Proyecto Nº SC94-105 RESISTENCIA A VIRUS DEL PIMIENTO EN

Proyecto Nº SC94-105
RESISTENCIA A VIRUS DEL PIMIENTO EN ESPAÑA. ESTUDIO DE SU
HERENCIA Y CARACTERIZACION DE SUS MECANISMOS
Equipo Investigador:
Fernando Ponz Ascaso (Dr. C.Q.)
Carmen de Blas Beorlegui (Dra. C.B.)
Serafina Castro Robleda (Dra. Far.)
Gerardo Carazo Monge (I.T.A.)
Alicia Romero Lorca (Dra. C.B.)
Iñigo Zabalgogeazcoa González (Dr. I.A.)
Begoña Blanco Urgoiti (L.B.)
Equivalente de jornada completa: 1,70
Centro de Investigación:
Mejora Genética y Biotecnología. SGIT. INIA.
Duración:
Enero 1994 - Diciembre 1997
Coste:
Miles de pesetas: 15.568
Fianciación INIA 100%
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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
El planteamiento y los objetivos de este proyecto se han ido cambiando significativamente a lo
largo de su desarrollo. Tal como se ha venido informando en los informes parciales anuales
correspondientes, se consideró que no se justificaba suficientemente el planteamiento inicial, que
estaba enfocado fundamentalmente a la caracterización de las resistencias a cuatro virus
diferentes presentes en una colección de germoplasma de pimiento. Esta consideración se
sustentó en los resultados de las primeras caracterizaciones de las resistencias previamente
encontradas. Así, se comprobó que las posibles fuentes de resistencia al virus del mosaico del
pepino (CMV) no presentaban unas características claras de heredabilidad y que se vencían con
suma facilidad por parte de distintos aislados virales. Se confirmó la presencia de una fuente de
resistencia al virus del moteado suave del pimiento (PMMV), pero presentaba unas
especificidades idénticas similares a las del gen de resistencia L3, ya presente en variedades
comerciales de pimiento y objeto de estudio hace años por parte de otros investigadores
españoles. Una situación similar se encontró para el caso del virus del bronceado del tomate
(TSWV). La resistencia por hipersensibilidad presente en la colección es la misma descrita para
este virus por otros autores hace ya algún tiempo. Otros investigadores españoles están también
llevando a cabo una buena caracterización de ésta y otras resistencias a este virus en pimiento. Se
decidió por tanto concentrarse en el virus Y de la patata, para que el que se disponía de una
buena colección de resistencias en pimiento. De hecho, desde un punto de vista de variabilidad
en las especificidades frente a diversos patotipos virales, las resistencias a PVY en pimiento
permiten el estudio de un abanico de situaciones muy amplio. Por otra parte, PVY es un
patógeno viral de suma importancia en otros cultivos de plantas solanáceas importantes como
son la patata, el tomate, el tabaco o la berenjena, así como en plantas solanáceas ornamentales
como la petunia.
El nuevo enfoque del proyecto se centró por tanto en dos aspectos de PVY como patógeno.
Por una parte, se continuó, como estaba previsto inicialmente, con la caracterización de
fuentes de resistencia a PVY en pimiento en especial desde la perspectiva de los mecanismos
celulares y moleculares subyacentes. El otro aspecto que se ha abordado de este virus ha sido
el de la caracterización de su extensa variabilidad en diferentes cultivos, sobre todo patata,
pimiento y tomate, aunque éste último en menor medida. En realidad, los dos aspectos
mencionados no son más que dos caras distintas de un mismo asunto. La realidad es que, con
unas pocas excepciones notables, la mayoría de las fuentes naturales conocidas proporcionan
resistencias con especificidades muy marcadas, que les proporcionan eficacia frente a aislados
o patotipos determinados. Otros patotipos virales vencen estas resistencias. En el caso de
PVY, y en otros, distintas resistencias presentatn unas características de durabilidad muy
variables. Es indudable que la disponibilidad de un conjunto de herramientas que permitan
una buena caracterización de la variabilidad presente en diferentes poblaciones de PVY, en
conjunción con la caracterización de los mecanismos mediante los que operan diferentes
resistencias al virus, posibilitarán un análisis del fenómeno de la variabilidad de la durabilidad
de las resistencias. Este análisis debe permitir en última instancia la incorporación de
componentes más racionalizados en el proceso de decisión de la utilización de las distintas
fuentes de resistencia disponibles frente a un virus dado.
