proteómica - Elfos Scientiae

CAPÍTULO 20
PROTEÓMICA
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PROTEÓMICA
LILA CASTELLANOS1, LUIS JAVIER GONZÁLEZ1 Y GABRIEL PADRÓN1
1
Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.
INTRODUCCIÓN.
ALGUNOS CONCEPTOS BÁSICOS
Una vez concluida la secuenciación del genoma humano, es necesario disponer
de técnicas que permitan comprender la relación entre la expresión de los genes
y los problemas biológicos. Este es precisamente el campo de la proteómica,
ciencia dedicada al estudio de la expresión de las proteínas y de sus cambios en
dependencia del contexto biológico. A diferencia de las técnicas clásicas utilizadas
en la bioquímica, la proteómica se basa en la separación y la identificación de
muchas proteínas (en el orden de mil o más) simultáneamente. Muchos de los
métodos utilizados en proteómica permiten obtener un despliegue (u ordenamiento
o arreglo) físico de mezclas muy complejas de proteínas, separadas mediante la
combinación hábil de dos (o más) técnicas de separación.
El proteoma [1] es el conjunto de proteínas expresadas por un organismo (o
por una parte de él, por ejemplo un tipo de tejido) en un momento dado. La
proteómica comprende tanto las técnicas para el estudio en gran escala de las
proteínas expresadas (proteoma) como las aplicaciones de estas técnicas al
análisis de problemas biológicos. Mientras que el genoma de un organismo es
esencialmente constante a lo largo de la vida, el proteoma tiene un carácter
dinámico: la expresión de proteínas cambia en diferentes etapas del ciclo celular
pero también en respuesta a acciones externas. En particular, las diferencias
entre un estado ¨normal¨ y uno patológico se traducen también a nivel molecular
en cambios en los patrones de expresión de proteínas. Es precisamente esta
variabilidad del proteoma lo que lo hace tan atractivo para la investigación
biomédica. Recientemente, la proteómica ha comenzado a dar una contribución
importante a nuestra comprensión de la biología y de la medicina.
Los avances logrados en genómica no se traducen directamente en nuestro
conocimiento de los respectivos proteomas: muchos genes carecen de función
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CAPÍTULO 20
conocida, a muchos otros se les adjudica una función por analogía con otros
genomas estudiados previamente. Si se extrapola la situación encontrada con la
levadura, más de la mitad del genoma humano no tiene una función conocida en
estos momentos.
La proteómica incluye diversos campos de investigación:
• La identificación de las proteínas expresadas por un organismo en una
condición dada (proteómica descriptiva o estructural, todas las proteínas
expresadas en un momento y en un contexto)
• La identificación de los cambios en el nivel de expresión de proteínas
asociados a cambios en las condiciones del organismo (proteómica
comparativa, cuáles proteínas cambian cuando un organismo se somete a
condiciones diferentes)
• La identificación de conjuntos funcionales de proteínas, es decir, grupos de
proteínas que se localizan en un mismo sitio celular y que operan en mutua
interacción (interacciones proteína-proteína, proteómica funcional)
• La identificación de las proteínas que forman un organelo (este enfoque
conduce a la elaboración de un mapa molecular de la célula)
¿P OR
QUE LA PROTEÓMICA ?
El dogma central de la genética:
ADN → ARN → PROTEÍNA
dió lugar a uno de los paradigmas esenciales de la biología que prevaleció durante
la segunda mitad del siglo pasado:
un gen → una proteína
Esta relación aparentemente simple, no refleja sin embargo la realidad [2].
Aunque es cierto que un gen codifica una secuencia de aminoácidos existen
dos eventos que incrementan considerablemente el número de proteínas que
pueden ser originadas por un gen y estar presentes en una célula en un momento
dado y por tanto hace más complejo el proteoma de una célula.
Uno de esos eventos es el fenómeno conocido como empalme alternativo
(splicing). En los mamíferos y otros organismos superiores el gen que codifica
una proteína no está constituido por una secuencia continua de nucleótidos.
Una parte de la secuencia del gen está formada por regiones no codificantes
que interrumpen la secuencia codificante del gen y son llamados intrones. Las
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regiones codificantes (y que por tanto dan lugar al ARN y posteriormente a la
proteína) son conocidas como exones. Cuando se forma el ARN mensajero,
mARN, los intrones son eliminados quedando así la secuencia que codifica una
proteína. El fenómeno de splicing consiste en que los exones pueden reordenarse
de varias formas y dar lugar a mas de una proteína a partir de un solo gen.
El otro evento, es el hecho de que una proteína puede ser modificada durante o después
de la traducción o síntesis de la proteína con la introducción de grupos sustituyentes,
en un proceso que se conoce como modificación post traduccional (MPT).
Se calcula que alrededor del 10 % de los genes de mamíferos codifican
proteínas cuya función es modificar otras proteínas, y que generan más de
200 tipos de modificaciones post traduccionales tales como: glicosilación,
fosforilación, incorporación de lípidos, etc. En adición, muchas proteínas
participan en las rutas metabólicas que conllevan a la degradación y finalmente
la eliminación de proteínas. Asi, en el sistema de ubiquitinacion participan 134
genes, mientras las fosfatasas son codificadas por unos 300 genes y las
proteínas kinasas se estiman codificadas por más de 1100 genes [3]. La función
de todas estas proteínas es la modificación de otras para modular su función
biológica. El cuadro se completa con el conjunto de proteínas que interviene
en la proteólisis y la degradación. En el proteosoma participan los productos
de expresión de unos 130 genes, mientras que las proteínas con función
proteolítica están codificadas por unos 1000 genes.
Por ello, una secuencia única de aminoácidos puede generar muchas especies
químicas diferentes. De esta forma se estima que los aproximadamente 40 000
genes del genoma humano pueden dar lugar a mas de un millón de proteínas.
Las diferencias que existen entre las poblaciones de mARN y de proteínas
están dadas, por una parte, por la amplia población de especies que portan
modificaciones químicas pero además, intervienen otras causas importantes: el
tiempo de residencia de las moléculas de proteínas en el interior de una célula o
de un compartimiento celular es variable debido a la degradación por proteasas,
a la traslocación intra y extracelular y a la modificación de las proteínas durante
su intervención en procesos biológicos. Por ello la medición de la expresión de
mARN no suministra valores confiables de los cuales se pudiera deducir la
abundancia y la presencia de las proteínas traducidas.
Las diferencias que existen entre las poblaciones de mRNA y de proteínas
están dadas por una parte por la amplia población de especies que portan
modificaciones químicas pero además, intervienen otras causas importantes: el
tiempo de vida media de las moléculas de proteínas en el interior de una célula
o de un compartimiento celular es variable debido a la acción de proteasas, a la
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traslocación intra- y extracelular y a la modificación de las proteínas durante su
intervención en procesos biológicos. Por ello la medición de la expresión de
mRNA no suministra valores confiables de los cuales se pudiera deducir la
abundancia y la presencia de las proteínas traducidas. Solo el estudio directo de
las proteínas, lo que es campo de la Proteómica, puede dar respuesta a estas
cuestiones. Adicionalmente, una molécula de mRNA puede originar varias
secuencias de proteínas, por el simple cambio del codón de iniciación o de
terminación, lo que origina moléculas de secuencias más cortas o más extensas.
En resumen, al concluir el siglo XX la idea de considerar las proteínas como
macromoleculas definibles por una secuencia de residuos de aminoácidos
completamente determinadas por la secuencia de una molécula de ADN había
cambiado sustancialmente: entre genes y proteínas existen diferencias de complejidad
que definen la existencia de un campo de conocimiento singular, irreducible a formas
relativamente menos complejas del conocimiento: al concluir el siglo las razones
para el surgimiento de la proteómica estaban solidamente establecidas.
¿COMO INVESTIGAR EL PROTEOMA?
