destacan por ser altamente diversos, abundantes y con amplia distribución geográfica. Múltiples estudios han demostrado la capacidad de algunas especies de micromicetos aislados del suelo para solubilizar fosfatos que se encuentran atrapados en compuestos complejos. Tomando en cuenta que el estado de Veracruz posee una alta biodiversidad de organismos fúngicos, es de esperar que en los suelos de la región, se encuentren una importante riqueza de cepas de micromicetos fosfato solubilizadores. - Dado que se ha documentado que especies de los géneros Penicillium y Aspergillus presentan una alta capacidad para solubilizar fosfatos, se espera que las cepas evaluadas en este estudio pertenecientes a estos géneros, resulten con una mayor capacidad para solubilizar Ca3(PO4)2 que el resto de las cepas. - Si los ácidos orgánicos excretados por los hongos juegan un papel importante en la solubilización del fósforo, es de esperar que en las pruebas cuantitativas de las especies con mayor capacidad solubilizadora se presente una mayor disminución del pH. - Si la producción de biomasa micelial está relacionada positivamente con la capacidad de los hongos para solubilizar fosfatos, entonces en las pruebas cuantitativas en medio líquido, las especies con mayor capacidad solubilizadora producirán una mayor biomasa micelial. 7 5. Objetivo general: Seleccionar cepas de micromicetos filamentosos saprobios nativos de suelos del centro del estado de Veracruz, con alta capacidad solubilizadora de fosfato a partir de Ca3(PO4)2. 5.1 Objetivo particulares: Evaluar mediante pruebas cualitativas la capacidad fosfato solubilizadora a partir de Ca3(PO4)2 de al menos 100 aislamientos de micromicetos filamentosos saprobios de suelo. Determinar el índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) de los aislamientos que resulten con mayor tamaño de halo en las pruebas cualitativas. Analizar la dinámica de crecimiento de las colonias de las cepas con mayor índice de ERS y determinar si existe alguna relación entre ambos factores. Evaluar cuantitativamente en medio líquido la capacidad fosfato solubilizadora a partir de Ca3(PO4)2 de los aislamientos con mayor índice de ERS. Determinar la relación entre el pH y la respuesta fosfato solubilizadora en la cepas seleccionadas y evaluadas cuantitativamente en medio líquido. Determinar la relación entre la producción de biomasa fúngica y la respuesta fosfato solubilizadora en las cepas seleccionadas y evaluadas cuantitativamente en medio líquido. 8 6. Materiales y metodología En la figura 2 se presenta un diagrama en donde se resumen las diferentes etapas que se abarca el presente estudio, mismas que a continuación se describen: 6.1. Reactivación de cepas de micromicetos filamentosos saprobios. Se utilizaron cepas de hongos del laboratorio de micromicetos del Instituto de Ecología A. C., las cuales fueron aisladas de agroecosistemas cafetaleros y del bosque mesófilo de montaña del centro del estado de Veracruz (Tabla 1). Estas cepas fueron reactivadas en medio de cultivo de papa dextrosa agar (PDA) durante 7 días a 25°C. 6.2. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de fosfato en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. Para la evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de P se empleó un medio de cultivo revelador con Ca3(PO4)2 (Sundara y Sinha, 1963). La actividad se detectó mediante la presencia de un halo claro alrededor de la colonia. El medio de cultivo se preparó con una mezcla compuesta por (NH4)2SO4 (0.5gr), KCl (0.2 gr), MgSO4-7H2O (0.3 gr), MnSO4 H2O (0.004 gr), FeSO4-7H2O (0.002 gr), NaCl (0.2 gr), D-Glucosa (10 gr), extracto de levadura (0.5 gr), cloranfenicol (0.1 gr), agar (20 gr) y agua (900 ml). Aparte se preparó una solución de fosfato compuesta por: Goma arábiga (0.5 gr), Ca3(PO4)2 (0.5 gr) y agua 100 ml. Ambas soluciones se esterilizaron por separado en una autoclave, una vez terminado el proceso de esterilización, de manera aséptica se vació la solución de fosfatos en el matraz que contenía el medio de cultivo, agitando de manera constante hasta homogenizar la solución. El medio se vació en cajas de Petri (10 cm diámetro), una vez solidificado se dejó reposar por 12 horas y se procedió a la inoculación de las cepas recién reactivadas, la cual se realizó de forma puntual en el centro de las cajas, posteriormente se incubaron durante 72 horas a una temperatura de 25° C. 9 Para categorizar el nivel la solubilización de las cepas que formaron halos, según el grosor del halo se establecieron tres escalas. Las escalas fueron: escala I colonias con halos de 1-4 mm, escala II colonias con halos de 5-8 mm y escala III colonias con halos de 9-12 mm. Las cepas ubicadas en la escala III fueron seleccionadas para la siguiente etapa. Reactivación de las cepas en papa dextrosa agar (PDA) Evaluación cualitativa de la actividad fosfato solubilizadora en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2 mediante formación de halos. Establecimiento de categorías y selección de cepas con mayor halo de solubilización (Escala III) Cálculo del índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) de las cepas incluidas en la Escala III Evaluación cuantitativa de la actividad fosfato solubilizadora en medios líquidos de las cepas con los valores más altos del índice de ERS Valoración de la relación del pH con la actividad fosfato solubilizadora, a lo largo de la evaluación cuantitativa Valoración de la relación de la biomasa fúngica total con la actividad fosfato solubilizadora, en el último día de la evaluación cuantitativa Figura 2.-Estrategia metodológica. 10 6. 