síndrome reproductivo y respiratorio porcino

CAPÍTULO 2.6.5.
SÍNDROME REPRODUCTIVO Y
RESPIRATORIO PORCINO
RESUMEN
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la
reproducción de las cerdas y problemas respiratorios de los lechones y cerdos en etapas
posteriores de crecimiento. La enfermedad está causada por el virus SRRP, un virus clasificado
actualmente como miembro del nuevo orden establecido de los Nidovirales, familia Arteriviridae,
género Arterivirus. La diana celular primaria de los virus son los macrófagos alveolares de los
cerdos. Existen dos tipos antigénicos principales, el tipo europeo y el tipo americano.
Actualmente el virus del SRRP se encuentra distribuido en la mayor parte del mundo donde existe
producción intensiva de cerdos. El fallo reproductivo se caracteriza por infertilidad, momificación
fetal, abortos, nacidos muertos, y el nacimiento de crías débiles que a menudo mueren al nacer por
trastornos respiratorios e infecciones secundarias. Los cerdos adultos pueden mostrar signos
ligeros de enfermedad respiratoria, a veces complicada por infecciones secundarias. El SRRP no
parece afectar a otras especies animales, sólo a cerdos.
Identificación del agente: El diagnóstico de la infección vírica del SRRP es difícil; el virus puede
aislarse de cerdos afectados a partir de tejidos tales como suero o líquido ascítico, o de muestras
de órganos, como pulmones, amígdalas, ganglios linfáticos y bazo. Para el aislamiento del virus se
recomiendan el uso de macrófagos alveolares porcinos porque constituyen el sistema de cultivo
más susceptible para los virus de ambos tipos antigénicos. También son adecuadas las células
MARC–145 (clon MA–104). Existe variabilidad entre grupos de macrófagos en cuanto a su
susceptibilidad frente al virus del SRRP. Por tanto, es necesario identificar un grupo con elevada
susceptibilidad, y conservar esta cepa en nitrógeno líquido hasta su uso. El virus se identifica y
caracteriza por inmunotinción con antisueros específicos. Se han desarrollado técnicas
adicionales, como la técnica inmunohistoquímica e hibridación in situ sobre tejidos fijados y la
transcripción inversa mediante la reacción en cadena de la polimerasa para la confirmación en el
laboratorio de la infección por el virus del SRRP.
Pruebas serológicas: Hoy en día se dispone de un amplio rango de pruebas serológicas para la
detección en suero de anticuerpos frente al virus del SRRP. La técnica de la inmunoperoxidasa en
monocapa emplea macrófagos alveolares y la técnica de inmunofluorescencia indirecta utiliza
células MARC–145 que se infectan normalmente con el tipo antigénico viral europeo o el
americano, respectivamente. Sin embargo, ambas técnicas pueden ser diseñadas con ambos tipos
de virus del SRRP. En la actualidad se usan frecuentemente técnicas inmunoenzimáticas (ELISA)
unidas a enzimas comercializados o propias. Se dispone de un ELISA comercial específico para
ambos tipos de virus, europeo y americano. Se han descrito ensayos de tipo ELISA indirecto,
ELISA de bloqueo y ELISA doble, que permiten distinguir entre los tipos europeo y americano.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas pueden ser de gran
ayuda en la prevención de las formas reproductiva y respiratoria del SRRP. Las vacunas vivas
modificadas no son adecuadas para su uso en hembras gestantes, cerdas jóvenes y verracos. La
vacunación puede dar lugar a la eliminación del virus vacunal en el semen. Las vacunas de virus
vivos modificados pueden persistir en animales vacunados y se ha descrito la transmisión potencial
a animales no vacunados y la consiguiente enfermedad inducida por el virus vacunal.
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Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
A. INTRODUCCIÓN
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (SRRP) se caracteriza por defectos en la reproducción de las
cerdas y crisis respiratorias de los lechones y cerdos en crecimiento (3, 17, 37) y es causa significativa de
pérdidas económicas. La enfermedad fue detectada por primera vez en 1987 en los Estados Unidos de América
(USA), donde fue conocida al principio como la enfermedad porcina misteriosa, debido a la naturaleza elusiva de
su agente causal, pero más tarde fue denominada síndrome respiratorio y de infertilidad porcino. Durante el
invierno de 1990–1991 la enfermedad apareció en Europa Occidental, donde se extendió rápidamente y adquirió
muchos más nombres, incluyendo Seuchenhafter Spätabort der Schweine, Abortus blauw, enfermedad azul
espigada porcina, síndrome dysgénésique et respiratoire du porc, y síndrome respiratorio y aborto epidémico
porcino (10, 13, 48). A lo largo de este capítulo, se empleará el nombre de SRRP para denominar esta
enfermedad; este es el nombre más ampliamente aceptado por la comunidad veterinaria internacional.
El virus del SRRP (PRRSV), el agente etiológico del SRRP, se clasifica en la actualidad como miembro del orden
Nidovirales, familia Arteriviridae, género Arterivirus (7). Para su multiplicación, tanto in vivo como in vitro, se
emplean preferiblemente macrófagos alveolares porcinos. El virus presenta envuelta, contiene ARN con
polaridad de mensajero y un diámetro de 50–70 nm. Se ha determinado la secuencia genómica del virus (14, 34),
y el ARN vírico es de aproximadamente 15 kb de longitud y codifica ocho marcos de lectura abierta (ORF). Se
han identificado tres proteínas estructurales principales: una proteína de la nucleocápsida (N; ORF 7) de 14–15
kDa, una proteína de membrana (M; ORF 6) de 18–19 kDa, y una glicoproteína de envuelta (E; ORF 5) de 24–25
kDa. Otras tres glicoproteínas estructurales menos abundantes están codificadas por las ORFs 4, 3, y 2 (38). Se
han preparado anticuerpos monoclonales tanto contra las proteínas estructurales mayoritarias como minoritarias
(15, 19, 32, 35, 43, 46, 50). Las cepas virales europeas están antigénicamente muy relacionadas entre sí, y más
alejadas de las correspondientes cepas americanas (4, 47). A su vez, la relación antigénica de éstas últimas
entre sí también es muy estrecha. Se ha detectado la presencia del SRRP en varios países de Asia y unos pocos
países de Sudamérica. Australia, Nueva Zelanda, Suecia y Suiza se encuentran libres de SRRP.
