UNIVERSIDAD DE COLIMA Facultad de Medicina CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS Evaluación de la citotoxicidad por acetaminofén en rata: Efecto de la melatonina T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FARMACOLOGÍA PRESENTA HECTOR ARTURO MAGAÑA ASESORA DRA. ESPERANZA GARCÍA MARTÍNEZ 1 INTRODUCCION El hígado contribuye al mantenimiento de la homeostasis en los vertebrados debido a su participación en procesos de biosíntesis y biodegradación. Además representa la glándula secretora más voluminosa al generar la bilis; ésta facilita la absorción intestinal de grasas y vitaminas liposolubles, permitiendo la eliminación de productos del catabolismo, como la bilirrubina (Bowman y Rand, 1984; Frazier, 1995; González, 1996). El hígado es una estructura heterogénea constituida por los siguientes componentes: 1) Células parenquimatosas o hepatocitos 2) Células reticuloendoteliales (células de Kupffer) 3) Vías biliares 4) Vasos sanguíneos y células almacenadoras de grasa (Ito y cols., 1994; González, 1996). ESTRUCTURA MICROSCÓPICA DEL HÍGADO. La unidad estructural del hígado consiste en un lobulillo poliédrico, descrito en los cortes histológicos como un hexágono (Celis, 1994). Este lobulillo parece estar organizado alrededor de la vena central, simplemente por el aspecto histológico del hígado; sin embargo, desde una perspectiva funcional, el lobulillo hepático también puede considerarse como un acino, con su centro en el espacio portal (González, 1996; Leeson y Leeson, 1977). El concepto del acino permite definir 3 zonas diferentes: la zona 1 o periportal (PP), próxima a los vasos terminales portales y arteriales, la zona 2 o intermedia (1), y la zona 3 o perivenosa (PV), situada alrededor de los vasos terminales eferentes (Figura 1). 2 FIGURA 1. ESTRUCTURA MICROSCOPICA DEL HIGADO. El hígado está integrado por masas de células epiteliales parenquimatosas (hepatocitos) dispuestas en cordones que se ramifican y anastomosan, entre los que se encuentran espacios sanguíneos sinusoidales. También se encuentran zonas denominadas áreas portales o conductos portales que incluyen ramas de la arteria hepática, vena porta y conductos biliares. Las zonas portales se disponen de forma tal que limitan los lobulillos del tejido hepático. El lobulillo hepático tiene varios conductos portales en su periferia, y en su centro tiene una vena central, tributaria de la vena cava inferior, de la que parten cordones radiados de células parenquimatosas en un eje central. Esta unidad estructural se repite miles de veces. Al observar los vasos aferentes (vena porta y arteria hepática) en la periferia del lóbulo y los vasos eferentes (vena central) en el centro del lóbulo, es evidente que la corriente sanguínea va de la periferia por los conductos sinusoidales, entre los cordones de hepatocitos hacia la vena central. La secreción de bilis de los hepatocitos fluye hacia los pequeños conductos biliares de la periferia. Los espacios sinusoidales entre los cordones hepáticos están revestidos de células retìculoendoteliales que se encuentran en una trarna de fibras reticulares finas (Modificado de Gartner y Hiatt, 1994 y Leeson y Leeson, 1997). 3 Las tríadas portales (o espacios portales) que se sitúan en la periferia del acino, a nivel de los ángulos del hexágono, contienen ramas intrahepáticas de los conductos biliares, de la arteria hepática, y de la vena porta. La vena central o vénula hepática terminal, como su nombre lo indica, se ubica en el centro del lobulillo. Desde este punto irradian láminas de hepatocitos con el espesor de una célula, que se extienden hasta el perímetro del lobulillo, donde se continúan con las láminas o trabéculas de otros lobulillos. Entre las trabéculas de hepatocitos están los sinusoides hepáticos, revestidos por células endoteliales, células de Kupffer y las células para almacenamiento de lípidos, denominadas células de Ito. Las células de Kupffer son macrófagos tisulares capaces de fagocitar bacterias y otras células extrañas. Entre el revestimiento endotelial y el parénquima hepático se sitúa un espacio extracelular, el espacio de Disse, que se comunica con el espacio intravascular por medio de fenestraciones del endotelio (Figura 1) (Beales y McLean, 1995; Chanda y Mehendale, 1996a; González 1996). El hígado presenta una doble circulación aferente: la que proviene del intestino por la vena porta, y la de la circulación sistémica, por la arteria hepática. El sistema de irrigación de la arteria hepática transporta sangre oxigenada mientras que el sistema porta transporta sustancias asimiladas en la digestión. La sangre aferente se distribuye en los hepatocitos a través de unos capilares especializados o sinusoides y posteriormente se drena a través del sistema de la vena hepática (González, 1996; Leeson y Leeson, 1977). Los vasos sanguíneos de gran calibre, que ingresan a través del hilio hepático, se dividen más adelante en pequeñas ramas interlobulillares de la arteria hepática y la vena porta de los espacios portales. Desde estos últimos los vasos interlobulillares distribuyen sangre hacia los sinusoides hepáticos, que fluyen en dirección centrípeta hacia la vena central. Las venas centrales se unen y forman venas sublobulillares que luego se fusionan para dar lugar a las venas suprahepáticas (González, 1996; Jungermann y Katz, 1989; Leeson y Leeson, 1977). La bilis fluye en dirección opuesta a la de la sangre y es secretada por los hepatocitos hacia el interior de los canalículos biliares; éstos están formados por la aposición de las superficies laterales de los hepatocitos 4 contiguos. Desde los canalículos, la bilis fluye hacia los conductillos biliares (conductos de Hering o colangiolos) en la periferia de las tríadas portales y luego desemboca en una rama del conducto biliar intrahepático. En el interior de cada lóbulo del hígado, los conductos biliares pequeños se fusionan de manera progresiva y forman los conductos hepáticos derecho e izquierdo. Las células del parénquima o hepatocitos, que representan aproximadamente el 60% del total de las células hepáticas son células en cuya membrana plasmática existen tres zonas perfectamente diferenciadas: la membrana sinusoidal (en contacto con los sinusoides), la membrana intercelular y la membrana canalicular. Esta última contribuye a delimitar, junto con la de otras dos o tres células adyacentes, los canalículos biliares, que siguen un sentido opuesto al de la circulación y convergen para formar finalmente el conducto biliar, el cual desemboca en el duodeno (González, 1996; Gartner y Hiatt, 1994). Los hepatocitos de la zona 1 están expuestos a sangre con una elevada concentración de oxígeno y solutos, mientras que los de la zona 3 se encuentran bañados por sangre con menor concentración de nutrientes y oxígeno (Figura 1). Una de las funciones más importantes del hígado es la relacionada con la biotransformación de un gran número de fármacos y toxinas. Los mecanismos enzimáticos responsables de los procesos de biotransformación son de dos tipos: las reacciones de Fase I y las reacciones de Fase II. Las primeras son fundamentalmente reacciones de óxido-reducción donde se incluyen los procesos de oxidación, reducción e hidrólisis. Las enzimas más importantes implicadas en las reacciones de Fase I son las oxidasas de función mixta del sistema del Citocromo P450 (CYP450). Las reacciones de Fase II son reacciones de conjugación catalizadas por enzimas transferasas e incluyen conjugación con sulfato, glucurónido y glutatión (Bowman y Rand, 1984). Debido a su gran irrigación sanguínea y al estrecho contacto que guarda con los fármacos y con sus metabolitos, el hígado es el principal órgano que está expuesto al daño producido por los metabolitos tóxicos resultantes de la biotransformación de los fármacos (Hinson y Forkert, 1995). 5 LESIONES HEPÁTICAS TÓXICAS. La gama de lesiones hepáticas agudas inducida por agentes químicos es tan amplia que abarca todo el espectro de enfermedades hepáticas, desde la colestasis (demostración morfológica de Ia presencia de pigmento biliar en los canalículos biliares y los hepatocitos, que refleja una disminución del flujo biliar a través de los canalículos y una reducción de la secreción de agua, bilirrubina y ácidos biliares por parte del hepatocito) transitoria, y clínicamente trivial, hasta la hepatitis fulminante fatal. Las lesiones hepáticas tóxicas crónicas son igualmente diversas y conforman un espectro que abarca desde una hepatitis persistente leve hasta una cirrosis activa (Rubin y Farber, 1992). En general, ciertas sustancias químicas hepatotóxicas producen invariablemente necrosis hepatocelular; las características que definen a las lesiones hepáticas provocadas por estas hepatotoxinas “previsibles” son las siguientes: 1) El agente responsable, en dosis suficientemente elevadas, siempre induce necrosis hepatocelular. 2) El grado de la lesión hepática depende de la dosis. 3) Estos compuestos inducen el mismo tipo de lesiones en diferentes especies (con algunas excepciones). 4) La necrosis hepatocelular es típicamente zonal y, con frecuencia, centrilobular. 5) El periodo transcurrido entre la exposición a la toxina y el desarrollo de necrosis hepatocelular es breve. En la mayoría de los casos, la necrosis hepática tóxica es consecuencia del metabolismo del compuesto por parte del sistema hepático de oxidasas de función mixta del CYP450, y éste es responsable de la producción de especies activas de oxígeno y metabolitos reactivos. La mayoría de las reacciones provocadas por las drogas son impredecibles y en muchos de los casos parecería que representan manifestaciones de sensibilidad poco usual hacia un efecto colateral relacionado con la dosis del fármaco. La predisposición a desarrollar reacciones de hipersensibilidad puede presentarse en sujetos con vías metabólicas diferentes a las de la mayoría de la población, o bien en aquellos 6 que responden de manera exagerada a un efecto farmacológico específico distinto al efecto terapéutico deseado. Las drogas y las sustancias químicas que ejercen efectos hepatotóxicos previsibles y que actúan a través de sus metabolitos, típicamente provocan necrosis centrilobular. Esta regionalización del daño se debe a que las enzimas encargadas del metabolismo de las drogas presentan mayor actividad en las zonas centrales. Algunos ejemplos de estos agentes incluyen el tetracloruro de carbono, el acetaminofén y las toxinas del hongo Amanita phalloides. En las zonas afectadas los hepatocitos presentan necrosis por coagulación y acumulación variable de lípidos. Si la dosis de la hepatotoxina es lo suficientemente alta, la necrosis puede afectar la totalidad del lobulillo. Sin embargo, los pacieliles o bien fallecen de insuficiencia hepática aguda o se recuperan sin secuelas (Rubin y Farber, 1992). CARACTERÍSTICAS DEL ACETAMINOFÉN. El acetaminofén (paracetamol, N-acetil-p-aminofenol, 4- hidroxiacetanilida, ó APAP) es un analgésico antipirético que se utiliza actualmente en la clínica con humanos (Halmes y cols., 1995; Mìtchell y cols., 1973a y b; Prescott y cols., 1974). A dosis terapéuticas [1.2 g/día en el hombre (Katzung, 1991)] presenta una gran seguridad farmacológica (Prescott y Critchley, 1983) y se considera como un sustituto seguro y de fácil adquisición de la aspirina, ya que no presenta efectos secundarios tales como ulceración o hemorragia gastrointestinal (Al-Obaidy y cols., 1995; Al-Obaidy y cols., 1996; Chen y Lin, 1996). Confiando en la seguridad farmacológica del APAP, inicialmente no se llevaron a cabo estudios farmacológicos serios; sin embargo, cuando se encontró que el APAP representaba el principal metabolito de la acetanilida y de la fenacetina, dos fármacos utilizados en la clínica como analgésicos (Bowman y Rand, 1984; Katzung, 1991) el interés sobre sus características y propiedades fisicoquímicas y farmacológicas aumentó considerablemente. Uno de los hallazgos más importantes sobre la farmacología del APAP fue el reportado por Eder y cols., (1964), quienes reportaron estados necróticos hepáticos en gatos a los que se administró una dosis diaria de 25-50 mg/kg de acetaminofén durante 26 semanas. Dos años después, en estudios de 7 toxicidad aguda realizados en ratas, Boyd y Bereczky describieron un daño hepático extensivo (Prescott y Critchley, 1983; Prescott y cols., 1971). El control clínico de los pacientes que son admitidos en los centros hospitalarios con daño hepático severo causado por enfermedad, envenenamiento accidental, o intentos suicidas