2.1. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de las cepas incluidas en la escala III, mediante el cálculo del índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS). Las cepas ubicadas en la escala III fueron evaluadas mediante el cálculo del índice de ERS según Vitorino et al. (2012), el cual se obtuvo mediante la siguiente fórmula (Figura 3). ERS: Diámetro de la colonia + halo de solubilización / diámetro de la colonia Para conocer de manera precisa la medida de los diámetros de las colonias y halos de solubilización de las cepas evaluadas, se tomaron fotos a las colonias durante los días de evaluación, las cuales fueron analizadas en el programa Image J 4.0. En total se realizaron 8 mediciones durante los 10 días posteriores a la inoculación de la cepas en el medio de cultivo revelador de Ca3(PO4)2 descrito con anterioridad. Para cada cepa se emplearon 5 repeticiones. Figura 3. Diagrama de los puntos de medición para el cálculo del índice de ERS = A/B; donde A) Diámetro de la colonia + el halo de solubilización y B) Diámetro de la colonia. Para la selección de las cepas con un mayor índice de ERS se utilizó la escala establecida por Silva Filho y Vidor (2000), donde la capacidad solubilizadora es considerada como baja si el índice ERS es menor a 2, media si el índice ERS es mayor a 2 pero es menor de 3 y alta si el índice ERS es mayor de 3. Paralelamente al cálculo del índice de ERS se evaluó la tasa de crecimiento de las colonias con la finalidad de detectar alguna relación entre la dinámica de crecimiento y el índice de ERS. 11 6.3. Evaluación cuantitativa de la actividad solubilizadora de las cepas con los valores más altos del índice ERS. Las cepas con los índices ERS más altos fueron reactivadas por 7 días a 25 °C en medio de cultivo PDA. Posteriormente se tomaron 4 discos de la parte marginal de la colonia (5 mm de diámetro) y se inocularon en medio revelador líquido con Ca3(PO4)2. Para cada cepa y para el tratamiento testigo (sin inocular) se efectuaron 5 repeticiones. Todos los cultivos se mantuvieron a 25ºC de manera estática durante 10 días. Bajo condiciones asépticas se tomaron aproximadamente 10 ml de cada muestra a los 2, 4, 6, 8, y 10 días posteriores a la inoculación; las muestras fueron centrifugadas a 8000 rpm. durante 15 min., posteriormente se pasaron por filtros Fisherbrand G6. En cada muestreo se midió el pH con un potenciómetro. El pH de las muestras al inicio del experimentó fue de 6.8. La cantidad de P soluble se evaluó por el método de reducción del ácido ascórbico, a 880 nm, para lo cual se empleó un espectrofotómetro Genesys 20. La técnica empleada se detalla a continuación: A cada muestra una vez filtrada y centrifugada se le agregaron 2 ml de reactivo combinado (Anexo 1), de manera paralela se preparó la curva de calibración (Anexo 1), todas las muestras (incluidas las de la curva) se agitaron en vortex durante 10 seg., posteriormente se dejaron reposar durante 20 min., una vez transcurrido el tiempo se tomaron las absorbancias de la curva de calibración y posteriormente se tomaron las absorbancias de las muestras sometidas a evaluación. Para el cálculo de la concentración total de P soluble en mg/L (CTP) se utilizó la siguiente ecuación: CTP = (FD) (C. mg/L) En donde: FD = Factor de dilución de la muestra C. mg/L = (Absorbancia de la muestra – intercepto) / (pendiente) 12 Para el cálculo del intercepto: Donde b: Para el cálculo de la pendiente: *Nota: Tanto en el cálculo del intercepto como la pendiente, x expresa los promedios de la concentración en mg/L de P en la curva de calibración, e y expresa los promedios de las absorbancias obtenidas de las muestras de la curva de calibración. 6.3.1. Cuantificación de la biomasa fúngica. En la última evaluación cuantitativa (al décimo día), los cultivos se pasaron por filtros Fisherbrand P5 pesados con anterioridad en una balanza analítica. Las muestras de la biomasa fúngica retenida en los filtros se colocaron en una estufa (marca Presicion 2EG) a 40° C por 24 horas, después se dejaron enfriar en un desecador durante 10 min. y se pesaron en una balanza analítica hasta obtener peso contaste. Una vez obtenido el peso seco final se le resto al valor del peso del papel filtro. 13 6. 4. Análisis estadísticos. Para determinar las diferencias entre los valores en los índices de ERS de las cepas incluidas en la escala III y en la evaluación cuantitativa se aplicó un ANOVA de una vía. Cuando se detectaron diferencias se procedió a realizar una prueba de Tukey para conocer entre que cepas o entre qué días se presentaron las diferencias significativas. Para relacionar la capacidad solubilizadora de las cepas con los factores siguientes: pH del medio, crecimiento de las colonias y producción de biomasa micelial se aplicaron análisis de regresión lineal simple. Todos los análisis se efectuaron con el programa Statistica 8.0. 14 7. Resultados 7.1. Evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de Ca3(PO4)2 en medio sólido. De un total de 375 cepas de hongos saprobios filamentosos que se intentaron reactivar, únicamente 151 crecieron en el medio de cultivo. Todas las colonias reactivadas fueron evaluadas en el medio revelador con Ca3(PO4)2 . De las 151 cepas, 120 (79.5%) formaron halos de solubilización (Tabla 1). Tomando en cuenta las escalas establecidas; 55 cepas (45.8%) se ubicaron en la escala I, 40 cepas (33.3%) en la escala II y 25 cepas (20.8%) en la escala III de solubilización. La escala I (halos de 1-4 mm de grosor) estuvo representada por 24 géneros entre los que sobresalen especies de Trichoderma, Oidiodendron, Pencillium ,Chaetomium, y Humicola; en la escala II (halos de 5-8 mm de grosor) se situaron 12 géneros entre los que se incluyen especies de Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cylindrocarpon y Talaromyces; y en la escala III (halos de 9-12 mm de grosor) se encuentran 13 géneros, entre los que sobresalen Penicillium, Aspergillus, Fusarium y Eupenicillium (Tabla 1). 