Se han publicado revisiones acerca de las manifestaciones clínicas detalladas y de las lesiones provocadas por
la infección por el PRRSV en cerdos de diferentes grupos de edad (3, 17, 37). En resumen, los cerdos
neonatales infectados por el PRRSV muestran disnea (dificultad respiratoria), pero también una variedad de
otros síntomas tales como conjuntivitis, fiebre, aspereza de pelo, anorexia, diarrea, temblores, eritema cutáneo,
edema de párpados y mortalidad, que puede llegar a ser elevada. En cerdos destetados y en crecimiento, se ha
observado fiebre, neumonía, defectos en el desarrollo y un incremento en la mortalidad por infecciones
bacterianas simultáneas. Las infecciones subclínicas son más comunes en cerdos en fase de acabado, verracos
y cerdas de reposición. La fiebre transitoria y la inapetencia pueden llegar a ser habituales. Se ha descrito que en
verracos infectados con el PRRSV y en los vacunados con la vacuna viva atenuada, el PRRSV puede aparecer
en el semen, lo que puede provocar cambios en la morfología y función del esperma. Existen datos de mortalidad
asociada con la infección por el PRRSV en cerdos adultos. Recientemente se ha descrito una forma virulenta de
SRRP: síndrome de mortalidad y aborto de cerdas (SAMS). La enfermedad reproductiva se conoce bastante
bien. Varios grupos de investigación han demostrado repetidamente que existe una relación causal entre la
infección por el PRRSV y los defectos de reproducción en las piaras de crianza, y la enfermedad ha podido ser
reproducida experimentalmente. Las infecciones en el último tercio del periodo de gestación parecen causar los
problemas principales, consistentes en abortos al final de la gestación con fetos momificados y en nacimientos
de lechones muertos o tan débiles que mueren tras su alumbramiento (13, 48). No está claro si las infecciones
en las primeras etapas de gestación pueden causar fallos reproductivos o problemas en la recría. Existen
algunas evidencias, aunque escasas, de varios aislados con diferente grado de virulencia reproductiva; en
algunos países se ha detectado la existencia de cepas que causan infección transplacental, sin efectos
destructivos en los fetos.
La importancia de la infección respiratoria es menos conocida. Ha sido difícil reproducir constantemente la
enfermedad respiratoria con el virus solo y también ha sido difícil demostrar experimentalmente en cerdos el
incremento en la susceptibilidad a infecciones bacterianas atribuida a la infección por el PRRSV. Algunos
estudios han descrito diferencias en la gravedad de los síntomas clínicos y en lesiones microscópicas y
macroscópicas tras la inoculación experimental de cerdos con diferentes aislados PRRSV (22, 23). Tal
predisposición del PRRSV a exacerbar otras enfermedades es actualmente un tema típico de estudio de varios
grupos de investigación, y aunque parece que el virus podría agravar algunas infecciones secundarias, no son
del todo conocidos sus posibles mecanismos.
Las lesiones microscópicas y macroscópicas consecuencia de la infección por el PRRSV se observan
principalmente en cerdos recién nacidos y lactantes. En cerdos adultos, las lesiones pueden ser similares pero
menos marcadas. Las lesiones macroscópicas asociadas con el PRRSV varían. Las lesiones de pulmón varían
desde ninguna a una apariencia difusa, y se complican habitualmente por infecciones bacterianas coincidentes.
Los ganglios linfáticos afectados, más comúnmente en cerdos jóvenes, pueden aumentar significativamente de
tamaño. Las lesiones microscópicas, bastante inespecíficas, habitualmente afectan al pulmón y al tejido linfoide.
Las lesiones de pulmón se caracterizan por neumonía intersticial multifocal que muestra infiltración de células
mononucleares en los septos alveolares, hipertrofia e hiperplasia neumocítica de tipo 2, y una marcada
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acumulación de exudado alveolar necrótico e inflamatorio. Los ganglios linfáticos muestran hiperplasia folicular,
focos de necrosis folicular y residuos en los folículos. Además, se han descrito lesiones vasculares, cardiacas y
cerebrales. Las lesiones fetales observadas sin consecuencia, se caracterizan por vasculitis, miocarditis y
encefalitis. Es importante señalar que la infección por PRRSV es solamente un agente infeccioso que se ha
asociado con neumonía intersticial en cerdos. El síndrome del adelgazamiento postdestete asociado con la
infección por circovirus porcino de tipo 2 está actualmente relacionado con neumonía intersticial y linfoadenitis en
cerdos.
En general, los anticuerpos parecen poseer un valor protector limitado. Los cerdos infectados pueden
permanecer virémicos durante 4–6 semanas después de la infección, y pueden transmitir el virus a otros cerdos.
No se sabe si los anticuerpos maternales pueden proteger contra infecciones tempranas, pero se puede detectar
viremia de la semana 4 en adelante en cerdos nacidos a partir de hembras seropositivas. Sin embargo, se ha
observado un cierto nivel de protección en lechones con anticuerpos maternos, y la elevación en los títulos de
anticuerpos neutralizantes se corresponde a menudo con un descenso en los títulos virales de la sangre.
Además, las hembras infectadas por segunda vez no muestran defectos reproductivos recurrentes. En pocas
palabras, la relación entre títulos de anticuerpos y protección no se entiende muy bien. La inmunidad mediada
por células no se ha estudiado ampliamente pero se piensa que ejerce un papel protector. La infección por
PRRSV, sin embargo, parece provocar una débil respuesta inmune celular adaptativa. Un aspecto intrigante de
la infección por PRRSV es la duración prolongada de viremia y la consiguiente transmisión de los virus por
contacto a animales, en comparación con otras infecciones virales. Los virus desaparecen de la circulación con
el tiempo, pero se mantiene una infección persistente en los tejidos linfoides. Sin embargo, en general se está de
acuerdo en que la infección no parece perdurar toda la vida.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente.
El diagnóstico virológico del SRRP es difícil. Ello es debido, principalmente, a que las células elegidas para aislar
el virus son los macrófagos alveolares porcinos, que debe extraerse de cerdos (preferentemente libres de
patógenos específicos [SPF]) de menos de 6–8 semanas de vida (48, 51). No todos los laboratorios disponen de
un suministro adecuado de este tipo de cerdos y las líneas celulares continuas no pueden reemplazar
correctamente a los macrófagos alveolares porque aquellas son generalmente menos susceptibles al virus.
Además, no todos los cultivos de macrófagos son igualmente susceptibles al virus; se desconoce la razón de
esto, pero es necesario probar cada cultivo antes de su uso.
