Tema 7. Estructura y organización del ADN Objetivos

Tema 7. Estructura y organización del
ADN
Genética CC. Mar 2005-06
Objetivos
•Examinar las propiedades que debe
tener el material hereditario.
•Comprender la estructura y
organización del material hereditario.
•Entender la replicación del ADN.
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Material hereditario
• El material hereditario debe …
– Contener de una forma estable la información
genética.
– Transmitir la información fielmente.
– Poder cambiar, permitiendo la variación,
adaptación y evolución.
• El material hereditario lo forman:
– ¿Proteínas?
– ¿Ácidos nucleicos (ADN y ARN)?
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Búsqueda del material hereditario
1890 August Weismann propone que hay una sustancia en el
núcleo que controla las características de los individuos.
1900 Los cromosomas contienen la información hereditaria. Más
tarde se comprueba que los cromosomas están hechos de
ácidos nucleicos (ADN y ARN) y proteínas.
1928 Experimento de transformación de Griffith.
1944 Experimento de transformación de Avery, MacLeod y
McCarty.
1953 Experimento del bacteriófago de Hershey y Chase.
1953 Watson y Crick proponen la estructura en doble hélice del
ADN.
1956 Gierer y Schramm demuestran que el ARN es el material
hereditario de algunos virus.
1957 Fraenkel-Conrat y Singer confirman el experimento de
Gierer y Schramm.
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Experimento de transformación de
Griffith
• Streptococcus pneumoniae: agente transforma cepa
IIR (no virulenta) en IIIS (virulenta).
Figura. Experimento de transformación de Griffith (1928).
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Experimento de transformación de
Avery, MacLeod y McCarty
• Lisaron bacterias IIIS y aislaron sus componentes.
• El ADN es el agente transformante.
Figura. Oswald Avery
Figura. Experimento de transformación de Avery, MacLeod y McCarty (1944).
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Bacteriófagos
Figura. Fago T2.
Figura. Ciclo lítico del fago T2.
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Experimento de Hershey y Chase
• Marcan fagos T2
– DNA (32P)
– Proteínas (35S)
• Infectan E. coli.
• 32P aparece en las
bacterias y progenie.
Alfred Hershey, Nobel 1969
Figura. Experimento de Hershey y Chase (1953)
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Virus ARN
• Gierer y Schramm (1956): ARN provoca enfermedad
del virus del mosaico del tabaco (TMV).
• Fraenkel-Conrat y Singer (1957): TMV (RNA A,
proteínas B) + TMV (RNA B, proteínas A) = TMV A.
Figura. Experimento de Fraenkel-Conrat y Singer.
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Estructura ADN (I)
• ADN y ARN son polímeros formados por
cadenas de nucleótidos:
– azúcar pentosa: desoxirribosa (ADN) o
ribosa (ARN).
– base nitrogenada.
– grupo fosfato.
Figura. Estructura de la desoxirribosa y ribosa.
Figura. Grupo fosfato.
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Estructura ADN (II)
• Purinas: adenina (A) y guanina (G).
• Pirimidinas: citosina (C), timina (T) y
uracilo (U).
• ADN: A, C, G y T.
• ARN: A, C, G y U.
Figura. Bases nitrogenadas.
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Estructura ADN (III)
• Nucleósido = pentosa
(C1) –enlace covalente–
base (purina N9,
pirimidina N1).
• Nucleótido = pentosa
(C5) + grupo fosfato.
• Cadenas
polinucleotídicas:
nucleótido (fosfato)
–enlace fosfodiéster 5’-3’–
nucleótido (C3).
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Estructura del ADN
• Estructura descubierta por James Watson
y Francis Crick en 1953.
• Basada en dos fuentes de información
principales:
– Estudios de composición de bases de Erwin
Chargaff.
– Estudios de difracción de rayos X de
Rosalind Franklin y Maurice Wilkins.
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Reglas de Chargaff
• Chargaff (1949):
–
–
–
–
(A + G) / (C + T) = 1
A/T = 1
G/C = 1
(A + T) / (G + C) = %GC
• Contenido GC varía a escala evolutiva:
– 50-60% procariotas
– 45% eucariotas
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Difracción de rayos X
• Los rayos X son difractados de una forma particular
según la disposición de los átomos en una molécula.
• Franklin y Wilkins (1953), ADN:
– hélice no sencilla
– diámetro de 2nm
– dos regularidades de 0.34 y 3.4 nm a lo largo del
eje de la molécula
Figura. Difracción de rayos X.