con drogas hepatotóxicas como el APAP o tetracloruro de carbono (CCI4 ) es un reto constante para los médicos. La incidencia mundial de muerte por sobredosis de APAP (dosis >15 gramos) durante las dos décadas pasadas aumentó dramáticamente; la necrosis hepática aguda, seguida de falla renal fulminante, ha sido la causa de las muertes (Chanda y Mehendale, 1996a; Prescott y Critchley, 1983). BIOTRANSFORMACION DEL ACETAMINOFÉN. El principal órgano involucrado en el metabolismo del APAP es el hígado (Bowman y Rand, 1984). En general, la biotransformación del APAP puede abordarse desde dos condiciones diferentes (Figura 2): A) biotransformación de dosis terapéuticas y B) biotransformación de sobredosis de APAP, o en estados de intoxicación (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996). A) Biotransformación de dosis terapéuticas. El metabolismo de los xenobióticos que, como el APAP, presentan grupos fenólicos se realiza principalmente por mecanismos de conjugación con ácido glucurónico y sulfato. Las reacciones de conjugación con glucurónido son catalizadas por la familia de enzimas de la difosfato glucuronosiltransferasa (UDP), enzimas que se encuentran unidas a la membrana del retículo endoplásmico. Esta familia de enzimas forma aglicones conjugando UDP-ácido glucurónico con los grupos hidroxilo de los compuestos fenólicos (Figura 2) (Roberts y cols., 1995). Las reacciones de sulfatación, por otra parte, son catalizadas por la familia de enzimas diméricas de las aril-sulfotransferasas, que utilizan al 3’fosfoadenosin-5’-fosfosulfato fonnando un éster sulfato (PAPS) como donador del grupo sulfato, fenólica, adenosin-5’-monofosfato y fosfato inorgánico (Liu y Klaassen, 1996; Roberts y cols., 1995). En ratas, la sulfatación del APAP se reconoce como una reacción de conjugación de alta afinidad y baja capacidad. La baja capacidad se debe a la 8 disponibilidad limitada de PAPS, que a la vez depende de la disponibilidad de su precursor, el sulfato inorgánico (Liu y Klaassen, 1996; Roberts y cols., 1995). En general, la glucuronidación y la sulfalación incrementan la hidrosolubilidad de los xenobióticos, disminuyendo el volumen de distribución y permitiendo la inactivación de los compuestos para su rápida excreción tubular renal (Roberts y cols., 1995). La tercera ruta más importante en el metabolismo del APAP es la oxidación a través del sistema microsomal de las oxidasas de función mixta del CYP450, específicamente por las isoformas 2E1, 1A2 y 3A4 (Halmes y cols., 1995; Webster y cols., 1996) que biotransforman el APAP a los derivados oxidados 3-hidroxi-APAP, 3-metoxi-APAP y N-acetil-p-amino benzoquinona imina (NAPQI) (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996). La eliminación de los productos del metabolismo de conjugación de dosis terapéuticas de APAP se realiza a través de los riñones, como conjugados de glucurónido o sulfato, y muy pequeñas cantidades como conjugados de glutatión y NAPQI; ninguno de estos metabolitos resulta tóxico para el organismo (Chanda y Mehendale, 1996a). En neonatos, la función metabólica hepática es reducida debido a que la maduración de las diferentes vías de biotransformación ocurre en diferentes etapas del desarrollo postnatal. Aunque prácticamente todas las funciones metabólicas se encuentran presentes a la edad de 3 meses, es hasta los 6 meses de edad que la capacidad metabólica se alcanza de forma total; sin embargo, existen amplias variaciones (Ritschel, 1980). Por lo anterior, solo del 10 al 20% del APAP se metaboliza por procesos oxidativos, excretando los productos de esta biotransformación (derivados 3-hidroxi o 3-metoxi) como conjugados de GSH por la orina (Chen y Lin, 1996). Aunque en neonatos la oxidación es cuantitativamente menos importante que la glucuronidación y la sulfatación, toxicológicamente representa el aspecto más importante en el metabolismo del APAP (Figura 2) (Al-Obaidy y cols., 1996). 9 NHCOCH3 OH3 ACETAMINOFÉN (N-acetil p-aminofenol; APAP) FASE II FASE I Citocromo P450 AUDPG UDP-glucuronil tranferasa PAPS Sulfotransferasa NHCOCH3 NHCOCH3 NHCOCH3 NHCOCH3 OCH3 O-glucurónido OSO3 Conjugado con Glucurónido Conjugado con Sulfato OH 3-Metoxi Acetaminofén NHCOCH3 OH O OH 3-Hidroxi N-acetil p-amino benzoquinona Acetaminofén Imina (NAPQI) Glutatión S-transferasa GSH NHCOCH3 EXCRECIÓN RENAL FASE II S-GSH O Conjugado NAPQI-GSH FIGURA 2. BIOTRANSFORMACION DEL ACETAMINOFÉN. Las dosis terapéuticas del acetaminofén son metabolizadas principalmente en el hígado y excretadas por los riñones, ya sea como un conjugado con yiucurónido o con sulfato (reacciones Fase II). Una muy pequeña cantidad es biotransformada por el sistema de oxidasas del citocromo P450 (reacciones Fase I) formando derivados oxidados y N-acetil p-amino benzoquinona imina (NAPQI). Tanto los derivados oxidados como el NAPQI se excretan por vía renal como conjugados con glutatión. De los tres metabolitos oxidados del APAP, el NAPQI es el que se forma en mayor concentración y solo del 5 al 10% del acetaminofén es convertido a los derivados 3-hidroxi o 3-metoxi-APAP. Ninguno de los metabolitos formados por biotransformación de dosis terapéuticas del APAP resultan tóxicos para el organismo. AUDPGA, ácido uridil-5’-difosfoglucurónico; PAPS, 3’- fosfoadenosin-5’-fosfosulfato; MFO, oxidasas de función mixta; GSH, glutatión reducido (Modificado de Chanda y Mehendale, 1996a y b). 10 B) Biotransformación de dosis tóxicas. Mientras que el APAP normalmente es biotransformado por procesos de glucuronidación, sulfatación y oxidación a dosis terapéuticas, cuando la dosis es excesiva estas rutas se saturan y el APAP excedente se metaboliza por el sistema microsomal del CYP450. En condiciones fisiológicas, la destoxificación del metabolito NAPQI, formado por la oxidación del APAP, se realiza eficientemente por el glutatión reducido (GSH), a través de la formación de conjugados 3-(GSH-S-yl)-APAP (Gibson y cols., 1996; Webster y cols., 1996) que son excretados por el riñón como conjugados de cisteína y ácido mercaptúrico (Figura 2) (Al-Obaidy y cols., 1996; Webster y cols., 1996). Sin embargo, como consecuencia del uso crónico, de las sobredosis, o de enfermedades hepáticas, las reservas de GSH disponibles para conjugación con NAPQI se agotan, ocasionando acumulación del NAPQI y , con ello, una necrosis hepática fulminante (Chen y Lin, 1996). De esta forma, el metabolismo del APAP relacionado con el CYP450 parece jugar un papel crítico en el daño hepático inducido por APAP, reconociéndose al NAPQI como el metabolito tóxico causante del daño. MECANISMOS DE LA HEPATOTOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN. Los mecanismos por los cuales el APAP produce hepatotoxicidad aún son tema de controversia, ya que mientras algunos estudios sugieren que la unión covalente del NAPQI a macromoléculas es la responsable del daño hepático, otros estudios proponen que los metabolitos reactivos del oxígeno producidos durante la biotransformación del APAP a NAPQI generan estados de estrés oxidativo responsables del daño hepático inducido por APAP (Adamson y Harman, 1993; Halmes y cols., 1995; Mitchell y cols., 1973a; Prescott y cols., 1974). A continuación se describen las bases experimentales sobre las que se fundamentan las teorías de la fijación covalente y la del estrés oxidativo. 1) Unión covalente a macromoléculas. La primera teoría propuesta para la generación del daño hepático por APAP propone que el metabolito NAPQI se une covalentemente a los grupos 11 tiol de macromoléculas celulares, principalmente a proteínas de membrana y enzimas. Esta propuesta ha basado su teoría en análisis inmunoquímicos de “Western blot” realizados en hígados de ratones tratados con dosis tóxicas del fármaco, los cuales indicaron que a nivel hepático la unión covalente del NAPQI ocurre en proteínas intracelulares especificas formando aductos 3(cisteín-S-yl)-APAP-proteína (Webster y cols., 1996). De acuerdo con Roberts y cols. (1991), quienes también realizaron análisis inmunohistoquímicos de ratones tratados con dosis tóxicas de APAP, los aductos formados por el APAP se localizan solamente en el área centrilobular, el área reconocida como el sitio blanco de la toxicidad por APAP, y no en las áreas periportales. Estos datos apoyan la correlación entre la unión covalente y la hepatotoxicidad; sin embargo, como ha sido puntualizado por Gillette (1974), la unión covalente solamente representa un ensayo para la detección del metabolito reactivo, y no para el mecanismo del daño, ya que éste podría producir la toxicidad por mecanismos diferentes (Gibson y cols., 1996). 2) Estrés oxidativo generado por el metabolismo del acetaminofén. La segunda teoría propuesta como el mecanismo de hepatotoxicidad por APAP es el estrés oxidativo, una condición en la que el balance entre las especies oxidantes y las defensas antioxidantes se inclina en favor de las primeras debido a una sobreproducción de éstas o a una disminución de los equivalentes reductores (Chen y Lin, 1996). De acuerdo con esta teoría, el metabolito reactivo del APAP actúa como un agente oxidante que produce estados de estrés oxidativo debido a la generación de especies reactivas de oxígeno como el peróxido de hidrógeno, los aniones superóxido, y el radical hidroxilo, generados durante la biotransformación del APAP a NAPQI (Figura 3). El primer paso en esta biotransformación comprende la oxidación de las dosis terapéuticas del APAP al radical N-acetil-4-aminofenoxil y peróxido de hidrógeno. El radical N-acetil-4aminofenoxil formado, posteriormente es convertido por un ciclo oxidaciónreducción asociado con la producción de aniones superóxido en presencia de oxígeno al metabolito N-acetil-p-amino benzoquinona imina (NAPQI) un metabolito electrofílico reactivo (Figura 3) (Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996). 12 Estas especies reactivas consumen el GSH disponible en las células hepáticas, convierten parte del GSH a la forma difulfuro oxidado (GSSG), producen lipoperoxidación, daño del DNA y oxidación de proteínas; es importante señalar que el ion férrico puede tener una importante función catalítica (Pal Yu, 1994). El mecanismo de fijación covalente ha sido descartado como responsable de la muerte celular mediante pruebas farmacológicas realizadas con inhibidores enzimáticos que proporcionan información acerca del estrés oxidativo generado durante el metabolismo del APAP. Con esto, es posible que la necrosis hepática en realidad se relacione con la toxicidad de especies reactivas de oxígeno y no con la fijación covalente; es decir, el metabolismo de las sustancias químicas hepatotóxicas por el CYP450 origina lesión celular irreversible por medio de mecanismos que no se relacionarían con la fijación covalente de los metabolitos reactivos. 13 NHCOCH3 OH Acetaminofén (N-acetil p-aminofenol; APAP) N-hidroxilación (Fase I) OH :N-COCH3 + OH H2O2 Peróxido de hidrógeno N-acetil-4 aminofenoxil Ciclo oxidación-reducción NHCOCH3 + O2 - O N-acetil p-amino benzoquinona Imina (NAPQI) Aniones superóxido Generación de OH . y O2 - Unión covalente a macromoléculas Estrés oxidativo MUERTE CELULAR FIGURA 3. MECANISMOS DE TOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN. En estados de intoxicación por APAP las rutas de conjugación con glucurónido y sulfato se saturan y el APAP excedente se metaboliza por el sistema de oxidasas del Citocromo P450 al metabolito NAPQI, el cual se ha reconocido como el causante de la toxicidad. Los dos mecanismos propuestos para la toxicidad por APAP son 1) la unión covalente a macromoléculas de membrana y 2) la generación de estados de estrés oxidativo como resultado de la biotransformación de APAP a NAPQI y por la acción de éste mismo. Por su naturaleza electrofílica, y ante la deficiencia del GSH, el NAPQI se une covalentemente a nivel de los grupos tiol de proteínas de membrana. Esta unión puede desencadenar la muerte celular. Durante la oxidación del APAP por el subtipo 2E1 del CYP450, se forman especies reactivas derivadas del oxígeno como los aniones superóxido (O2. ) y los radícales hidroxilo (OH. ), además de peróxido de hidrógeno (H2O2). El intermediario N-acetil-4-aminofenoxil, formado por oxidación del APAP, rápidamente es convertido a NAPQI por un ciclo oxidación-reducción en el que se generan aniones superóxido. Tanto el peróxido de hidrógeno como los aniones superóxido pueden producir la muerte celular. El NAPQI también puede generar estados de estrés oxidativo que, producen especies reactivas tales como los radicales hidroxilo y los aniones superóxido. 