Rev. de Med. E. C. Narnrra IV: 128, 1960 FACULTAD DE MEDICINA· ESTUDIO GENERAL DE NAVARRA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Modificación de la técnica crioscópica de Beckmann con 6ncs clínicos :J. M.ª Macarulla y Blanca Mendía RESUMEN Se modifica la técnica de Beckmann de medida del descenso crioscópico con objeto de aplicarla al análisis diario de la clínica. Por medio de un pequeño sobreenfriamiento previo controlado y modificación del aislamiento térmico durante la cristalización se consigue una notable reducción de la cantidad de muestra empleada, del tiempo de operación y del error por concentración de la muestra al separarse hielo. Se comprueba el método mediante series de disoluciones de substancias puras y mezclas y se aplica al estudio del plasma, suero y orina. La medida del descenso crioscópico, cuya importancia como método de investigación clínica es sobradamente conocida 5, no se ha utilizado plenamente en el análisis diario de laboratorio por dificultades de orden técnico, principalmente por la cantidad de tiempo y muestra necesarios para obtener resultados precisos. Con el objeto de resolver estos y otros inconvenientes hemos realizado un estudio experimental. Aunque esta determinación ha sido sustituída por la medida de la densidad de la OTina (imprecisa al crecer de distinto modo según el tipo de soluto) o por el análisis de alguna sustancia representativa, es indudable que para efectos osmóticos, únicamente interesa el número total de partículas disueltas por Kg de agua, valor que puede sólo presumirse de la medida de esta densidad o de una concentración parcial 1, conociéndose en cambio con exactitud mediante la determinación del descenso crioscópico. La aplicación clínica del método clásico de Beckmann 6, presenta varios inconvenientes perfectamente subsanables: a) neces,idad de una notable cantidad de muestra para bañar el termómetro y agitador; b) empleo de cierto tiempo en el enfriamiento lento de las muestras en la cámara de crioscopía; c) variación del punto crioscópico en función del sobreenfriamiento y la cantidad de hielo, separado. El apartado a) lo resolvemos empleando tubos de ensayo uniformes de 145 mm de longitud y 13 mm de diámetro medio, de capacidad tal que 2 ml de muestra cubran holgadamente el bulbo del termómetro Beckmann; éste mismo sustituye con ventaja al agitador CRIOSCOPIA CLINICA Junio, 1960 de acero, homogeneizando mejor el líquido. Este análisis, si bien emplea una cierta cantidad de líquido problema -2 mi- no lo consume, pudiéndose éste utilizar en los restantes análisis clínicos. Si se usa una cantidad menor de 2 ml el resultado obtenido por este método no es tan seguro. El tiempo del análisis y la oscilación del punto crioscópico -referidos en los apartados b) y c)- los reducimos al mínimo, produciéndose un sobreenfriamiento previo de la muestra, pequeño y constante, en baño aparte, y también del termómetro por separado, de tal modo que, al pasar aquélla al vaso de crioscopía con doble cámara de aire e introducirle el termómetro se oroduce una cristalización inmediata. Reducier{do la difusión térmica al 129 mm1mo -por la doble cámara de aire y por el pequeño gradiente de temperatura del baño al tubo problema- se calcula teóricamente la cantidad de hielo separada, que resulta ser menor del 2 por ciento de la muestra líquida, cuando se alcanza el equilibrio. La ligera elevación térmica, producida por la agitación mecánica, viene a favorecer esta situación final. MÉTODO Material Disponemos de algunos vasos Dewar de distintas capacidades y fines (fig. 1): Termómetro Beckmann Termómetro - tºc. Beckmann -1.5ºC. 13mm doble cómoro de fJire mezcla mezcla friqorífica o -2.Sºc. friqoríficfJ de ·10ºrJ ·16ºc. Tubo VfJCÍo soporte de r¡omo Papel de filtro VASO! VASO 11 VASOlll Fig. 1.-Las muestras de plasma u orina son enfriadas en el vaso I a una temperatura algo inferior a su punto de congelación manteniéndose líquidas gracias al fenómeno de la sobrefusión. En el vaso III el termómetro se enfría, después de cada lectura, a Ja temperatura de -1 a --2° C. Al pasar las muestras del vaso I al II e introducirles el termómetro frío, se produce la congelación i1nmediata con la estabilización de la temperatura en el punto crioscópico. Las pérdidas de calor y la cantidad de hielo separado en la cristalización son mínimas 130 J. M. MACARULLA Y BLANCA MENDIA 1) Vaso I.