15 Tabla 1.- Resultados de la evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora de fosfato, escala de solubilización, valores del índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) y procedencia de las cepas de micromicetos estudiadas. Especie Solubilización Ca3(PO4)2 **Escala de solubilización ***ERS Procedencia Acremonium byssoides - - Cafetal Acremonium chrysogenum 2gh177 + II BMM Acremonium chrysogenum 66 - - BMM Acremonium roseolum 18 + III Acremonium salmoneum + I BMM Anungitopsis sp. gh 370 - - Cafetal Apiosordaria yaeyamensis + I Cafetal Arthrobotrys oligospora* + I Cafetal Arthrographis cuboidea + I BMM Aspergillus candidus 6* + III Aspergillus cervinus - - Aspergillus sclerotiorum 17 + III 1.5/B (5) Cafetal Aspergillus sydowii 5 * + III 2/M (5) Cafetal Aspergillus tamarii + II + III Beauveria bassiana + II BMM Chaetomium crispatum - - Cafetal Chaetomium cochliodes - - Cafetal Chaetomium funicola + I Cafetal Chaetomium fusiforme + I Cafetal Aspergillus sp. 1Y 19 2.5/M (5) 2.3/M (5) BMM BMM Cafetal Cafetal 1.8/B (7) BMM 16 Chaetomium globosporum - - Cafetal Chaetomium hexagonosporum - - Cafetal Chaetomium ochraceum - - Cafetal Chaetomium piluliferum + I BMM Chaetomium turgidopilosum + I Cafetal Chaetomium sp. 208 - - Cafetal Chrysosporium pannorum + I BMM Chrysosporium serpens + I BMM Cladosporium cladosporioides 16* + III Cordana oblongispora + II BMM Cordana pauciseptata 288 + I BMM Cordana pauciseptata 2gh 113 + I BMM Cylindrocarpon congoense + II Cafetal Cylindrocarpon didymum + II Cafetal Cylindrocarpon olidum + II Cafetal Eladia saccula + I Cafetal Epicoccum nigrum 21 + III 2.2/M (4) Cafetal Eupenicillium euglaucum 11 + III 2.7/M (8) Cafetal Eupenicillium levitum + II + III Eurotium amstelodami + II Cafetal Exophiala jeanselmei var. jeanselmei + I Cafetal Eupenicillium ludwigii 13 2.2/M (4) Cafetal Cafetal 2.3/M (3) Cafetal 17 Exophiala pisciphila + I Cafetal Fusarium moniliforme var. subglutinans * + II Cafetal Fusarium solani * - - Cafetal Fusarium sp. 1 + II Cafetal Fusarium sp. 2 + II Cafetal Fusarium sp. 12 + II Cafetal Fusarium sp. 18 + II Cafetal Fusarium sp. 19 + II Cafetal Fusarium sp. 25 7 + III 2.2/M (3) Cafetal Fusarium sp. 3Y 8 + III 2.3/M (3) BMM Geomyces pannorum var. asperulatus gh 422 + I Cafetal Geomyces pannorum var. asperulatus 2gh 183 + I BMM Gliocephalotrichum bulbilium - - Cafetal Gonytrichum chlamydosporium var. simile + I Cafetal Graphium sp. 3gh 114 + I Cafetal Graphium sp. 3gh 108 - - BMM Harposporium lilliputanum + II Cafetal Humicola sp. 2gh 18 + I Cafetal Humicola sp. 2gh 26 + I Cafetal Humicola sp. 2gh 205 1 + III Humicola sp. 2gh 131 + I Cafetal Humicola sp. 2gh 275 + I Cafetal Humicola sp. 2gh 118 + II Cafetal 2.2/M (3) Cafetal 18 Humicola sp. 3gh 122 + I Merimbla sp. 3gh 18 2 + III Nectria fuckeliana - - Cafetal Nectria inventa + I Cafetal Nectria radicícola + II Cafetal Nigrospora oryzae - - Cafetal Oidiodendron maius + I Cafetal Oidiodendron rhodogenum C5 + I Cafetal Oidiodendron rhodogenum 196 + I Cafetal Paecilomyces puntonii + II Cafetal Penicillium arenícola 23 + III Penicillium brevicompactum 3gh 17 * + I Penicillium brevicompactum C103 22 * + III Penicillium canescens + II Cafetal Penicillium citrinum 94 * - - Cafetal Penicillium citrinum 2gh 9 * + II BMM + III Penicillium glandicola + II Cafetal Penicillium implicatum * + II Cafetal Penicillium lividum C29 + II Cafetal Penicillium lividum 2gh 6 + I Cafetal Penicillium melinii + I Cafetal Penicillium glabrum 15 * Cafetal 1.7/B (5) 2/M (6) Cafetal Cafetal Cafetal 3.6/A (6) 1.7/B (5) Cafetal Cafetal 19 Penicillium miczynskii 24 + III 2.2/M (3) BMM Penicillium olsonii 14 + III 2/M (6) Cafetal Penicillium pinophilum * + II Cafetal Penicillium purpurogenum * + I Cafetal Penicillium restrictum - - Cafetal Penicillium simplicissinum * + II Cafetal Penicillium verrucosum gh 327 9 + III Penicillium verrucosum 2gh 4 + II Penicillium waksmanii 3 + III Penicillium vulpinum + II Penicillium sp. 90 10 + III Penicillium sp. 96 + I Cafetal Penicillium sp. 99 + II Cafetal Phialomyces sp. 3gh 86 - - Cafetal Phialomyces sp. 355 + I BMM Phialophora richardsiae 440 + I Cafetal Phialophora richardsiae 2gh 105 + I Cafetal Phoma minutispora + I Cafetal Phoma sp. 354 + I Cafetal BMM Pseudogliomastix protea - - 25 + III Scopulariopsis acremonium + II Sagenomella diversispora 2.2/M (8) Cafetal BMM 3.8/A (8) BMM Cafetal 2.2/M (4) 3.5/A (7) Cafetal BMM Cafetal 20 Scopulariopsis brevicaulis + II + III Sporothrix schenckii + I Cafetal Talaromyces flavus var. flavus 2gh 100* + I Cafetal Talaromyces flavus var. flavus C31 12 * + III Talaromyces trachyspermus + II Cafetal Talaromyces wortmannii + II Cafetal + II Cafetal + III Trichoderma pubescens - - BMM Trichoderma strictipile 3gh 10 + II Cafetal Trichoderma strictipile 2gh 241 + I Cafetal Trichoderma strictipile C81 - - Cafetal Trichoderma virens + I Cafetal Trichothecium roseum var. roseum * + I Cafetal Umbelopsis vasiformis + I Cafetal Verticillium albo-atrum * + I BMM Verticillium fungicola - - Cafetal Verticillium suchlasporium - - BMM Verticillium suchlasporium var. catenatum + I BMM Cepa 4 + I Cafetal Cepa 5 + II Cafetal Cepa 6 - - Cafetal Scopulariopsis brevicaulis 4 Talaromyces sp. 123 Trichocladium