Aplicaciones y soluciones de Agilent El camino más corto al resultado deseado Jaume C. Morales Especialista de Producto Agilent Technologies Spain Tarragona / Lleida Octubre de 2012 Tendencias en análisis alimentario/ambiental • En los análisis de un solo compuesto se puede cuantificar directamente en MS ó MS/MS dependiendo de la matriz. • En el Análisis MultiResiduo el alto numero de compuestos a determinar pueden mermar la sensibilidad por el menor tiempo dedicado en un SQ / QQQ (SIM / MRM). • Los métodos de screening deben tener suficiente sensibilidad para detectar aunque NO suelen (*) ser útiles para cuantificar. (Puntos por pico) • Necesidad de métodos de screening para luego cuantificar sólo los compuestos encontrados. Confirmacion y cuantificación únicamente de positivos. • El conjunto de un screening previo, equipos de alta sensibilidad y herramientas de adquisición y tratamiento de datos avanzadas permiten disponer de sistemas altamente sensibles, productivos y robustos. (*) Nuevo iFunnel QTOF 6550A Tendencias en análisis alimentario/ambiental Compuesto MultiResiduo único Screening (MS) Quant MS Quant MS/MS 3 -- X LC/GC TOF/GCMS Matriz Limpia SQMS Matriz Compleja QQQ Confidentiality Label November 14, 2012 Flujo de trabajo óptimo • • • Intentar cuantificar TODO el listado de productos regulados de una sola vez puede comprometer la sensibilidad y robustez del sistema. Los métodos MultiResiduo tienen un límite dependiendo de la cromatografía. El barrido o screening nos permite confeccionar un listado de los compuestos que estan presentes por técnicas de IDENTIFICACIÓN. La Cuantificación y confirmación posterior de SÓLO aquellos compuestos que dieron positivo permite obtener unos resultados más sensibles, reproducibles y robustos. Screening Confirmación Cuantificación Flujo de trabajo óptimo GC/QQQ GC/SQ LC/QQQ LC/TOF/QTOF Screening Confirmación Cuantificación Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Cuantificción Screening Los compuestos se identifican por masa exacta Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF Screening 1290 Infinity UHPLC Agilent 6460B LC/QQQ Confirmación Los compuestos se identifican por masa exacta El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Cuantificción Cuantificación Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 5973C GC/SQ El GC/MSD detecta todo aquello que se ionice en la fuente Los compuestos se identifican por espectro EI Screening Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 5973C GC/SQ El GC/MSD detecta todo aquello que se ionice en la fuente Los compuestos se identifican por espectro EI Screening Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 7000B GC/QQQ Screening Confirmación Cuantificación Screening genérico con sistemas de Tiempo de Vuelo Page 11 Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo El TOF es un cronómetro que mide el tiempo que tardan los diferentes iones en llegar al detector desde que se disparan en el PULSER. Los iones más ligeros llegan antes y los más pesados, más tarde. Ese tiempo se contrasta con una calibración del equipo t <-> m/z y sabemos con exactitud la m/z del ión. Genéricamente se entiende por masa exacta cuando el error en la medida es menor de 5 ppm. Los sistemas basados en SQ/QQQ suelen mostrar un error de masa > 150ppm. Error en la medida = (Masa Medida - Masa Calculada) Masa Calculada 12 X 1.000.000 = ppm Cálculo de la Masa exacta y el Error en la Masa Medida Atom Hydrogen Carbon Nitrogen Oxygen Total Plus H Total Minus e- Mass of Atom 1.00783 12.00000 14.00307 15.99492 # of Atoms 40 33 2 9 1.00783 1 0.00055 1 Calculated = exact or theoretical (609.28121 - 609.28066) x 1.000.000 609.28066 = 0.902 ppm Sum 40.31300 396.00000 28.00615 143.95424 608.27338 1.00783 609.28121 0.00055 609.28066 CH3 CH3 O N O N H O CH3 H H CH3 H O O O O O CH3 CH3 Reserpine (C33H40N2O9) Ión ≠ Reserpina + H Ión = Reserpina + H+ Error si se omite el e- O H+ = H – 1e- Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo TOF TOF Adquisición de todo el espectro (Full Scan) Tiapride 0.8 ppm QTOF QTOF Adquisición de todo el espectro (Full Scan) Adquisición