El estudio de los mecanismos de resistencia ha obligado a la incorporación al acerbo
tecnológico del laboratorio de técnicas de análisis celular ya desarrolladas. Para el análisis de
variabilidad se abordó el desarrollo de tecnología nueva que lo posibilitara. La tecnología
desarrollada ha resultado ser útil para su objetivo inicial y ha permitido además el estudio
detallado de la competencia que opera en infecciones mixtas de razas y aislados de PVY.
2
RESULTADOS
Mecanismos de resistencia a PVY.
Se ha establecido que el gen pvr21 de pimiento que confiere resistencia al patotipo 0 de PVY
funciona interfiriendo con el movimiento intercelular del virus a corta distancia. Se han
estudiado también los mecanismos de acción de los genes Pvr4 y pvr5. Aunque los resultados
aún deben completarse con los experimentos finales de demostración, la evidencia disponible
indica que Pvr4 interfiere con la replicación y/o acumulación virales de todos los aislados
conocidos de PVY, mientras que pvr5 parece actuar de manera similar, pero con especificidad
de patotipo. Finalmente se ha estudiado el mecanismo celular que previene que los aislados de
PVY-pimiento infecten la especie patata. En este sistema, la interferencia parece producirse al
nivel de la replicación/acumulación viral.
Desarrollos tecnológicos.
Se ha desarrollado un procedimiento rápido de tipificación genético-molecular de aislados de
PVY, aplicable en principio a cualquier otro virus, sin ninguna limitación teórica. El método
parte del desarrollo propio anterior de la IC-(RT)-PCR, para completarlo con un análisis de
RFLPs que permite la tipificación rápida de un aislado viral en su raza genética
correspondiente. El método se desarrolló primeramente centrándose en un gen viral
considerado como marcador genómico (el gen de la proteína de la cápsida). Posteriormente se
ha conseguido aplicar la IC-RT-PCR a la amplificación de todo el genoma de PVY, lo que
abre la puerta a la posibilidad de llevar a cabo la tipificación genética analizando la totalidad
del genoma viral.
Establecimiento de razas y patotipos de PVY y de la competencia entre ellas
La demostración de la posibilidad de tipificación genética rápida de aislados de PVY se realizó
con una primera colección de aislados, lo que permitió confirmar la presencia de tres razas
genéticas principales entre los aislados más comunes de PVY. Posteriormente se amplió el
estudio a un grupo de aislados de PVY-patata que se suponen poco frecuentes (PVY-C), y que
en realidad constituyen un patotipo viral. Ello puso de manifiesto la existencia de una nueva raza
de PVY, que se caracterizó desde diversos puntos de vista. También se ha empezado una primera
caracterización de las razas de PVY-tomate. En el caso de PVY-pimiento se ha puesto de
manifiesto que, a diferencia de lo que ocurre en patata, los distintos patotipos virales pertenecen
a una misma raza genética. La metodología explicada en el punto 2 se ha aplicado al estudio de
la competencia que se establece entre aislados virales en infecciones mixtas, llegando a la
conclusión de que una infección mixta sólo es posible entre razas distintas de PVY. Entre
aislados próximos genéticamente, pertenecientes a la misma raza viral, se establece una
competencia que termina con el total desplazamiento del aislado con un menor grado de
adaptación (“fitness”).
INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA
PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES
Mecanismos de resistencia a PVY.