Mientras que las moléculas de ADN y de ARN se construyen mediante un
ordenamiento variable de solo cuatro componentes estructuralmente invariables
(desoxinucleótidos y nucleótidos respectivamente), las moléculas de proteínas
presentan una diversidad estructural extraordinaria que se manifiesta en varios
niveles de complejidad: a nivel de la estructura primaria por los posibles
ordenamientos esencialmente de 20 residuos de aminoácidos a los que se suman
todas las variantes de modificaciones post traducción posibles. Y a nivel de
estructura espacial, esta diversidad se manifiesta en muy diversas estructuras
de las que depende esencialmente la actividad biológica. Los estudios de la
diversidad estructural tridimensional de las proteínas también están en curso,
mediante ensayos masivos de cristalización y determinación de estructura
tridimensional haciendo uso de técnicas de difracción de rayos X y de resonancia
magnética nuclear, pero este tema no será objeto de este capitulo. Nos
centraremos, por tanto en los métodos encaminados a la investigación de la
diversidad molecular de las proteínas asociada a la existencia de diferentes
estructuras primarias (término que será utilizado en nuestro texto para incluir
también las modificaciones post traducción).
Podríamos adelantar una formulación del dogma central de la proteómica
comparativa en los siguientes términos:
“Los cambios en un nivel superior del fenotipo de un organismo o de uno de sus
componentes está relacionado con cambios en el fenotipo molecular de la
expresión de proteínas”.
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Por tanto, la idea es relacionar las características biológicas de un sistema con
la expresión de las proteínas y más específicamente, relacionar los cambios en
las propiedades biológicas con los cambios en la expresión de proteínas.
Para ello es necesario disponer de técnicas que permitan a) separar miles de
especies; b) identificar las especies de interés y c) cuantificar la magnitud de
los cambios en la expresión de proteínas. La proteómica aborda este complejo
problema técnico con variadas herramientas.
Estas técnicas se agrupan en dos grandes campos: las que se basan en la
resolución de proteínas intactas y que utilizan principalmente técnicas de
electroforesis o de cromatografía de proteínas y las que se basan en la conversión,
en una primera etapa, de las mezclas de proteínas en mezclas complejas de sus
péptidos de degradación proteolítica. En el primer grupo están las técnicas que
utilizan la electroforesis bidimensional (2DE) atendiendo a una primera separación
por carga eléctrica y una segunda separación por talla. También comprende la
combinación de dos o tres métodos ortogonales de cromatografía o
isoelectroenfoque en solución seguido de cromatografía (por ejemplo, separación
por talla seguida de separación por hidrofobicidad; separación por carga, por
talla y finalmente por hidrofobicidad; separación por IEF de flujo libre seguido
de separación por masa o por hidrofobicidad). Las fracciones obtenidas en
estas separaciones, tras múltiples etapas, pueden ser resueltas a continuación
por 2DE o por electroforesis en geles de SDS (SDS PAGE), o alternativamente,
ser digeridas y analizadas por espectrometría de masas.
En el segundo grupo (técnicas basadas en un primer paso de conversión de las
mezclas de proteínas en mezclas de péptidos obtenidos por proteólisis específica) se
sustituye la resolución de proteínas por la resolución cromatográfica de las mezclas
de sus péptidos obtenidos por proteólisis específica generalmente con tripsina.
Alternativamente, se hace la selección de un conjunto de péptidos representativos
de la presencia de las proteínas parentales atendiendo a alguna propiedad.
Si bien la electroforesis en geles de SDS es una técnica de rutina en los
laboratorios biológicos, la electroforesis bidimensional de alta resolución requiere
de un laboratorio dedicado, tanto por los requisitos de reproducibilidad como por
la variedad y complejidad de los pasos del proceso. La electroforesis
bidimensional es hasta el presente, la única técnica que permite resolver con
alta eficiencia las isoformas que difieren en punto isoeléctrico y por ello, se
sigue utilizando ampliamente. A continuación discutiremos los aspectos esenciales
de la técnica así como las características que deben tener las muestras para su
análisis con estos métodos. Los detalles experimentales están disponibles en
excelentes manuales y artículos de revisión [4-9].
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CAPÍTULO 20
E LECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
(2DE)
Los geles bidimensionales fueron introducidos en 1975 simultáneamente por J.
Klose [10] en Berlin y O’ Farrell [11], en los Estados Unidos. Estos geles [12]
permiten obtener un arreglo o despliegue físico en dos dimensiones de mezclas
complejas de proteínas (Figura 20.1). Se basan en la combinación de dos técnicas
ortogonales (es decir, que no comparten principios físicos comunes): 1) la
separación por carga eléctrica (focalización isoeléctrica, IEF) en la que las
proteínas migran en un gradiente de pH hasta alcanzar el sitio donde carecen
de carga, es decir su punto isoeléctrico y 2) la separación por tamaño molecular
que se efectúa en un gel de poliacrilamida en presencia de un detergente aniónico
muy potente, el docecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) .
Figura 20.1. Electroforesis bidimensional de proteínas de la fracción nuclear de células de cáncer
de pulmón humano (small cell lung cancer). Las proteínas de la fracción nuclear se
extrajeron con una solución de agentes caotrópicos y detergentes. La primera
dimensión se efectuó en un gel de poliacrilamida tubular con anfolinas portadoras
de rango 2 a 11. La segunda dimensión se efectuó en un gel vertical de 16.5 %
poliacrilamida en presencia de SDS. Las proteínas se detectaron mediante tinción
con plata (Gel confeccionado en el laboratorio de los autores).
Para los organismos cuyos genomas han sido ya secuenciados es posible calcular
el proteoma teórico. Estos abarcan aproximadamente desde pI 3 hasta pI 12-13
y desde 1,000- 2,000 Da hasta aproximadamente 500 kDa. Pero la mayor parte
(posiblemente alrededor del 70 %-80 %) de las proteínas están concentradas
en una zona mas estrecha que va aproximadamente entre pI 3.5 y pI 10 y masa
entre 10 y 100 kDa. Esta es la zona que generalmente se estudia con las técnicas
de electroforesis bidimensional.
En adición, un tercer elemento tiene que ser considerado: el grado de
hidrofobicidad de las proteínas. Este es muy variable y va desde estructuras
hidrofílicas hasta estructuras muy hidrofóbicas. Las proteínas hidrofóbicas
abundan en las membranas, y tienen regiones o dominios cuyas propiedades de
solubilidad son más cercanas a las de los polímeros orgánicos convencionales
PROTEÓMICA
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que a las de las proteínas globulares hidrosolubles. Las técnicas basadas en
2DE no son especialmente buenas en el análisis de proteínas muy hidrofóbicas
aunque continuamente se hacen avances técnicos para superar esta limitación
[13]. Por ello, generalmente las poblaciones estudiadas por 2DE están sesgadas
hacia las moléculas mas hidrofílicas, mientras que las proteínas hidrofóbicas se
analizan preferentemente mediante combinaciones de técnicas cromatográficas
y de SDS-PAGE o mediante su previa conversión a mezclas de péptidos.
La Tabla 20.1 resume las etapas principales de un análisis por 2DE seguido de
identificación de las proteínas de interés.
Tabla 20.1. Etapas en el análisis de la expresión de proteínas por 2DE e
identificación de los cambios por espectrometría de masas
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CAPÍTULO 20
Tabla 20.1 (continuación).
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P R E PARACIÓN
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DE MUESTRAS
Cualquiera sea su origen (proteínas totales o procedentes de un fraccionamiento
subcelular), las muestras biológicas sometidas a electroforesis bidimensional
requieren de un tratamiento previo cuya función es liberarlas de todos los
componentes no proteicos presentes. Estos son esencialmente: lípidos, ácidos
nucleicos, componentes de naturaleza orgánica e inorgánica de baja masa
molecular como vitaminas y cofactores, las sales y los iones inorgánicos. La
eliminación de estos componentes es un arte del cual depende la calidad de la
preparación y por ello el éxito o el fracaso del experimento. Las técnicas utilizadas
para eliminar estos componentes tienen que cumplir ciertas condiciones: a) no
pueden alterar el perfil de proteínas (es decir, no es posible una técnica que
cause la pérdida irrecuperable de ciertas proteínas); b) no pueden introducir
modificaciones sobre las proteínas (por ejemplo, no puede trabajarse en
condiciones en que las proteasas endógenas sean activas y causen la proteólisis
de componentes de la muestra [14] y c) el número de pasos debe ser mínimo y
su diseño concebido para que al final, la preparación esté en condiciones de ser
incorporada al gel de la primera dimensión (focalización) o a cualquier
procedimiento de análisis alternativo a la 2DE. Un aspecto crítico es la presencia
de sales provenientes de tampones utilizados en la obtención de una preparación.