Ciertas líneas celulares de riñón de mono (p. ej. MA–104) pueden reemplazar correctamente a los macrófagos
pero estas líneas celulares no permiten la multiplicación de todos los aislados, particularmente de las cepas
europeas. Este capítulo, por tanto, sólo describe el aislamiento de virus con macrófagos alveolares. Se han
desarrollado técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia para detectar el antígeno del PRRSV en
tejidos. Estas pruebas son más rápidas que el aislamiento de los virus y no necesitan la infraestructura de los
cultivos celulares. Además, la técnica inmunohistoquímica (21, 28) empleando tejidos fijados con formalina hace
posible la visualización del antígeno junto con las lesiones histológicas y permite el análisis comparativo
retrospectivo con especímenes de archivo. También se ha descrito la hibridación in situ, capaz de detectar y
diferenciar los genotipos PRRSV norteamericano y europeo en tejidos fijados con formalina (29, 41). La
transcripción inversa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT–PCR) y la PCR combinada son
pruebas muy sensibles para detectar el ARN vírico (12, 27, 30, 33, 45) y ahora son empleadas más
habitualmente sobre otros tejidos diferentes, incluyendo el suero. Estas pruebas son también útiles cuando es
problemático el aislamiento del virus, como por ejemplo cuando se examina semen (12) y cuando se emplean
tejidos parcialmente degradados por autolisis o por calor durante el transporte de las muestras para el
aislamiento de los virus. Se ha diseñado una técnica de PCR multiplex para diferenciar los aislados PRRSV
norteamericano y europeo (20). El análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción de
los productos amplificados por PCR, ha permitido diferenciar cepas naturales y vacunales del PRRSV (49) y
recientemente se han llevado a cabo estudios epidemiológicos moleculares mediante el análisis filogenético de
secuencias específicas de genes estructurales.
a)
Obtención de macrófagos alveolares a partir de los pulmones
Los pulmones deben proceder preferentemente de cerdos SPF o de una piara de cerdos que se haya
demostrado estar libre de la infección por PRRSV. Los mejores resultados se obtienen con cerdos de
menos de 8 semanas de vida. Los macrófagos se deben obtener a partir del pulmón el mismo día del
sacrificio del cerdo. Los pulmones deben lavarse tres o cuatro veces con un volumen total aproximado de
200 ml de tampón fosfato salino estéril (PBS). Posteriormente el líquido de lavado recogido se centrifuga a
1.000 g durante 10 minutos. El precipitado resultante conteniendo los macrófagos se resuspende en PBS y
se centrífuga (se lava) dos veces más. El precipitado final se resuspende en 50 ml de PBS, y se realiza un
recuento del número de macrófagos para determinar la concentración celular. Los macrófagos pueden ser
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utilizados en fresco, o pueden conservarse en nitrógeno líquido según procedimientos estandarizados, a
una concentración final de aproximadamente 4 x 107 macrófagos/1.5 ml. Los cultivos de macrófagos no
deben mezclarse.
b)
Comprobación de los cultivos de macrófagos alveolares
Antes de poder utilizar un cultivo de macrófagos, éste debe validarse. Se realiza por titulación con un
PRRSV estándar, de título conocido, sobre los nuevos macrófagos, mediante un ensayo de
inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA) con suero positivo y negativo, en placas inoculadas con estos
macrófagos. Se considera que las células son adecuadas para ser usadas sólo si el PRRSV estándar crece
hasta alcanzar su título específico (DICT50 o dosis infectiva 50% en cultivo celular). Es recomendable que
los macrófagos alveolares y el suero bovino fetal (FBS) empleados para suplementar los medios de cultivo
estén libres de pestivirus.
c)
Aislamiento de virus a partir de macrófagos alveolares
Los macrófagos alveolares se inoculan en los pocillos de fondo plano de placas de microtitulación para
cultivo de tejidos. Tras la adhesión, los macrófagos se infectan con la muestra. Las muestras pueden ser
suero o líquido ascítico, o suspensiones de tejidos al 10%, tales como amígdalas, pulmón, ganglios
linfáticos, y bazo. En general, el PRRSV provoca un efecto citopático (ECP) en los macrófagos después de
1–2 días de cultivo, pero a veces los virus producen un ECP casi inapreciable o sólo se observa tras pases
sucesivos. Una vez que se observa un ECP, el PRRSV debe ser identificado por inmunotinción con un
antisuero específico.
i)
Inoculación de los macrófagos en las placas de microtitulación
Se descongela un vial conteniendo 6 x 107 macrófagos/1,5 ml. Se lavan las células una vez con 50 ml
de PBS y la suspensión celular se centrífuga a 300 g durante 10 minutos (a temperatura ambiente).
Se resuspenden las células en 40 ml de medio RPMI (Rose Memorial Institute) 1640 suplementado
con FBS al 5% y mezcla de antibióticos al 10 % (medio de crecimiento). Se dispensan 100 µl de la
suspensión celular en cada pocillo de la placa de microtitulación (con un vial de células, se pueden
inocular cuatro placas de microtitulación a una concentración de 105 células en cada pocillo de las
placas).
ii)
Preparación de las diluciones de la muestra (suero, líquido ascítico, suspensión de tejidos al 10%) en
placas base
Se dispensan 90 µl de medio de crecimiento en cada pocillo de una placa de microtitulación. Se
añaden muestras de 10 µl a los pocillos de las filas A y E (dilución 1/10 por duplicado). Se agitan las
placas y se transfieren 10 µl de las filas A y E a las filas B y F (dilución 1/100). Se agitan las placas y
se transfieren 10 µl de las filas B y F a las filas C y G (dilución 1/1.000). Se agitan las placas y se
transfieren 10 µl de las filas C y G a las filas D y H (dilución 1/10.000). Se agitan las placas.
iii)
Incubación de las muestras
Se transfieren 50 µl de las diluciones de la muestra de las placas base a los correspondientes pocillos
de la placa con macrófagos (primer pase). Se incuban de 2–5 días y se observan diariamente los
posibles ECP. El día 2, se inoculan macrófagos en placas de microtitulación nuevas (como se ha
indicado previamente). Se transfieren 25 µl de los sobrenadantes procedentes de las placas del primer
pase a los pocillos correspondientes de las nuevas placas inoculadas (segundo pase). Tras incubar
durante 2–5 días se observa la posible aparición de ECP.
iv)
Lectura e interpretación de los resultados
Los pocillos en los que los macrófagos muestran ECP sólo en el primer pase se considerarán falsos
positivos debido a la toxicidad de la muestra. Los pocillos en los que los macrófagos presenten ECP
en ambos pases o sólo en el segundo pase se considerarán como presuntos positivos. Todos los
pocillos con monocapas de macrófagos que no muestren ECP serán confirmados como PRRSV
negativos mediante inmunotinción con un antisuero PRRSV–positivo. Las muestras ECP–positivas
deben identificarse como PRRSV positivos mediante cultivo de las muestras de sobrenadante ECP–
positivo, o diluciones de la muestra original, durante 24 y 48 horas en los macrófagos, y posterior
inmunotinción con antisuero PRRSV–positivo.
v)
Inmunotinción con antisuero PRRSV–positivo
Se infectan macrófagos con 50 µl de sobrenadante de muestra de tejido como se describe en la
Sección B.2.a., y se crecen las células infectadas durante 24 y 48 horas. Se prepara la dilución
apropiada de un suero PRRSV–positivo en tampón de dilución, y se inmunotiñen los macrófagos como
se describe en la Sección B.2.a. o B.2.b.