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Modelo de Watson y Crick (1953)
1. Dos cadenas polinucleotídicas enlazadas en una
doble hélice dextrógira.
2. Las cadenas son antiparalelas, una está orientada en
dirección 5’-3’ y la otra en dirección 3’-5’.
3. El esqueleto azúcar-fosfato se sitúa en la parte
externa, mientras que las bases nitrogenadas se
orientan perpendicularmente hacia el eje interno.
4. Las bases complementarias en cadenas opuestas
forman enlaces de hidrógeno. A se empareja con T
(puentes 2H), y C con G (puentes 3H).
5. Pares de bases 0.34 nm aparte. Una vuelta completa
de la hélice requiere 3.4 nm (10 bases por vuelta).
6. Las vértebras de azúcar-fosfato forman surcos
mayores y menores.
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Modelo de la doble hélice
ADN-B
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Un descubrimiento revolucionario
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Protagonistas
• Crick, Watson y Wilkins recibieron el
Nobel en 1962.
Rosalind
Franklin
James D.
Watson
Francis H.
Crick
Maurice H. F.
Wilkins
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Tipos diferentes de ADN
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Estructura del ARN
• El ARN es de cadena única,
y puede adoptar estructuras
complejas, incluso
intramoleculares.
• El ARN utiliza como azúcar
la ribosa.
• El ARN utiliza U en vez de
T.
• El ARN puede catalizar
importante reacciones
biológicas.
tRNA
rRNA
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Organización del ADN en cromosomas
• El DNA de la célula se organiza cromosomas.
• El cromosoma o juego de cromosomas que
contiene todo el DNA de un organismo se
denomina genoma.
• En procariotas el genoma es usualmente un
cromosoma circular único.
• En eucariotas el genoma es un juego haploide
completo de cromosomas contenidos en el
núcleo celular.
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Cromosomas virales
• Virus = ácidos nucleicos + proteínas.
• Material genético:
– ADN!1, ADN!2, ARN!1, ARN!2
– Circular o linear
– Uno o varios cromosomas
Los fagos pares son ADN!1. El
genoma de T4 abarca 168 kb. En una
población los distintos genomas son
permutaciones circulares de los
mismos genes. Algunos genes se
repiten al principio y final del
cromosoma, lo que se denomina
redundancia terminal.
Fago "X174 infecta E. coli. Tiene un
único cromosoma circular de ADN de
5386 nucleótidos. Forma icosaédrica.
El fago # es parecido a
los fagos T. Genoma
ADN!2. Presenta
extremos pegajosos
complementarios.
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Cromosomas procarióticos
• La mayoría ADN!2 circular.
• En Bacteria y Archaea el cromosoma se localiza una
masa densa (nucleoide).
• E. coli: 1 cromosoma de 4.6 Mb
– Superenrrollamiento
– Lazos
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Valor C
• Valor C = cantidad total de ADN en el genoma
haploide de una especie.
• Varía entre las especies sin relación con
complejidad estructural u organizativa (paradoja
del valor C).
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Cromatina
• La cromatina es el complejo de ADN y proteínas
cromosómicas. Parecida en todos los eucariotas.
• En la cromatina encontramos proteínas histonas y no
histonas.
• Las histonas son comunes, pequeñas, básicas (+)
–
–
–
–
Papel fundamental en el empaquetamiento de la cromatina.
Cinco tipos principales H1, H2A, H2B, H3 y H4,
En peso, histonas/ADN =1 en todos los eucariotas.
Muy conservadas evolutivamente (H4 de vacas y guisantes se
diferencian en 2 aminoácidos).
• Las proteínas no histonas son a menudo acídicas (-)
– Difiere mucho entre los tipos celulares y entre los diferentes
organismos.
– En peso, no histona / ADN = 50-100%.
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Empaquetamiento ADN (I)
• El genoma de un única célula humana (3.4 ! 109
pb) debería de medir 2.3 metros.
• Empaquetamiento a varios niveles:
– Enrollamiento del ADN (145 pb) sobre octámeros de
histonas (2 ! H2A, H2B, H3 y H4) para formar los
nucleosomas.
– Conexión de los nucleosomas mediante ADN de unión
(9-115 pb) asociado a H1.
– Empaquetamiento de los nucleosomas en fibras de
cromatina de 30 nm.
– Formación de dominios en lazo.