Por ejemplo, el Tris, el fosfato salino (PBS) y el HEPES que son de uso frecuente
en bioquímica, focalizan en una región del gel si se encuentran presentes en la
preparación final, como consecuencia esa región aparece ¨vacía¨ de proteínas.
El límite de la concentración total de iones que puede tener la muestra es de 40 mM.
Por encima de ese valor la conductividad de la muestra es elevada, lo que
provoca el sobrecalentamiento del gel y su daño.
La preparación de muestras generalmente incluye los siguientes pasos:
1. Extracción o solubilización de proteínas.
2. Eliminación de lípidos mediante extracción con solvente orgánico.
3. Eliminación de ácidos nucleicos mediante digestión con nucleasas, coprecipitación con compuestos básicos o ultracentrifugación.
En algunos protocolos se eliminan las sales mediante el cambio del tampón de
la muestra por la solución de focalización o mediante precipitación total de
proteínas con ácido tricloroacético en acetona y posterior redisolución en la
solución de muestra.
Otro aspecto importante es la calidad del material biológico. Las líneas celulares
tienen que ser controladas para verificar la ausencia de micoplasmas. Las
muestras provenientes de pacientes necesitan condiciones especiales de
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CAPÍTULO 20
conservación que deben quedar instrumentadas antes del inicio de la manipulación
médica. Las muestras provenientes de órganos o de tejidos deben ser liberadas
de materiales colaterales como tejidos de sostén y epitelio vascular. Los materiales
provenientes de biopsias tumorales deben además liberarse de células normales
que hayan sido removidas conjuntamente con el tumor durante la biopsia.
Solubilización de proteínas. Un procedimiento ideal de solubilización debe
cumplir varios requisitos: extraer totalmente las proteínas que se desean estudiar,
de modo que su abundancia en la solución de extracción refleje su abundancia
relativa en la célula o el organelo, no modificar químicamente ningún grupo
funcional presente en las proteínas (por ejemplo, evitando oxidaciones de
metioninas, intercambios de puentes disulfuro, reacciones de desamidación, de
isomerización entre ácido aspártico y ácido isoaspártico) e impedir las reacciones
de degradación provocadas por la liberación de proteasas al medio [14]. Para la
solubilización de proteínas se utilizan mezclas de agentes caotrópicos, y
detergentes, a los que se adicionan otros componentes: inhibidores de proteasas,
un agente reductor y anfolinas del rango adecuado. La electroforesis
bidimensional impone requisitos rígidos en cuanto a los agentes solubilizantes
que pueden ser utilizados. Lamentablemente, el SDS, a pesar de su alta capacidad
de solubilización de proteínas, es incompatible con la focalización isoeléctrica
debido a su carácter iónico, no obstante, se utiliza para la disolución de los residuos
insolubles en todos los otros agentes pero estos extractos deben diluirse notablemente
con soluciones que contengan detergentes no iónicos antes de aplicar a la primera
dimensión. Por igual razón se excluye el cloruro de guanidinio. Los reactivos más
usados para la preparación de las soluciones de solubilización son [8]:
Agentes caotrópicos: urea 8-9 M, mezclas de urea 5 M + tiourea 2 M
Detergentes: CHAPS 1-4 %, Triton X 100 1-2 %, NP 40 1-2 %, SB 3-10 0.5-1 %,
ASB 14 0.5-1 %
Reductores: DTT 1 %, DTE 1 %, TBP 1 %
Anfolinas del rango adecuado: 1-2 %
Inhibidores de proteasas: Mezcla comercial de inhibidores de proteasas serínicas,
aspárticas y metalo-proteasas.
Adicionalmente puede incorporarse glicerol o propanol en una concentración
de hasta unos 15 %, especialmente recomendados para el análisis de proteínas
básicas. Recientemente se ha reportado una sustancial mejora en las separaciones
2DE de proteínas hidrofóbicas (integrales de membrana) mediante la
incorporación de trifluoroetanol al 50% en la solución de extracción y de
rehidratación [13].
PROTEÓMICA
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La selección de la primera dimensión. El método original propuesto de modo
independiente por O’ Farrell [11] y por Klose [10]en 1975 se basa en la separación
de las proteínas por su carga utilizando un gel cilíndrico de poliacrilamida al cual
se le incorporan mezclas de anfolitos solubles (compuestos de bajo peso molecular
que poseen carga eléctrica), presentes en una mezcla compleja de modo que sus
componentes cubran con sus pK un amplio rango de valores). Con este método y
haciendo uso de la focalización en condiciones de no-equilibrio de pH (NEPHGE)
[15] es posible separar en un mismo gel proteínas ácidas y proteínas básicas
(Figura 20.1). A principios de los años 80 se introdujo una modificación en la
primera dimensión, que consistió en la co-polimerización de los anfolitos con la
matriz de acrilamida, creando en el gel un gradiente estable de carga [7]. Estos
geles están disponibles en el mercado (IPG: Immobilized pH Gel).
Selección del rango de análisis. Hay variadas opciones en cuanto al rango de
pI de separación y la longitud de la separación (están disponibles comercialmente
IPG desde 7 cm hasta 24 cm). En una primera etapa frecuentemente se prefiere
realizar un gel bidimensional exploratorio de rango amplio, entre pI 3 y 10 ,
seguido de separación por tamaño en el rango de 14 a 150 kDa utilizando geles
de 12.5 % en la segunda dimensión. Esta primera etapa permite ajustar la
preparación de la muestra y la cantidad de muestra a aplicar al gel. A continuación
se selecciona un rango de pI mas estrecho, por ejemplo entre 4 y 7 unidades y
entre 6 y 10 unidades. De esta forma, se obtiene mucha mayor información, si
bien el número de geles (y el costo en muestra, tiempo y dinero) se duplica.
Cuando se desea incrementar la información sobre una región especifica, se
utilizan separaciones en geles llamados de rango estrecho o zoom. En estos
geles es posible expandir una unidad de punto isoeléctrico a lo largo de una
distancia de 18 cm.
Evidentemente, un estudio abarcador del proteoma llevaría a realizar una serie
de geles que cubran con una alta resolución desde pI 3 hasta pI 11, y desde
masas de 2 kDa hasta masas de 500 kDa. Si bien técnicamente esto es posible,
en la práctica tal estudio resulta excesivamente costoso en muestra, tiempo y
recursos. Generalmente los extractos celulares totales (o las subfracciones
obtenidas) se analizan mediante electroforesis en geles de focalización isoeléctrica
de rango 3 a 10 o de rango 4 a 7 y 6 a 11. Esta separación se sigue con una
segunda separación por tamaño en un gel convencional de SDS. El mapa obtenido
tiene físicamente dos dimensiones. Un gel de alta resolución en el rango de pI
de 2.5 a 10 y de masas de 15 a 120 kDa permite la resolución de 5,000 –8,000
especies [16] si la detección es radiactiva, pero rutinariamente en este sistema
el número de especies detectables con tinción con plata es de unas 1500 a 2,000
(Figura 20.1). Es importante recordar que, debido a las características de la
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CAPÍTULO 20
técnic a, las determinaciones de cambios en la expresión de proteínas requieren
la realización de varias réplicas de geles (para cada muestra tres como mínimo,
pero preferiblemente un número mayor de geles). Por todo ello, la estrategia
más utilizada comprende:
1. La selección de uno o de varios compartimientos celulares de interés.
2. La realización de subfraccionamiento celular.
3. El análisis de la expresión diferencial de proteínas mediante geles de rango
intermedio (generalmente de tres unidades de pI en 18 cm) seguidas de
separaciones por tamaños entre 14 y 150 kDa.
4. Análisis de imágenes y análisis estadístico de los cambios en la expresión.
Muchos de los aspectos que acabamos de discutir no sólo son importantes para
las muestras destinadas a electroforesis bidimensional sino también para muestras
que se analizan mediante técnicas no electroforéticas, como las basadas en la
cromatografía líquida bidimensional seguida de espectrometría de masas.