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2.
Pruebas serológicas
Existe una variedad de técnicas para la detección de anticuerpos séricos contra el PRRSV. El diagnóstico
serológico es, en general, fácil de realizar, y presenta una adecuada especificidad y sensibilidad, especialmente
en una piara base. En ocasiones el suero de cerdos individuales causa problemas por reacciones inespecíficas,
pero esta dificultad se puede resolver tomando de nuevo muestras al cabo de 2–3 semanas. La serología se
lleva generalmente a cabo generalmente mediante técnicas de unión, tales como el IPMA, la técnica de
inmunofluorescencia, o la técnica del enzimoinmunoensayo (ELISA) – de todas ellas se han descrito muchas
variedades (1, 8, 9, 16, 24, 36, 39, 40, 48, 52). Estas pruebas se llevan a cabo habitualmente con antígeno vírico
de un determinado tipo antigénico, de modo que los anticuerpos dirigidos contra el otro tipo antigénico,
heterólogo, pueden ser detectados con menor sensibilidad. En Dinamarca se ha utilizado extensamente un
ELISA de bloqueo (39) y se ha descrito como un sistema ELISA doble que emplea como antígeno tanto el virus
europeo como el americano (40). La primera vacuna atenuada viva para el SRRP basada en el virus del tipo
americano se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42), y se ha descrito en Dinamarca el
desarrollo subsiguiente en las piaras de defectos en la reproducción del SRRP inducidos por el virus de la
vacuna (6, 31). La reacción al PRRSV vacunal del tipo americano puede que se produzca en países que usan o
han estado usando esta vacuna; los países europeos pueden, por tanto, observar reacciones y aislar ambos
tipos antigénicos (6, 31). Recientemente se ha descrito la identificación de las cepas de PRRSV de tipo europeo
en EE.UU. y Canadá, pero su prevalencia no está bien documentada.
Los anticuerpos contra el virus pueden detectarse mediante técnicas de unión a anticuerpo tan sólo 7–14 días
después de la infección, y alcanzan sus títulos máximos en 30–50 días. Algunos cerdos pueden convertirse en
seronegativos en 3–6 meses, pero otros permanecen seropositivos durante mucho más tiempo. Los anticuerpos
neutralizantes se desarrollan lentamente y no alcanzan títulos elevados. Se pueden detectar a partir de 3 ó
4 semanas tras la infección y pueden persistir durante 1 año o más. Se ha descrito el uso del complemento para
aumentar la sensibilidad de la prueba de neutralización sérica del virus (25). Todavía no se ha investigado en
profundidad la duración de los títulos de anticuerpos tras la infección, y probablemente los resultados
dependerán de las pruebas realizadas. Los anticuerpos maternos tienen una vida media de 12–14 días, y su
título puede, en general, detectarse hasta 4–8 semanas después del nacimiento, dependiendo del título de
anticuerpos de la vaca en el parto y la prueba realizada. En un medio infectado, los cerdos nacidos de madres
seropositivas pueden seroconvertirse activamente a partir de las 3– 6 semanas de vida.
Este capítulo describe con detalle el IPMA y cómo llevar a cabo esta prueba en laboratorios donde se hayan
establecido los procedimientos de aislamiento de virus empleando macrófagos, y pueda ser utilizado con virus de
ambos tipos antigénicos. Esta técnica puede ser adaptada también a la línea celular MARC–145, para los tipos
europeo y americano (39, 40). Igualmente se ha diseñado una técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
empleando células MARC–145 para la serología del PRRSV y se incluye en el presente capítulo. Se dispone de
ELISAs comerciales con buena sensibilidad y especificidad y se han comparado (18).
a)
Detección de anticuerpos por la técnica de la inmunoperoxidasa en monocapa
Los macrófagos alveolares se inoculan en los pocillos de placas de microtitulación. Tras la adhesión, los
macrófagos se infectan con el PRRSV. El objetivo es infectar aproximadamente el 30–50% de los
macrófagos de modo que seamos capaces de distinguir suero no específico. Después de un periodo de
incubación, los macrófagos se fijan y se emplean como sustrato celular para las pruebas serológicas. En
cada placa se pueden analizar 11 sueros por duplicado. Los sueros a analizar se diluyen e incuban sobre el
sustrato celular. Si en el suero problema están presentes anticuerpos, se unirán al antígeno en el
citoplasma de los macrófagos. En la siguiente etapa de incubación, los anticuerpos unidos se detectarán
mediante un anticuerpo anti–especie conjugado a peroxidasa de rábano (HRPO). Finalmente, el sustrato
celular se incuba con una solución cromógeno/sustrato1. La lectura de la prueba se realiza mediante un
microscopio invertido.
1
•
Inoculación de macrófagos en las placas de microtitulación
i)
Se descongela un vial conteniendo 6 x 107 macrófagos/1.5 ml.
Preparación de la solución cromógena
Solución stock de cromógeno (3–amino–9–etil–carbazol[AEC]): (a) 4 mg AEC; (b) 1 ml N, N–dimetil–formamida.
Se disuelve (a) en (b) y se conserva la solución stock AEC a 4°C en la oscuridad.
Preparación de la solución del cromógeno/sustrato (se prepara poco tiempo antes de usar)
Se prepara 0.05 M tampón acetato sódico, pH 5.0, como sigue: se disuelve 4.1 g de acetato sódico en 1 litro de agua
destilada. Se ajusta el pH a 5.00 con ácido acético al 100%.
Se añade 1 ml de solución stock AEC a 19 ml de 0.05 M tampón acetato sódico.
Se añaden 10µl de H202 al 30% por cada 20 ml de solución cromógeno/sustrato.
La solución se filtra a través de filtros de 5µm.
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ii)
Se lavan las células una vez con 50 ml de PBS y la suspensión celular es centrifugada 10 minutos a
300 g (a temperatura ambiente).
iii)
Las células se introducen en 40 ml de medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 5%, 100 IU
(Unidades Internacionales) de penicilina y 100 µg de estreptomicina (medio de crecimiento).
iv)
Se distribuyen 100 µl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de microtitulación (con un
vial de células, se pueden inocular cuatro placas a una concentración de 105 células por cada pocillo
de las placas). Alternativamente se utiliza tampón HEPES (ácido N–2– hidroxietilpiperazina, N–2–
etanosulfónico)
v)
Se incuban las placas 18–24 horas a 37°C en un incubadorcon atmósfera humidificada y un 5% de
CO2 en el medio.