del espectro MS/MS: Tiapride 0.8 ppm Aportación de los sistemas de Tiempo de Vuelo Scoring basado en Masa Monoisotópica (varia en ppm) Distribucion Isotópica (varia en %) Isotope spacing (varia en ppm) 15 El análisis por LC/MS TOF/QTOF de compuestos DESCONOCIDOS tiene como objetivo identificar ésos compuestos a través de : • masa exacta • perfil isotópico • espectro MS/MS (QTOF) Además, el cromatograma Full Scan permite el análisis retrospectivo. Molecular Feature Extractor (MFE) Desde la complejidad de los datos iniciales a la obtención de la informacion más relevante 2D 3D Compuestos encontrados en extracto de espinaca Búsqueda por masa exacta en Base de datos An Application Kit for Multi-Residue Screening of Pesticides using LC/TOF or Q-TOF with a Pesticide Personal Compound Database August 5, 2009 , 5990-4251EN Page 17 Agilent Personal Compound Database Bases de Datos de masa exacta (PCDL, .xls, .csv) Scoring basado en Masa Monoisotópica (varia en ppm) Distribucion Isotópica (varia en %) Isotope spacing (varia en ppm) • Contienen 1600 Pesticidas y 7300 Compuestos Toxicilógicos recopilados de 5 laboratorios de control regional en Europa y Asia • Scoring basado en masas monoisotopicas, isotope spacing/distribution • Links a Chemspider y otras webs • Customizable, abiertas a nuevos datos de ususario Resultados del Screening usando MFE + PCDB de pesticidas COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero presentes en la DB – Estándares no inyectados TOF : Análisis Retrospectivo Max. 5.9e6 cps. TIC of +TOF MS: from Sample 3 (Aceite MSPD 10 ppb) of Aceite MSPD calibration.wiff 21.0 5.9e6 5.8e6 5.6e6 5.4e6 Muestra analizada buscando 15 pesticidas solicitados… (El Diuron no se encontraba en la lista…) 5.2e6 5.0e6 4.8e6 4.6e6 4.4e6 4.2e6 4.0e6 3.8e6 3.6e6 3 meses después, el cliente tiene problemas con Diuron. 3.4e6 Intensity, cps 3.2e6 3.0e6 2.8e6 2.6e6 2.4e6 ¿Contenían las muestras Diuron hace 3 meses? 2.2e6 2.0e6 1.8e6 19.4 25.1 28.5 22.8 14.5 27.9 18.1 1.6e6 2.2 16.9 21.5 23.5 27.7 24.6 16.1 2.4 1.4e6 29.1 26.5 25.7 17.6 19.0 1.2e6 13.7 20.1 15.8 3.5 1.0e6 11.6 4.1 4.4 12.6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0 2 4 6 8 10 12 14 16 Time, min 20 18 20 22 24 26 28 30 TOF : Análisis Retrospectivo DIURON Fórmula empírica: C9H10Cl2N2O Masa Exacta : 243.0243 (El software incluye una calculadora de masas) Max. 1.4e4 cps. 21.3 1.4e4 1.4e4 1.4e4 1.3e4 1.3e4 1.2e4 1.2e4 1.1e4 1.1e4 diuron XIC 233.0243 1.0e4 9500.0 9000.0 8500.0 Intensity, cps 8000.0 7500.0 7000.0 6500.0 6000.0 5500.0 5000.0 4500.0 4000.0 3500.0 3000.0 2500.0 2000.0 1500.0 1000.0 500.0 0.0 21 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 Time, min 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 Agilent Quick Start Application Kits El camino más rápido a la productividad Disponibles para GC, GC/MS, LC y LC/MS para: Análisis alimentario Análisis ambiental Análisis Forense/Toxicológico Análisis petroquímico Todo lo necesario para el éxito de su aplicación: • Configuración ideal de instrumento + Bases de Datos & Software • Consumibles específicos para la aplicación • Documentación específica para la aplicación • Muestras de test específicas para la aplicación • Método en CD • Herramientas de entrenamiento en video • Chequeo opcional en fábrica • Chequeo opcional de la aplicacion on-site Flujo de trabajo óptimo para LC/MS 1200 Infinity LC Agilent LC/TOF/QTOF Screening 1290 Infinity UHPLC Agilent 6460B LC/QQQ Confirmación Los compuestos se identifican por masa exacta El TOF/QTOF detecta todo aquello que se ionice en la fuente Cuantificción Cuantificación Características del diseño Cuadrupolo Simple Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Único Cuadrupolo Guía de iones octopolar 1º Cuadrupolo Detector Guía de iones octopolar Espectro con iones del “fondo” (API: ESI, SQ sólo deja pasar el ión 210 APCI,…) 210 210 222 268 165 170 210 250 280 290 190 210 Características del diseño Triple Cuadrupolo Cuadrupolo Simple Capilar dielectrico frio Cuadrupolos hiperbolicos Guía de iones octopolar Características del diseño Triple Cuadrupolo Capilar dielectrico frio