EL RANGO DINÁMICO D E EXPRESIÓN: U N RETO A LA TECNOLOGÍA
Se estima que una célula de un organismo superior contiene en un instante de
tiempo unas 5 000 especies diferentes de mARN [3]. De estas 5 000 especies,
unas 4 000 existen en un número muy bajo de copias (una o dos moléculas por
célula) y dan lugar a proteínas poco abundantes o muy escasas. No obstante, se
debe recordar que la abundancia de una proteína no sólo depende del número
de copias de mARN sino también, del tiempo de vida de la proteína sintetizada
en la célula. Se estima que una célula en un instante contiene en el orden de
mil millones de moléculas de proteínas, correspondientes a 5 000 secuencias de
mARN presentes. Sin embargo, el 90 % de la masa de proteínas esta formado
por unas 100 especies diferentes, mientras que el 10 % restante esta formado
por una enorme diversidad de moléculas. Si estimamos que una secuencia de
aminoácidos puede dar lugar a unas 20 variantes moleculares o especies,
entonces concluimos que 5 000 mARN diferentes son responsables por unas
100 000 especies moleculares diversas a nivel de proteínas [3]. Ese es
precisamente el campo de análisis de la proteómica y por ello han sido necesarias
herramientas muy poderosas para la separación de especies moleculares que
difieren ligeramente y para su identificación.
Aquí estamos ante dos problemas: primero, un gran número de especies a
resolver, cuantificar e identificar; segundo, un número muy pequeño de especies
es responsable de la mayor parte del contenido total de proteínas, con lo que
existe un rango dinámico de expresión muy amplio.
PROTEÓMICA
379
El rango dinámico de expresión representa los órdenes de magnitud (número de
copias por célula o por ml de fluido) en los que se mueve la expresión de las
proteínas en una célula o fluido fisiológico [17]. El rango dinámico de expresión
en las proteínas celulares es de unos 5-7 órdenes, mientras que en el plasma es
de 10-11 órdenes. Por ejemplo, la concentración de albúmina y la de glucagón
en plasma difieren en 9 órdenes de magnitud. La concentración de la hemoglobina
es del orden de 10 11 pg/ml, mientras que las interleucinas están en
concentraciones del orden de 1 a 10 pg/ml [18]. Ciertamente, no existe ningún
método físico o químico de análisis que pueda dar una respuesta lineal a lo largo
de un rango tan amplio de magnitudes. Por tanto, el análisis de las proteínas con
bajo número de copias es un reto tecnológico de la proteómica.
Los límites experimentales del método basado en 2DE están dados por dos
factores: los limites de lo que podemos detectar en el gel y de lo que podemos
medir por espectrometría de masas. Aproximadamente, ambos coinciden: la
tinción con plata de alta sensibilidad permite ver proteínas presentes en el orden
de 1 000 copias por célula, si en el gel se ha aplicado la masa correspondiente a
10 8 a 10 9 células [17]. Pero no podemos ver ni identificar proteínas expresadas
en un número inferior de copias, a menos que primero se lleven a cabo pasos de
prefraccionamiento, encargados de incrementar la concentración de un grupo
de componentes en la muestra a expensas de la supresión de otros.
PRINCIPALES FORMAS DE ABORDAR LOS PROBLEMAS QUE PLANTEA EL AMPLIO RANGO DINÁMICO
Este proble ma, que es esencial para un análisis abarcador del proteoma celular,
se ha abordado con los siguientes enfoques:
a) Eliminación selectiva de componentes mayoritarios. Para ello es necesario
que los métodos sean altamente específicos y no eliminen simultáneamente
los componentes minoritarios. Este enfoque está dirigido al estudio de un
subproteoma enriquecido en las especies menos abundantes, tras la
eliminación de las más abundantes. Se basa principalmente en series
sucesivas de cromatografías de inmunoafinidad con anticuerpos policlonales
inmovilizados en columnas que retienen las especies mayoritarias.
Recientemente [19] se utilizó una sucesión de 9 pasos de inmunoafinidad
para la preparación de una muestra de plasma humano. Ello permitió
identificar 3 800 especies moleculares correspondientes a 325 genes diferentes
(es decir, que aproximadamente cada proteína aparece como promedio con 11
variantes moleculares resueltas). Algunos de estos sistemas consisten en
una única columna portadora de 6 tipos de anticuerpos policlonales dirigidos
contra las 6 proteínas más abundantes en el plasma y están disponibles
comercialmente.
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CAPÍTULO 20
b) Fraccionamiento de las proteínas totales. Un fraccionamiento celular típico
consiste en la obtención de fracciones citosólica, microsomal, mitocondrial y
nuclear [20] (ver Figura 20.2).
Figura 20.2. Fraccionamiento de células en organelos subcelulares.
El fraccionamiento subcelular por organelos permite concentrar el estudio en
un compartimiento celular de interés para investigar allí la expresión de proteínas
mucho más a fondo. Alternativamente puede realizarse un subfraccionamiento
por solubilización diferencial (Figura 20.3), que consiste en la extracción de la
masa celular mediante el uso de agentes solubilizantes cada vez más enérgicos
[20] . Tras cada incubación, el material no disuelto se separa por centrifugación,
y el sobrenadante (fracción soluble) se colecta por separado. El precipitado
residual se extrae con una solución de mayor poder solubilizante. Un esquema
típico consiste en: a) extracción en TRIS 40 mM pH 11, b) extracción en urea,
c) extracción del residuo final en SDS. Recientemente han ganado popularidad
los métodos de fraccionamiento basados en propiedades físico-químicas utilizando
técnicas múltiples o en serie (por ejemplo, fraccionar por carga eléctrica mediante
isoelectroenfoque en solución, seguido de separación por hidrofobicidad en
columnas de fase reversa o por tamaño en columnas de exclusión molecular).
Estos sistemas generan una gran cantidad de fracciones, cada una de ellas se
convierte en un subproteoma y de hecho en un subproyecto de estudio.
PROTEÓMICA
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Figura 20.3. Fraccionamiento de proteínas celulares según su solubilidad en diferentes soluciones
de extracción.
c) Utilización de técnicas de muy alta resolución en electroforesis bidimensional.
Una alternativa es utilizar geles de tipo zoom en la primera dimensión
(separación por carga). Actualmente existen en el mercado geles comerciales
que expanden una unidad de punto isoeléctrico a lo largo de 18 cm. En ellos
es posible aplicar una alta carga de proteínas con lo que las especies poco
abundantes se hacen visibles. Ciertamente estos geles permiten ver en todo
detalle una región del proteoma pero excluyen el resto. Por ello se utilizan
solo cuando se desea estudiar algún aspecto particular que ha sido previamente
explorado con un sistema más abarcador aunque con menor profundidad.
Por su costo en tiempo, en material biológico y en recursos, seria irrealizable
intentar estudiar un proteoma utilizando todas las técnicas de enriquecimiento
mencionadas. Pero las diversas combinaciones de ellas son de gran utilidad
cuando se desea centrar el estudio en una fracción. Por ejemplo, es posible
estudiar el subproteoma nuclear de una línea celular, mediante el uso de geles
zoom para analizar el rango de pI 8.0 a 9.0 seguido de separaciones en geles de
tris tricina [22] de segunda dimensión que resuelven específicamente las
proteínas de baja talla. Con ello veremos en detalle una parte del proteoma
celular correspondiente a las proteínas básicas de baja talla presentes en la
fracción nuclear.
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CAPÍTULO 20
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA
Como ya se mencionó la electroforesis bidimensional posee algunas limitaciones
para analizar proteínas hidrofóbicas ya que por su escasa solubilidad están
subrepresentadas en los mapas electroforéticos bidimensionales obtenidos hasta
el momento. Por otra parte, aquellas proteínas que poseen puntos isoeléctricos
muy ácidos o básicos son difíciles de focalizar en la mayoría de los geles de
isoelectroenfoque disponibles en el mercado. El amplio rango dinámico es otro
problema no resuelto.
Por tales motivos, en los últimos años ha existido la tendencia a trabajar con los
péptidos en vez de las proteínas tratando de solucionar las limitaciones señaladas.
La idea consiste en marcar diferencialmente con isótopos estables los péptidos
generados por la proteólisis de todas las proteínas sintetizadas por una célula o
tejido en dos condiciones que se desean estudiar o comparar. Posteriormente,
mediante el análisis por cromatografía líquida de fase reversa (o combinada
con otro método cromatográfico) acoplada a la espectrometría de masas se
puede realizar la identificación de las proteínas en las bases de datos de
secuencias. La cuantificación se logra mediante un análisis detallado de las
distribuciones isotópicas de los péptidos analizados y así se infiere la expresión
diferencial de las proteínas que los contienen.