•
Infección de las células con PRRSV
i)
A cada pocillo se le añaden 50 µl de una suspensión vírica conteniendo 105 DICC50/ml, reservando
dos pocillos sin infectar como controles.
ii)
Se incuban las placas 18–24 horas a 37°C en un incubador con CO2 al 5%.
•
Fijación de las células
i)
Se decanta el medio de crecimiento y las placas se enjuagan una vez en solución salina.
ii)
Las placas se golpean suavemente sobre una toalla para eliminar el exceso de líquido y se secan (sin
tapadera) 45 minutos a 37°C.
iii)
Se congelan las placas (sin tapadera) 45 minutos a –20°C. (Las placas que no se utilicen
inmediatamente en las pruebas deben ser selladas y conservadas a –20°C).
iv)
Se incuban las células 10 minutos a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% (en PBS).
Alternativamente las células pueden fijarse en etanol absoluto enfriado en hielo durante 45 minutos a
5°C o en acetona al 80% en hielo durante 45 minutos (5).
v)
Se elimina el paraformaldehído y las placas se lavan una vez con solución salina.
•
Preparación de las diluciones de suero en una placa base
i)
Se distribuyen 180 µl de 0,5 M NaCl con suero de caballo al 4% y Tween 80 al 0,5%, a pH 7,2 (tampón
de dilución), en los pocillos de las filas A y E de la placa/s base.
ii)
Se adicionan 120 µl del suero problema y control a los pocillos de las filas A y E (=dilución 1/10), y se
agitan.
iii)
Se diluye el suero cuatro veces transfiriendo 40 µl de las filas A y E a las filas B y F, y así
sucesivamente hasta preparar las siguientes diluciones 1/40, 1/160 y 1/ 640.
•
Incubación del suero en las placas con macrófagos fijados
i)
Se transfieren 50 µl de cada uno de los pocillos de la placa/s base a los correspondientes pocillos de
una placa con macrófagos fijados. Se sella la placa/s y se incuba durante 1 hora a 37°C.
ii)
Se eliminan las diluciones de suero y se lava la placa/s tres veces con 0,15 M NaCl + Tween 80 al
0,5%.
•
Incubación con el conjugado
i)
Se diluye el conjugado de conejo anti–porcino HRPO a una dilución predeterminada en 0,15 M NaCl
+ Tween 80 al 0,5%. Se añaden 50 µl de la dilución del conjugado a todos los pocillos de la placa/s.
Se sella la placa/s y se incuba 1 hora a 37°C. Se lavan las placas tres veces.
•
Procedimiento de tinción
i)
Se dispensan 50 µl de la solución filtrada de cromógeno/sustrato (AEC) a todos los pocillos de la
placa/s (ver nota al pie de página 1).
ii)
Se incuba el AEC durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Se sustituye el AEC por 50 µl de 0,05 M acetato sódico, pH 5,0 (ver nota al pie de página 1).
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•
Lectura e interpretación de los resultados
Si los anticuerpos están presentes en el suero problema, aproximadamente el citoplasma del 30–50% de
las células del pocillo estará teñido de rojo intenso por el cromógeno. Un suero problema negativo se
reconocerá por falta de tinción del citoplasma. Un suero que reacciona de forma inespecífica puede teñir
todas las células del pocillo (si se compara con un suero control positivo). El título de un suero se expresa
como el inverso de la mayor dilución que tiñe el 50% o más de los pocillos. Un suero con un título < 10 se
considera negativo. Un suero con un título de 10 a 40 se considera como débil positivo. A menudo se
observa tinción inespecífica en algunas diluciones. Un suero con un título de ≥ 160 se considera positivo.
b)
Detección de anticuerpos con la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Aunque en la actualidad no existe una única técnica de inmunofluorescencia aceptada como estándar, se
han desarrollado varios protocolos que utilizan diferentes laboratorios en Norte América. La técnica IFI
puede llevarse a cabo sobre portas de ocho cámaras empleando la línea celular MARC–145 y un aislado
PRRSV adaptado a dicha línea celular. Para evitar la reacción cruzada con pestivirus, se recomienda que
las células y el FBS, para suplementar el medio de cultivo, estén libres de pestivirus. Tras un periodo de
incubación, las células infectadas por PRRSV se fijan y se utilizan como sustrato celular para las pruebas
serológicas. Se comprueban las muestras de suero empleando una única dilución de examen, la 1/20, y las
muestras serán consideradas positivas o negativas a esta dilución. Cada suero porcino a analizar se
añadirá a los pocillos o cámaras conteniendo las células infectadas por el PRRSV. Los anticuerpos contra
este virus, si están presentes en el suero, se unirán a los antígenos en el citoplasma de las células
infectadas. Tras esta etapa se añade un anticuerpo anti–porcino–IgG conjugado a fluoresceína, el cual se
unirá a los anticuerpos porcinos que estén unidos a los antígenos del PRRSV en las células infectadas.
Para observar los resultados se emplea un microscopio de fluorescencia. Pueden emplearse también
placas de microtitulación a fin de poder titular el suero (ver Sección b1 más adelante).
868
•
Inoculación e infección de las células MARC—145 en placas de microtitulación
i)
Se añaden 50 µl de medio de cultivo celular (p ej. Medio Mínimo Esencial [MEM] conteniendo L–
glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 100 IU de penicilina y 100 µg de estreptomicina) sin FBS a
cada pocillo de las columnas 2, 4, 6, 8, 10 y 12 de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta
multicanal.
ii)
Se emplean células confluentes MARC–145 tripsinizadas (cultivadas en frascos de cultivo) para
inocular placas de microtitulación de 96 pocillos y se resuspenden las células en medio de cultivo
conteniendo FBS al 8% a una concentración de 100.000–125.000 células/ml. Las células MARC–145
se tripsinizan a partir de los frascos de cultivo para los ensayos IFI una vez a la semana, empleando
tripsina/EDTA (ácido etilendiamino–tetra–acético) y se inoculan en frascos de cultivo a una
concentración de 250.000 células/ml. Tras 4 días en los frascos de cultivo, se adiciona medio de
cultivo nuevo conteniendo FBS al 2% manteniéndose tres días más.
iii)
Empleando una pipeta multicanal se adicionan 150 µl de la suspensión celular a cada pocillo de la
placa de 96 pocillos.
iv)
Se diluye la preparación del PRRSV en MEM sin FBS hasta una concentración de 102,2 DICC50/50µl y
se distribuyen 50 µl en cada pocillo de las columnas 1, 3, 5, 7, 9 y 11.
v)
Se incuban las placas aproximadamente 48–72 horas a 37°C en un incubador con atmósfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta obtener una monocapa con el 40–50% aproximadamente de las
células infectadas, lo que se determinará mediante inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente,
las placas de microtitulación pueden ser primero inoculadas con suspensiones celulares MARC–145
(p. ej. a una concentración de 100.000 células/ml en un medio suplementado con FBS al 5–10%) e
incubadas, como máximo 72 horas, hasta que las células confluyan. Entonces se añaden volúmenes
de 50 µl de preparaciones del PRRSV (p. ej. 105 DICT50/ml) en cada pocillo y las placas se incuban un
tiempo adicional de 48–72 horas antes de la fijación. Se ha sugerido el uso de tampones orgánicos
tales como HEPES en los medios para estabilizar el pH cuando no se dispone de incubadores con
CO2.