14 De esta forma el mecanismo de daño por la peroxidación de los fosfolípidos integrantes de la membrana representa una explicación viable ante la lesión por APAP. La peroxidación lipídica puede ser iniciada por un metabolito del compuesto original (como en el caso del CC14) o por especies de oxígeno activado formadas durante el metabolismo de la toxina (Figura 3), potenciándose esta última por el debilitamiento de las defensas antioxidantes (Gibson y cols., 1996). TRATAMIENTO CONTRA LA HEPATOTOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN. El tratamiento efectivo contra la intoxicación por APAP solo llegó a ser posible con el descubrimiento de la bioactivación del APAP a NAPQI por el CYP450, y del papel esencial que juega el tripéptido glutatión (Mitchell y cols., 1973a y b). El grado de conversión de APAP al metabolito tóxico se refleja en la fracción de la dosis recuperada en la orina como conjugados de cisteína y ácido mercaptúrico, de manera que las especies más susceptibles excretan una mayor concentración de compuestos conjugados que las especies más resistentes; en el hombre, el daño hepático después de una sobredosis de APAP se asocia con un aumento en la excreción urinaria de conjugados (Prescott y Critchley, 1983). La hepatotoxicidad por APAP se modifica en forma importante por todos aquellos factores que alteran la actividad enzimática microsomal y el nivel de GSH. Mitchell y cols., (1973a) mostraron que el daño hepático por APAP aumenta al estimular el sistema enzimático microsomal con agentes inductores tales como fenobarbital, o puede ser disminuido por inhibición con cloruro de cobalto o piperonil butóxido. En forma similar, la necrosis hepática aumenta si las reservas de GSH son saturadas por la previa administración de dietilmalato. La reducción de las reservas de GSH producida por el ayuno o por dietas bajas en proteínas también acentúan la hepatotoxicidad experimental por APAP. Por el contrario, al proporcionar precursores de GSH como a l cisteína, el daño disminuye (Prescott y Critchley, 1983). 15 A) Inhibición de la activación metabólica. La inhibición selectiva de la oxidación por CYP450, la ruta del metabolismo de APAP que genera el metabolito tóxico, representa una atractiva opción para la prevención del daño hepático. En estudios desarrollados en animales de experimentación se ha mostrado que la toxicidad aguda del APAP se reduce en forma significativa con la administración aguda de etanol (Prescott y Critchley, 1983). En este caso, la protección se atribuye a la inhibición competitiva de la activación metabólica de APAP ya que el etanol es oxidado por el mismo sistema CYP450-2E1 (Gebhardt, 1992). En las ratas, el etanol reduce en forma importante la excreción del conjugado de APAP con ácido mercaptúrico; en el hombre, una carga aguda de etanol (1.72 g/Kg cada 8 horas) reduce en forma marcada la fracción excretada de una dosis oral de APAP (20 mg/Kg) en forma de cisteína y conjugados de ácido mercaptúrico (Prescott y Critchley, 1983). El efecto protector del etanol sólo se presenta en tratamientos agudos. El consumo crónico aumenta considerablemente la hepatotoxicidad inducida con APAP e incrementa la excreción urinaria del conjugado de ácido mercaptúrico como resultado de la inducción de la biosíntesis de las enzimas microsomales (Chanda y Mehendale, 1996a y b; Prescott y Critchley, 1983). B) Estimulación de la conjugación con sulfato. Debido a que la disponibilidad de sulfato inorgánico es limitada y a que el sistema se satura fácilmente con sobredosis de APAP, se ha propuesto que la estimulación de la sulfatación a través de la administración de sulfato inorgánico representa un mecanismo eficiente que debería favorecer la eliminación del APAP después de una sobredosis. Esta hipótesis se probó administrando sulfato de sodio en ratas; aunque la conjugación y la velocidad de eliminación de APAP con sulfato aumentó, el efecto protector obtenido por esta manipulación fue mínimo por lo que no ha tenido relevancia en la clínica (Prescott y Critchley, 1983). 16 C) Compuestos sulfhidrilo. En su estado reducido, el glutatión (GSH) se considera como el antídoto ideal contra la intoxicación por APAP. La concentración intracelular del tripéptido en su forma reducida es de 0.5 mM, sin embargo, en algunos casos puede llegar hasta 10 mM (Kaplowitz y cols., 1985; Meister, 1989). La relación intracelular de las formas reducida y oxidada del glutatión (GSSG), que es de 100:1 se mantiene por la actividad de las enzimas reductasa del glutatión (GR), per-oxidasa de glutatión (GPx), transhidrogenasas y por la acción de los radicales libres. La GR es una enzima dependiente del NADPH que regenera el GSH que ha sido convertido a GSSG por oxidación y por reacciones de transferencia del grupo tiol. La enzima GPx dependiente de selenio reduce el peróxido de hidrógeno a agua y otros peróxidos (Figura 4) (Kaplowitz y cols., 1985; Meister, 1988; Meister, 1989; Meister y Anderson, 1989; Pal Yu, 1994). Se ha obtenido una baja eficiencia al administrar dosis elevadas de GSH como tratamiento para la toxicidad del APAP, por lo que se ha empleado como alternativa la estimulación de la biosíntesis del tripéptido por compuestos tales como cisteína, N-acetil-cisteína, metionina, cisteamina y otros compuestos que contienen grupos sulfhidrilo, Estos compuestos son efectivos en la prevención de la hepatotoxicidad experimental por APAP ya que impiden el agotamiento de las reservas de GSH (Prescott y Critchley, 1983). 17 COOH (CH 2) 2 CHNH2 COOH Acido Glutámico CH2SH ATP H2NCH2COOH ? Cisteína -glutamil cisteína sintetasa ADP + Pi CH2SH CO-NH-CH-COOH (CH 2) 2 CHNH2 COOH -glutamil cisteína ATP ? H2NCH2COOH Glicina Sintetasa de glutatión ADP + Pi CH2SH CO-NH-CH-CO-NHC H2COOH (CH 2) 2 CHNH2 ? COOH -glutamil-cisteinil-glicina GLUTATIÓN; GSH Nucleófilo intracelular Antioxidante FIGURA 4. GLUTATION: Biosíntesis y función. EI glutatión se encuentra en las células animales y también en muchas plantas y bacterias. En los mamíferos, el hígado es el principal órgano involucrado en la biosíntesis del tripéptido, la cual es catalizada por la acción sucesiva de las enzimas ?-glutamil-cisteína sintetasa y sintetasa de glutatión. La concentración en hígado y otros tejidos de gamma-glutamilcisteína es muy baja ya que no solo es sustrato para la sintetasa de glutatión, sino que también puede ser utilizada por la ?-glutamil-transpeptidasa y la ?-glutamilciclotransferasa. Normalmente la actividad de la ?-glutamil-cisteína sintetasa es inferior al máximo ya que es inhibida por retroalimentación por el glutatión. El glutatión sintetizado intracelularmente es transportado a través de las membranas celulares donde participa como a) fuente del glutatión plasmático (en sus formas reducida y oxidada, GSH y GSSG) b) coenzima en la reacción de la glioxalasa en la que el metilglioxal es convertido a c L-la tato c) nucleófilo intracelular en la destoxificación de metabolitos electrofílicos y d) antioxidante (Meister, 1988). 18 FARMACOS UTILIZADOS EN EL ENVENENAMIENTO POR ACETAMINOFÉN. La caracterización química y toxicológica de la naturaleza electrofílica del metabolito reactivo del APAP ha permitido la producción de antídotos eficaces, tales como la metionina, la cisteamina, la N-acetil-cisteína (Prescott y Critchley, 1983) y la L-2-oxotiazolidina-4-carboxilato (Kretzschmar, 1996). Tanto la administración de N-acetilcisteína, como de L-Z-oxotiazolidina-4carboxilato, metionina o cisteamina, protegen a los pacientes de la aparición de hepatotoxicidad fulminante y de la muerte (Bowman y Rand, 1984; Prescott y Critchley, 1983). El tratamiento a base de N-acetil-cisteína se considera actualmente como el tratamiento de elección contra el envenenamiento por APAP. Si se administra dentro de las 10 primeras horas en una dosis de 300 mg/kg, previene el daño hepático, la falla renal, e incluso la muerte en pacientes con envenenamiento severo con el fármaco. Al igual que los otros agentes estudiados en el hombre, el efecto protector de N-acetilcisteína disminuye drásticamente si el tratamiento se retarda más allá de 8-10 horas, y es inefectivo si se administra después de 15 a 16 horas (Prescott y Critchley, 1983). Mecanismos de protección. La protección contra la hepatotoxicidad inducida por APAP puede explicarse por varios mecanismos: 1) Los fármacos tales como la cisteína, la N-acetil-cisteína y la metionina que contienen al aminoácido cisteína estimulan la síntesis del GSH (Figura 4), facilitando su conjugación con APAP. Otros agentes como la cisteamina y el dimetilsulfóxido (DMSO) antagonizan la depleción inducida por APAP, e indirectamente estimulan la síntesis de GSH. La cisteamina también puede actuar inhibiendo la activación metabólica de APAP. 19 2) Cisteamina, cisteína, N-acetil-cìsteina y alfa -mercaptopropionilglicina reaccionan directamente con el metabolito tóxico de APAP, formando los conjugados correspondientes; sin embargo, la conjugación con glutatión catalizada por la glutatión-S-transferasa es una reacción de mayor afinidad. 3) Bajo ciertas condiciones el APAP puede ser regenerado a partir del NAPQI por agentes reductores tales como la cisteína y el ácido ascórbico. El ácido ascórbico puede inhibir la unión covalente in vitro del APAP a los microsomas hepáticos reduciendo la letalidad por APAP en ratones (Prescott y Critchley, 1983). 20 ANTECEDENTES. La utilización del APAP como analgésico-antipirético en la clínica con humanos ha aumentado en los últimos años. A dosis terapéuticas su biotransformación se realiza por el hígado y da como resultado la formación de conjugados APAP-sulfato y APAP-glucurónido que resulta n inocuos para el organismo; del APAP ingerido, solo el 5-10% es metabolizado por el sistema de oxidasas del CYP450, produciendo los derivados oxidados 3-hidroxi, 3 -metoxi y la iminoquinona N-acetil p-amino benzoquinona imina (NAPQI) (Chanda y Mehendale, 1996a). La intoxicación puede ser resultado de: 1) Administración de dosis terapéuticas en pacientes con deficiencia hepática crónica. 2) Utilización de altas dosis de APAP como citotóxico diferencial de células tumorales en pacientes con cáncer. 3) Administración de dosis terapéuticas en pacientes con deficiencias nutricionales. 4) Administración de dosis terapéuticas sin un control médico (particularmente en niños). 5) La ingestión voluntaria de sobredosis. En estados de intoxicación las rutas de conjugación con glucurónido y sulfato se saturan, de manera que la biotransformación mediada por el sistema del CYP450 se vuelve cuantitativamente más importante. Actualmente se reconoce que la acumulación de los metabolitos oxidativos del APAP representa la causa de la hepatotoxicidad del APAP, que puede concluir en una necrosis centrilobular fulminante. Los mecanismos de hepatotoxìcidad asociados a la intoxicación por APAP todavía se encuentran en debate. Hasta la fecha se han propuesto dos teorías: la primera propone que el metabolito NAPQI altera la función celular por unirse de manera covalente a macromoléculas de membrana, específicamente a proteínas; esta unión se favorece por las características electrofílicas del metabolito y las propiedades nucleofílicas de los grupos tiol presentes en las proteínas. La segunda teoría sostiene que el metabolito NAPQI se comporta 21 como un agente oxidante con posibilidades de iniciar un daño oxidativo; en estos casos, la oxidación de los grupos amino de las proteínas de membrana sería el principal mecanismo del daño celular (Gibson y cols., 1996). Algunos autores han propuesto que si bien la causa de la muerte celular es el estrés oxidativo, éste se produce de manera indirecta por la generación de aniones superóxido y peróxido de hidrógeno durante la biotransformación del APAP a NAPQI (Figura 3). Esta propuesta ha sido reforzada con estudios in vitro, en los que se ha mostrado que el APAP reduce de manera importante la actividad de diferentes enzimas del sistema antioxidante endógeno. Kyle y cols., (1987) y Adamson y Harman (1993) propusieron que los metabolitos derivados del oxígeno, particularmente el radical hidroxilo, desempeñan un papel importantes en la citotoxicidad del APAP in vitro. Estos investigadores probaron que al agregar- las enzimas superóxido dismutasa, catalasa, o deferoxamina (un quelador del ión férrico) al tejido hepático incubado con 1,3bis-(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU; un inhibidor de la reductasa del GSH) se previene la muerte celular, apoyando la participación de los