Aunque la idea parece sencilla, no deja de tener asociada una gran complejidad
pues si bien el trabajo con péptidos puede ser más fácil en comparación con las
proteínas, no es menos cierto que ya la mezcla de proteínas que se deriva de
una célula o tejido de por sí es muy compleja por lo que una vez realizada la proteólisis
la mezcla de péptidos que se genera debe ser mucho más compleja aún.
Por tales motivos se han empleado propiedades ortogonales para lograr la
separación de la mezcla de péptidos obtenida. Entre estas propiedades tenemos
la talla, carga, hidrofobicidad, e interacción biológica o afinidad. Por lo tanto es
de esperar un sinnúmero de posibles combinaciones en la cromatografía
multidimensional pero lo común entre todas radica en que persiguen un mismo
objetivo: obtener la mejor resolución posible para posteriormente identificar una
mayor cantidad de proteínas en el análisis por espectrometría de masas.
Entre las combinaciones más empleadas se encuentra la cromatografía de
intercambio iónico con la cromatografía de fase reversa (RP). Particularmente
en esta combinación la utilización de columnas de RP en el segundo paso permite
que la mezcla a su vez sea desalada y pueda ser analizada mediante
espectrometría de masas empleando electronebulización (ESI). También se han
reportado otras combinaciones que emplean cromatografías de exclusión por
tamaño molecular (SEC) y RP [23]. Raida y colaboradores combinaron la
PROTEÓMICA
383
cromatografía de intercambio catiónico (SCX) con RP-HPLC acoplada al
espectrómetro de masas para medir las masas de alrededor de 3000 péptidos
de un hemofiltrado humano [24]. Aunque los dos pasos cromatográficos fueron
desarrollados en experimentos diferentes, este estudio demostró el elevado poder
resolutivo de la cromatografía multidimensional y la espectrometría de masas
para el fraccionamiento y análisis de un gran número de péptidos.
Mediante la combinación de intercambio catiónico y RP-HPLC se ha publicado
quizás el más eficiente método de identificación de proteínas a partir de mezclas
complejas de péptidos. Esta tecnología se conoce como MudPIT
(Multimensional Protein Identification Technology) [25,26]. En esta
metodología se emplean sales volátiles para eluir por pasos los péptidos retenidos
en una matriz de intercambio catiónico y separarlos posteriormente en una
columna de RP-HPLC acoplado a un espectrómetro de masas. Con la aplicación
de esta metodología se logró identificar proteínas muy hidrofóbicas con múltiples
regiones transmembranarias, proteínas de pI superiores a 12 e inferiores a 4 y
proteínas que el uso de codones (Codon adaptation index) de su gen deben
ser muy minoritarias.
Otros grupos han desarrollado procedimientos SCX-RP para una gran variedad
de aplicaciones [27,28]. También se ha empleado la electroforesis capilar (CE)
acoplada a la cromatografía de fase reversa para separar péptidos originados
por la digestión de una proteína [29] y existen reportes de cromatografías
tridimensionales
La inclusión de una cromatografía de afinidad en uno de los pasos de separación
multidimensional de péptidos ha sido muy útil pues permite retener selectivamente
péptidos o proteínas basándose en interacciones específicas lo que simplifica
considerablemente la mezcla compleja de péptidos proteolíticos. Así por ejemplo,
en la identificación de la fosforilación, que es una de las modificaciones
postraduccionales más importantes por estar involucrada prácticamente en todos
los mecanismos de transducción de señales, las columnas de IMAC-Fe 3+ han
permitido el aislamiento de los fosfopéptidos y el estudio del fosfoproteoma de
varios organismos [30-32].
La utilización de columnas con lectinas inmovilizadas ha permitido la captura
selectiva de glicopéptidos que facilita el estudio del glicoma de los organismos
[33]. También se han empleado otras variantes que incluye la derivatización
química de aminoácidos para que, mediante el empleo de una cromatografía de
afinidad, sea posible el aislamiento selectivo de los péptidos modificados dentro
de todos los péptidos proteolíticos generados.
Uno de los ejemplos más creativos dirigidos a realizar proteómica sin emplear
la electroforesis bidimensional es la metodología conocida como ICAT (isotope-
384
CAPÍTULO 20
coded affinity tags) [34]. En esta metodología se procede a la derivatización
química de los péptidos con un reactivo conocido también como ICAT que posee
un extremo que reacciona específicamente con los residuos de cisteínas libres
y en el otro extremo posee biotina. Los péptidos marcados (que contienen
cisteína) se aislan selectivamente, mediante una cromatografía de afinidad con
avidina, los péptidos que contienen residuos de cisteínas modificadas. Este paso
de cromatografía de afinidad es esencial para simplificar las mezclas complejas
de péptidos e identificar proteínas minoritarias, que de analizarse la mezcla de
péptidos cruda no pudieran ser identificadas. Adicionalmente el reactivo posee
una región intermedia que contiene 4 grupos metilenos, con un total de 8
hidrógenos, que pueden estar sustituidos por deuterio. De esta forma se tienen
realmente dos reactivos, el ligero (con H) y el pesado (con D). La cuantificación
de la expresión diferencial de proteínas se logra al marcar una condición con el
reactivo ligero y la segunda condición con el reactivo pesado
Ambos extremos del reactivo ICAT se encuentran enlazados por un brazo
espaciador que en una de las variantes el ICAT ligero posee los isótopos naturales
en cambio el ICAT pesado posee 8 átomos de deuterio. Cada una de las
condiciones se marcan de manera independiente isotópicamente con cada uno
de reactivos ICATy Ligeros y después los eluatos de afinidad se mezclan en
cantidades equivalentes y la cuantificación se realiza al determinar la intensidad
relativa de las especies ligera y pesada de los péptidos analizados por
espectrometría de masas.
A esta metodología se le señalan las siguientes limitaciones:
1. Las proteínas que no contienen residuos de cisteínas quedan excluidas del
análisis.
2. La masa molecular del reactivo ICAT, en ocasiones comparable con la masa
molecular del péptido a identificar puede causar interferencias durante la
ionización de los péptidos y en la interpretación de los espectros de masas.
3. La cuantificación puede aportar resultados erróneos pues durante la
separación por fase reversa los péptidos marcados con ICAT ligero pueden
eluir significativamente separados de los marcados con la versión pesada.
Recientemente se han introducido nuevas versiones del reactivos ICAT para
tratar de solucionar estos problemas. Por ejemplo el reactivo en fase sólida
para disminuir las pérdidas en la cromatografía de afinidad y se ha sustituido el
marcaje con deuterio por 13 C para evitar las diferencias en el tiempo de retención
en RP-HPLC de los péptidos derivatizados con el ICAT ligero y pesado con lo
que se minimizan los posibles errores en la cuantificación. Esta metodología
tiene el gran mérito de haber sido la pionera en proponer una estrategia bien
PROTEÓMICA
385
estructurada y concebida para explotar las potencialidades de la espectrometría
de masas y realizar los estudios de proteómica sin la necesidad del empleo de la
electroforesis bidimensional.
Gevaert y colaboradores desarrollaron un método diagonal que emplea dos pasos
consecutivos de cromatografía de fase reversa, denominado COFRADIC
(combined fractional diagonal chromatography) [35]. Después de obtener
múltiples fracciones de una mezcla compleja de péptidos mediante cromatografía
de fase reversa, a cada una de las fracciones se le realiza un tratamiento oxidativo
que transforma selectivamente a los péptidos que contienen metioninas en
metioninas sulfóxido, que los convierten en especies más hidrofílicas que los
péptidos originales. Se repite la separación por RP-HPLC con las fracciones
después de oxidadas. Solo las fracciones que redujeron el tiempo de retención
(y por tanto contienen las metioninas oxidadas) son colectadas y analizadas por
espectrometría de masas. De esta manera, de la mezcla compleja inicial de
péptidos solo se analizan por espectrometría de masas aquellos que contienen
residuos de metionina en su secuencia. Aunque en este reporte no se refieren
términos cuantitativos, se sugiere que el empleo del marcaje isotópico estable
con 18 O pudiera ser utilizado para que esta metodología suministre información
cuantitativa sobre la expresión diferencial de proteínas. En este trabajo fueron
seleccionados e identificados péptidos (que contienen metionina) provenientes
de 800 proteínas diferentes.