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Empaquetamiento ADN (II)
Nucleosoma
Fibras de 30 nm
Nucleosomas unidos por
ADN de unión + H1
Dominios en lazo
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Empaquetamiento ADN (III)
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Eucromatina y heterocromatina
• Eucromatina: sigue los ciclos habituales de
condensación (máxima en metafase)y
descondensación durante el ciclo celular.
– La mayoría del genoma de una célula activa es eucromatina.
– Transcripción activa.
– Secuencias no repetidas.
• Heterocromatina: siempre condensada.
– Transcripción inactiva.
– La heterocromatina constitutiva está presente en todas las
células en posiciones idénticas cromosomas homólogos.
Básicamente ADN repetitivo. Ej. Regiones centroméricas.
– La heterocromatina facultativa varía en estado de célula a
célula, durante el desarrollo, y a veces, entre cromosomas
homólogos. Ej. corpúsculos de Barr.
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ADN centromérico y telomérico
• En el centrómero se pueden encontrar secuencias de
ADN especiales (CEN en levaduras) que interactúan
con los microtúbulos.
• Las secuencias teloméricas mantienen la estabilidad de
los cromosomas y intervienen en su replicación:
– Secuencias simples teloméricas: secuencias repetidas en
tándem en los extremos con funciones esenciales
estabilizadoras.
– Secuencias asociadas a telómeros, de forma más interna, algo
más complejas y con función desconocida.
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Propiedades físico-químicas de los
ácidos nucleicos
• Densidad de los ácidos nucleicos.
• Desnaturalización de los ácidos nucleicos:
temperatura de fusión (Tm).
• Absorbancia a 260 nm.
• Cinética de renaturalización: Curvas Cot.
• Hibridación de los ácidos nucleicos.
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32
Densidad y desnaturalización
• $G+C $densidad del ADN.
• Desnaturalización: paso de cadena doble a
sencilla.
Absorbancia a 260 nm
– $G+C $estabilidad del ADN (+puentes 3H).
– Temperatura de fusión (Tm): Tº necesaria para
desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla.
– $G+C $Tm
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33
Absorbancia UV a 260 nm
• El menor grado de absorción se produce en
estado de doble hélice.
• La absorción aumenta cuando se produce la
desnaturalización pasando a estado de hélice
sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la
absorbancia).
• Si degradamos este ADN de hélice sencilla a
nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta
la absorbancia.
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Cinética de la reasociación (I)
• La renaturalización es el paso de hélice sencilla a
doble hélice.
• Curvas Cot o de renaturalización.
• Cot ! = tiempo en que se ha reasociado ! del ADN.
– Directamente proporcional a la complejidad del ADN del
organismo.
– $secuencias repetidas $velocidad renaturalización
Figura. Curva Cot.
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Cinética de la reasociación (II)
• Las curvas Cot de virus y bacterias tienen un sólo
punto de inflexión (secuencias únicas).
• Las curvas Cot de eucariotas poseen varios puntos de
inflexión:
– Cot ! bajos (10-4 a 10-1): secuencias altamente repetidas
– Cot ! 10–102: secuencias moderadamente repetidas.
– Cot ! > 103 : secuencias únicas o de bajo número de copias.
Figura. Curvas Cot.
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Hibridación
• Las técnicas de desnaturalización renaturalización
permiten la hibridación ADN+ADN o ADN+ARN.
• Se puede identificar el gen que ha dado lugar a un
determinado ARN mensajero.
• Las técnicas de hibridación "in situ" permiten localizar
la posición de un gen de un cromosoma eucariótico.
– ADN marcado con fluorescencia (FISH).
– Marcaje del genoma (GISH).
Figura. FISH
Figura. GISH
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Secuencias únicas y repetidas de ADN
• ADN de secuencia única: una o
pocas copias.
– Genes codificantes
– ADN procariota
– ~65% genoma humano
• ADN repetitivo:
– Moderadamente repetitivo (pocas
o hasta 105 copias) o altamente
repetitivo (105 – 107 copias).
– Disperso (SINEs y LINEs; función
desconocida) o en tándem
(centrómeros y telómeros; ~65%
genoma humano; microsatélites).
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Modelos de replicación del ADN
• Semiconservativo: cada molécula de la progenie conserva una de las
hebras parentales.
• Conservativo: las hebras parentales sirven como un único molde para la
síntesis de nuevas dobles hélices.
• Dispersivo: fragmentos de doble hélice parental sirven como moldes
para la síntesis de nuevos segmentos de doble cadena. Las nuevas hélices
están formadas por segmentos parentales y de la progenie.