•
Inoculación e infección de células MARC—145 en portas de ocho cámaras
i)
Se añaden 500 µl de una suspensión de células MARC–145 (p. ej. en MEM suplementado con FBS al
10%) a una concentración de 100.000 células/ml, a cada compartimento de un porta de ocho cámaras.
ii)
Se incuban las células aproximadamente 48–72 horas a 37°C en un incubador con atmósfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
iii)
Se añaden a cada cámara 50 µl de una suspensión del PRRSV conteniendo 105 DICC50/ml y después
se incuban las células aproximadamente 18 horas en un incubador con atmósfera humidificada y un
5% de CO2. En ese momento podrán observarse mediante inmunofluorescencia indirecta 15–20
células infectadas por campo de visión.
•
Fijación de las células
i)
Se elimina el medio, se lava una vez con PBS y se elimina el PBS. En el caso de portas de ocho
cámaras, se sacan las paredes de plástico de los compartimentos y se dejan intactas las gomas.
ii)
Se añaden volúmenes de 150 µl de acetona (al 80% en agua) fría (4°C) a cada pocillo de una placa de
96 pocillos. Las placas se incuban 30 minutos a 4°C. En el caso de portas de ocho cámaras, se
emplea acetona (80–100%) a temperatura ambiente para fijar las células durante 10–15 minutos a
temperatura ambiente. Algunas marcas comerciales de acetona pueden degradar las gomas de las
cámaras dejando una película sobre los portas. Es recomendable comprobar la acetona antes de
usarla para la fijación rutinaria.
iii)
Se elimina la acetona y se secan las placas y portas a temperatura ambiente.
iv)
Las placas pueden introducirse entonces en bolsas de plástico, se sellan y conservan a –70°C hasta
su uso. Los portas pueden mantenerse de forma similar en cajas de portas.
•
Preparación de las diluciones de suero
i)
Se diluyen las muestras de suero hasta la dilución 1/20 en PBS (0,01 M; pH 7,2) en placas de
96 pocillos (p. ej. se añaden 190 µl de PBS empleando una pipeta multicanal y seguidamente 10 µl del
suero problema).
ii)
Se incluyen como controles de referencia sueros de título conocido, positivos con anticuerpos contra el
PRRSV y negativos, sin ellos.
•
Incubación de los sueros con células MARC—145 fijadas
i)
Se sacan las placas almacenadas en el congelador a –70°C y cuando alcanzan la temperatura
ambiente, las células se rehidratan unos pocos minutos con 150 µl de PBS. Se quita el PBS invirtiendo
las placas y se secan con toallas de papel. Las células en los portas de ocho cámaras no se
rehidratan.
ii)
De cada suero diluido se añaden volúmenes de 50 µl a un pocillo conteniendo células no infectadas
fijadas y a un pocillo conteniendo células infectadas fijadas. Se añaden volúmenes similares de cada
suero a cada cámara de los portas.
iii)
De la misma manera se añaden volúmenes de 50 µl de diluciones de sueros control negativo y
positivo.
iv)
Se incuban las placas tapadas a 37°C durante 30 minutos en una atmósfera húmeda. Los portas
deben ser incubados de forma similar en cajas o bandejas de portas con tapadera.
v)
Se eliminan las muestras de suero y las placas se secan sobre toallas de papel. Se deben realizar un
total de seis lavados empleando 200 µl de PBS. El PBS se añade a cada pocillo y a continuación se
invierten las placas para eliminar el PBS. En el caso de portas, después de extraer las muestras de
suero, se lavan 10 minutos con PBS.
•
Incubación con el conjugado
i)
Mediante una pipeta multicanal se añaden a cada pocillo volúmenes de 50 µl de los conjugados
diluidos apropiadamente (en PBS preparado en el momento) de IgG (cadenas ligeras y pesadas) de
conejo o de cabra anti–porcino conjugada con FITC (isotiocianato de fluoresceína). Volúmenes
similares se añaden a las cámaras individuales de los portas.
ii)
Se incuban las placas o los portas con sus tapaderas a 37°C durante 30 minutos en una atmósfera
húmeda.
iii)
Se elimina el conjugado de las placas y éstas se secan sobre toallas de papel. Se realiza un total de
cuatro lavados mediante PBS, como se ha descrito previamente. Tras eliminar el conjugado de los
portas, se aclaran con PBS, se lavan 10 minutos con PBS y se aclaran con agua destilada. Se deben
golpear suavemente los portas sobre un papel absorbente para eliminar el exceso de agua.
iv)
Las placas y los portas se observan mediante un microscopio de fluorescencia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
869
Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
•
Lectura e interpretación de los resultados
La presencia de fluorescencia verde en el citoplasma de células infectadas combinada con la ausencia de
tal señal en células no infectadas es un indicador de la presencia de anticuerpos contra el PRRSV en el
suero a la dilución analizada. El grado de la intensidad de fluorescencia puede variar de acuerdo con la
cantidad de anticuerpo específico anti–PRRSV presente en el suero probado.
La ausencia de fluorescencia verde específica en ambos tipos de células, infectadas y no infectadas, se
interpreta como ausencia de anticuerpos contra PRRSV en tal suero a la dilución probada. La prueba debe
repetirse si en células infectadas no se observa fluorescencia al utilizar el suero control positivo o si se
observa fluorescencia con el suero control negativo. No debe verse fluorescencia en células no infectadas
con ninguno de los sueros control. Cualquier suero problema que ofrezca resultados dudosos debe ser
probado de nuevo a la dilución 1/20 y si los resultados siguen sin ser claros, es necesario tomar una nueva
muestra del mismo animal para su análisis posterior.
b1) Evaluación mediante IFI de sueros para la titulación de anticuerpos
Pueden emplearse placas de microtitulación y la técnica IFI con el propósito de titulación de sueros. Se
pueden titular hasta 16 sueros en cada placa de microtitulación de 96 pocillos.
i)
Se inoculan las placas con células MARC–145 y se incuban a 37°C en un incubador con atmósfera
humidificada y un 5% de CO2 hasta que confluyan.
ii)
Se inoculan todos los pocillos con la preparación del PRRSV excepto los pocillos de las columnas
1, 6 y 11, y las placas se incuban a 37°C en un incubador con atmósfera humidificada y un 5% de CO2
durante 48–72 horas.