Celda de colision hexapolar Cuadrupolos hiperbolicos Detección Off-axis Guía de iones octopolar Una bomba turbo 1º Cuadrupolo 3º Cuadrupolo Guía de iones octopolar Celda de colisión (hexapolo) Q1 sólo deja pasar el ión “precursor” 210 pass Espectro con iones del “fondo” (API: ESI, APCI,…) 210 Detector Celda Colisión rompe el ión 210 (y sus productos) 210 Q3 monitoriza sólo los fragmentos 158 y 191 característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máx. sensibilidad 222 268 165 170 210 250 158 280 290 190 210 150 191 210 170 190 210 TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual) 158 160 191 190 ¿Cuándo usar MS/MS? ¿SQ ó QQQ? Cuando la Matriz es compleja se pueden producir Interferencias por coincidencia de los iones de cuantificación del analito con los de la matriz Permite la cuantificación selectiva de compuestos CONOCIDOS en muestras que presentan un elevado fondo químico Muestra Mejor S/N en matrices complejas que el que puede obtenerse por tecnologías que trabajan en Scan o SIM. Las exigencias de las normativas más actuales resultan más fáciles de cumplir gracias al poder de la confirmación MS/MS 14/11/2012 ¿Es más sensible MS/MS? MS/MS: 283.8:213.9 Single MS: SIM 283.8 100 fg HCB – Matriz Limpia S/N=26:1 RMS S/N=37:1 RMS 300 fg HCB - Diesel S/N=6:1 RMS S/N=86:1 RMS 14/11/201228 AITEX ¿Es más sensible MS/MS? SIM - EIC (246) MRM (246->176,175) Manzana S/N = 448 Col S/N = 241 Ginseng S/N = 446 Naranja S/N = 456 Espinaca S/N = 260 La última tecnología en LC Triple Quads Agilent ha desarrollado un nuevo LC Triple Quad cada año desde 2007 6490 Triple Quad Tecnología iFunnel 6490 Rendimiento 6460 6460 TripleTriple QuadQuad 6430 Triple Quad 6430 6420 Triple Quad Análisis de Ultratrazas y alta velocidad Análisis de trazas en rutina 6460 Cuantificación Rutinaria 6420 Easy Choice – Rango medio Escalabilidad…. S/N 6460 Triple Quad LC/MS x4 6430 Triple Quad LC/MS x2 6420 Triple Quad LC/MS 31 EMEAI CMS WebEx Training 7/22/2011 MRM dinámico (DMRM) Optimizer Mejora de la sensibilidad basado en la especificidad de la transición a su tiempo Si no se dispone de Kits de Agilent permite buscar los valores de adquisición óptimos para la cuantificación tMRM Confirmación espectral de los target sin barrido ni perdida de sensibilidad Page 32 Análisis por segmentos vs. MRM dinámico x105 5 Segmento 1 Segmento 2 4 Segmento 3 Segmento 4 3 2 1 1 MRM Dinámico: No7 hay segmentos 5 6 8 9de tiempo 10 11 12 13 Counts vs. Acquisition Time (min) La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés 2 3 4 Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico 14 MRM dinámico Rt Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs. MRM dinámico Tiempo de Ciclo Nº de Transiciones Concurrentes = x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs. Abundance >>> MRM dinámico - Simulación Time >>> Concurrent Compounds Principios de funcionamiento de Dynamic MRM Time (min) Time Segment 1 1 2 3 4 5 6 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 MRM Compounds (10/block) 50 80 100 70 Cycle Time (sec) 0.5 0.8 1 0.7 20 40 40 30 0.4 0.4 0.4 0.4 Dynamic MRM Max Coincident Cycle Time (sec) Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos más estrechos, más analitos y dwell times mayores por compuesto QQQ Analyte Optimizer: Máxima Sensibilidad Cuando NO se dispone de una Base de Datos de Fragmentor ni MRM Optimización Automática de 2 Settings clave Fragmentor Voltage Collision Energy “Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan” Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM 1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de confirmación de cada uno de los compuestos detectados Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM Secondary MRM Transitions are “Triggered” Triggered cycle (above threshold) Primary cycle (below threshold) Threshold Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos … Página 39 tMRM Product Ion Spectrum x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 334 > 76 76.0 80 334 > 132 132.1 100 334 > 91 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 140 91.1 80 100 334 > 145 