asperum 20 * Cafetal 1.8/B (8) 2.4/M (5) 3.1/A (5) Cafetal Cafetal Cafetal 21 Cepa 7 - - Cafetal Cepa 11 - - Cafetal Cepa 13 + II Cafetal Cepa 14 + II Cafetal Cepa 15 - - Cafetal Cepa 16 + I Cafetal Cepa 17 + II Cafetal Cepa 18 - - Cafetal Cepa 22 + I Cafetal Cepa 23 + I Cafetal Cepa 24 + I Cafetal Cepa 25 - - Cafetal Cepa 26 + II Cafetal Cepa 28 + I Cafetal Cepa 30 + I Cafetal Cepa 32 - - Cafetal Cepa 33 + I Cafetal Cepa 34 + II Cafetal Cepa 35 - - Cafetal + : presencia de halo; - : ausencia de halo *Especies reportadas en la literatura como solubilizadoras de Ca 3(PO4)2. **Escala de solubilización I: 1-4 mm, escala de solubilización II: 5-8 mm, escala de solubilización III: 9-12 mm. *** ERS: Valores máximos del índice de eficiencia relativa de solubilización según la escala de Silva-Filho y Vidor (2000). A: alta, M: media y B: baja;. El número entre paréntesis representa el día de máxima solubilización. BMM: Bosque mesófilo de montaña. Los superíndices indican las cepas representadas en la figura 4. 22 7.2. Índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) de las cepas incluidas en la escala III de solubilización. Como se mencionó anteriormente, un total de 25 cepas fueron ubicadas dentro de la escala III (Tabla 1), mismas a las que en un ensayo subsecuente se les evaluó el índice de ERS durante un periodo de 10 días. En todas las cepas el valor del índice ERS tuvo una variación constante en los diferentes muestreos efectuados. El tiempo en que se detectó la máxima respuesta solubilizadora varió considerablemente entre las 25 cepas analizadas (Tabla 1). Al respecto es factible distinguir cepas con una respuesta rápida al tercer día de crecimiento las cuales fueron las más frecuentes, tales como Humicola sp. 2gh 205, Merimbla sp. 3gh 18, Fusarium sp. 3Y y Penicillium miczynskii; otras por lo contrario tuvieron una respuesta lenta entre el séptimo y octavo día fueron Penicillium waksmanii, Sagenomella diversipora y Acremonium roseolum y finalmente están las que presentaron una respuesta intermedia entre el cuarto y quinto día de evaluación, entre estas se encuentran Penicillium olsonii, Epicoccum nigrum, Scopulariopsis brevicaulis gh 310 (Tabla 1). De acuerdo a los valores máximos obtenidos para el índice de ERS (Figura 4) y con base en la escala empleada por Silva Filho y Vidor (2000); seis de las cepas evaluadas tuvieron una actividad solubilizadora baja, las especies de este grupo son: Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus sydowii, Aspergillus sp. 1Y, Humicola sp. 2gh 205, Merimbla sp. 3gh 18 y Penicillium glabrum (Anexo 2), quince presentaron una solubilización media, las siguientes especies se ubican en este grupo: Scopulariopsis brevicaulis gh 310, Aspergillus candidus, Fusarium sp. 25, Fusarium sp. 3Y, Eupenicillium euglaucum, Eupenicillium ludwigii, Talaromyces flavus var. flavus C31, Cladosporium cladosporioides, Acremonium roseolum, Epicoccum nigrum, Penicillium arenícola, Penicillium sp. 90, Penicillium olsonii, Penicillium verruculosum gh 327 y Penicillium miczynskii (Anexo 3). Las cepas consideradas con un alto nivel de solubilización fueron Penicillium waksmanii, Sagenomella diversipora, Penicillium brevicompactum C103 y Trichocladium asperum (Anexo 4). 23 A los valores obtenidos para las cepas con los índices más altos se les aplicó un ANOVA en el que se encontró diferencias significativas entre los índices de ERS (F=21.75, p = 0.0002). La cepa de Trichocladium asperum tuvo valores menores en comparación con los de las otras tres cepas, por lo cual fue descartada de la prueba cuantitativa. Índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) 4.4 4.0 3.6 3.2 2.8 2.4 2.0 1.6 1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Cepas evaluadas Figura 4.- Valores máximos del índice ERS en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. El número de las cepas corresponde a las especies que se enlistan como superíndices en la tabla 1.Las líneas verticales corresponden a la desviación estándar, los rectángulos al error estándar y los cuadrados al promedio. Los valores son el promedio de 5 repeticiones. 24 7.3. Dinámica de crecimiento y valores del índice de ERS de las especies con más alta capacidad de solubilización. La cepa de Penicillium waksmanii tuvo un crecimiento de 1-2 mm por día, al final del ensayo alcanzó una colonia de 16 mm de diámetro. En cuanto a los valores del índice de ERS en el ANOVA se encontraron diferencias significativas (F= 40.83, p=0.0000001); del sexto al décimo día se alcanzó la máxima solubilización (Tukey p=0.003), sin que se detectaran en este periodo diferencias significativas (Figura 5). En el análisis de regresión lineal simple no se encontró relación entre el índice de ERS y el diámetro de la colonia. A B v C Figura 5.-Penicillium waksmanii. A) Gráfica de la dinámica de crecimiento e índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. B) Colonia en PDA, C) Reverso de la colonia y halo de solubilización al octavo día de crecimiento en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. Las líneas verticales corresponden a la desviación estándar. Los valores son el promedio de 5 repeticiones. 25 La cepa Penicillium brevicompactum C103 tuvo un crecimiento de 2-4 mm por día, al final del ensayo alcanzó una colonia de 28.5 mm de diámetro. En cuanto a los valores del índice de ERS en el ANOVA se encontraron diferencias significativas (F=34.94, p=0.0000001), del quinto al sexto día se detectó la máxima solubilización (Tukey p= 0.0001). A partir del noveno día el índice de ERS comenzó a disminuir (Figura 6). En el análisis de regresión lineal simple no se encontró relación entre el índice de ERS y el diámetro de la colonia. A B C Figura 6.