Investigación y Desarrollo Agroalimentario - 1999-2000 SC00-026. BIO-PCR, un nuevo método de detección de "grasa" en semilla de judía (Phaseolus vulgaris). Caracterización genética y patogénica de Pseudomonas syringae patovares phaseolicola y syringae Investigador principal Organismo Ana J. González Fernández SERIDA Equipo investigador Juan José Ferreira Fernández Elena Landeras Rodríguez Mª Carmen Mendoza Fdez. SERIDA Lab. Sanidad Vegetal Universidad de Oviedo Objetivos nOptimizar y valorar la técnica BIO-PCR para la detección de P. syringae pv. phaseolicola en semilla de judía. nEstablecer el mapa epidemiológico de las bacteriosis en el Principado de Asturias. nProponer un sistema de tipificación genético para P. syringae. nCaracterización patogénica de P. syringae pv. phaseolicola para determinar las razas presentes en Asturias. Resultados Optimización y valoración de la técnica BIO-PCR para la detec ción de P. syringae pv. phaseoli cola (denominada actualmente P. savastanoi pv. phaseolicola) en semilla de judía Se ensayó el método con las cepas de la colección del SERIDA que están identificadas y 106 caracterizadas, y con tres cepas de referencia de la Colección Española de Cultivos Tipo [CECT 321 (pv. phaseolicola), 94 (pv. sin especificar) y 126 (pv. tomato)]. El total de cepas ensayadas fue de 63, de las cuales 13 correspondían al pv. syringae, 48 al pv. phaseolicola y dos fuera de tipo. Los resultados que se presentan a continuación son todavía parciales. Partiendo del ADN total de las cepas, se realizó tanto la PCR-anidada o "nested-PCR" tal como se ha descrito en el método (Schaad et al., 1995), como los dos pasos por separado, es decir, con el par externo por una parte y con el interno por otra. También se han ensayado los iniciadores descritos por Prosen et al. (1993). Mediante PCR-anidada se encontró que de la totalidad de las cepas del pv. phaseolicola ensayadas aparecía la banda descrita por los autores (400 pb) en 40 de ellas, lo que supone la detección de un 85% de las cepas. De las cepas del pv. syringae ensayadas (cinco en este caso) se detectó la banda en dos de ellas, contrariamente a lo esperado. Cuando se realizó la PCR con el primer par de iniciadores (5.1-3.1), se encontró que las trece cepas del pv. syringae ensayadas daban un resultado negativo, que era el esperado, y de las 48 cepas del pv. phaseolicola, el 44% amplificaban la banda de 500 pb descrita por los autores. Con el segundo par de iniciadores (5.2-3.2), de las trece cepas del pv. syringae ensayadas, en tres casos se detectaba la banda de 400 pb descrita, contrariamente a lo esperado, y en 42 cepas del pv. phaseolicola ensayadas, amplificaban la banda sólo el 33,3% de las mismas. Área de Cultivos Hortofrutícolas y Fores tales A la vista de los resultados, no podemos considerar que la técnica sea universal y específica para el pv. phaseolicola, puesto que en nuestra serie no es capaz de clasificar correctamente todas las cepas. Sin embargo, dadas las ventajas de las técnicas de PCR para realizar diagnósticos rápidos, vamos a seguir los ensayos para intentar conseguir ajustar al máximo la correcta clasificación de las cepas de nuestra serie. Por otro lado, estos resultados nos indican que existen diferencias en la faseolotoxina entre las cepas ensayadas que podrían servirnos para caracterizar mejor las bacterias en estudio. Con los iniciadores descritos por Prosen et al., se ensayaron 54 cepas en total, de las cuales en las correspondientes al pv. syringae (siete) no hubo amplificación, resultado concordante con lo esperado. Sin embargo, de las 47 cepas ensayadas correspondientes al pv. pha seolicola, sólo en seis se obtuvo amplificación de la banda de 1,9 Kb descrita por los autores, lo que representa la detección de sólo el 12,76% de las cepas. Recogida de muestras de semi llas y análisis de las mismas Se analizaron dos muestras de semillas, de las cuales una dio resultado negativo y en la otra se aisló P. syringae pv. syringae. Se dispone, además, de otras cuatro muestras de semilla procedentes de fincas infectadas por P. syringae pv. phaseolicola, interesantes para contrastar la utilidad del método BIO-PCR. Además, se recogieron cinco cepas del pv. phaseolicola y cuatro del pv. syringae, a partir de 13 muestras de hojas y vainas analizadas, que se han incluido en los ensayos. Caracterización genética de las cepas Se realizó PCR-ribotipificación utilizando los cebadores rib1 y rib2 (Kostman et al., 1992), con los que se consiguió diferenciar muy pocos tipos, de forma que todas las cepas de la serie correspondientes a los pvs phaseolicola y syrin gae dan dos perfiles diferentes indistintamente del patovar al que pertenezcan. Se van a ensayar otros cebadores descritos para genes ribosomales y todas las combinaciones posibles de los mismos. También se dispone ya de los cebadores REP y ERIC que nos permitirán ensayar la caracterización de las cepas mediante esta técnica, y se han iniciado los ensayos mediante RAPD. Caracterización patogénica de P. syringae pv. phaseolicola Se multiplicaron las variedades enviadas por el Dr. J.D. Taylor y se dispone de semilla para comenzar los ensayos de patogenicidad, excepto en el caso de Ph. acutifolius que habrá que multiplicar en el ciclo de primavera para conseguir mayor cantidad de semilla. Referencias bibliográficas Kostman, J.R.; Edlind, T.D.; LiPuma, J.J.; Stull, T.L.; 1992. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polimerase chain reaction ribotyping. J. Clin. Microbiol. 30: 2084-2087. Prosen, D.M.; Hatziloukas, E.; Schaad, N.W.; Panopoulos, N.J. 1993. Specific detection of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola DNA in bean seed by polimerase chain reaction-based amplification of a phaseolotoxin gene region. Phytopathology 83: 965970. Schaad, N.W.; Cheong, S.S.; Tamaki, S.; Panopoulos, N.J.; Hatziloukas, E.; Panopoulos, N.J. 1995. A combined biological and enzymatic amplification (BIO-PCR) technique to detect Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in bean seed extracts. Phytopathology 85: 243-248. 107