procesos oxidativos en esta toxicidad (Adamson y Harman, 1993; Blazka y cols., 1996; Gibson y cols., 1996; Martin y McLean, 1995). Debido a que en los sistemas de cultivo de hepatocitos sometidos a condiciones de toxicidad por APAP los radicales hidroxilo altamente tóxicos y reactivos no pueden ser eficientemente destoxificados por los sistemas enzimáticos intracelulares ni por el GSH (ya que se encuentra saturado), se ha propuesto que la utilización de aquellos agentes que protegen contra el estrés oxidativo (antioxidantes) representan alternativas viables en el tratamiento de la toxicidad inducida por APAP (Arnaiz y cols., 1995; Chen y Lin, 1996; Gibson y cols., 1996). Bajo estas condiciones, las únicas defensas endógenas contra el estrés oxidativo y el daño inducido por intermediarios electrofílicos son los antioxidantes de bajo peso molecular tales como la melatonina, la cual actúa como una defensa antioxidante primaria no enzimática contra la acción del radical hidroxilo que es extremadamente reactivo (García y Peraza, 1995; Löffler, 1996; Reiter, 1994a y b). La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) representa el principal producto hormonal de la glándula pineal, producido a partir del aminoácido esencial triptofano. Recientemente se ha propuesto a la melatonina como un 22 potente depurador de radicales hidroxilo y peroxilo in vitro La capacidad depuradora de radicales peroxilo in vitro mostrada por melatonina resultó más eficiente no solo a la capacidad del GSH y del ácido ascórbico, sino que además es dos veces más eficiente que la vitamina E (Reiter, 1994b; Reiter, 1995). In vivo se ha mostrado que la melatonina protege contra la toxicidad del herbicida tóxico paraquat (Melchiorri y cols., 1996), y contra los lipopolisacáridos endotóxicos (LPS) (Sewerynek y cols., 1995b; Takeyama y cols., 1996). El mecanismo propuesto para la acción depuradora de radicales libres por melatonina se muestra en la figura 5. La hormona melatonina no solo es capaz de atrapar aniones superóxido, sino que también representa un eficiente depurador de radicales hidroxilo. La depuración de radicales hidroxilo por melatonina se demostró en experimentos desarrollados por Tan y cols. (1993), quienes utilizaron el reactivo 5,5-dimetilpirrolina N-óxido (DMPO) y la fotólisis del peróxido de hidrógeno con luz ultravioleta (UV) para la generación de radicales hidroxilo. Estos radicales hidroxilo sustraen un electrón del grupo amino presente en el anillo pirrólico para dar un radical indolil, el cual atrapa a los aniones superóxido. Esta capacidad de la melatonina para depurar radicales libres no solo se debe a la alta afinidad química que presenta por el radical hidroxilo, sino también a la capacidad del radical indolil para reaccionar, directamente, sin requerir otro catalizador, con los aniones superóxido (Hardeland y cols., 1993). 23 FIGURA 5. MECANISMO PROPUESTO PARA LA ACCION DEPURADORA DE RADICALES HIDROXILO POR LA HORMONA MELATONINA. La indolamina melatonina destoxifica in vitro en una forma selectiva y eficiente agentes oxidantes reactivos tales como los radicales hidroxilo (OH. ), otros radicales libres (. R) e iones férricos, gracias a las características nucleofílicas que le confiere el anillo indólico. Esta acción destoxificadora la realiza por donación de uno de sus electrones a estos compuestos electrofílicos, que conduce a la formación de un radical indolil y a la oxidación parcial de la indolamina. Este radical transitorio rápidamente es convertido al metabolito kinuramina por la acción de los aniones superóxido (O2. ). El ataque de este anión al radical indolil se efectúa casi exclusivamente en los carbonos 2 y 3 (C-2 y C3); sin embargo, debido a la mayor estabilidad del catión que se forma por el ataque en C-3, que deslocaliza con mayor facilidad la carga positiva sin implicación de la parte bencénica de la molécula, el intermediario formado por el ataque en esta posición es el más probable. La apertura del anillo pirrólico por la acción de los aniones superóxido refleja la facilidad de oxidación de los indoles (Modificado de Tan y cols., 1993; Gilchrist, 1995; Paquette, 1937). 24 A nivel del sistema nervioso, la protección de las neuronas contra el estrés oxidativo y el daño por especies reactivas del oxígeno tales como el peróxido de hidrógeno se realiza por la enzima peroxidasa de GSH (GPx). Un aumento en la actividad de la GPx puede atenuar el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas (Barlow-Walden y cols., 1995; Reiter, 1994b). De acuerdo con Barlow-Walden y cols., (1995) la función de esta enzima puede aumentarse por activación con melatonina (Figura 6). En este estudio, la administración de una dosis intraperitoneal de melatonina (500 µg/kg de peso) en ratas hembras de 12 semanas aumentó la actividad de la GPx. La melatonina no solo incrementa la velocidad de eliminación de los radicales hidroxilo por captación directa, sino que además disminuye la generación y formación de radicales hidroxilo a través de la inducción de la peroxidasa del glutatión (Barlow-Walden y cols., 1995). MELATONINA Peroxidasa de GSH H2O2 + GSH GSSG + H2O FIGURA 6. ACTIVACION DE LA ENZIMA PEROXIDASA DE GLUTATION POR MELATONINA. El peróxido de hidrógeno es reducido a agua por una reacción catalizada por la enzima peroxidasa de glutatión en la que el tripéptido participa como sustrato. H2O2= peróxido de hidrógeno; GSH= glutatión reducido; GSSG= glutatión oxidado; GPx = peroxidasa de glutatión (Modificado de Barlow-Walden y cols., 1995). Considerando que a) uno de los mecanismos por los cuales el APAP produce hepatotoxicidad es la generación de estados de estrés oxidativo, y que la melatonina tiene una función antioxidante y depuradora de radicales libres, y b) que la melatonina regula el nivel del GSH, tripéptido necesario para la eliminación del metabolito citotóxico del APAP, consideramos importante estudiar experimentalmente la posibilidad de que esta hormona reduzca el daño hepatotóxico producido por APAP. 25 OBJETIVOS 1) Evaluar la toxicidad del acetami nofén in vivo, utilizando como indicadores de daño las actividades enzimáticas de la lactato deshidrogenasa (LDH), y de las aminotransferasas de aspartarto (AST) y alanina (ALT). 2) Comparar el efecto de la melato nina sobre la toxicidad del acetaminofén con el efecto de la N-acetil-cisteína y la cisteamina, fármacos utilizados en el tratamiento de la intoxicación con acetaminofén en humanos. 3) Evaluar los cambios histológicos, a nivel hepático, producidos por la intoxicación con APAP, y bajo el tratamiento con N-acetil-cisteína y melatonina. 4) Implementar el sistema de cultivo de hepatocitos como modelo para estudiar in vitro el mecanismo de acción de fármacos hepatotóxicos. 26 METODOS PROCEDIMIENTO IN VIVO I. SOLUCIONES. 1) Acetaminofén (APAP). Las concentraciones de APAP que se han utilizado para la generación de un daño hepático severo no mortal en rata varían desde los 500 hasta los 1000 mg por Kg de peso corporal (Beales y McLean, 1995; Mitchell y cols., 1973a). Debido a que no es recomendable administrar grandes volúmenes de líquido por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas, la dosificación del APAP se realizó empleando soluciones sobresaturadas del fármaco en solución salina isotónica (SSI) [0.2 g/mL de solución]. Considerando la limitada solub lilidad del APAP en agua (1 g/70 mL a 25°C o 1 g/20 mL a 100°C en el presente estudio fue necesario utilizar las propiedades químicas del fármaco para preparar soluciones sobresaturadas. Connors y cols. (1979) reportaron que una solución saturada de APAP presenta un valor de pH de aproximadamente 6.0, y un pKa de 9.51; es decir, el valor de pH en el cual las formas disociada y no disociada del fármaco se encuentran en equilibrio es un pH alcalino. La solubilización del APAP se logró utilizando una solución salina isotónica con un valor de pH próximo al valor de pKa reportado para el fármaco. A este pH (~10.0 -10.5) el APAP presentó buena solubilidad y estabilidad (Connors y cols., 1979; Mitchell y cols., 1973a). De acuerdo con los estudios de estabilidad desarrollados por Koshy y Lanch (1961) la hidrólisis es la ruta principal de degradación que contribuye a la inestabilidad del fármaco; la hidrólisis del APAP produce ácido acético y paminofenol. Macroscópicamente, esta degradación por oxidación del fármaco resulta evidente por un cambio instantáneo en la coloración de las soluciones del APAP (Connors y cols. 1979), por lo que el criterio de estabilidad para las soluciones del fármaco se basó en la coloración de las mismas, las cuales debían permanecer incoloras por un tiempo mayor de 5 minutos. 27 2) Melatonina. La melatonina presenta una alta solubilidad en solventes polares (Costa y cols., 1995), por esta razón, el vehículo empleado para la preparación de una solución de almacenamiento fue una mezcla de SSI y etanol en Ias siguientes proporciones: 20 mg de melatonina se disuelven en 200 a 300 µl de etanol, y se lleva a un volumen de 5 mL con SSI. 3) Cisteamina y N-acetil-cisteína (NAC). La disolución de cisteamina y de N-acetil-cisteína (NAC) se hizo en SSI en una proporción de 20 mg/mL de solución. Tanto la cisteamina como la NAC presentan una buena solubilidad en agua. II. SUJETOS EXPERIMENTALES. Se utilizaron ratas adultas macho de la cepa Wistar de ~60 días de edad con un peso corporal de 200 a 250 gramos. Todas las ratas se mantuvieron en cajas de plástico (4 a 6 ratas por caja), a temperatura ambiental y con un ciclo luz-oscuridad natural. Hasta el día del experimento y durante éste las ratas tuvieron libre acceso al agua y al alimento, el cual fue a base de croquetas. Todos los experimentos se realizaron durante la fase de luz, haciendo la primera administración a la misma hora (07:00 A.M.). III. GRUPOS EXPERIMENTALES. El día del experimento las ratas se dividieron en cuatro grupos, aplicándoles uno de los siguientes protocolos experimentales (Figura 7): 28 FIGURA 7. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EL ESTUDIO DE LA ACCION PROTECTORA Y/O DE ANTIDOTO DE LA MELATONINA SOBRE LA TOXICIDAD INDUCIDA POR ACETAMINOFÉN EN RATA. 29 Grupo 1: Daño hepático por acetaminofén. La capacidad hepatotóxica del acetaminofén se evaluó administrando las dosis de 500, 600, 800 ó 1000 mg/kg del fármaco. Las características evaluadas para la cuantificación del daño fueron el porcentaje de letalidad, la latencia de muerte, el comportamiento, las características hepáticas macroscópicas y microscópicas, la medición de la actividad de las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH), aminotransferasa de aspartato (AST) y aminotransferasa de alanina (ALT). De acuerdo con los resultados obtenidos en esta evaluación se seleccionó la dosis de 500 mg/kg ya que se adaptó a las necesidades de nuestro protocolo, tanto en tiempo de vida de las ratas administradas con esta dosis así como en magnitud y significancia del daño obtenido, comparado con las condiciones basales. Grupo 2: Curva dosis respuesta (Acción preventiva). El estudio de la acción preventiva de Melatonina (MEL) y N-acetilcisteína contra el daño hepático inducido por APAP se evaluó administrando en primer término una dosis única (0.1, 1.0, 10.0 ó 30.0 mg/kg) de alguno de los dos fármacos y tres horas después una sola dosis de 500 mg/kg de APAP. Grupo 3: Grupo control. La evaluación de los cambios o alteraciones generados por los fármacos empleados en este estudio se realizó administrando dosis únicas de cada uno de ellos. A partir de los resultados obtenidos en la curva dosis-respuesta se administraron las dosis de MEL y NAC que ofrecieron la mayor protección contra la toxicidad del APAP; la dosis tóxica de APAP seleccionada y el vehículo utilizado para la disolución del APAP. Los grupos experimentales se dividieron de la siguiente manera: a) Solución salina isotónica (pH= 10.5) b) Acetaminofén (500 mg/kg) c) N-acetil-cisteína (10 mg/kg) d) Cisteamina (10 mg/kg) e) Melatonina (10 mg/kg) 30 4) Actividad como antídoto. Administración de una dosis de 500 mg/kg de APAP, seguida por una dosis única de a) Melatonina ó b) N-acetil-cisteína tres horas después de la administración del APAP. Las dosis de melatonina o N-acetil-cisteína corresponden a las dosis que permitan una mayor protección contra el daño hepático generado por APAP, de acuerdo con los resultados obtenidos con el grupo 2. Vía de administración: La vía de administración para cada uno de los compuestos estudiados fue la intraperitoneal (i.p.), utilizando como volumen máximo de dosificación de 0.5 mL. IV) ANESTESIA. 