-Penicillium brevicompactum C103. A) Gráfica de la dinámica de crecimiento e índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. B) Colonia en PDA, C) Reverso de la colonia y halo de solubilización al sexto día de crecimiento en medio revelador sólido con Ca3(PO4)2. Las líneas verticales corresponden a la desviación estándar. Los valores son el promedio de 5 repeticiones. 26 La cepa de Sagenomella diversispora tuvo un crecimiento diario de 1-4 mm, al final de la evaluación el diámetro promedio de las colonias alcanzó 20.4 mm. Desde el primer muestreo este hongo presentó poca variación en los valores del índice de ERS, el valor máximo se obtuvo al séptimo día, en el ANOVA se detectó que existen diferencias significativas (F=2.74; p= 0.04), de acuerdo a las pruebas de Tukey estas diferencias son entre el valor del último día y el resto de los valores obtenidos en el ensayo (Tukey p=0.03). A partir del octavo día se detectó una tendencia a la disminución del índice de ERS (Figura 7). En el análisis de regresión lineal simple no se encontró relación entre el índice de ERS y el diámetro de la colonia. A B C Figura 7.-Sagenomella diversispora. A) Gráfica de la dinámica de crecimiento e índice de eficiencia relativa de solubilización (ERS) en medio revelador de Ca3(PO4)2 . B) Colonia en PDA. C) Reverso de la colonia y halo de solubilización al séptimo día de evaluación en medio revelador de Ca3(PO4)2. Las líneas verticales corresponden a la desviación estándar. Los valores son el promedio de 5 repeticiones 27 7. 4. Evaluación cuantitativa de las cepas con mejor respuesta solubilizadora según el índice de ERS. Como puede apreciarse en la figura 8 existe una marcada diferencia en la cantidad del fósforo soluble entre los tratamientos con los hongos evaluados y el control, lo cual corrobora la capacidad solubilizadora de las especies seleccionadas mediante las pruebas cualitativas. En el análisis de varianza se encontraron diferencias significativas entre los valores de fósforo soluble en los cultivos líquidos de las tres especies evaluadas (F= 11.88 p= 0.000035). Los valores máximos de solubilización para cada una de las tres cepas variaron según el tiempo de incubación. Al segundo día no se encontraron diferencias significativas entre las tres cepas, posteriormente, al cuarto día en los cultivos de P. brevicompactum C103 se detectó la mayor solubilización; en los días subsecuentes y hasta el final del ensayo, fue en los cultivos de P. waksmanii fueron los que presentaron las mayores concentraciones de P soluble. En el cultivo de P. waksmanii (Figura 8) los valores de la concentración de P soluble fueron significativamente diferentes en los días que duró el ensayo (F = 151.33 p= 0.00000001). En la primera fase de crecimiento del cultivo se presentó un aumento gradual de P soluble, posteriormente al sexto se obtuvieron las concentraciones más altas (98.26 mg/L) las cuales fueron significativamente mayores (Tukey p=>0.05) al resto de los días evaluados. Igualmente en los cultivos con la cepa de P. brevicompactum C103, hubo diferencias significativas en los distintos días de evaluación (F= 10.75, p=0.000081), a partir del cuarto día (70.74 mg/L) y hasta el final del ensayo, la concentración de P soluble alcanzó los máximos valores, sin que se encontraran diferencias significativas durante dicho periodo de incubación (Figura 8). 28 La cepa de Sagenomella diversispora tuvo una menor actividad solubilizadora en comparación con las cepas de Penicillium; en el ANOVA se encontraron diferencias entre los días de incubación (F=7.07 p= 0.001), la más alta solubilización de fósforo se detectó al décimo día (51.46 mg/ L), sin embargo no fue significativamente mayor a la encontrada al sexto y octavo día (Figura 8). 120 Fósforo soluble ( mg/L) 100 80 Control Sagenomella diversispora 60 Penicillium brevicompactum 40 Penicillium waksmanii 20 0 2 4 6 8 10 Días de evaluación Figura 8.- Evaluación cuantitativa en medio revelador líquido con Ca3(PO4)2. de la capacidad solubilizadora de las tres especies seleccionadas. Las líneas verticales corresponden a la desviación estándar.Los valores son el promedio de 5 repeticiones. 7.4.1. Relación entre el pH del medio y la solubilización de fósforo en los cultivos líquidos de las tres especies seleccionadas. A lo largo del periodo que duró el ensayo, en todos los tratamientos con los hongos evaluados hubo un descenso en el pH. La magnitud y forma en que los cultivos se acidificaron fue diferente en cada una de las especies, mientras que en el control el pH se mantuvo prácticamente sin cambios notorios. Tanto en P. brevicompactum C103 como en S. diversispora (Figuras 9 C y D) el pH bajó una unidad al segundo día, en el primer caso continuó disminuyendo muy ligeramente y en el segundo se mantuvo en el mismo nivel y aumentó al final del ensayo. 29 En el análisis de regresión lineal simple para la cepa de P. waksmanii se detectó una tendencia significativa (p= 0.03, Figura 10) a la disminución del pH en el periodo de mayor solubilización del fósforo (Figuras 9B). A B C D Figura 9.- Relación entre la solubilización de Ca3(PO4)2, y la variación del pH, por las 3cepas evaluadas cuantitativamente. A) Testigo, B) Penicillium waksmanii, C) Penicillium brevicompactum C103 y D) Sagenomella diversispora. Las barras indican el fósforo solubilizado y las líneas el valor de pH. 30 Figura 10.- Relación entre la solubilización de Ca3(PO4)2 y el pH del medio en Penicillium waksmanii. 