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Experimento de Meselson y Stahl (1958)
• Obtuvieron evidencia experimental de que el
modelo semiconservativo era el correcto.
• Marcan ADN de E. coli con 15N.
• 15N y 14N (normal) se pueden separar mediante
centrifugación en gradientes de densidad.
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Experimento de Meselson y Stahl (1958)
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41
ADN polimerasa I
• Arthur Kornberg (1955): la ADN polimerasa I
lleva a cabo la síntesis de ADN.
• Los componentes necesarios son:
– La ADN polimerasa I
– Desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs = dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), precursores de los
nucleótidos.
– Un molde de ADN.
– Iones de magnesio (Mg2+), que optimizan la
actividad de la ADN polimerasa.
Figura. Arthur Kornberg (Nobel 1959).
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42
Reacción de la polimerasa I de ADN (I)
• Formación de un enlace fosfodiéster en el 3’-OH de la
desoxirribosa y el fosfato 5’ del dNTP.
– La energía proviene de la liberación de 2 de los 3 fosfatos.
– La cadena que crece actúa como cebador en la reacción.
• La polimerasa encuentra el dNTP complementario al
nucleótido de la cadena molde y lo incorpora
– 800 nucleótidos por segundo.
– 1 error cada 10-6 nucleótidos.
• La dirección de la síntesis es 5’-3’.
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Reacción de la polimerasa I de ADN (II)
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44
Reacción de la polimerasa I de ADN (III)
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45
Polimerasas de ADN procarióticas
• E. coli: 3 polimerasas de ADN (I, II, y II).
• Actividad exonucleásica 3’-5’: corrección de
errores (tasa error final 10-9).
• La polimerasa de ADN I presenta además
actividad exonucleásica 5’-3’.
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Replicación en procariotas
• Un único origen de replicación (oriC en E. coli, ~245 pb).
• En este sitio el ADN se desnaturaliza en cadenas sencillas
produciendo una horquilla de replicación.
• Replicación bidireccional.
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47
Inicio de la replicación en E. coli (I)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Una girasa (tipo de topoisomerasa) relaja el superenrollamiento del
ADN.
Proteínas iniciadoras se unen al origen de replicación.
Una helicasa de ADN se une a las proteínas iniciadoras. La helicasa
avanza hidrolizando ATP desenrollando la doble cadena.
Las proteínas de unión al ADN de cadena sencilla (SSB), previniendo
que estas cadenas se emparejen de nuevo.
La primasa de ADN (polimerasa de ADN) se une a la helicasa
formando el primosoma.
La primasa sintetiza un cebador de ARN (11-12 nt.), al cual puede
añadir nucleótidos la polimerasa de ADN III en dirección 5’-3’.
El cebador de RNA es más tarde eliminado y reemplazado por ADN
por acción de la polimerasa de ADN I. El hueco es sellado por una
ligasa.
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Inicio de la replicación en E. coli (II)
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49
Replicación semidiscontinua (I)
• Para mantener la polaridad 5’-3’, el ADN ha de sintetizarse en
direcciones opuestas en ambas hebras molde.
• Hebra líder: síntesis en la misma dirección que el movimiento de
la horquilla de replicación.
– Síntesis continua.
– Sólo necesita 1 cebador
• Hebra retardada: síntesis en dirección opuesta al movimiento de
la horquilla de replicación.
– Síntesis discontinua (fragmentos de Okazaki).
– Necesita varios cebadores de ARN.
– Eventualmente los fragmentos de Okazaki son conectados entre sí
por la acción de la polimerasa I de ADN (que reemplaza el cebador
de ARN por ADN) y una ligasa de ADN, que une los fragmentos.
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50
Replicación semidiscontinua (II)
ADN superenrrollado relajado por la girasa y desenrollado por la helicasa + proteínas:
5’
Proteínas SSB
Fragmentos de Okazaki
ATP
1
Polimerasa III
2
3
Hebra retardada
Helicasa
+
Proteínas Iniciadoras
3’
primasa
Polimerasa III
%
5’
Cebador
ARN
3’
Pares de bases
5’
Cebador de ARN reemplazado
por la polimerasa I
& hueco sellado por la ligasa
3’
Hebra líder
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51
Replicación semidiscontinua (III)
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52
Replicación semidiscontinua (IV)
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53
Replisoma
• Las proteínas que intervienen en la replicación forma
un complejo denominado replisoma.