Espectrometria de masas (MS)
La espectrometría de masas es la herramienta empleada en los estudios de
proteómica para la identificación de las proteínas. Su principio se asemeja a lo
que ocurre cuando un haz luminoso incide sobre un prisma: la radiación
electromagnética es descompuesta o separada de acuerdo a las diferentes
longitudes de onda. En un espectrómetro de masas un haz de iones es separado
de acuerdo a la relación masa/carga: m/z.
En un espectrómetro de masas hay dos elementos esenciales: la fuente de
ionización, donde son producidos los iones al suministrarle energía a la muestra
que se estudia y el analizador (un campo eléctrico, un campo magnético, de
tiempo de vuelo o una combinación de ellos), donde los iones son separados de
acuerdo a la relación masa/carga (m/z). La energía suministrada puede ser
suficiente no solamente para ionizar la molécula y obtener el llamado ión molecular
(la molécula intacta pero con una carga positiva o negativa) sino también para
provocar la fragmentación de la molécula dando lugar a iones fragmentos. Los
iones producidos son característicos de un determinado compuesto químico y por
tanto es posible su identificación a partir del espectro de masas.
386
CAPÍTULO 20
Aunque la espectrometría de masas ya era una técnica establecida para la
caracterización de los compuestos orgánicos desde finales de la década de los
años 50, los métodos de ionización disponibles hasta 1981 no eran aplicables a
las llamadas biomoléculas (péptidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos)
por cuanto exigían la evaporación previa de la muestra. Por esta razón, para
estudiar los compuestos con elevados puntos de fusión o que se descomponen
con la temperatura había que obtener derivados volátiles y en el caso de que
esto no fuera posible, simplemente no podían ser estudiados.
En 1981, Michael Barber y Richard Bordoli, de la Universidad de Manchester
publican la aplicación de un método de ionización suave, el FAB (fast atom
bombardment) al estudio de proteínas [36]. El método, aunque ya no se emplea
debido a su baja eficiencia de ionización, fue un resultado de gran importancia
pues permitió por primera vez la medición de la masa molecular de los péptidos
y la determinación de la secuencia sin necesidad de obtener un derivado volátil.
En 1989, John Fenn publica [37] la aplicación de la ionización por electronebulización
(electrospray ionization, ESI) al estudio de péptidos, proteínas y otras
biomoléculas. Un año antes Koichi Tanaka había publicado un nuevo método de
ionización conocido como MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization) [38]. Poco después Michael Karas y Franz Hillenkamp publican varias
aplicaciones del MALDI en el campo de las proteínas [39]. Fenn y Tanaka
recibieron el premio Nobel de Química en el 2002 por estos descubrimientos.
Estos dos métodos revolucionaron completamente la aplicación de la
espectrometría de masas a las biomoléculas y en apenas diez años la
espectrometría de masas se convirtió en el método más poderoso para el análisis
y la caracterización de péptidos y proteínas.
El MALDI emplea un láser ultravioleta para suministrar la energía capaz de
ionizar el compuesto. Previamente la muestra es mezclada íntimamente con la
matriz. La matriz es un elemento muy importante y está constituida por
compuestos insaturados (ácido sinapínico, ácido 2,5 dihidroxibenzoico (DHB),
ácido 4-hidroxi-α-cianocinámico, etc.) capaces de absorber energía a la longitud
de onda del láser. De esta forma la matriz absorbe la mayor parte de la energía
suministrada que de otra forma destruiría la muestra totalmente y facilita la
ionización del compuesto que se desea analizar.
El ESI se había desarrollado como un procedimiento para la interfase entre la
cromatografía líquida y la espectrometría de masas [40]. Así la muestra es
transportada en solución (puede ser desde un cromatógrafo líquido) a través de
un capilar en cuyo extremo se encuentra un alto voltaje (entre 3-4 kV). De esta
forma se produce una nebulización de pequeñas gotas formadas por el solvente
PROTEÓMICA
387
y la muestra y que portan un número considerable de cargas eléctricas. El
solvente es eliminado con la ayuda de una corriente de gas (usualmente nitrógeno)
y finalmente queda la muestra ionizada con varias cargas.
Tanto el MALDI como el ESI son métodos de ionización suave, esto es, la
energía suministrada a la muestra es relativamente baja, y los compuestos son
ionizados pero no ocurre la fragmentación de las moléculas como en el caso de
de la ionización por impacto electrónico, el método de ionización más usado
para el estudio de moléculas orgánicas.
En ambos métodos de ionización, MALDI y ESI, un péptido adquiere una carga
positiva o negativa por adición o eliminación de protones respectivamente, dando
lugar a los iones pseudomoleculares que corresponden a la masa molecular del
péptido más (o menos en el caso de iones negativos) la masa de uno o varios
protones. Si se adiciona un protón la carga del péptido será unitaria, y si se adicionan
varios protones se obtendrán iones multicargados. En el MALDI los iones son
fundamentalmente monocargados mientras que en el ESI los iones son usualmente
multicargados. En principio es posible estudiar los iones positivos o negativos
aunque es mucho más frecuente la espectrometría de masas de iones positivos.
Al introducir una mezcla de péptidos en el espectrómetro de masas usando
MALDI o ESI como método de ionización se obtiene un grupo de señales que
corresponden a los iones moleculares de cada uno de los péptidos, por cuanto
no se producen fragmentaciones de las moléculas.
SECUENCIACIÓN D E PÉPTIDOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Al no producirse fragmentaciones durante la ionización por MALDI o ESI se
obtiene solamente información sobre la masa molecular de un péptido pero no
es posible obtener información de su secuencia. Para lograr este propósito se
emplea un proceso llamado Disociación Inducida por Colisiones (DIC) o
Disociación Activada por Colisiones (DAC). Este consiste en introducir el haz
de iones de la muestra en una región que contiene un gas químicamente inerte
(usualmente argón), para que por las colisiones generadas entre ambos, una
parte de la energía cinética que poseen las moléculas se transforme en energía
vibracional de sus enlaces y ocasione la disociación en dependencia de su
fortaleza 41]. Aunque la eficiencia de la fragmentación de un péptido está muy
influenciada por las características de su secuencia, se ha observado que también
depende del gas de colisión que se emplee [42].
La nomenclatura aceptada por los especialistas en este campo para clasificar los
iones fragmentos de un péptido es la que propusieron Roepstorff y Fohlmann [43].
Se plantea que la ruptura del esqueleto carbonado de un péptido puede originar
seis tipos diferentes de fragmentaciones (an , bn , c¨n , xn , y¨n , zn ) que se clasifican
388
CAPÍTULO 20
en series del extremo N-terminal (an , bn , cn ) o series del extremo C-terminal (xn ,
y¨n , zn ) en dependencia de cuál de los dos extremos del péptido original se
conservan en sus estructuras. El subíndice que acompaña cada tipo de
fragmentación se corresponde con la cantidad de residuos aminoacídicos que
posee el ión fragmento (ver Figura 20.4).
Figura 20.4. Nomenclatura de las fragmentaciones que se obtienen por Disociación Activada
por Colisiones en experimentos MS/MS. Los fragmentos a, b y c contienen el
extremo N-terminal y los fragmentos x, y y z conservan el extremo C-terminal. Los
subíndices que acompaña cada tipo de fragmentación se corresponden con la
cantidad de residuos aminoacídicos en el ión fragmento. Nótese que los fragmentos
b y y se obtienen por ruptura del enlace peptídico y por tanto son complementarios
en la información sobre la secuencia. Son además, en general, los iones mas intensos
en el espectro MS/MS.