iii)
Se elimina el medio de cultivo y las monocapas se lavan una vez con PBS (0,01 M, pH 7,2). Las
monocapas se fijan con acetona fría (solución acuosa al 80%) durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Se elimina la acetona, se secan al aire las placas y se mantienen tapadas a –20°C para
almacenamientos cortos o a –70°C para almacenamientos a largo plazo, hasta su uso.
iv)
Se preparan diluciones seriadas del suero incluyendo un suero control positivo anti–PRRSV realizando
diluciones al cuarto y empezando por la dilución 1/16 ó1/20. Se diluye un suero control negativo a la
dilución 1/16 ó 1/20. Se administran 50 µl de cada dilución (1/16, 1/64, 1/256, 1/1024 ó 1/20, 1/80,
1/320, 1/1280) en los pocillos conteniendo el antígeno vírico de las columnas 2, 3, 4, 5 ó 7, 8, 9, 10.
Para cada suero, también se dispensan 50 µl de la dilución 1/16 ó 1/20 en los pocillos control de las
columnas 1 y 6. De la misma forma se administran las diluciones de los sueros control positivo y
negativo en los pocillos de las columnas 11 y 12.
v)
Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda. Se desecha el suero y se
lavan las placas tres veces con PBS.
vi)
Se añaden 50 µl de IgG anti–porcino, diluida apropiadamente, conjugada con FITC y las placas se
incuban a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda. Se elimina el conjugado, y las placas se
lavan varias veces y se golpean ligeramente sobre material absorbente para eliminar el exceso de
líquido.
•
Lectura e interpretación de resultados
Mediante examen al microscopio de fluorescencia, el título de un suero se define como el inverso de
dilución más alta del suero en lal que se observa la típica fluorescencia citoplasmática. Empleando
muestras de suero, por duplicado, un incremento del título de cuatro veces con un intervalo de 2 semanas,
es un indicativo de infección activa en un animal determinado. No se debe observar fluorescencia
específica en células control no infectadas empleando sueros problema o sueros control positivo o negativo.
Tampoco se debe observar fluorescencia en células infectadas usando suero control negativo. La
fluorescencia específica debe aparecer en células infectadas empleando suero control positivo a las
diluciones apropiadas. El acabado final del IFI puede variar entre distintos laboratorios. Los resultados de
las pruebas también pueden variar dependiendo del aislado PRRSV empleado en las pruebas debido a la
diversidad antigénica.
c)
Detección de anticuerpos mediante las técnicas de enzimoinmunoensayo
Varios laboratorios han desarrollado ELISAs (indirecto o de bloqueo) para pruebas serológicas (1, 8, 9, 16,
24, 39, 40). Se ha descrito un sistema ELISA doble–de bloqueo que permite distinguir entre reacciones
serológicas frente a los tipos antigénicos europeo y americano (40). Se dispone de kits comerciales de
ELISA para determinar el estado serológico de los cerdos frente al PRRSV. Estos kits emplean los tipos
PRRSV americano o europeo separadamente o bien ambos antígenos combinados. La principal ventaja es
870
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
el manejo rápido de gran número de muestras. También se han desarrollado y están disponibles
comercialmente ELISAs que utilizan proteínas recombinantes de ambos tipos de PRRSV como antígenos.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En USA se han autorizado varias vacunas de virus vivos modificados (MLV) para el control de las formas
reproductiva y/o respiratoria del SRRP. También, tanto en EE.UU. como en Europa se ha autorizado el uso de
una vacuna con virus muertos, con objeto de ayudar en la reducción de abortos y crías débiles causadas por la
forma reproductiva del SRRP. Todas las vacunas frente al SRRP actualmente autorizadas en EE.UU. contienen
el tipo antigénico americano. En Europa, se han autorizado y se dispone comercialmente de dos vacunas MLV.
Los tipos antigénicos (americano o europeo) empleados, deben ser apropiados a la región de aislamiento (44).
Las directrices a seguir para la producción de vacunas de interés veterinario se indican en el Capítulo I.1.7.
Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 pretenden ser
en esencia generales y pueden ser complementadas ante requerimientos regionales y nacionales.
Aunque la vacunación de los cerdos no evita la infección con el PRRSV, puede ser útil en granjas porcinas que
experimenten problemas con el SRRP o granjas con alto riesgo de infección por el PRRSV. Las vacunas MLV no
han sido pensadas para ser utilizadas en explotaciones no experimentadas, ni en cerdas gestantes, ni en cerdas
jóvenes o machos en edad de crianza. Las vacunas MLV han sido diseñadas para ser aplicadas a cerdas adultas
y jóvenes 3–6 semanas antes de tener crías y en lechones de 3 semanas de edad o mayores para ayudar a
reducir los trastornos provocados por el SRRP. El virus de la vacuna puede persistir en verracos y puede ser
diseminado a través del semen (11, 12). El virus de la vacuna MLV puede ser vertido y transmitido por contacto a
cerdos no vacunados (42).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El aislado del PRRSV utilizado en la producción de vacunas debe ir acompañado de una ficha describiendo
su origen e historial de pases. El aislado debe ser seguro en los cerdos a la edad a la que va dirigida la
vacuna y proporcionar protección frente al virus de desafío objeto de la prueba. Los aislados para cualquier
vacuna MLV deben demostrar ausencia de reversión a su estado virulento tras varios pases en animales
hospedadores.
b)
Método de cultivo
El PRRSV se propaga en una línea celular continua de riñón de mono verde africano, tal como la MA–104 o
Vero. La propagación vírica no debe exceder de cinco pases desde el virus del inóculo original (MSV) a
menos que pases posteriores demuestren proporcionar protección en el ganado porcino.
c)
Validación como vacuna
El MSV debe estar libre de bacterias, hongos y micoplasmas. Mediante técnicas con anticuerpos
fluorescentes, debe demostrarse que el MSV está libre de virus extraños, incluyendo el virus de la
gastroenteritis transmisible, el adenovirus porcino, el virus de la encefalitis hemaglutinante porcina, el
parvovirus porcino, el virus de la diarrea vírica bovina, reovirus, y el virus de la rabia. El MSV debe estar
libre de virus extraños comprobándose mediante ECP y hemoadsorción en la línea celular Vero y en un tipo
celular porcino embrionario.
Se sabe que los aislados atenuados del PRRSV causan viremia y que pueden transmitirse a animales
susceptibles. Debe demostrarse que el MSV no es virulento en lechones y hembras gestantes mediante
cinco pases seriados del MSV a través de cerdos susceptibles empleando la ruta de infección más natural.