• La hebra retardada puede plegarse:
– las polimerasas de las dos hebras forman un complejo.
– Se acercan los fragmentos de Okazaki. El primosoma puede
ser reusado en la misma horquilla.
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54
Replicación ADN circular E. coli
1. Dos horquillas de replicación
resultan en una estructura en
forma de zeta (&).
2. A medida que se separan las
hebras, se forma
superenrrollamiento positivo
en algún otro lugar de la
molécula.
3. Las topoisomerasas alivian la
tensión en los
superenrrollamientos,
permitiendo que las dos
hebras continúen separándose.
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55
Replicación en círculos rodantes
•
1.
2.
3.
4.
Varios fagos de ADN,
como "X174.
Corte en la hebra +.
El extremo 5’ la hebra +
se desplaza para formar
un horquilla.
La cadena intacta sirve
como molde.
La síntesis en la la hebra
+ desplazada ocurre de
forma discontinua hacia
el final de la cadena.
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Replicación del ADN en eucariotas
• La replicación el ADN es similar en procariotas y en
eucariotas (varios cromosomas).
• En cada ciclo celular, cada cromosoma debe de ser
duplicado fielmente durante la fase S. Tres puntos de
chequeo:
– Punto START (G1; en levaduras): se comprueba si la célula es
suficientemente grande y el ambiente favorable, para pasar a
la fase S.
– Punto de chequeo de la G2: se decidirá si la célula entra en
mitosis, para lo que todo el DNA tiene que estar replicado.
– Punto de chequeo durante la mitosis: los cromosomas deben
de estar propiamente ligados al huso mitótico para que se
complete la mitosis.
– En estos chequeos intervienen ciertas proteínas denominadas
ciclinas, y quinasas dependientes de ciclinas.
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57
Polimerasas de ADN eucarióticas
• No se sabe mucho sobre estas enzimas, pero al
menos 5 han sido identificadas en mamíferos:
– Polimerasa ' (alfa): nuclear, replicación del ADN,
sin función correctora.
– Polimerasa ( (beta): nuclear, reparación del ADN,
sin función correctora.
– Polimerasa ) (gamma): mitocondrial, replicación
del ADN, con función correctora.
– Polimerasa * (delta): nuclear, replicación del ADN,
con función correctora.
– Polimerasa + (epsilon): nuclear, reparación del ADN
(?),con función correctora.
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Replicón eucariótico
• Cada cromosoma
eucariótico es una doble
cadena linear de ADN.
• Existen varios orígenes de
replicación (no simultáneos).
• La región de replicación se
denomina replicón o unidad
de replicación.
– El replicón se mueve de forma
más lenta que en procariotas.
– Los fragmentos de Okazaki son
más pequeños (100-150 pb).
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Orígenes de replicación
• En levaduras se han identificado secuencias
específicas que parecen conferir la habilidad de
replicación autónoma (secuencias de replicación
autónoma o ARSs).
• Se cree que por lo menos algunas de estas secuencias
corresponden con orígenes de replicación.
• En eucariotas más complejos los orígenes de
replicación no están bien definidos.
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60
Replicación de los telómeros (I)
• Al eliminar los cebadores de los extremos, los huecos no pueden
ser cebados por otros fragmentos => los cromosomas se acortaría
en cada ronda de replicación.
• Secuencias repetidas en tándem en los telómeros.
• La telomerasa (transcriptasa reversa), que contiene proteínas y
ARN complementario a la repetición terminal, añade repeticiones
en el extremo del cromosoma, rellenando el hueco dejado por el
cebador.
• El resultado de la acción de la telomerasa es el alargamiento del
cromosoma.
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61
Replicación de los telómeros (II)
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62
Ensamblaje del nuevo ADN en
nucleosomas
• La replicación está
coordinada con la
formación de nuevos
nucleosomas.
• Se requiere la formación
de nuevas histonas.
• Los nucleosomas se
forman casi de forma
inmediata durante la
replicación.
Figura. Ensamblaje de nucleosomas.
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63
Replicación del ADN mitocondrial
• Modelo del lazo de desplazamiento o
lazo D.
• Hélice ligera (L) y pesada (H).
• Primero se inicia la replicación
unidireccional de la nueva hélice L.
• Cuando se ha sintetizado, unos 2/3 de
la hélice L, comienza la síntesis de la
nueva hélice H, en otro origen y en
una sola dirección, opuesta a la de
síntesis de la hélice L.
Figura. Replicación del ADN mitocondrial
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