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 100 334 > 105 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 145.0 140 180 105.1 80 100 120 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 334 > 147 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 147.0 100 140 180 334 > 117 117.0 80 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 117.0 91.1 105.1 120 334 > 119 119.0 80 100 334 > 171 171.1 80 100 120 140 160 100 180 132.1 171.1 80 120 tMRM Product Ion Spectrum 145.0 76.0 100 x103 8 7 6 5 4 3 2 1 0 120 140 160 180 334.2 200 220 240 260 280 300 320 340 tMRM Library Searching Tebufenpyrad Standard 50 ppb Library match score: 96.75 Control de 300 Pesticidas en matriz de manzana niveles de ppb cuantificados en 15 min con 1290 LC/6460 QQQ Residuos de Pesticidas La mayor parte de frutas y verduras en nuestras bolsas de la compra se cultivan con la ayuda de productos químicos que previene la presencia de insectos y malas hierbas. Los sistemas de salud pública controlan de modo regular los pesticidas presentes en aguas y alimentos. Analysis of 300 Pesticides in 15 min. Agilent 1290 Infinity LC + 6460A Triple Quad with Agilent Jet Stream Technology ~600 Dynamic MRM Transitions 9 replicates analyzed at 200 pg level Mean area %RSD = 3.2, Mean height %RSD= 3.6 Agilent MassHunter Workstation Page 43 February-2009 Sistema Agilent LC-QQQ para el análisis en rutina de herbicidas neutros en aguas potables Enriquecimiento En-Linea Requisitos de la directiva Europea Límites de detección de 10 ng/litro (10 ppt) por herbicida. Métodos NO ms tradicionales e.g lc-dad Extración de 5 litros en cartuchos SPE consume tiempo, disolventes y fungibles. Problemas de falsos positivos. Métodos Single Quad MS Mayior sensibilidad que los tradicionales pero pueden surgir interferencias en algún tipo de muestras (matriz compleja) Pasos de operación 1. Carga de 900 ul de muestra de agua en el cartucho de enriquecimiento. 2. Giro de válvula, ‘backflush‘ desorbe mediante gradiente HPLC. 3. Separación en columna análitica y MRM QQQ. 4. Recondicionamiento del cartucho de enriquecimiento durante el análisis. 5. Listo para el siguiente análisis después de ~ 20 minutes. Cartucho – pequeño pero MUY importante 1. Mayor ahorro en costes. 2. Ayuda amortización. 3. Coste ~4 Euro/cartucho 4. Re-utilizable. 5. Bajo coste/muestra. 6. Material polimerico Styrene di-vinil benzeno. 7. Otros materiales SPE para diferentes compuestos. Esquema del sistema enrichment columns high pressure gradient pump high pressure sampler column compartment with analytical column enrichment autosampler with 900ul head optional stream selection valve quaternary loading pump Flujo de trabajo óptimo para GC/MS Agilent 7000B GC/QQQ Screening Confirmación Cuantificación Y si las interferencias de matriz son muy graves: Posibilidad de MSMS 100 fg HCB AGILENT GCMS Ion Trap 220/240 AGILENT GCQQQ 7000B Agilent 7000B Triple Quadrupole GC/MS Especificaciones Parámetros Especificaciones Agilent 7000B EI MRM Sensibilidad EI Scan Sensibilidad 100 fg OFN > 1500:1 RMS S/N, 272 → 241. 1 pg OFN scan desde 50 a 300 amu para ion 272 > 300:1 S/N MRM Velocidad de scan (transitions/sec) Minimo dwell time en MRM 500 1 ms Rango dinámico 106 Limite de detección instrumental Resolución de masas Unidad de masas IDL 12 fgajustable por tune, 0.7 a 2.5 Daltons Rango de masas (m/z) 10 a 1050 Velocidad de scan Hasta 6,250 µ/s Celda de colisión Hexapolo lineal con aceleración lineal IUPAC Gold Book http://goldbook.iupac. org/L03540.html Precisión USP United States Pharmacopeia 30 Limite de detección instrumental IDL 12 fg Exactitud UE Method Validation And Quality Control Procedures For Pesticide Residues Analysis In Food And Feed. Document No. Sanco/10684/2009 EPA Analytical Detection Limit Guidance, 1996 Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits Desviación estandar El limite de detección como un cálculo estadistico LD = t * SD LD es el limite de dtección t es el valor de la t de student (t=2.988 al 99% y 8 iny) SD e la desviacion estandar DL (area) = 2.988* SD (area) SD % RSD x100 x IDLconc t RSD 100 fg 100 x 100 fg (2.988) (4) (100 