8 horas después de la administración del acetaminofén o de cada uno de los otros fármacos (grupo control) las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (*Anestesal) a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal por vía i.p. V. PRUEBAS ENZIMATICAS Y ANALISIS MACRO Y MICROSCOPICO. 1) Toma de muestras sanguíneas. Con la ayuda de una jeringa para insulina sin anticoagulante se extrajo una muestra de aproximadamente 0.6 mL de sangre de la vena yugular. Una vez coagulada, se centrifugó a 2500 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 5 minutos para la separación del paquete celular y el suero. 2) Pruebas enzimáticas. Las muestras séricas obtenidas se emplearon para la cuantificación de la actividad de las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH), arninotransferasa de aspartato (AST) y aminotransferasa de alanina (ALT). Los principios en los que se basan estas determinaciones son los siguientes (Figura 6): 31 i) Lactato deshidrogenasa (LDH). La medición de LDH se desarrolló mediante un método colorimétrico basado en la reducción reversible de piruvato a lactato, catalizada por la LDH, la cual representa el último paso de la glicólisis anaerobia. LDH Ácido pirúvico + NADH <======> Ácido láctico + NAD En el equilibrio, la reacción favorece fuertemente la reducción de piruvato a lactato a una velocidad proporcional a la cantidad de LDH. La cantidad de piruvato remanente después de la incubación es inversamente proporcional a la cantidad de LDH activa en la muestra. La cuantificación realizada por este método se refiere a la lactato deshidrogenasa total presente en el suero, es decir, a la suma de todas las isoenzimas (Lynch, M.J. y cols., 1977). ii) Aminotransferasas. Los mamíferos realizan la degradación de los aminoácidos en el hígado principalmente por acción de las enzimas denominadas aminotransferasas (o transaminasas). Las aminotransferasas catalizan la transferencia de un grupo ? -amino desde un ? -aminoácido a un ? -cetoácido. Los ? -aminoácidos pueden ser el aspartato o la alanina, por lo que se les denomina como aminotransferasa de aspartato (AST) y aminotransferasa de alanina (ALT), mientras que el cetoácido es el ? -cetoglutarato (Lynch y cols., 1977). Bajo condiciones normales los niveles séricos de estas enzimas son muy bajos; sin embargo, cuando hay daño tisular hay un aumento en la actividad enzimática. En las lesiones agudas de la célula hepática, los niveles séricos de la ALT se encuentran considerablemente aumentados teniendo un incremento incluso mayor que el de la AST; lo anterior da lugar a la idea de que las mediciones de ALT son más específicas de alteraciones agudas del hígado que las mediciones de AST; sin embargo, la experiencia no confirma esta opinión ya que las cifras séricas de AST también aumentan considerablemente en las lesiones agudas del hepatocito (Lynch y cols., 1977). 32 Análisis Estadístico: Los resultados obtenidos en la cuantificación de las actividades enzimáticas de la LDH, AST y ALT se evaluaron utilizando la prueba de t de Student y el análisis de varianza (ANOVA) (Wackerly y cols., 1996; Wallenstein y cols., 1980). 3) Análisis macroscópico y microscópico. El análisis macroscópico del daño generado por altas dosis de APAP se realizó observando en todos los órganos abdominales, dando atención especial al hígado y al riñón, órganos blancos para la actividad citotóxica del APAP. Las características morfológicas observadas para la evaluación del daño fueron coloración, consistencia, dilatación de vasos sanguíneos y presencia de trombos. El análisis microscópico del daño por APAP se evaluó mediante cortes histológicos de hígado fijados por inmersión en una solución de formaldehído al 10%. Los hígados fijados fueron incluidos en parafina, cortados en láminas de 3-4 µm de espesor, y teñidos por la técnica de hematoxilina y eosina. Las características que se consideraron como indicadores del daño celular fueron: la aparición de vacuolas y de agregados basófilos en el núcleo de los hepatocitos perivenosos, principalmente, y la presencia de un citoplasma más esosinófilo que lo usual. 33 PROCEDIMIENTO IN VITRO CULTIVO DE HEPATOCITOS AISLADOS Un punto clave en el desarrollo de los métodos para la preparación de hepatocitos aislados intactos vino de la demostración del valor de la colagenasa como una herramienta para la separación de las células hepáticas. Dos años después, Berry y Friend (1969) introdujeron la técnica de perfusión del hígado con colagenasa como un medio para aumentar el rendimiento (Berry y cols., 1991). Los dos requerimientos esenciales para cualquier método de preparación de hepatocitos aislados por perfusión con colagenasa son 1) la exposición de las células a una concentración muy baja de calcio, para permitir el rompimiento de las uniones desmosomales y 2) la utilización de calcio para lograr la activación de la colagenasa. Este conflicto se ha resuelto utilizando procedimientos en dos etapas (Berry y cols., 1991). En el presente estudio, el cultivo de hepatocitos intactos se realizó modificando el protocolo propuesto por Seglen (1973) mediante la aplicación de un procedimiento de perfusión del hígado en dos etapas a través de la vena porta hepática. En el primer paso, el hígado se perfundió con una solución amortiguadora libre de calcio (puede también utilizarse un quelante como el EGTA) para separar los contactos desmosomales y provocar la disociación completa del parénquima; después, la perfusión se continuó con una solución que contenía colagenasa y calcio (un activador obligatorio de la enzima) para disolver la matriz extracelular (Celis, 1994). I. SOLUCIONES 1) DMEM (GIBCO Cat. No. 31600-026). Este es un medio de cultivo con Lglutamina, 110 mg/L de piruvato sódico y sin bicarbonato de sodio. Para preparar 1 litro de solución se midieron 900 mL de agua desionizada y se adicionó a este volumen el medio contenido en un sobre (realizarlo a temperatura ambiente, 15-30°C) con agitación suave. Se agregaron 10 mL de una solución HEPESNa 1 M para obtener una concentración final amortiguada de 10 mM. Se ajustó el pH a un valor de 7.4 34 esterilizando por filtración con presión negativa usando un filtro Nalgene (diámetro del poro 0.2 µm). MEDIO DMEM COMPLETO: Se agregó al medio DMEM 10% de suero de ternera y 0.1% de antibiótico que contenía 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G sódica y 25 µg/mL de anfotericina B. 2) SOLUCION DE TYRODE. mM NaCl KCI HEPES-Na+ 154.2 5.4 10.0 CaCl2 1.8 MgCl2 1.0 A esta solución se agregaron glucosa (1 mg/mL), albúmina (1 mg/mL) y colagenasa tipo IV (2 mg/mL). 3) SOLUCION TYRODE SIN CALCIO. A la solución tyrode sin calcio se agregó 0.1% de antibiótico. 4) SOLUCION DE LAVADO. A la solución Tyrode sin calcio se le agregó 1 mg/mL de albúmina y 0.1% de antibiótico. 5) HEPARINA Se disolvieron 10 mg de heparina por mililitro de solución salina isotónica estéril para obtener una concentración de 1000 UI/mL. 35 6) COLAGENA COMO SUSTRATO PARA CULTIVO A. EXTRACCIÓ N: Se preparó una solución de colágena a partir de fibras aisladas de cola de rata; el procedimiento fue el siguiente: a) Se sacrificó una rata y se quitó la piel que cubría a la cola. b) Con la ayuda de unas pinzas de disección se extrajeron las fibras de colágena y se depositaron en una solución de ácido acético glacial al 80%. c) Se agitó durante 24 horas a una temperatura de 0 a 4°C. B. APLICACIÓ N DE LA COLAGENA A LAS CAMARAS DE CULTIVO Se tomaron unos cuantos mililitros de solución en un vaso de precipitados de 20 mL inmerso en hielo, y se trasladaron a la campana de flujo laminar. Se extendió una película delgada de colágena en el fondo de las cajas de cultivo, utilizando un hisopo de algodón. Posteriormente se colocaron las cajas en una cámara de luz ultravioleta durante 30 a 60 minutos para secar y esterilizar la colágena. Antes de colocar el medio de cultivo en que se van a sembrar las células, es muy importante lavar las cajas con agua destilada estéril para evitar la acidez que provocaría cualquier residuo del ácido acético. ll. SUJETOS EXPERIMENTALES Y EXTRACCION DEL HIGADO. Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar con un peso corporal de 200 a 250 gramos las cuales se anestesiaron con pentobarbital sódico (45 mg/kg, i.p.). Una vez inconscientes, las ratas se colocaron sobre una mesa de disección y se aplicó una dosis de 1000 UI de heparina por la vena femoral. La perfusión del hígado se realizó de la siguiente manera (Figura 8): 1) Con un corte largo y transverso se abrió el abdomen de la rata, previamente desinfectado con alcohol etílico al 70%, extrayendo los intestinos para exponer el área de las venas porta hepática y cava posterior. Utilizando unas pinzas finas de disección se rompió el tejido conectivo que cubre la región iliolumbar y se colocó una ligadura “floja” alrededor de la vena porta utilizando hilo de seda. Se alineó la cánula portal a lo largo de la vena ajustando esta posición para 36 asegurar que la punta de la cánula portal permaneciera justo dentro de la ligadura. Para eliminar las burbujas de aire de la cánula, el sistema de perfusión se “purga” inicialmente pasando un poco de la solución Tyrode sin calcio. 2) Con tijeras finas se hace un corte profundo en la vena portahepática canulando inmediatamente e iniciando la perfusión con solución Tyrode libre de calcio caliente (37°C) (1er. Paso). Casi al mismo tiempo se hace un corte en la vena cava posterior, para permitir el eflujo, perfundiendo un volumen total de 40 ml de la solución libre de calcio. 3) Se incrementa gradualmente el flujo de la perfusión para lavar la sangre del hígado y, cuando el hígado está completamente decolorado y adquiere un ligero color tostado, la vena cava superior se cortó justo abajo del diafragma y se incrementó el flujo de la perfusión a 50 ml/min, perfundiendo un volumen total de 20 ml. 4) Por un momento se suspendió el flujo de la perfusión y se inició la perfusión de una solución de Tyrode con calcio que conte nía colagenasa tipo IV. La perfusión del hígado se realiza inicialmente a una baja velocidad, mientras se permite que la solución Tyrode libre de calcio se consuma, incrementando la velocidad de perfusión a 50 ml/min. 5) Una vez terminada la perfusión del Tyrode con calcio y colagenasa, el hígado se diseca cortando la vena cava en sus dos extremos así como la vena porta y el ducto biliar (distal a la ligadura portal). Se cortan todos los ligamentos delgados que conectan al hígado con los intestinos y la pared abdominal; finalmente el hígado se extrae y se sumerge en la solución de lavado sin calcio, contenida en una caja de Petri. 37 FIGURA 8. DISECCION Y PERFUSION DEL HIGADO PARA LA PREPARACION DE HEPATOCITOS AISLADOS. III. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE HEPATOCITOS. 1) Con la ayuda de unas pinzas finas, se sujeta firmemente el hígado a través de la vena cava para eliminar la cápsula de Glisson que cubre a este órgano. Una vez eliminada la cápsula, el hígado se corta en pequeños trozos que son colocados en un matraz Erlenmeyer que contenga solución Tyrode sin calcio con albúmina y antibiótico, incubando a 37°C con agitación durante 30 minutos. 2) La suspensión formada se filtra a través de una gasa estéril para la remoción de los desechos de tejido conectivo y masa celular. Al final, la gasa se presiona suavemente contra el fondo interno y las paredes de un embudo de plástico, y se levanta lentamente sobre la suspensión agitando suavemente para evitar la compresión de las células a través del filtro. 3) La suspensión de hepatocitos se lava por centrifugación (1000 rpm/10 minutos) con resuspensión suave en 40 ml de medio DMEM completo. Finalmente las células se resuspenden en DMEM completo. 38 IV. VIABILIDAD CELULAR. La viabilidad celular de la suspensión de hepatocitos obtenida se evaluó con el método de exclusión del azul tripano. El azul tripano es una amina orgánica, con una carga neta negativa que no penetra al interior de los hepatocitos que presentan sus membranas intactas, mientras que las células dañadas rápidamente lo incorporan al citoplasma; es probable que la exclusión de la amina sea un proceso de membrana dependiente de energía (Ferry y cols., 1991). Después de incubar durante 1-2 minutos una alícuota de la suspensión de hepatocitos (50 µL) con una solución de azul tripano 0.02%, se colocaron 15 µL de la mezcla en una cámara de Neubauer y se contó el número de células en un microscopio invertido. El porcentaje de viabilidad se calcula mediante la siguiente ecuación: %Viabilidad = Total de células - Células teñidas Total de células V. INCUBACION DEL MEDIO EN LA CAMARA DE CULTIVO E INOCULACION DE LOS HEPATOCITOS. Se agregó 1 mL del medio DMEM completo a cada uno de los compartimentos de la cámara de cultivo. Se incubó a 34°C y se sembraron alícuotas de 300 µL de suspensión de hepatocitos en cada uno de los pozos de la cámara de cultivo. Se incubaron las células a 34-36°C en una incubadora y se cambió el medio 2 horas después para eliminar las células no adheridas, así como los eritrocitos. El experimento con los fármacos se realizó 24 horas después. VI. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES. Después de 24 horas de incubación, los hepatocitos se sometieron a los siguientes tratamientos: a) Grupo control: Adición del medio DMEM sin químicos. 39 b) Acetaminofén: Suplementación del DMEM con APAP suficiente para obtener una concentración 5 mM. c) Melatonina: Adición de melatonina al medio DMEM para obtener una concentración, 2mM. d) Acción Protectora: Pretratamiento de los hepatocitos con melatonina 2 mM. La hormona se agregó 0, 2, 4 y 6 horas antes de la adición de APAP (5 mM). e) Acción Antídoto: Adición de melatonina 2 mM 2 ó 4 horas después de la adición de 5 mM de APAP a los hepatocitos en cultivo. VII. INDICE DE TOXICIDAD POR ACETAMINOFÉN EN HEPATOCITOS EN CULTIVO. La medición del daño celular se realizó cuantificando los niveles de LDH liberado al medio de cultivo. A nivel celular, la enzima lacato deshidrogenasa se encuentra localizada en forma casi exclusiva a nivel del citoplasma, por lo que su cuantificación en el líquido extracelular se utiliza como un indicador del daño celular. La actividad de LDH para cada uno de los grupos experimentales se expresa en relación a la concentración de proteínas totales en cada cámara en que se sembraron las células. Las proteínas de la monocapa celular se cuantificaron por el método de Bradford. A) Desprendimiento de la monocapa celular. Una vez retirado el medio DMEM de los compartimentos de la cámara de cultivo, los hepatocitos se suspendieron, con la ayuda de una espátula, en una solución amortiguadora hipotónica con la siguiente composición: mM NaCl KCI HEPES-Na+ 120.0 6.0 25.0 MgCl2 1.0 CaCl2 1.2 40 Suplementada con glucosa (10 mg/mL) y 0.01% de azida de sodio. El pH de la solución se ajustó a 7.4 B) Método de Bradford. Este método de cuantificación de prote ínas se basa en la unión del Azul de Coomassie G-250 a proteínas. Esta unión causa un cambio en la absorbancia del colorante en el rango de longitud de onda de 465 a 595 nm. A diferencia de otros métodos de cuantificación de proteínas, éste es un ensayo rápido y reproducible (la unión del colorante a las prote ínas ocurre en forma total en aproximadamente 2 minutos). A diferencia del procedimiento de Lowry, el método de Azul de Coomassie no presenta interferencia con cationes tales como sodio o potasio, ni con carbohidratos como la sacarosa (Bradford, 1976). Se prepararon soluciones de albúmina para obtener la curva de calibración. A cada una de las diluciones preparadas se adicionaron 5 mL del reactivo de Azul de Coomassie y 2 minutos después se leyeron las absorbancias a una longitud de onda de 595 nm. La concentración de proteína presente en cada uno de las cámaras se calculó a partir de la ecuación de regresión lineal obtenida para la curva de calibración. 41 RESULTADOS. I. ACCION TOXICA DEL ACETAMINOFÉN. La administración intraperitoneal de acetaminofén a dosis de 500, 600, 800 y 1000 mg/kg provocó las siguientes alteraciones: A) Comportamiento. En todas las ratas a las que se administró una dosis superior a los 800 mg/kg de acetaminofén se presentó un estado de somnolencia y letargo permanente que inició a los pocos minutos después de administrado el fármaco. La administración de las dosis de 500 y 600 mg/kg no alteró el estado de vigilia de las ratas, presentando un comportamiento y movilidad normal. B) Porcentaje y latencia de muerte. Dosis mayores a los 600 mg/kg de APAP producen un incremento en el porcentaje de letalidad; el 100% de letalidad se obtiene en las ratas tratadas con 800 ó 1000 mg/kg del hepatotóxico. Con respecto a las dosis de 500 y 600 mg/kg, los porcentajes de letalidad fueron del orden de 0 y 25%, respectivamente. El tiempo requerido para obtener el efecto letal por acetaminofén fue de aproximadamente 3 horas para las ratas tratadas con 800 ó 1000 mg/kg mientras que para la dosis de 600 mg/kg la letalidad se presentó aproximadamente a las 6 horas después de administrado el fármaco. C) Características hepáticas macroscópicas. A través del análisis macroscópico se observó que los principales órganos que sufren el efecto tóxico del APAP con dosis mayores a 600 mg/kg fueron (en orden decreciente): intestino, estómago e hígado, sin indicios macroscópicos de daño a nivel de riñón o corazón. Las principales alteraciones fueron inflamación del intestino y dilatación de sus vasos; inflamación del estómago y formación de zonas necrosadas a nivel de los bordes de los lóbulos hepáticos, con acumulación de líquido perito neal. 42 En algunas ratas a las que se administraron dosis de 500 mg/kg también se observó el cuadro descrito anteriormente, sin embargo, la incidencia y el grado del daño fueron menores. D) Cortes histológicos. En la figura 9 se muestran cortes histológicos de hígados de ratas tratadas con SSI (9a), APAP (500 mg/kg; 9b) y MEL (10 mg/kg; 9c) 3 horas antes de la dosis tóxica del APAP (500 mg/kg). En la figura 9a se observa la morfología hepática normal, caracterizada por una distribución radial de las cadenas de hepatocitos con respecto a la vena central y espacios sinusoidales de tamaño regular. En la figura 9b, se observa que la administración de una dosis única de APAP produce las siguientes alteraciones en la morfología hepática: en la periferia de la vena central se observan signos de necrosis con un desarreglo de los cordones de hepatocitos, aumenta el tamaño de los espacios sinusoidales y se presenta necrosis en algunas áreas de los sinusoides hepáticos, particularmente aquéllos que se localizan en la periferia del área perivenosa. Algunos hepatocitos presentan una acumulación no cuantificada de cromatina, que en algunos casos produce gránulos distribuidos en la región perinuclear; en algunos hepatocitos se observa la formación de vacuolas y en general, el tejido hepático presentó una menor afinidad por la eosina. A diferencia de los hepatocitos perivenosos, los hepaocitos de la zona periportal mostraron, en general, una morfología preservada. En la figura 9c se observa que el pretratamiento con MEL preserva en forma significativa la morfología del tejido hepático, presentándose características similares a las observadas en los cortes de ratas tratadas con SSI. 43 A FIGURA 9. CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DEL TEJIDO HEPATICO DE RATAS TRATADAS CON (A) SOLUCION SALINA ISOTONICA (x480), (B) 500 mg/kg DE ACETAMINOFÉN (x300) y (C) MELATONINA (10 mg/kg) 3 HORAS ANTES DE APAP (500 mg/kg) (x300). En la figura 9a se observa la morfología típica del tejido hepático caracterizada por una vena central (VC) alrededor de la cual irradian cadenas de hepatocitos (H) separados por un espacio sinusoidal (S). Después de la administración de una dosis tóxica de acetaminofén se observa necrosis hepatocelular a nivel de la vena central con ensanchamiento de tos espacios sinusoidales y formación de pequetías vacuolas (V) en el interior de los hepatocitos (Figura 9b). El pretratamiento con melatonina ayuda a la preservación de la integridad del tejido hepático; al igual que en las ratas control, se observa una disposición radial de los hepatocitos con respecto a la vena central y espacios sinusoidales normales (9c). 44 B C 45 E) Actividad enzimática. Las actividades enzimáticas de la LDH, AST y ALT presentaron un aumento significativo (comparado con las actividades enzimáticas del grupo control) en las ratas tratadas con una dosis de 500 mg/kg de APAP. Las actividades enzimáticas para las ratas tratadas con 800 ó 1000 mg/kg, no fueron cuantificadas debido a la acción letal de estas dosis. En la tabla 1 se muestran las actividades enzimáticas promedio de LDH obtenidas para las ratas tratadas con SSI (grupo control) y APAP a las dosis de 500 y 600 mg/kg. DOSIS APAP (mg/kg) LDH (U/I) mM SSI 252.32±95.44 5 500 520.87±59.22 7 600 610.00±54.54 5 Tabla 1. ACTIVIDADES DE LA ENZIMA LDH EN RATAS TRATADAS CON APAP (500 y 600 mg/kg; i.p.). Los valores representan la actividad promedio ± la desviación estándar. SSI = grupo tratado con solución salina isotónica (pH= 10-10.5); n= número de experimentos. II. CURVA DOSIS-RESPUESTA PARA LA ACCION PREVENTIVA Los resultados obtenidos en la evaluación de la acción preventiva de melatonina y N-acetil-cisteína contra el daño hepático inducido por APAP se muestran en la figura 10. El pretratamiento con MEL o NAC en dosis de 10 mg/kg de peso mantuvo los niveles de LDH en valores que no presentan diferencia significativa al ser comparados estadísticamente (ANOVA- Bonferroni) con el grupo control (SSI). 46 FIGURA 10. EVALUACION DE LA ACCION PROTECTORA DE N-ACETIL-CISTEINA Y MELATONINA CONTRA LA TOXICIDAD INDUCIDA POR APAP EN RATAS. La acción protectora de N-acetil-cisteina (NAC) y melatonina (MEL) se evaluó dando un pretratamiento a las ratas con metatonina [0.1, 1.0, 10 y 30 mg/kg, i.p. (n= 4, 4,10 y 4, respectivamente)] o N-acetil-cisteína [0.1, 1.0, 10 y 30 mg/kg, i.p. (n= 4 para cada, una de las dosis)] 3 horas antes de la administración de una dosis tóxica de acetaminofén (500 rng/kg). La administración de dosis de 10 mg/kg de N-acetil-cisteína o melatonina reduce la actividad da la LDH a valores que no presentan diferencia significativa (*p<0.05) cuando son comparados estadísticamente, con la prueba de ANOVABonferroni, con respecto al grupo control (C); sin embargo, a diferencia de la N-acetilcisteína que a dosis de 1 y 30 mg/kg mantuvo la actividad de la AST en niveles estadísticamente similares a los del grupo control, ninguna de las dosis administradas de melatonina redujo en forrna significativa dichos niveles. Las actividades de ALT obtenidas para las ratas pretratadas con N-acetil-cisteína a las 4 dosis probadas no presentaron diferencia estadísticamente significativa al aplicar la prueba de ANOVABonferroni con respecto al grupo control. De las dosis administradas de melatonina solamente la dosis de 30 mg/kg ofrece una protección significativa con respecto a las actividades enzimáticas del grupo control. *= diferencia 47 estadísticamente significativa ante la prueba de ANOVA-Bonferroni (p<0.05) con respecto al grupo control (SSI). La actividad sérica de la enzima AST se mantiene dentro de los niveles basales solamente cuando se administraron 1 y 30 mg/kg de N-acetil-císteína, antes de Ia intoxicación con APAP, mientras que de las dosis administradas de melatonina ninguna logró mantener los niveles séricos de la AST dentro del rango de valores normales (ANOVA-Bonferroni; p<0.05). La administración de N-acetil-cisteína, en el rango de dosis analizadas (0.1 a 30 mg/kg) logró mantener la actividad sérica de la enzima ALT en niveles similares a los basales, mientras que de las dosis utilizadas de melatonina solamente la administración de 30 mg/kg logró un efecto similar. La actividad de la enzima ALT representa un índice clave de hepatotoxicidad dentro de la clínica con humanos. La dosis de N-acetil-cisteína y melatonina seleccionada para los siguientes protocolos fue de 10 mg/kg para ambos fármacos; esta selección se hizo considerando que: 1) La administración de una dosis de 10 mg/kg de NAC o de melatonina logra mantener la actividad enzimática de la LDH en niveles que no presentan diferencia significativa cuando se comparan con las actividades séricas de la enzima obtenidas para el grupo control. 