Aunque las fragmentaciones de las cadenas laterales son de gran importancia
para la diferenciación de aminoácidos que poseen igual masa (aminoácidos
isobáricos) y suministran más información estructural, es necesario destacar
que en proteómica esta fragmentaciones no resultan de utilidad para la
identificación de las proteínas pues la mayoría de los espectrómetros que se
emplean actualmente realizan la disociación inducida por colisiones de los péptidos
en un régimen de baja energía y las fragmentaciones de las cadenas laterales están
ausentes del espectro de masas. Sin embargo, el desarrollo reciente de los
PROTEÓMICA
389
espectrómetros de masas MALDI-TOF/TOF [44,45] pudiera vislumbrar una
aplicación en el campo de la proteómica al observarse fragmentaciones de las cadenas
laterales que suministran mayor cantidad de información estructural. Además se
obtienen espectros de masas con muy buena calidad en el rango de los femtomoles.
La abundancia relativa de estas series N y C-terminales en el espectro está
determinada generalmente por la posición del residuo básico en la secuencia. Así
por ejemplo, cuando residuos de Arginina están ubicados en el extremo N o en el
extremo C del péptido, abundan en el espectro las series N o C-terminal
respectivamente. Este fenómeno es conocido en la literatura inglesa como charge
remote fragmentation [46] y plantea que la fragmentación ocurre a lo largo de la
cadena peptídica inducida por la carga a pesar de que ésta se mantiene en un
lugar fijo (alejado en muchos casos), presumiblemente en la posición en que está
ubicado el residuo básico. Por este motivo es usual observar que los espectros de
masas de los péptidos trípticos son abundantes en iones C-terminales (series y¨ n ).
Para secuenciar un péptido, cada uno de los iones fragmentos observados en el
espectro se debe clasificar de acuerdo a la nomenclatura antes mencionada,
pues de esta manera las diferencias en masas de series consecutivas de un
mismo tipo (b5 , b4 , b3 , b2 …) pueden ser asignadas a uno de los veinte aminoácidos
más comunes y así obtener la secuencia peptídica. Por otra parte, un péptido se
puede secuenciar simultáneamente a partir de sus dos extremos con un solo
espectro pues la información suministrada por las series N y C-terminales son
complementarias. Se obtienen secuencias parciales desde ambos extremos y al
superponerlas se determina una secuencia altamente confiable (ver Figura 20.5).
Figura 20.5. Esquema de un experimento MS/MS. La mezcla de péptidos proteolíticos es
ionizada y se introduce en el primer analizador, donde se selecciona uno de los
péptidos que pasa a la cámara de colisiones. Aquí ocurre la interacción con el gas
neutro (Argón) y se producen las fragmentaciones que son medidas en el segundo
analizador para obtener el espectro MS/MS y deducir la secuencia del péptido.
390
CAPÍTULO 20
SE C U E N C I A C I Ó N
D E UNA M E Z C L A D E PÉPTIDOS .
E SPECTROS MS/MS
Lo referido en el epígrafe anterior implica que debemos tener un péptido puro,
pues si tuviéramos una mezcla de péptidos se producirían fragmentos de todos
ellos y sería imposible la interpretación de los espectros. Por esta razón se
requiere aislar o seleccionar un péptido determinado para proceder a su
secuenciación.
Esto es posible mediante la espectrometría de masas en tándem o MS/MS que
consiste en dos analizadores separados por la cámara de colisiones donde el
gas neutro provoca las fragmentaciones (ver Figura 20.6).
Figura 20.6. Espectro MS/MS del péptido VLFSSDGGVVK. Puede observarse que la mayoría de
los iones presentes corresponden a los fragmentos y, algo frecuente en los espectros de
péptidos trípticos que poseen un aminoácido básico en el extremo C-terminal y por
tanto conservan la carga en ese residuo. En este ejemplo es posible deducir con relativa
facilidad la secuencia completa del péptido, algo que no siempre ocurre.
Cuando se introduce una mezcla de péptidos en la fuente de ionización, se
produce la ionización de todos y al penetrar en el primer analizador es posible
seleccionar solo uno de ellos, los restantes simplemente chocan con las paredes
del analizador. El péptido seleccionado pasa a la cámara de colisiones donde se
PROTEÓMICA
391
producen los fragmentos que son posteriormente analizados en el segundo
analizador con lo que se obtiene la secuencia del péptido de forma similar a la
descrita en el epígrafe anterior.
Una vez concluida esta operación para un péptido, se selecciona otro péptido y se
procede de forma similar. Este procedimiento es rápido y automático por lo que
se pueden medir los espectros MS/MS de varios péptidos presentes en una mezcla
en un tiempo relativamente breve y obtener sus secuencias. Esta posibilidad técnica
también tiene otra repercusión importante en proteómica y es que las proteínas
que se van a identificar no tienen que estar totalmente puras. Es posible identificar
varias proteínas en una mezcla como ocurre en ocasiones en una banda de
electroforesis donde puede existir más de una proteína.
MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES
Como hemos la espectrometría de masas permite identificar una proteína, y
secuenciarla lo que resulta de gran importancia aunque hay otro aspecto muy
relevante de esta técnica que es su capacidad para identificar y localizar las
modificaciones post-traduccionales. Se conocen más de 200 tipos de
modificaciones. La espectrometría de masas es prácticamente el único método
capaz de detectarlas y determinar su ubicación en la cadena de aminoácidos.
De la descripción del procedimiento de secuenciación por espectrometría de
masas resulta evidente que es posible detectar cualquier posible modificación
por el corrimiento de masa que provoca en el aminoácido donde se encuentra
localizada. Cuando al analizar un espectro MS/MS para secuenciar un péptido,
el valor de masa obtenido para alguna de las fragmentaciones no se corresponde
con ninguno de los valores de masas de los veinte aminoácidos más comunes,
es muy probable que sea debido a la presencia de una modificación post
traduccional. Con el auxilio de tablas que reportan los corrimientos de masa
provocados por las diferentes modificaciones se puede identificar el aminoácido
y la modificación correspondiente. En la Tabla 20.2 se muestran los corrimientos
esperados para algunas de las modificaciones mas comunes. Pueden encontrarse
tablas muy completas en: http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home o http://
www.unimod.org/
Tabla 20.2. Modificaciones post traduccionales más comunes
m
m
392
CAPÍTULO 20
Tabla 20.2 (continuación).
Es conocida la repercusión de estas modificaciones en las funciones biológicas
de las proteínas, de ahí la importancia de contar con un método capaz de
identificarlas. Sin embargo, aún es difícil poder cuantificar la fracción de moléculas
de una proteína que se encuentra modificada en un sitio dado y establecer si
esa modificación es transitoria.
ESTRATEGIAS PARA LA IDENTIFICACIÓN D E LAS PROTEÍNAS
Como ya fue mencionado anteriormente (Tabla 20.1), las proteínas separadas
por electroforesis bidimensional son digeridas con una enzima, usualmente tripsina,
con lo que se obtiene una mezcla de péptidos. Los péptidos son extraídos del gel
e introducidos directamente en el espectrómetro de masas para su identificación.
En la actualidad existen tres estrategias fundamentales para la identificación de proteínas
basadas en la información primaria suministrada por la espectrometría de masas:
La primera de las estrategias para la identificación de proteínas en las bases de
datos se basa en que la digestión proteolítica de una proteína con una proteasa
altamente específica, origina de manera reproducible un conjunto de péptidos
que es característico para cada una de las proteínas.
Por esta razón, es posible predecir mediante una digestión in silico el conjunto
de péptidos que se debe generar mediante el tratamiento proteolítico específico
de cada una de las proteínas almacenadas en las bases de datos de secuencias
y por lo tanto se puede calcular teóricamente las masas moleculares de cada
uno de los péptidos esperados.
PROTEÓMICA
393
La masa molecular de cada uno de los péptidos proteolíticos se puede determinar
experimentalmente mediante ESI-MS o MALDI-MS. Esta información se
conoce como huella de masas de los péptidos de una proteína o peptide mass
fingerprint (PMF). Por tanto, la proteína analizada puede ser identificada
exitosamente cuando se produce una correspondencia entre los valores
experimentales de las masas moleculares de cada uno de sus péptidos con los
valores de masas teóricas esperadas para una de las proteínas existentes en las
bases de datos.
Con la instrumentación disponible en la actualidad la medición de las masas
moleculares puede realizarse de manera rutinaria con un error inferior a los
50 ppm por lo que las identificaciones por esta metodología son muy confiables
y es previsible que con la introducción masiva de espectrómetros más acuciosos
la calidad de las identificaciones sea aún superior pues está directamente
relacionada con la exactitud de la medición de las masas moleculares de los
péptidos proteolíticos [47,48].