3
PROPORCIONADA
POR
EL
Se han estudiado los mecanismos de acción de varias resistencias a PVY presentes en
germoplasma de pimiento. La caracterización más completa se ha llevado a cabo para el gen
de resistencia recesiva pvr21, que proporciona una resistencia específica de patotipo viral. Los
primeros trabajos de esta caracterización se llevaron ya a cabo en un proyecto anterior (INIA
8562). El análisis inmunocitoquímico de fluorescencia realizado en protoplastos ha puesto
claramente de manifiesto que la interferencia en el ciclo viral se produce al nivel del
movimiento viral intercelular a corta distancia, en un cultivar de pimiento portador en
homozigosis de los alelos recesivos de este gen. La caracterización de los mecanismos de
acción de los genes Pvr4 y pvr5 se hizo en un tipo de material vegetal distinto, como son
líneas dihaploides generadas en el INRA de Montfavet (Francia). Este trabajo se llevó a cabo
en colaboración con investigadores de esta institución. La resistencia de Pvr4 es dominante y
no es específica de patotipo viral. De hecho, no se conoce todavía ningún aislado de PVY
capaz de vencer esta resistencia. La resistencia de pvr5 es recesiva y específica de patotipo,
como la de pvr21. Aun a falta de realizar los experimentos finales de confirmación, los
resultados obtenidos para estos dos genes indican mecanismos de acción similares entre ellos,
en el sentido de impedir una acumulación viral detectable a nivel celular, y diferentes de la
puesta de manifiesto para pvr21. El panorama que se dibuja si se consideran en conjunto
nuestros resultados, considerando también lo que se va conociendo en otros sistemas de
resistencia a virus en cultivos diferentes sugiere lo que parecen ser dos conclusiones
generales, si bien aun provisionales, para mecanismos de resistencia viral. La primera es que
las resistencias extremas, activas incluso a nivel celular, son mucho más difíciles de vencer
por parte del patógeno viral y actúan fundamentalmente impidiendo la acumulación viral
celular. La segunda es que las resistencias específicas de patotipo, que se vencen con más
facilidad por parte de nuevos patotipos virales, no presentan uniformidad mecanística,
actuando a distintos niveles de interferencia en el ciclo vital viral (acumulación, movimiento
intercelular a corta distancia, movimiento a larga distancia y otros). Estos son datos a
considerar a la hora de elegir las resistencias más adecuadas en programas de mejora.
Desarrollos tecnológicos.
El estudio mecanístico de las resistencias a PVY en pimiento aporta información sobre un
aspecto concreto de una situación más general, que no es otra que la durabilidad de una
resistencia determinada frente al patógeno. La caracterización de la variabilidad genética del
virus supone de hecho un abordaje complementario en el estudio de la posible durabilidad de
una resistencia. Desgraciadamente las resistencias extremas, aquellas que prácticamente no se
vencen por nuevos patotipos virales, son muy poco frecuentes. La mayoría de los genes de
resistencia resultan sobrepasados, a corto o medio plazo desde su introducción. Se conoce
muy poco acerca de las características que presentan los aislados pertenecientes a los
patotipos virales vencedores de las resistencias, que les permiten hacerlo. Sin embargo la
hipótesis de que a mayor grado de variabilidad genética en una especie viral determinada,
como por ejemplo PVY, mayor probabilidad se presenta de obtener patotipos virales más
agresivos, resulta casi una obviedad. Se deduce por consiguiente la importancia de disponer
de metodologías rápidas y precisas de caracterizar la variabilidad genética de las poblaciones
virales. A lo largo de este proyecto se ha desarrollado una tecnología que permite llevar a
cabo tipificación genético-molecular rápidamente, con una fiabilidad mucho mayor que la
serológica al uso, y más próxima a la de la secuenciación de genomas virales. La ventaja de la
nueva tecnología frente a esta última es su rapidez y aplicabilidad a grandes números de
muestras procedentes directamente del campo. El método parte de nuestro propio desarrollo
patentado de la IC-(RT)-PCR, para completarlo con un análisis de RFLPs que permite la
tipificación rápida de un aislado viral en su raza genética correspondiente. El método se
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desarrolló primeramente centrándose en un gen viral considerado como marcador genómico
(el gen de la proteína de la cápsida). Posteriormente se ha conseguido aplicar la IC-RT-PCR a
la amplificación de todo el genoma de PVY, lo que abre la puerta a la posibilidad de llevar a
cabo la tipificación genética analizando la totalidad del genoma viral.