2) La N-acetil-cisteína en el rango de dosis de 0.1 a 30 mg/kg mantiene la actividad de la ALT en niveles similares al basal, protegiendo al tejido hepático contra la toxicidad por APAP. 3) La melatonina a dosis de 10 mg/kg se ha utilizado como un agente protector contra la peroxidación lipídica inducida por CCl4 (Daniels y cols., 1995). III. EFECTO DE LOS FARMACOS Los efectos producidos sobre las acti vidades enzimáticas por la administración de dosis únicas de melatonina (10 mg/kg), N-acetil-cisteína (10 mg/kg) ó cisteamina (10 mg/kg) se muestran en la figura 11, donde además se 48 incluyen los resultados obtenidos al administrar la SSI (vehículo del APAP) y APAP (500 mg/kg). La administración de dosis únicas de melatonina o cisteamina (10 mg/kg) mantiene los niveles enzimáticos de la LDH, la AST y ALT similares a los obtenidos para el grupo tratado con SSI, reflejando una buena seguridad farmacológica y una buena reproducibilidad para ambos fármacos. Por el contrario, la administración de N-acetil-cisteína produce un incremento importante en las actividades enzimáticas, tanto de la LDH como de la AST; además la dispersión de los datos refleja una diferencia en la respuesta entre individuos. La variabilidad obtenida con N-acetil-cisteína indica que bajo nuestras condiciones experimentales, no es recomendable la utilización de la N-acetil-ciste ína como fármaco de referencia para el estudio de compuestos con propiedades para la prevención del daño hepático. Con respecto al comportamiento se observó que, a diferencia de las ratas tratadas con NAC, las ratas tratadas con melatonina presentaron un ligero estado de somnolencia y una reducción en la movilidad. No se observaron cambios importantes en las características morfológicas macroscópicas de los órganos abdominales en las ratas tratadas con N-acetil-cisteina, cisteamina o melatonina. 49 FIGURA 11. EFECTO DE LA ADMINISTRACION DE DOSIS UNICAS DE (C) SOLUCION SALINA ISOTONICA (n=7), (A) ACETAMINOFÉN (500 mg/kg; n=8), (N) NACETIL-CISTEINA (10 mg/kg; n=14), (Ci) CISTEAMINA (10 mg/kg; n=4) y (M) MELATONINA (10 mg/kg; n=4) SOBRE LAS ACTIVIDADES SERICAS DE LAS ENZIMAS LDH, AST y ALT EN RATAS. La administración de APAP en ratas ocasiona un aumento significativo en las actividades enzimáticas de LDH, AST y ALT, con respecto al grupo (C), indicando un daño generado por el fármaco. Cisteamina y melatonina no alteran los niveles enzimáticos, obteniendo actividades semejantes a las del grupo control (C). Las actividades enzimáticas en suero de ralas dosificadas con N-acetil-cisteína presentaron una gran dispersión y un aumento significativo (*p<0.05) al ser comparadas con las del grupo control (C). El análisis estadístico empleado fue el de ANOVA-Bonferroni utilizando un nivel de significancia p<0.05. 50 IV. ACTIVIDAD COMO ANTÍDOTO. En la figura 12 se muestran los valores promedio de las actividades de LDH obtenidos en la evaluación de la actividad como antídoto de la melatonina, la cisteamina y la N-acetil-cisteína. Cuando los fármacos se administraron después de la intoxicación con APAP se observó un aumento importante en la actividad de la LDH Este aumento fue similar al obtenido por la administración de APAP solo. De los tres grupos experimentales, el grupo de ratas tratadas con NAC presentó la mayor actividad promedio además de una gran dispersión; esto limita la utilización de este fármaco como antídoto ya que en dosis únicas no ofrece ninguna mejoría ante la toxicidad inducida por APAP. La administración de cisteamina y de melatonina después de la intoxicación con APAP tampoco redujo los niveles enzimáticos de la LDH, presentando actividades promedio similares a las obtenidas para el grupo tratado solo con APAP. De acuerdo con lo anterior, y bajo nuestras condiciones experimentales, puede establecerse que una vez que el mecanismo de toxicidad del APAP se ha iniciado, la administración de dosis únicas de N-acetil-cisteína, cisteamina o melatonina no reducen el daño hepático. 51 FIGURA 12. EVALUACION DE LA CAPACIDAD COMO ANTIDOTO ANTE LA TOXICIDAD POR (A) ACETAMINOFÉN (500 mg/kg; n=8) DE (N) N-ACETILCISTEINA (10 mg/kg; n=8), (Cí) CISTEAMINA (10 mg/kg; n=4), Y (M) MELATONINA (10 mg/kg; n=4). La administración de dosis únicas de melatonina o cisteamina 3 horas después de la administración del hepatotóxico redujo la toxicidad del mismo, de acuerdo con la prueba estadística ANOVA-Bonferroni realizada con las actividades promedio de la LDH para ambos grupos. La administración de N-acetil-cisteína como antídoto no ofrece mejoría ante la toxicidad por APAP; esto se refleja en los niveles enzimáticos de LDH que fueron más altos que los obtenidos para el grupo tratado solo con APAP. 52 V. MODELO DE CITOTOXICIDAD IN VITRO. Durante la implementación de la técnica para el cultivo de hepatocitos se realizaron pruebas de viabilidad celular, utilizando la técnica de exclusión de azul tripano. Los porcentajes de viabilidad obtenidos en nuestras condiciones experimentales fluctuaron entre un 85 y un 90%. Los resultados obtenidos en la evaluación de la toxicidad del APAP y del efecto de la melatonina se muestran en la tabla 2. TRATAMIENTO LDH (U/I)/µg de Proteínas 1.0947 Control 1.8225 Acetaminofén (5mM) 0.9529 Melato nina (2 mM) 1.4349 Acetaminofén (5 mM) + Melatonina (2 mM) ACCIÓN PREVENTIVA Horas 2 1.5800 4 1.5735 6 1.1641 ACCIÓN DE ANTÍDOTO Horas 2 0.7055 4 1.0105 TABLA 2. EVALUAClON DE LA ACCION DE LA MELAT ONINA SOBRE LA TOXICIDAD INDUCIDA POR ACETAMINOFÉN EN HEPATOCITOS EN CULTIVO. La acción preventiva se evaluó pretratando a los hepatocitos con melatonina 2 mM y lespués de 2, 4 ó 6 horas se agregó al medio APAP (5 mM). La acción como antídoto se evaluó administrando melatonina 2 ó 4 horas después del pretratamiento con APAP 5 (mM). 53 El tratamiento de los hepatocitos con APAP 5 mM produce un aumento en la actividad de la LDH, el cual indica daño a nivel de la membrana celular. La adición de melatonina 2 mM al medio de cultivo no altera la actividad enzimática de la LDH en hepatocitos. La acción protectora de la melatonina ante la toxicidad del APAP fue parcial, obteniendo la mayor protección en los hepatocitos pretratados con melatonina 6 horas antes de la adición del APAP al medio. La actividad enzimática para este grupo de hepatocitos solo difiere en 0.0694 U/I de LDH/µg de prote ína con respecto al grupo de hepatocitos control. La adición de melatonina 2 ó 4 horas después del APAP mantiene la actividad enzimática de la LDH en los niveles basales (grupo control) reflejando que la melatonina preserva la integridad de la membrana plasmática de los hepatocitos. 54 DISCUSION Y CONCLUSIONES DAÑO HEPÁTICO POR ACETAMINOFÉN: Modelo in vivo. El hígado es el principal órgano involucrado en el metabolismo y biotransformación de compuestos químicos y drogas, afectando de forma significativa la disposición sistémica de los mismos. Durante la biotransformación, el hígado puede dar lugar a la formación de metabolitos bioactivos, algunos de los cuales son tóxicos. Si dichos metabolitos no son destoxificados eficientemente, el propio hígado se convierte en el blanco idóneo de su actividad citotóxica (Hinson y Forkert, 1995; Jover y cols., 1994). La mayoría de los eventos patológicos en el hígado presentan un patrón característico en su localización zonal. Las razones de esta distribución preferencial todavía no son claras, pero se pueden incluir alteraciones en la macro y microcirculación, diferentes respuestas inmunológicas, así como varios aspectos de la regionalización del metabolismo hepático. Como resultado de una intoxicación aguda o crónica por ciertos compuestos químicos, se observa una toxicidad en una región específica del tejido hepático, la cual se explica por la zonación de las diferentes reacciones que intervienen durante el metabolismo de la droga. Uno los fármacos con una toxicidad regioespecífica es el APAP, el cual tiene en la zona perivenosa el sitio blanco para la acción tóxica del NAPQI (Jungermann y Katz, 1989; Zieve y cols., 1986). Los resultados obtenidos en el presente estudio corroboran esta especificidad en la localización del daño por APAP. Es probable que esta zonación sea resultado de la heterogeneidad funcional del tejido hepático, que presenta en la zona perivenosa el mayor contenido de enzimas oxidasas (CYP450) responsables de la conversión de APAP a NAPQI, así como una menor actividad del glutatión. Ya sea como resultado de la unión covalente a macromoléculas de membrana o a los estados de estrés oxidativo generados por los intermediarios electrofílicos del oxígeno, la zona perivenosa representa el sitio idóneo para la toxicidad del APAP. La inactivación del metabolito tóxico por unión a GSH y la subsecuente conversión en ácido mercaptúrico, ocurre a nivel periportal, la zona con el mayor contenido de GSH. De esta manera, la especificidad de la toxicidad del APAP parece relacionarse a la mayor capacidad activadora en la zona perivenosa y al mayor grado de 55 destoxificación en la zona periportal debido a los niveles más altos de GSH. La muerte celular producida por el APAP es evidente dentro de las primeras 8 horas, y ocurre principalmente en las tres primeras columnas de células que rodean a las venas centrales (Chanda y Mehendale, 1996b; Jungermann y Katz, 1989; Mitchell y cols., 1973: Prescott y cols., 1971; Prescott y cols., 1974; Zieve y cols., 1986). La cuantificación de la actividad de las enzimas intracelulares lactato deshidrogenasa (LDH) y las aminotransferasas de aspartato y alanina (ALT y AST) representa un método indirecto en el diagnóstico y valoración funcional del hígado que permite distinguir, junto con la cuantificación de las bilirrubinas (directa, indirecta y total), las diferentes clases de hepatopatías (Lynch y cols., 1977). El estudio de las actividades de estas enzimas forma parte de las pruebas de funcionamiento hepático utilizadas en la clínica con humanos, ya que cuando ocurre algún daño a nivel de este órgano, son liberadas de los hepatocitos a la circulación sistémica, donde pueden cuantificarse por métodos calorimétricos o enzimáticos. En nuestros estudios, la medición de las actividades enzimáticas de la LDH, la AST y la ALT, se utilizó como un indicador de toxicidad aguda por APAP. En las ratas tratadas con 500 mg/kg de APAP, las actividades enzimáticas aumentaron en forma significativa indicando la generación de daño celular. Puede establecerse que el daño ocurrió no solo a nivel hepático ya que el aumento en la actividad de la LDH, una enzima que se encuentra distribuida en todo el organismo, nos indica la presencia de un daño celular a nivel general. Por otra parte, las enzimas AST y ALT presentan una distribución más específica; se encuentran en mayor proporción en tejido cardiaco y hepático, respectivamente. El aumento en la actividad de la ALT puede considerarse un parámetro más específico de hepatotoxicidad que el aumento en la actividad de la LDH; si bien algunos autores consideran que la actividad de la AST es más apropiada para el diagnóstico de un daño a nivel cardiaco, podemos decir que el aumento obtenido en la actividad de la AST ratifica la presencia del daño a nivel hepático, ya que este tejido también contiene una concentración significativa de la enzima (Lynch y cols., 1977). 56 Aunque en estudios previos (Mitchell y cols., 1973; Price y Jollow, 1986) se ha reportado la utilización de dosis de hasta 1000 mg/kg de peso para la obtención de estados de toxicidad aguda en ratas, en nuestros experimentos se produjo una necrosis macroscópica en hígado con dosis de 800 o 1000 mg/kg, con alteraciones importantes en órganos abdominales como estómago e intestino. Esta diferencia podría atribuirse a la variabilidad individual o a la dieta (una de las fuentes para la obtención de los precursores del glutatión) ya que ambas influyen de manera importante en la susceptibilidad a los químicos (Chanda y Mehendale, 1996b). Ante la necesidad de administrar grandes dosis de APAP en volúmenes pequeños de solución, y considerando que las soluciones de APAP disponibles en el mercado eran inadecuadas para nuestro proyecto por su baja concentración (1 mg de APAP por mL de solución) y por la presencia de metanol (el cual es un inductor del sistema del CYP450) como vehículo, fue necesaria la utilización de una solución salina alcalina (pH= 10~10.5) para la preparación de nuestras soluciones. A pesar de la alcalinidad de nuestras soluciones, éstas resultaron inocuas para las ratas ya que las actividades enzimáticas de LDH obtenidas para los grupos tratados con solución salina (pH~6.0) y la solución salina alcalina no fueron estadísticamente diferentes [247.264 ± 63.5901 U/L (n=4) y 252.3232 ± 95.4404 U/L (n=5)], por lo que la utilización de soluciones saturadas alcalinas representa una alternativa viable para la administración de soluciones sobresaturadas del fármaco. Cabe mencionar que en los estudios previos sobre la toxicidad del APAP, algunos autores han administrado dosis de 300 a 1500 mg/kg de APAP por vía i.p., disolviendo el fármaco en una solución salina con un pH de 11.3 a 25°C (Mitchell y cols., 1973a). En muchos estudios de toxicidad por APAP también se utiliza la vía oral para