fg ) IDLconc 12 fg 100 %RSD 4 IDL especifación basada en la reprodubilidad de la medida Caso real en un cliente en España 8 ínyecciones consecutivas, 1 μl, 100fg/μl OFN MS/MS transition of m/z 272→222 Area precision: 2 .0 % RSD IDLconc = (t * RSD * concentration)/100 (t para el 99% de confianza, n-1 grados de libertad=2.988) IDLconc = 6 fg Analizador GC-MS/MS Lineal Inerte, fuente de alta temperatura Dos cuadrupolos de cuarzo, monolitico, hipoerbólico recubierto de oro (igual que 5975) (Igual que 5975) Detector de Triple eje (igual que 5975) Nuevo desarrollo, Celda de colisión hexapolar patentada He quenching Bomba Turbo Edwards Técnicas básicas para los analizadores GCMS -Nuevo Inyector Multimodo para alto contenido en matriz (MMI) -Tecnologia de flujo capilar (CFT) -Bases de datos RTL -Sistemas cuadrupolo (SIM/SCAN) y Triple Cuadrupolo (MRM) -Material necesario para preparación muestra (QuEChERS) La más completa base de datos MRMs con la máxima flexibilidad Contiene 7000 MRMs optimizados de 1000 pesticidas -- basados en más de 1000 inyecciones Máxima Flexibilidad permitiendo la optimización de métodos • Promedio de 7 transiciones MRM por componente con sus intensidades relativas -- Muy util para evitar interferencias proveniente de la matriz • Clasificado por compuestos, numero CAS etc. En formato excel -- Permite busquedas y ordenación fácil para realizar métodos • Tres métodos cromatográficos con RTs y RI -- Permite máxima liberta para seguir flujo de trabajo del cliente • Intensidades absolutas por cada transición MRM -- Permite una semi- cuantificación sin el uso de estandares Analyzer 2.0 Update – No sólo pesticidas Hasta 1100 compuestos con mas de 8000 transiciones MRM • Pesticidas • Ftalatos • PBDEs • PAHs • PCB congeneres • EPA 8270 target compounds Industrias Target: Alimentación y Medioambiente Flexibilidad: 7 transiciones; clasificaciones; 3 RTs y RIs Base de datos con RTs (y RIs) para ser usado con hasta tres metodos de GC diferentes(CP, CF-target, and CF-screening). Peso molecular promedio y masa exacta Cada pesticida es clasificad con hasta dos categorias The Flexibility: Excel format, relative and absolute intensity Excel MassHunter Format Las intensidades absolutas y relativas (Color Scales): Red denotes strong intensity and blue denotes weak intensity among ALL transitions. Un Ion de Cuantificacion y varios cualificadores por compuesto 61 Click para ordenar, esconder y mostrar los cualificadores 62 Ordenar para rápidamente seleccionar un Quant (Q0) y seleccionar los tres cualificadores (construccion sencilla de metodos)! 63 Click en el boton de ordenacion para seleccionar/mostrar los compuestos que serán añadidos al metodo de adquisición. 64 BARRIDO CON LCMS MASA EXACTA CUANTIFICACION CON LCMS QQQ OK PERO ¿COMO? Existe nueva tecnología que puede ayudarle a ser más productivo ¿Implementarlo, requiere tiempo y personal cualificado? Agilent tiene la solución Page 66 Aportando las nuevas tecnologías justo a la línea de SALIDA Nuevos Analizadores y Kits de Agilent Analizadores y Kits Trabajar mejor y más rápido, Con resultados de mayor confianza Kits LCMS de Pesticidas Agilent Rápida puesta a punto • Última tecnología para el análisis de multiresiduos Fácil adaptación • Soluciones para sus NECESIDADES Soluciones disponibles para Pesticidas HOY Pesticide Solution Suite #SP1 7890-0456 GC/MSD Pesticide DRS Screening Analyzer #SP1 7890-0457 GC/MSD Japanese Positive list Analyzer #SP1 7890-0473 GC/MS/FPD/uECD Pesticide DRS Screening analyzer #SP1 7890-0501 GC/MS/MS Pesticides CP Analyzer #SP1 7890-0502 GC/MS/MS Pesticides CF Analyzer G6854AA LC/(Q)TOF Pesticide Personal Compound Database kit G1733AA LC/QQQ Pesticides Dynamic MRM Database Kit Iníciese rápidamente Application kit •Columnas, consumibles y mezcla test •Nota de aplicación y Guía de inicio rápida •CD con los parámetros del método •Bases de datos LCMS/PCDL para el rápido cribado Application Kits para Target Screenning 72 Application Kits para Untarget Screening 73 LY BBEETTTTEERR MMSS SSOOL LUUTTI OI ONNSS CCLLEEAARRLY ¿Preguntas? 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