Establecimiento de patotipos y razas de PVY y de la competencia entre ellas.
El desarrollo metodológico referido en la sección anterior se llevó a cabo utilizando una
colección de aislados de PVY de orígenes geográficos diversos y procedentes de distintos
huéspedes, disponible en nuestro laboratorio. Una vez comprobada la eficacia de esta nueva
forma de abordar la tipificación genética de aislados de PVY se procedió a su aplicación a
casos de interés, por lagunas de conocimiento sobre ellos. Uno de estos casos era el de los
aislados tipo C de PVY, descritos originalmente como una raza de PVY-patata. Sobre estos
aislados existe una gran confusión acerca de su naturaleza, debido a informaciones en cierta
medida contradictorias sobre ellos en la literatura científica. Nuestro análisis ha revelado que
el conjunto de estos aislados constituye un patotipo viral, definido por la eficacia frente a ellos
del gen de resistencia Nc de patata. Desde un punto de vista genético-molecular conforman
dos razas genéticas claramente diferenciadas. Una de estas razas supone de hecho una raza
nueva de PVY, no descrita hasta ahora. La otra raza no es nueva sino que curiosamente, es un
subgrupo de la raza genética provisionalmente denominada NP, constituida por aislados de
PVY procedentes de huéspedes que no sean la patata. Esta raza de aislados tipo C de PVY se
diferencia además de las otras razas de PVY-patata por su capacidad de infectar pimiento.
También hemos estudiado los aislados típicos de PVY-pimiento. La situación aquí es
totalmente diferente. Se ha puesto de manifiesto que la variabilidad genética de estos aislados
es muy pequeña. Todos los aislados caracterizados han resultado ser tipo NP, con una
pequeña distancia genética entre ellos. Es de resaltar la paradoja de que con una base genética
tan estrecha, exista un potencial amplio de variedad de patotipos, como los descritos para los
genes pvr21 y pvr5, por ejemplo. No está claro todavía el porqué de esta situación. Una
posibilidad interesante es que los determinantes de patotipo radiquen en motivos moleculares
muy pequeños y específicos. Si esto es así, se produciría una situación favorable para el
desarrollo de sistemas racionalizados de utilización de resistencias en función de la estructura
genética de poblaciones virales particulares para dichos determinantes. Los primeros datos
que se han obtenido para PVY-tomate sugieren una situación diferente a los otras estudiadas.
El tomate parece ser un huésped muy permisivo para las distintas razas de PVY. Es posible
incluso que se pueden definir razas virales nuevas en este cultivo.
Una característica de nuestro nuevo procedimiento de tipificación viral es la posibilidad que
ofrece para el análisis de infecciones múltiples por aislados virales distintos del mismo virus,
indistinguibles por otras metodologías, especialmente serológicas. Ello nos ha permitido el
estudio de la evolución temporal de infecciones dobles con múltiples parejas de aislados de
PVY. La conclusión clara que se deriva de este estudio es que por encima de un cierto umbral
de distancia genética los aislados conviven en una misma planta huésped, pero por debajo del
umbral compiten, desplazando el de mayor grado de adaptación (“fitness”) al de menor, con
mayor rapidez según la distancia genética entre ellos es menor. Esta observación tiene un gran
de potencial de aplicación en estrategias de control por protección cruzada clásica o
transgénica.
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FORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Begoña Blanco Urgoiti, titulada
“Caracterización de razas genéticas del potyvirus Y de la patata (PVY). Aplicaciones
taxonómicas y epidemiológicas”, en la E.T.S.I. Agrónomos de la Universidad Politécnica de
Madrid. 1997. Apto “cum laude”.