31 7.4.2. Relación entre la biomasa fúngica total de las cepas y la solubilización de fósforo en los cultivos líquidos de las tres especies seleccionadas. La cepa que más biomasa produjo fue P. waksmanii con 263.8 mg, seguido de P. brevicompactum C103 con 253 mg y S. diversispora con 125.6 mg. Aunque no se encontraron diferencias significativas entre la biomasa total y la concentración de fósforo soluble cuantificado al final del ensayo, se detectó una tendencia en donde la especie con menor biomasa fue la que tuvo la menor solubilización (Figura 11). C103 Figura 11.- Biomasa fúngica total en relación con el fósforo soluble al décimo día de evaluación en las cepas Penicillium waksmanii, Penicillium brevicompactum C103 y Sagenomella diversispora en medio revelador líquido con Ca3(PO4)2. Los valores mostrados son el promedio de 5 repeticiones. 32 8. Discusión Más del 50% de las cepas que se intentó reactivar (375) no crecieron, probablemente esto se debió a que el material había estado refrigerado por casi 7 años, lo que pudo ocasionar alteraciones fisiológicas en las cepas. Al respecto cabe mencionar que Hartung et al. (1989), reportan que la viabilidad de algunas colonias puede disminuir hasta en un 50% en lapsos de 5-10 años de almacenamiento. Este fenómeno es una limitante que debe ser considerada en el empleo biotecnológico de los hongos microscópicos filamentosos. Para evitar el detrimento fisiológico de las cepas es aconsejable probar diferentes métodos de conservación y efectuar una constante resiembra para reactivar periódicamente las cepas (Fernández et al., 2012). El empleo de las pruebas reveladoras mediante halos en el medio de cultivo sólido, resultó de gran utilidad para detectar de forma relativamente sencilla y rápida las cepas que tienen capacidad solubilizadora. No obstante que solo el 40% de las cepas probadas mostraron desarrollo activo (120 cepas), un alto porcentaje de ellas (79.4%) formó halos solubilizadores. Por lo que es factible concluir que los suelos de donde se aislaron los micromicetos del presente estudio destacan por el alto número de cepas fosfato solubilizadoras. Es importante señalar que las cepas estudiadas provienen de suelos de bosque mesófilo de montaña y de fincas cafetaleras con diferentes tipos de sombreado en las que existe un alto porcentaje de materia orgánica (Geissert e Ibáñez, 2008). Así mismo, por la presencia de diferentes especies arbóreas nativas del bosque mesófilo, estos sitios presentan una considerable acumulación de restos vegetales que al descomponerse incrementan el humus en los horizontes edáficos superiores. Esta situación podría explicar el alto número de especies solubilizadoras, dado que la presencia de una alta población de micromicetos solubilizadores ha sido relacionada positivamente con el contenido de materia orgánica en el suelo (Vera et al., 2002). De acuerdo a la literatura, 19 de los 42 géneros evaluados con respuesta positiva a la solubilización de Ca3(PO4)2 en el presente trabajo, al parecer no han sido reportados como solubilizadores, estos géneros son: Anungitopsis, Arthrographis, Beauveria, Gliocephalotrichum, Nigrospora, Chrysosporium, Cordana, Cylindrocarpon, Eladia, 33 Geomyces, Merimbla, Nectria, Oidiodendron, Phialomyces, Phialophora, Pseudogliomastix, Sagenomella, Sporotrix y Umbelopsis. Los resultados obtenidos corroboran la alta capacidad fosfato solubilizadora de las especies de los géneros Penicillium y Aspergillus. De las 25 especies evaluadas de Penicillium, 23 formaron halos de solubilización, así mismo, todas las cepas correspondientes a los géneros Eupenicillium y Talaromyces los cuales son estados sexuales o perfectos de Penicillium resultaron positivas. Por esta razón, a la fecha los aislamientos de especies del género Penicillium son los más estudiados como solubilizadores de fosfatos y de los cuales se ha logrado obtener cepas que actualmente son empleadas como biofertilizantes, tal es el caso del producto Fosfosol © comercializado en Colombia (Ñústez y Acevedo, 2005). De la misma forma que para Penicillium, la mayoría de las cepas evaluadas del género Aspergillus, tuvieron respuestas positivas a la solubilización, en este caso, 5 de las 6 cepas formaron halos, 4 de ellas alcanzaron la escala III. La producción de diferentes tipos de ácidos como ac. oxálico y ac. cítrico, por las especies de Aspergillus, se ha asociado con su capacidad para solubilizar fosfatos (Narsian y Patel, 2000). Debido a las limitaciones de tiempo y material no se seleccionaron cepas de este género para las etapas subsecuentes del presente trabajo, no obstante por la capacidad de las especies de Aspergillus para solubilizar sería interesante retomar los aislamientos positivos para futuras investigaciones. Los valores obtenidos en la primera fase del estudio, dan soporte a futuras investigaciones enfocadas en algunas especies, que aun cuando no presentaron una respuesta sobresaliente en la formación de halos (escalas I y II), podrían ser efectivas por poseer otras propiedades con aplicación biotecnológica. Entre las cepas que resultaron positivas están algunas especies que se emplean como agentes de control biológico para plagas o enfermedades, tal es el caso de Beauveria bassiana que es un hongo entomopatógeno usado en el control de plagas como la mosca blanca (Wraight et al., 2000), coleópteros de la especie Monochamus alternatus (Shimazu et al., 1992), garrapatas de la especie Rhipicephalus appendiculatus (Mwangi et al., 1995), entre otras. Así mismo dentro del género Chaetomium se han probado diversas especies que tienen una respuesta antagónica ante importantes fitopatógenos como son