En un ensayo de inmunogenicidad, el MSV en su nivel de pase más elevado intentado para la producción,
debe proteger a los cerdos susceptibles contra una cepa virulenta heteróloga de desafío. Para la forma
respiratoria, los lechones de 3 semanas se vacunan con el nivel de pases mal alto del MSV. Los lechones
se enfrentan a un aislado virulento del PRRSV 2–16 semanas más tarde para determinar si están
protegidos de los signos clínicos respiratorios del SRRP. Para determinar protección de las pérdidas
causadas por la forma reproductiva de SRRP, los animales vacunados se desafiarán aproximadamente al
día 85 de la gestación. Un número significativo de los vacunados debe estar protegido de los signos clínicos
de la enfermedad reproductiva, incluyendo momificación fetal, nacidos muertos y o lechones débiles,
cuando se comparan con los controles. Los estudios de pruebas de campo deberían conducir a determinar
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
871
Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
la seguridad de la vacuna. Debe incluirse en cada lugar cerdos centinelas no vacunados a fin de vigilar la
posible fuga de virus atenuados.
2.
Método de producción
La línea celular de riñón de mono verde africano se siembra en recipientes adecuados. Para la producción se
emplea medio MEM complementado con FBS; el FBS debe estar libre de pestivirus o anticuerpos frente a
pestivirus y también libre del riesgo de encefalopatía espongiforme bovina. La incubación se realiza a 37°C.
Los cultivos celulares se inoculan directamente con un stock de virus productor del SRRP, que generalmente
procede del 1 al 4° pase a partir del MSV. Los cultivos inoculados se incuban de 1–8 días antes de recoger el
medio de cultivo. Durante la incubación, los cultivos deben observarse diariamente para detectar ECP y
contaminación bacteriana.
Las vacunas de virus muertos se inactivan químicamente con formalina o etileneimina binaria y se mezclan con
un adyuvante adecuado. Las vacunas MLV se mezclan generalmente con un estabilizador antes de ser
embotelladas y liofilizadas. Si se emplea formalina como inactivador, debe comprobarse que en el producto final
la concentración residual de formaldehído no excede de 0,5 g/l.
3.
Control interno
Los lotes de producción del PRSV deben ser titulados en cultivos de tejidos mediante estandarización del
producto. Los lotes de titulación baja deben concentrarse o bien mezclarse con lotes de titulación más alta para
alcanzar el título correcto.
4.
Control de lotes
Las muestras en sus envases finales deben analizarse en cuanto a su pureza, seguridad o inocuidad y potencia.
Los viales de MLV deben ser probados en cuanto al contenido máximo de humedad permitido.
a)
Pureza
Las muestras se examinan para descartar una posible contaminación con bacterias, hongos o pestivirus.
Para probar la presencia de bacterias se inoculan diez recipientes, cada uno de ellos conteniendo 120 ml
de medio hidrolizado de caseína de semilla de soja, con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de
contenedores finales. Los diez recipientes se incuban a 30–35°C durante 14 días y se realiza un
seguimiento del posible crecimiento bacteriano. Para probar la presencia de hongos se inoculan
10 recipientes, cada uno de ellos conteniendo 40 ml de medio hidrolizado de caseína de semilla de soja,
con 0,2 ml procedentes de 10 muestras de contenedores finales. Los recipientes se incuban a 20–25°C
durante 14 días y se observa el posible crecimiento de hongos.
b)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad pueden llevarse a cabo con una combinación de cobayas, ratones o cerdos.
c)
Potencia
Las muestras de los contenedores finales de una vacuna MLV se titularán (log10) en placas de
microtitulación para la determinación del título.
872
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se preparan diluciones decimales partiendo de 10–1 hasta 10–5 empleando la vacuna problema
rehidratada y 1,8 ml de MEM. Debe titularse un control positivo interno del PRRSV en el rango
apropiado.
ii)
Se inocula 0,1 ml/pocillo de cada dilución en cinco pocillos de una placa con 96 pocillos conteniendo
monocapas de riñón de mono verde africano.
iii)
Se incuba la placa a 37°C en una atmósfera con CO2 durante 5–7 días.
iv)
Se observan las placas microscópicamente para detectar ECP. El control positivo interno del PRRSV
debería dar un título dentro del rango de 0,3 log10 DICC50 de su media predeterminada.
v)
Se determina la DICT50/dosis mediante el método de Spearman–Kärber. El título obtenido debe ser al
menos 1,2 logs mayor que el título utilizado en el ensayo de inmunogenicidad. Los 1,2 logs incluyen
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.6.5. — Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
0,5 logs para estabilidad durante el periodo de validez del producto y 0,7 logs para la variabilidad de la
prueba de potencia.
Para determinar la potencia del producto final de vacunas con virus muertos se pueden emplear animales
hospedadores o pruebas de vacunación/serología con animales de laboratorio o pruebas de
vacunación/desafío. Los ensayos en paralelo empleando técnicas tipo ELISA que cuantifican antígeno para
comparar un estándar con el producto final son adecuados para determinar la potencia relativa de un
producto. El estándar debe proporcionar protección en el animal hospedador.
d)
Duración de la inmunidad
Los estudios de la duración de la inmunidad se realizan antes de que la vacuna reciba la acreditación final.
Para la forma respiratoria del SRRP, la duración debe ser elevada hasta la edad de puesta en mercado de
los cerdos. La duración de la inmunidad para la forma reproductiva debe cubrir la etapa de destete de los
lechones.
e)
Estabilidad
Todas las vacunas tienen inicialmente un periodo de validez de 24 meses antes de expirar. Los estudios de
estabilidad en tiempo real se llevan a cabo para confirmar si es correcta la fecha de expiración.
f)
Conservantes
Los antibióticos se añaden durante la producción, generalmente gentamicina sulfato o neomicina, no
excediendo los 30 µg/ml.
g)
Precauciones (riesgos)
La vacunación sólo se recomienda para cerdos de piaras PRRSV–positivas. Las vacunas MLV tratan de ser
una ayuda en la reducción de la enfermedad asociada con la forma respiratoria y/o reproductiva del SRRP y
no está recomendada para ser usada en cerdas gestantes, ni en cerdas jóvenes o machos en edad de
crianza. La vacunación de machos en edad de crianza con la vacuna MLV no se recomienda debido al
posible vertido del virus de la vacuna en el semen (11, 12). La primera vacuna MLV para el SRRP basado
en el virus tipo americano, se ha observado que se transmite a animales no vacunados (6, 42) y por tanto
causa defectos en la reproducción típicos del SRRP inducidos por el virus de la vacuna en las
explotaciones afectadas (6, 31).
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver sección C.4.b.
b)
Potencia
Ver sección C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para el Síndrome reproductivo y respiratorio porcino (ver el
Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar un
listado más actualizado: www.oie.int).
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