PUBLICACIONES
Artículos científicos
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Martínez Zubiaur, Y., Zabalgogeazcoa, I., de Blas, C., Sánchez, F., Peralta, E. L., Romero, J.,
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Journal of General Virology, 79. 2037-2042.
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batches. Situation of the NTN, Wilga and Z isolates. European Journal of Plant Pathology,
104. 811-819.
Libros
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Ponz, F. 1996. Resistencia a virus de plantas. En “Patología vegetal”. Ed.: Sociedad Española
de Fitopatología . Nº I.S.B.N. 84-921910-0-7. Nº de Volúmenes 1. 101-118.
Patentes y Obtenciones
Gustavo Barbosa Nolasco, David Martínez Herrera, Florentina Sánchez Sánchez, Javier
Romero Cano, Fernando Ponz Ascaso, Vicente Torres Pascual.
Denominación: Procedimiento para analizar estructuralmente el genoma de patógenos virales
y subvirales.
Registrado en Madrid.
Fecha 21-Diciembre-1993
Situación actual: concedida el 1 de abril de1996, por la Oficina Española de Patentes y
Marcas, con el número 2074961.
Gustavo Barbosa Nolasco, Carmen de Blas Beorlegui, David Martínez Herrera, Florentina
Sánchez Sánchez, Javier Romero Cano, Fernando Ponz Ascaso, Vicente Torres Pascual.
Denominación: Procedimiento para la tipificación molecular de patógenos virales con genoma
RNA y de patógenos subvirales mediante síntesis aleatoria de cDNA.
Registrado en Madrid.
Fecha 6-Mayo-1994
Situación actual: concedida el 16 de agosto de1996, por la Oficina Española de Patentes y
Marcas, con el número 2078185.
Begoña Blanco Urgoiti, Fernando Ponz Ascaso, Florentina Sánchez Sánchez, Vicente Torres
Pascual.
Denominación: Procedimiento para detectar la presencia de virus Y de la patata
Registrado en Madrid.
Fecha 13-Octubre-1994
Situación actual: pendiente de adjudicación. Número de solicitud de la Oficina Española de
Patentes y Marcas: 9602551.
Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios
Ponz, F, Cambra, M. Avances en el diagnóstico virológico vegetal. IV Congreso Nacional de
Virología. Sociedad Española de Virología. Madrid (España). Septiembre, 1995.
Ponz,F. La IC-RT-PCR como método general de diagnóstico y tipificación genética de virus
vegetales. IX Congreso Latinoamericano de Fitopatología. Asociación Latinoamericana de
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Martínez-Herrera, Sánchez, F., de Blas, C., Jordá, C., Nolasco, G., Romero, J., Torres, V.,
Ponz, F. Quick PCR typing of plant viruses. 4th International Congress of Plant Molecular
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Zabalgogeazcoa, I., de Blas, C., Martínez Zubiaur, Y., Romero, J., Ponz, F. A geminivirus
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mediante análisis del tipo PCR-RFLP directamente sobre muestras vegetales. VII Congreso de
la Sociedad Española de Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
Blanco, B., Ponz, F., Martínez, A., Marquínez, R., Pérez de San Román, C., Legorburu, J.
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Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre,
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de Blas, C., Cabaleiro, C., Zabalgogeazcoa, I., Segura, A., Ponz, F. Closterovirus asociados a
la enfermedad del enrollado en vides de la provincia de Pontevedra. VII Congreso de la
Sociedad Española de Fitopatología. Sitges, Barcelona (España). Octubre, 1994.
Zabalgogeazcoa, I., de Blas, C., Martínez Zubiaur, Romero, J., Ponz, F. Presencia de un
geminivirus en tomates de Cuba. VII Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología.
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Caranta, C., Thabuis, A., Romero, A., Daubèze, A.M., Blattes, A., Nemouchi, G., Chuvet,
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1998.
9