Phytophthora spp., Fusarium oxysporum y Sclerotium rolfsii 34 (Soytong et al., 2001). Por su parte dentro del género Trichoderma se han estudiado especies que por su capacidad para producir compuestos antibióticos y micoparasíticos son empleadas como agentes de control biológico de importantes fitopatógenos. Entre las especies más comercializadas para el control biológico se encuentra Trichoderma virens a partir de la cual se elabora el producto Tri-abax ® (Argumedo-Delira et al., 2009; www.abaxton.com). En cuanto a los resultados del índice de ERS, cabe mencionar que la variación en el periodo de crecimiento para la respuesta óptima de solubilización de cada cepa es un factor que debe ser considerado en la programación de los ensayos experimentales para dar oportunidad a la expresión de las especies con respuesta lenta, tal fue el caso de la mejores cepas detectadas en este trabajo. Al comparar con trabajos similares los índices de ERS de P. waksmanii, P. brevicompactum C103 y S. diversispora, los cuales están en un rango de 3.5 a 3.8 (Tabla 1), es evidente que su capacidad solubilizadora es superior a los encontrados por Morales et al. (2011) quienes reportan un máximo de 1.3 para cepas de las especies Penicillium albidum, P. thomii, P. restrictum, P. frequentans, Gliocladium roseum y Penicillium sp. En la valoración cuantitativa, la ausencia de P soluble en los controles claramente demuestran que las tres cepas evaluadas son fosfato solubilizadoras y que la manipulación de los cultivos fue la adecuada. La cepa de P. waksmanii mostró la mayor solubilización seguida de las cepas de P. brevicompactum C103 y S. diversispora (Figura 9), este comportamiento coincide con los resultados de la evaluación cualitativa de la actividad solubilizadora (Figura 4), lo cual confirma la confiabilidad de las técnicas empleadas. Contrario a lo obtenido en este trabajo para la cepa de P. waksmanii, Coutinho et al. (2011), mediante pruebas cualitativas semejantes no detectaron en dicha especie capacidad para solubilizar fosfatos, estos resultados permiten suponer que existe variación en la expresión fisiológica entre las especies. Estudios futuros son requeridos para comparar la respuesta de cepas de la misma especie provenientes de diferentes hábitats. Tanto el manejo de los suelos como sus características físico-químicas son factores que podrían estar influyendo en el comportamiento fisiológico de la microbiota edáfica (Thomas et al., 1985). 35 En lo que respecta a la cepa de P. brevicompactum C103, Gómez-Giñán y Zabala (2001), también aislaron esta especie de la rizosfera de maní, los resultados de estos autores en cuanto a la capacidad solubilizadora de la cepa en cuestión son ligeramente mayores (88.85 μg/ml de P soluble) a los obtenidos en el presente trabajo (70.74 mg/L). Para la cepa de S. diversispora no se encontraron trabajos en donde se reporte su capacidad para solubilizar fosfato. El género Sagenomella, morfológicamente presenta un parecido con los géneros Penicillium y Aspergillus, por lo que podría suponerse que están relacionados filogenéticamente y que comparten vías metabólicas semejantes lo que explicaría su capacidad solubilizadora. Los mecanismos de solubilización que emplean las especies fúngicas es una temática polémica; diversos autores han asociado la disminución del pH por la producción de ácidos orgánicos, con la efectividad de solubilización (Gómez-Guillán y Zabala, 2001; HernándezLeal et al., 2011; Chun-Chao et al., 2007). En los resultados obtenidos del presente trabajo únicamente en la cepa de P. waksmanii (Figura 9B) se encontró una relación estadísticamente significativa, consistente en que a medida que aumentó la solubilización del P disminuyó el pH del medio. Ninguna de las tres cepas evaluadas provocó una pronunciada acidificación del medio de cultivo, la mayor acidificación se detectó en el cultivo de P. brevicompactum C103, en el cual el pH disminuyó de 6.8 a 5.1 al final del estudio (Figura 9C). Estos resultados son contrarios a los obtenidos por Gómez-Guiñan y Zabala (2001) y Chun-Chao et al. (2007) quienes mencionan que la solubilización de Ca3(PO4)2 está relacionada con el descenso en el pH. En relación a este punto, Barroso y Nahas (2005) y Walpola y Yoon (2012) indican que la solubilización por acidificación depende de la naturaleza y fuerza del ácido que el hongo produzca, puesto que existen ácidos como los tri o di- carboxílicos que son más eficientes solubilizadores que los ácidos mono básicos y aromáticos. En algunas investigaciones se ha reportado que enzimas como la fosfatasa ácida y la fitasa están involucradas en la solubilización del P (Vitorino et al., 2012; Gómez-Guiñán y Zabala, 2001; Narasian y Patel, 2000; Reddy et al., 2002; Barroso y Nahas, 2005). Estas enzimas rompen el enlace éster de las formas insolubles de P, dejando iones de ortofosfato asimilables para las plantas (Sayer et al., 1995). 36 Por lo cual es recomendable que en subsecuentes estudios se analicen las enzimas fosfatasa ácida y fitasa, para conocer sí las especies estudiadas solubilizan el P mediante la producción de enzimas en vez de la producción de ácidos orgánicos, lo cual podría explicar la baja fluctuaciones del pH en las cepas estudiadas. Así mismo, es factible pensar que varios procesos estén asociados en la solubilización de los fosfatos. En cuanto a los resultados de la producción de la biomasa fúngica total de las tres cepas evaluadas, se muestra que no existe una relación positiva significativa con la cantidad de P solubilizado, este comportamiento coincide con Lara et al. (2011), Vassilev et al. (1997) y Moratto et al.