-De unos 1.000 mi de capacidad; se llena hasta la mitad de una mezcla de hielo, agua líquida y algo de sal equilibrándose para la temperatura aproximada de 0.5 a 1o c por debajo de los puntos a determinar. Para plasmas y orinas corrientes es conveniente utilizar un vaso I, con esta mezcla frigorífica estabilizada a unos -1.5º C. Para orinas muy concentradas se prepara otro vaso I con mayor proporción de sal, a temperatura de -3º C. En estos vasos se pone un termómetro que aprecie l/2º c y un máximo de 25-40 tubos de ensayo de los citados, conteniendo 2 mi de agua bidestilada o de las diversas muestras a analizar, para que se sobreenfríen a la temperatura del baño. 2) Vaso II.-De unos 250 ml de capacidad; se llena hasta más de la mitad de la misma mezcla de hielo, agua y sal, equilibrándose para -2.5º C. El tapón de caucho está atravesado por dos tubos anchos concéntricos, separados por una cámara de aire de unos 4 mm de espesor. Casi en el fondo del tubo interno hay un disco de caucho perforado que permite escurrir el agua al fondo de éste, y en la boca otro disco con una perforación mayor que sirve de apoyo al tubo de ensayo con la muestra a congelar, creando simultáneamente la segunda cámara aislante de aire. Con estas dos cámaras y la pequeña diferencia de temperaturas decrece al mínimo la tendencia a enfriarse la muestra dentro del vaso II. 3) Vaso III.-De unos 125 ml de capacidad; se llena con una mezcla de hielo y sal que se equilibra para la temperatura de -10 a -16º C. Un tapón de caucho es atravesado justamente por un tubo seco con un cilindro de papel de filtro en el fondo. En él se puede introducir el termómetro Beckmann hasta apoyarse en el papel de filtro. Técnica de la determinación I) 2 ml de las muestras a analizar se Vol. IV colocan en los tubos de 13 mm de diámetro y se introducen en el vaso I, enfriándose sin congelar hasta la temperatura del mismo. El termómetro se prepara de la forma clásica para operar entre + l y -5º c aproximadamente y se deja en el vaso III hasta que se enfríe a unos 2º c por debajo de cero. 2) Se pasa el primer tubo con agua bidestilada, ya frío, al vaso II y cuando el termómetro Beckmann presumimos está algo más bajo de Oº C se introduce en su interior, con lo que se rompe el sobreenfriamiento y se produce la cristalización inmediata. La temperatura sube primero rápida y luego lentamente. Por último se estabiliza marcando un máximo. La escala termométrica está graduada en centésimas de grado pudiéndose distinguir las milésimas aproximadas. La media de cuatro o más determinaciones concordantes hechas con agua bidestilada a lo largo de la serie de análisis, nos da el cero efectivo de la escala para aquel día. Durante el proceso de cristalización se debe agitar el líquido con el termómetro, primero activamente y, cerca del máximo, con suavidad, para no producir sobrecalentamientos locales. Anotada la temperatura de este máximo se extrae el termómetro con cristalitos de hielo adheridos. Se seca con papel de filtro y se pasa a III hasta la siguiente lectura. 3) Se quita el tubo de agua de II y en su lugar se introduce una muestra problema de I. Al pasarle el termómetro frío (-1 a -2º C) también congela inmediatamente; se agita y anota la temperatura del máximo. Después de alcanzado éste, la temperatura puede bajar unos 0.005º c y seguir después bajando muy lentamente por concentrarse el líquido a medida que se separa el hielo casi puro. La figura 2 recoge la variación de temperaturas de diversos líquidos de análisis a partir del momento de la inmersión del termómetro en ellos. Si se agita adecuadamente, el máximo Junio, 1960 131 CRIOSCOPIA CL!N!CA suele presentarse durante los 30 primeros segundos de la inmersión. Por tanto el tiempo de una determinación completa, líquido y se puede extraer el termómetro para otras determinaciones. En este caso se invierte un tiempo algo mayor en cada una (unos 3 minutos por lectura). RESULTADOS TIEMPOS Fig. 2.