la dosificación del fármaco; esto permite la administración de volúmenes mayores de solución pero con el inconveniente de que la biotransformación ocurre en un periodo de tiempo mayor, a diferencia de la vía i.p. en la que la dosis y el tiempo requerido para la biotransformación del fármaco y la obtención de cuadros de intoxicación son menores. El establecimiento de un tratamiento efectivo contra la toxicidad del APAP es posible si se toma en cuenta la activación metabólica del fármaco y el 57 papel central del tripéptido GSH. Considerando que bajo condiciones de toxicidad los niveles de GSH están saturados, y que este tripéptido representa el antídoto ideal contra la acción tóxica del NAPQI, la utilización de compuestos que presentaran en su molécula alguno de los aminoácidos precursores del GSH, específicamente a la cisteína (el aminoácido limitante en la biosíntesis del GSH), resultó una buena alternativa. En la actualidad el tratamiento en humanos consiste en la aplicación de N-acetil-cisteína en una dosis inicial de 140 mg/kg de peso por vía oral y la aplicación de dosis repetidas en intervalos de 4 horas de 70 mg/kg de peso hasta un total de 17 dosis o hasta que los niveles enzimáticos de la ALT llegue a los niveles basales (Harrison, 1995). La recuperación de las actividades enzimáticas normales sólo es posible cuando el daño hepático no es muy severo ya que, como un mecanismo de defensa, el hígado responde activando la regeneración celular y la reparación tisular (Chanda y Mehendale, 1996a); ambos mecanismos son ineficientes en estados de intoxicación fulminante debido a la inhibición de la división celular causada por los hepatotóxicos como el APAP. En nuestro estudio, la administración de N-acetil-cisteína de manera individual en dosis de 10 mg/kg, produce un aumento significativo en la prueba de ANOVA-Bonferroni (con respecto al grupo control) en las actividades enzimáticas de LDH y AST con una gran variabilidad individual, quedando en duda su utilidad como un parámetro de comparación confiable en la evaluación de nuevos fármacos con propiedades de antídoto ante la hepatotoxicidad de los fármacos. Por el contrario, la administración de melatonina en dosis únicas de 10 mg/kg, ofrece una gran seguridad farmacológica, obteniendo niveles enzimáticos semejantes a los de las ratas tratadas solamente con la solución salina y con una variabilidad individual baja. La utilización de N-acetil-cisteína (10 mg/kg) como antídotos 3 horas después de la administración de una dosis tóxica de APAP no ofrece ninguna mejoría ante las alteraciones inducidas por el fármaco. Incluso al reducir el intervalo de tiempo entre la intoxicación y el inicio del tratamiento con los antídotos los niveles de las actividades enzimáticas presentaron un aumento similar en ratas a las que se administró N-acetil-cisteína a la misma dosis solo 58 una hora después de haber administrado el APAP (datos no mostrados). Es probable que la utilización de un esquema de aplicaciones repetidas, similar al empleado en la clínica con humanos, represente una mejor alternativa para la restauración de la integridad del tejido hepático y de otros órganos que, como los riñones, también están expuestos a la acción tóxica del APAP. Al igual que en las ratas a las que se administró N-acetil cisteina o melatonina como antídotos, el pretratamiento 3 horas antes de la administración del APAP (500 mg/kg) con N-acetil cisteina en dosis de 0.1 y 1.0 mg/kg i.p. provocó un aumento en los niveles enzimáticos aún mayor que el obtenido para APAP solo. Sin embargo, el pretratamiento con dosis de 10 mg/kg i.p. ofrece una buena protección, obteniendo niveles enzimáticos para la LDH similares a los de las condiciones basales. Además de la gran variabilidad individual obtenida por la acción de la Nacetil-cisteína por sí misma, los cambios temporales también influyeron de manera importante en el efecto de los fármacos. Lo anterior se comprobó al comparar los resultados obtenidos en los grupos de animales tratados durante los períodos de verano e invierno, ya que a pesar de administrar la misma dosis de APAP o de los antídotos, la menor variabilidad y mayor protección se obtuvo en el grupo de ratas tratado durante el período de verano. Estos cambios en susceptibilidad a los fármacos sugieren una variabilidad de tipo estacional. Los niveles enzimáticos de la LDH y la ALT en ratas pretratadas con melatonina fueron similares a los basales para las dosis de 10 y 30 mg/kg de peso respectivamente; sin embargo, como resultado de la variabilidad individual, los cuatro grupos pretratados con melatonina (0.1, 1.0, 10 y 30 mg/kg) presentaron niveles enzimáticos que, entre sí, no presentaron diferencia significativa al realizar el análisis de t de Student y ANOVA. Es decir, la protección ante el daño hepático por APAP en el rango de 0.1 a 30 mg/kg de melatonina no depende de la concentración de la hormona en el intervalo estudiado. 59 HEPATOTOXICIDAD POR APAP: Modelo in vitro. Los modelos celulares in vitro tienen una gran utilidad en áreas de la investigación toxicológica, especialmente en las encargadas de establecer los mecanismos de acción de los compuestos químicos, ya que en estas preparaciones el metabolismo de éstos puede estudiarse bajo condiciones estrictamente controladas. Una de las ventajas de la utilización de estos modelos celulares es la reducción importante del uso de animales en la investigación científica, aún cuando estos modelos no logran reproducir completamente la especial interacción funcional que se da en el animal íntegro. A diferencia de los modelos in vivo, los mecanismos de toxicidad y de defensa en un sistema de cultivo son resultado de las características de un solo tipo celular y, aunque resultan más específicos no hay que olvidar que la respuesta final de un organismo es el resultado de la integración de un conjunto de respuestas que provienen de diferentes órganos y que involucra diferentes tipos celulares. La cuantificación del daño en las preparaciones in vitro, al igual que en las preparaciones in vivo, puede lograrse eficientemente con la medición de las actividades de la o las enzimas predominantes en cada tipo celular. Uno de los indicadores utilizados con mayor frecuencia en los estudios de toxicidad es la medición de la actividad de la enzima citosólica LDH, la cual se encuentra presente en todos los tipos celulares (Berry y cols., 1991). A diferencia de los hepatocitos control (inmersos en medio DMEM sin químicos), los niveles de LDH cuantificados para los hepatocitos tratados con APAP a una dosis 5 mM, fueron mayores; este aumento en la actividad de LDH extracelular puede interpretarse como el resultado de la liberación de LDH debido al rompimiento de la membrana plasmática de los hepatocitos. El tratamiento de los hepatocitos con melatonina 2 mM no altera los niveles de la LDH. El comportamiento in vitro observado para la melatonina en cultivo es similar al obtenido con el grupo de ratas a las que se administró una dosis única de melatonina, indicando en forma conjunta que la utilización de melatonina in vivo o in vitro no altera la homeostasis celular ni del organismo, presentando una gran seguridad farmacológica; sin embargo, es necesario 60 evaluar la variabilidad de los diferentes grupos experimentales in vitro realizando un mayor numero de experimentos. A pesar de que la acción de la melatonina como antídoto in vivo fue prácticamente nula, en nuestra preparación in vitro la utilización del compuesto 2 o 4 horas después del tratamiento con APAP proporcionó un mejor resultado. En este protocolo las actividades de la LDH fueron aún menores que la del grupo control. En este caso, la obtención de actividades de LDH inferiores a las control con melatonina 2 mM, puede ser resultado de una combinación de su capacidad depuradora de radicales libres y de la capacidad regeneradora de membranas lipídicas que presenta la melatonina, sin embargo, nuestros resultados no nos permiten afirmar con certeza esta acción. Aunque la utilización de melatonina como un agente preventivo de la toxicidad por APAP en cultivo logra disminuir parcialmente los niveles de LDH, la magnitud de esta acción es menor a la actividad como antídoto. Las dosis de APAP utilizadas para la obtención de efectos tóxicos en cultivo de hepatocitos varían de 0.1 a 10 mM (Martin y McLean, 1995); sin embargo, es necesario considerar la especie utilizada, y el método de preparación de las células ya que se han reportado variaciones para diferentes cepas de rata (Price y Jollow, 1986). Por otro lado, la dosis de melatonina (2 mM) es la dosis que se utiliza normalmente en cultivos de hepatocitos en los que se ha probado su acción protectora ante la acción de fármacos que se caracterizan por inducir estados de estrés oxidativo (Sewerynek y cols., 1995a y c). Considerando los resultados de la acción protectora y de antídoto presentada por la melatonina en el estudio de citotoxicidad in vitro puede proponerse que el mecanismo de toxicidad empleado por el fármaco en el cultivo de hepatocitos puede ser mediado por intermediarios reactivos del oxígeno que generan estados de estrés oxidativo. De ser así, algunas de las características representativas de esta condición de estrés oxidativo sería un aumento en la relación [GSH]:(GSSG], a favor de la forma oxidada, un incremento en la actividad de las enzimas que oxidan el GSH (peroxidasa de GSH), así como la presencia de peroxidación lipídica. 61 Aunque nuestros resultados in vitro apoyan fuertemente el mecanismo del estrés oxidativo para la generación del daño por APAP, éstos no son apropiados para proponer la exclusión del mecanismo de fijación covalente en esta toxicidad. Sin embargo, en años recientes se ha establecido la función antioxidante tanto de la N-acetil-ciste ína (Kröger y cols., 1997) como de la cisteamina (Pal Yu, 1994), lo cual apoya en forma importante la validez de la toxicidad del acetaminofén por un mecanismo de estrés oxidativo. A diferencia del organismo integro, una de las desventajas de los cultivos de hepatocitos es que el procedimiento de dispersión celular puede alterar las características metabólicas del parénquima hepático; sin embargo, actualmente se han desarrollado técnicas de cultivo que permiten conservar la expresión de enzimas esenciales para la biotransformación. La ventaja más importante del cultivo hepático es la posibilidad de controlar el ambiente fisicoquímico de las células (pH, temperatura, presión osmótica, presiones de oxígeno y dióxido de carbono, entre otras); esta condición no podría lograrse con facilidad en un sistema in vivo (Freshney, 1994). El desarrollo de las condiciones correctas para la perfusión hepática in situ con colagenasa representa una de las herramientas más útiles para la obtención de suspensiones de células parenquimales viables que pueden ser cultivadas con alta pureza y con la posibilidad de permitir la propagación de cultivos celulares (Berry ycols., 1991; Freshney, 1994). El procedimiento de perfusión básico en dos pasos implementado en nuestro laboratorio se basó en el protocolo propuesto por Seglen en 1975, y permite la obtención de hepatocitos viables no solo de ratas, sino también de otras especies (entre las que se incluyen ratones, conejos, y cobayos), modificando únicamente el volumen y la velocidad de perfusión de las soluciones de acuerdo con el tamaño del hígado. Consideramos que este diseño será útil para realizar estudios acerca del mecanismo de acción de diferentes fármacos. Cabe mencionar que aún es posible incluir algunas modificaciones para optimizar el protocolo de forma que las características funcionales hepáticas puedan ser mantenidas y expresadas al máximo. 62 La técnica original de Seglen ya ha sido adaptada por otros autores para el cultivo de hepatocitos de humano, obteniendo buenos resultados a partir de la perfusión de una porción ó de biopsias del tejido hepático (Freshney, 1994). 63 BIBLIOGRAFIA 1) Adamson, G.M.; Harman, A.W. (1993) Oxidative stress in cultured hepatocytes exposed to acetaminophen. Biochem Pharmacol., Vol. 45, No. 11, 2289-2294. 2) Al-Obaidy, S.S., Li Wan Po, A., McKiernan, P. J., Glasgow, J. F. T., Millership, J. (1995) Assay of paracetamol and its metabolites in urine, plasma and saliva of children with chronic liver disease. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 13, pp. 1033-1039. 3) Al-Obaidy S.S., McKiernan, P.J.; Li Wan Po, A.; Glasgow, J.F.T.; Collier, P.S. (1996). 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