(2005). 37 9. Conclusiones Los suelos cafetaleros y del bosque mesófilo de montaña del centro de Veracruz resguardan un alto porcentaje de micromicetos fosfato solubilizadores. De acuerdo al índice de ERS se corroboró que especies de los géneros Penicillium y Aspergillus presentan una alta capacidad para solubilizar fosfatos. De las 25 cepas evaluadas, Penicillium waksmanii, Sagenomella diversispora, Penicillium brevicompactum C103 y Trichocladium asperum obtuvieron los índices de eficiencia relativa más altos. No se encontró relación entre la dinámica de crecimiento de las cepas seleccionadas y la variación del ERS. En la evaluación cuantitativa de Ca3(PO4)2 la cepa P. waksmanii obtuvo la mayor solubilización de fósforo (98.26 mg/L). Solamente en la cepa de P. waksmanii se encontró en el medio líquido una relación entre la disminución del pH y la solubilización del P. La producción de biomasa fúngica no estuvo relacionada con la capacidad solubilizadora en ninguna de las cepas evaluadas cuantitativamente. 38 10. Perspectivas La presente contribución aporta las bases para la realización de estudios futuros con cepas nativas adaptadas a las condiciones edafoclimáticas de la región. Los resultados obtenidos muestran las potencialidades de algunas cepas como agentes solubilizadores de fosfatos. Lo que brinda la posibilidad de su empleo como bio-inoculos en suelos agrícolas con deficiencia en fósforo, situación prevalente en los suelos de la región del centro de Veracruz. Para lo cual es necesario el planteamiento de experimentos a nivel de invernadero y de campo que evalúen la capacidad solubilizadora de las cepas en diferentes tipos de suelos, así como su respuesta al interactuar con el resto de la biota edáfica. Es necesario complementar este tipo de trabajos con la evaluación in vitro de factores que podrían potenciar la solubilización del P como son diferentes fuentes de carbono y nitrógeno. Así mismo resulta interesante conocer la capacidad de estos hongos para solubilizar diferentes fuentes de P no disponible como son los compuestos de fosfato de hierro y fosfato de aluminio. Por otro lado es importante profundizar en los mecanismos de solubilización para conocer en qué forma interactúan los cambios de pH con la producción de enzimas. La importancia de conocer la diversidad específica y fisiológica de la micobiota edáfica radica en valorar su conservación y evaluar su potencial biotecnológico para restaurar y mejorar la fertilidad de los suelos mediante estrategias biológicas que sean de bajo costo y amigables con el medio ambiente para así reducir el uso de fertilizantes químicos. 39 11. Bibliografía Argumedo D., Alarcón R., Ferrara C., R. y Peña C. J. J., 2009. El género fúngico Trichoderma y su relación con contaminantes orgánico e inorgánico. Revista Internacional de Contaminación Ambiental 25 (4): 257269. Ávila J., 2001. El mercado de los fertilizantes en México/ situación actual y perspectivas. Problemas del Desarrollo 189-207. Barroso C. B. y Nahas E., 2005. The status of soil phosphate fractions and the ability of fungi to dissolve hardly soluble phosphates. Applied Soil Ecology 29: 73-83. Barroso C. B., Pereira G. T. y Nahas E., 2006. 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Finalmente se efectúan las lecturas en el espectrofotómetro, esta reacción tiene una estabilidad de hasta 24 horas de confianza. 45 Preparación de reactivos: Reactivo combinado* Reactivo 300 ml 200 ml 150 ml 50 ml 25 ml H2S04 5N 150 ml 100 ml 75 ml 25 ml 12.5 ml (NH4)3C4H4O6 15 ml 10 ml 7.5 ml 2.5 ml 1.25 ml (NH4)6Mo7N6O2.4H2O 45 ml 30 ml 22.5 ml 7.5 ml 3.75 ml C6H8O6 (Disolver en agua destilada) Agua destilada 1.584 gr 1.056 .792 gr .264 gr .132 gr 90 ml 60 ml .45 ml 15 ml 7.5 ml **NOTA: Los reactivos deben agregarse en ese orden, de lo contrario la reacción no se llevará a cabo. Ácido sulfúrico concentrado 5 N (H2S04 5N) En 600 ml de agua destilada se agregan 140 ml de H2S04 concentrado y se aforan a un litro. Tartrato de antimonio [(NH4)3C4H4O6 ] Se disuelven .3gr de (NH4)3C4H4O6 en 50 ml de agua destilada, posteriormente se aforan a 100 ml. Esta mezcla debe mantenerse en refrigeración a 4°C. Molibdato de amonio [(NH4)2MoO4] Disolver 4 gr de (NH4)2MoO4 en 100 ml de agua destilada. Se mantiene en refrigeración a 4°C. Ácido ascórbico (C6H8O6) Se disuelve la cantidad a utilizar en agua destilada hasta que desaparezcan los gránulos. Este compuesto se prepara al momento de utilizarse. 46 Anexo 2 Cepas pertenecientes a la escala III de solubilización de Ca3(PO4)2, con ERS bajos (Escala de Silva-Filho y Vidor, 2000). A D B C E F Figura 12.- A) Aspergillus sclerotiorum , B) Aspergillus sydowii, C) Aspergillus sp. 1Y, D) Merimbla sp 3gh 18, E) Humicola sp. 2gh 205 y F) Penicillium glabrum . 47 Anexo 3 Cepas pertenecientes a la escala III de solubilización de Ca3(PO4)2, con ERS medianos (Escala de Silva-Filho y Vidor, 2000). A B C D E F D D A A H G D A I A 48 M J M K L N Figura 13.- A) Scopulariopsis brevicaulis, B) Cladosporium cladosporioides, C) Aspergillus candidus, D) Acremonium roseolum, E) Fusarium sp. 3Y, F) Fusarium sp. 25, G) Penicillium miczynskii , H) Eupenicillium euglaucum, I) Eupenicillium ludwigii, J) Talaromyces flavus var. flavus C31, K) Epicoccum nigrum, L) Penicillium verruculosum gh 337 M) Penicillium olsonii y N) Penicillium sp. 90 49 Anexo 4 Cepas pertenecientes a la escala III de solubilización de Ca3(PO4)2, con ERS altos (Escala de Silva-Filho y Vidor, 2000). . A B C D Figura 14 .- A) Penicillium waksmanii, B) Penicillium brevicompactum, C) Sagenomella diversispora y D) Trichocladium asperum 50