-Variación de la temperatura en las muestras a analizar durante el fenómeno de la congelación de las mismas. El origen de abscisas corresponde al momento de inmersión del termómetro (enfriado a -2° C) en la muestra. El máximo se alcanza antes de los 30 segundos de agitación suave. La temperatura se estabiliza un cierto tiempo y lentamente empieza a descender. Se pueden hacer más de 40 determinaciones en una hora trabajando en serie, no llega a los 90 segundos -comprobando bien el punto de congelación-, pudiéndose pues hacer más de 40 lecturas seguidas en el plazo de una hora. El tubo seco del vaso III sublima algo de escarcha del vapor atmosférico, asimismo el termómetro en su interior también capta microcristalitos de hielo que garantizan la congelación instantánea del líquido subenfriado al ser introducido aquél en éste. Si interesa utilizar posteriormente la muestra de plasma con otros fines analíticos, el termómetro, lavado con agua fría destilada y secado antes de ponerlo en III, se introducirá en el problema pero no se deberá extraer de él para no separar hielo aumentando la concentración de la mezcla remanente. Entonces se saca conjuntamente tubo y termómetro; se calienta aquél con la mano hasta la fusión total del hielo, se agita un poco el De acuerdo con la bibliografía3 consideramos Kc= 1,858º C / mol soluto / Kg agua, y aplicamos la expresión m=538L..Tc que nos da la concentración total de solutos m en un líquido determinado expresada en miliosmoles/Kg de agua. Los valores que se obtienen por este método son totalmente reproducibles y se ajustan bien a los teóricos, como veremos a continuación. En efecto, hemos determinado los descensos crioscópicos de una serie de disoluciones de urea, glucosa y cloruro sódico purísimos cuyos resultados, consecuencia de medidas cuadruplicadas plenamente concordantes figuran respectivamente en las Tablas I, Ir y III. En ellas se observa que la osmolalidad ideal medida por pesada y la real por crioscopía son prácticamente idénticas en la zona de las concentraciones fisiológicas y, aunque se advierte la influencia del factor de actividad o coeficiente osmótico a concentraciones elevadas, éste es despreciable para efectos clínicos en las mediciones corrientes. Asimismo hemos determinado descensos crioscópicos en mezclas de electrolitos y solutos orgánicos observándose que la osmolalidad total es una magnitud aditiva en disoluciones diluídas y decrece sobre el valor ideal en las concentradas. Para acabar de contrastar el método, de un lote de muestras a distintas diluciones se tomó 2, 4 y 8 mi de cada una de ellas en tubos de capacidad creciente y se determinó su punto de congelación, resultando una concordancia plenamente satisfactoria dentro del error experimental, concordancia que se hizo extensiva al punto de congelación que determina- Vol. IV J. M. MACARULLA Y BLANCA MEND!A 132 TABLA I Determinación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de urea por medida cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión. Temperatura media de congelación leída en la escala del Termómetro Bcckmann Substancia (2ml) 6.017 5.809 5.604 5.266 5.090 4.888 4.286 Agua Urea C 1 e2 Ci e4 es e6 11 Te Concentración real deducida según la fórmula 11 Te. 1000 Concentración ideal por pesada (müsm/Kg agua) m 1.858 (müsm/Kg agua) ü=1;* o o o 0.208 0.413 0.751 0.927 1.129 1.731 111.9 222.3 404.2 498.9 607.6 931.6 109.2 215.0 406.8 496.6 613.7 935.1 es el número de partículas en que se rompe la molécula. * TABLA II Determi,nación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de glucosa por medida cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión. Temperatura media de congelación leída en la escala del Termómetro Beckmann --------- Substancia (2ml) Agua Glucosa e1 e2 C3 e4 e, e, 5.053 4.934 4.779 4.634 4.307 3.867 3.353 11 Te Concentración real deducida según: 11 Te. 1000 m 1.858 (müsm/Kg agua) Concentración ideal por pesada (müsm/Kg agua) (i=l)• o o o 0.119 0.274 0.419 0.746 1.186 1.700 64.0 147.5 225.5 401.5 638.3 915.0 59.5 133.9 210.2 394.6 630.0 909.5 es el número de partículas en que se rompe la molécula. * TABLA HI Determinación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de cloruro sódico por medida cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión. Temperatura media de congelación leída en la escala del Termómetro Beckmann Substancia (2ml) e2 e, e4 es Cn * Concentración ideal por pesada (müsm/Kg agua) (i=2)* ----- ----~ Agua Sal e1 11 Te Concentración real deducida según: 11 Te. 1000 m 1.858 (müsm/Kg agua) 6.029 5.927 5.856 5.790 5.579 5.277 4.433 o o o 0.102 0.173 0.239 0.450 0.752 1.596 54.9 93.1 128.6 242.2 404.7 859.0 47.9 88.8 118.8 240.3 429.9 936.5 es el número de partículas en que se rompe la molécula. Junio, 1960 CRIOSCOPIA CLINICA mos en las mismas por el método de Beckmann clásico. Con nuestra técnica el plasma normal suele dar un 6. Te de 0.56 a 0.58º C 4 que corresponde a la concentración de 301 a 312 müsm/Kg agua; la orina presenta una oscilación mucho mayor siendo su valor medio aproximado de 1.2º C. Hemos hecho la comprobación en ellos, determinando cationes (Na, K, Ca, Mg, NH,), aniones (CI, C03H, fosfatos, proteinatos), urea, creatinina, aminoácidos, glucosa, etc.; y la adición de las concentraciones osmolares de todas estas sustancias da aproximadamente la concentración total deducida mediante el descenso crioscópico 2 • Procediendo con rigor científico deberíamos pasar las concentraciones molares de cada partícula a molales pero esta modificación puede omitirse por la compensación que supone el despreciar el coeficiente osmótico g 3 que en los electrolitos no llega a la unidad. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES La determinación del punto de conge- 133 lación de un líquido biológico da la cifra de su concentración osmolal, con mayor precisión y garantía que la medida de su densidad. La única dificultad de la técnica crioscópica reside en la adquisición de un buen termómetro tipo Beckmann; por lo demás este análisis puede competir con la densimetría, pues reúne, en cuanto a tiempo y cantidad de muestra, las ventajas del densímetro y del picnómetro, no arrastrando sus inconvenientes respectivos. El pequeño sobreenfriamiento previo controlado, permite hacer el análisis totalmente reproducible y con error mínimo -como demuestran las tablas I, II y III- al no irradiarse calor durante la experiencia (el baño II actúa más como aislante que como congelante) y no separarse una cantidad notable de hielo que cambiaría la concentración final. La concentración total medida en Osmoles /Kg agua permite controlar indirectamente otras determinaciones ya que la suma de cationes, más aniones, más substancias no iónicas debe dar precisamente esta osmolalidad. Una diferencia notable denota un error de análisis u omisión de alguna substancia importante 7• 8 • SUMMARY lmprovements of Beckmann's Chryoscopic Descent MetLod for CHnical Purposes The method of Beckmann's Chryoscopic Descent is adonted with sorne modifications in mder to obtain the greatest accuracy in the results, using the mínimum time and amount of sample. Three Dewar Vessels are employed (Fig. 1). In I a refrigerant mixture, composed of ice, water and salt, is used. The temperature obtained is about -1.5° e (aproximately 0.5 1o e below the freezing point of liquids to be analized). 2 mi of sarnple are dropped into a standard test-tube with an average diameter of 13 mm and it is cooled in Vessel I to the temperature of the refrigerant mixture. A similar mixture is placed in Vessel II and it is brought to -2.5° C. There are two concentric tubes in it forrning a double air pocket in order to avoid a heat irradiation. In III a mixture of ice and salt is placed which gives --10 or -16° C and a dry testtube (with sorne filter paper in the bottom) in order to cool the Beckmann's Therrnometer. For the reading of freezing point of samples, the cold test-tubes are changed from I to H. The Thermorneter is put in, and the sample is well shaken until the ternperature goes up to a rnaxirnurn where it remains for a certain length of time (Fig. 2). The Ther.morneter dried with filter paper is introduced in III for the next reading .. 134 J. l\L MACARULLA Y BLANCA MEND!A Analysis time in urine is less than 90 seconds far each sample; consequently in an hour more than 40 analysis can be done. When plasma is needed in further analysis it should be melted by hand heat befare taking out the Thermometer from it in order to avoid changes in its concentration. In this case the required time is a little more (about 3 minutes). Many concentrations of pure substances have Vol. IV been determinated using this method, resulting values being in satisfactory concordance with the theoretical ones (by weighting) in the zone of physiological concentration (Table I, II, and III). Equation m=538 .6. Te is applied, m being the concentration expressed in miliosrnols/Kg wate'f. Mean values of .6. Te for plasma are 0.56 0.58° C. corresponding to 301 - 312 mOsm/l. BIBLIOGRAFÍA l. 2. DARROW, D. c. y F. L. PRATT. J. A. M. A. 143: 365, 1950 y 143: 432, 1950. CAMELE, J. L. Chemical Anatomy, Physio· 6. logy and Pathohlogy of Extracellular Fluid. 3. 4. 5. Cambridge, 1953. GEIGY, R. J. Tablas Científicas, 1958. GRAM, H. C. Am. !. Med. Sci. 168: 511, 1924. HAMBURGER, J., G. RICHERT y J. CROSNIER, 7. 8. Techniques de Reanimation Médicale et Controle de !'Equilibre Humoral. París, 1954. HENNING, N. Ií.linische Laboratoriumsdiagnostik. München, 1959. JEANNERET, P., H. RosEMUND y A. F. ESSELLIER. Helv. Med. Acta. 21: 291, 1954. RAPOPORT, S., W. BRODSKY y C. D. WEST. Am. J. Phys. 157: 357, 1949.