Hoy en día existen varios programas accesibles vía Internet que brindan el
servicio de identificación de proteínas en línea utilizando la estrategia del PMF
y entre los más empleados se encuentra el MASCOT, (http://
www.matrixscience.com/cgi/search_ form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF)
[49], el ProFound (http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe) [50]
y el MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm). De todas las
estrategias para la identificación de proteínas en las bases de datos de secuencia
ésta fue la que inicialmente ganó más popularidad, debido a su gran sencillez
por ello, numerosos grupos de trabajo la implementaron en sus laboratorios y
desarrollaron los programas de cómputo apropiados para este propósito [51,52]
(ver Figura 20.7).
Sin embargo, cuando se digieren proteínas poco abundantes en la banda de gel,
incluso empleando los protocolos optimizados, con frecuencia se obtienen bajos
recobrados de los péptidos proteolíticos y es frecuente encontrar que solo
aparezcan las señales de masas correspondientes a uno, dos o tres péptidos
proteolíticos. En estos casos la estrategia de PMF puede brindar resultados
ambiguos o identificaciones erróneas. En tales situaciones es necesario obtener
información de la secuencia de los péptidos analizados.
Esta limitante fue resuelta con el surgimiento de otra estrategia conocida como
etiqueta de secuencia (sequence tag) para la identificación de proteínas. Ella
plantea que para lograr la identificación solo es necesario extraer una pequeña
secuencia parcial (3 a 4 aminoácidos) del espectro ESI-MS/MS de un péptido
[53]. Este método revolucionó la identificación de las proteínas a partir de la
secuencia deducida de los espectros de masas por cuanto se requería una
394
CAPÍTULO 20
interpretación exhaustiva del espectro MS/MS para obtener la secuencia
aminoacídica lo más completa posible de algunos de los péptidos proteolíticos
para poder identificar la proteína correspondiente. El procedimiento del sequence
tag es particularmente útil en los espectros ESI-MSMS de los péptidos trípticos
pues esa pequeña secuencia parcial es muy fácil de extraer pues la región de
mayor masa es muy limpia en cuanto a la relación señal/ruido y es rica en los
fragmentos y¨ n (el aminoácido básico se conserva en el C-terminal).
Figura 20.7. Pasos principales en la identificación de proteínas mediante la huella de masas de
los péptidos de una proteína (peptide mass fingerprint). 1: las proteínas se separan
en un gel bidimensional. Las proteínas de interés se seccionan del gel y se digieren
con tripsina. 2. Los péptidos procedentes de la digestión tríptica se analizan por
espectrometría de masas, en este caso usando la técnica de ionización conocida
como MALDI. 3. Se obtienen las masas moleculares de los péptidos trípticos
obtenidos en la digestión. 4. Los valores de masas obtenidos experimentalmente se
comparan con las digestiones teóricas existentes en las bases de datos de proteínas
y que son accesibles vía Internet. Se obtiene el resultado con la identificación de la
proteína y una evaluación de la confiabilidad de la identificación.
Aunque el método es muy confiable y hay programas que extraen de manera
automática la secuencia parcial a partir de los espectros ESI-MSMS, en algunos
casos se requiere de la intervención del especialista, pues el éxito de la
identificación se basa en una correcta interpretación de espectros para extraer
la secuencia parcial.
PROTEÓMICA
395
La última de las estrategias pretende minimizar la intervención del especialista
en la identificación de las proteínas en las bases de datos de secuencias [54,55].
Esta estrategia se conoce como huella de masas del espectro MS/MS y se basa
en que cada péptido que se fragmenta mediante un proceso de disociación
inducida por colisiones produce un espectro de iones fragmentos (MS/MS), que
es muy característico de su secuencia y que lo diferencia del resto de los péptidos
almacenados en las bases de datos.
El espectro MS/MS de un péptido está mayoritariamente representado por
fragmentos originados por la ruptura del enlace peptídico (y¨ n o bn ). Si la
secuencia de la proteína que contiene al péptido se conoce, es posible predecir
las masas de los fragmentos iónicos que se originarán. Por ello, el programa
basa su identificación en buscar primeramente el conjunto de todos los péptidos
(dentro de las proteínas en las bases de datos) que, originados por un corte
específico de la proteasa empleada, coincidan con la masa molecular del péptido
que se analiza. Posteriormente, a cada uno de los péptidos que posean esa
característica se le calculan las masas moleculares de los iones fragmentos
posibles y se comparan con las masas moleculares de los fragmentos obtenidos
experimentalmente en el espectro MS/MS. Se selecciona el péptido con mejor
coincidencia y así queda identificada la proteína (ver Figura 20.8).
Figura 20.8. Resumen de las Estrategias de Identificación de Proteínas. Las 3 principales estrategias
son: 1. Huella de masas de la proteína. Se obtiene el espectro de masas de la mezcla
de péptidos proteolíticos. Los valores de las masas obtenidos se comparan con las
digestiones teóricas de las proteínas en las bases de datos para la identificación. 2.
Etiqueta de secuencia. Requiere de espectros MS/MS. Se seleccionan uno o varios
péptidos, se obtiene el espectro MS/MS y se determina una secuencia parcial. Es
suficiente 3-4 residuos para identificar la proteína en las bases de datos. 3. Huella de
masas MS/MS. Igualmente requiere del uso de MS/MS pero a diferencia del anterior
no es necesaria la determinación de una secuencia parcial. Se basa en que los iones
fragmentos de un péptido son característicos y por tanto basta para encontrar un
péptido idéntico en las bases de datos e identificar la proteína correspondiente.
396
CAPÍTULO 20
Resulta evidente que para todos estos programas mencionados es indispensable
disponer de la secuencia de las proteínas en las bases de datos para una correcta
identificación.
Particularmente para la identificación de proteínas que pertenezcan a un
organismo de genoma desconocido solo se podrá obtener un resultado exitoso,
mediante la estrategia de PMF, si la proteína de interés comparte una identidad
de secuencia elevada con respecto a alguna de las proteínas reportadas en las
bases de datos. Mientras menor sea la identidad de secuencia, menos confiable
será la identificación realizada.
Si la similitud de secuencia es muy baja o si la secuencia del gen no es conocida
entonces los péptidos trípticos tienen que ser secuenciados completamente a
partir de la interpretación manual o automática de los espectros MS/MS de
cada péptido. La identificación se realiza mediante el alineamiento de las
secuencias determinadas experimentalmente contra bases de datos de secuencias
conocidas, para encontrar secuencias similares. No obstante, si la secuencia de
la proteína en cuestión no es muy similar a las reportadas en las bases de datos
esta estrategia puede fallar. Esto es debido a que es poco probable que la
secuencia de genes de una especie sea idéntica a la otra y las sustituciones de
nucleótidos pueden provocar sustituciones de aminoácidos que implican cambios
en las masas de los péptidos analizados y por tanto, repercute negativamente en
la identificación.
Los programas de alineamiento de secuencias de proteínas y genes más
empleados son el BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov/blast y el FASTA
www.ebi.ac.uk/searches/fasta.html. La identificación a través de estos
programas resulta difícil, ya que ambos algoritmos se han optimizado para
comparar secuencias de proteínas y nucleótidos de mayor longitud que los
péptidos secuenciados por espectrometría de masas. Por otro lado, la
espectrometría de masas no permite diferenciar aminoácidos isobáricos ya que
presentan masas muy similares (Lys y Gln) o idénticas (Leu e Ile) y la calidad
del alineamiento puede estar determinada por cuál aminoácido de los antes
mencionados se introduzca en la secuencia a alinear ya que estos programas
contienen una matriz diferente para cada uno.
El auge alcanzado en la aplicación de la espectrometría de masas a la
secuenciación de proteínas ha motivado que los programas de alineamientos
hayan sido recientemente modificados para adaptarlos al alineamiento óptimo
de secuencias cortas de péptidos. Particularmente, el FASTA modificado (FASTS)
[56] posee aún una limitante pues las búsquedas son lentas y la puntuación final
de los envíos depende no sólo del número de péptidos sino que disminuye con el
número de secuencias de péptidos en cada solicitud enviada.
PROTEÓMICA
397
Shevchenko et al., [57,58] propusieron el programa BLAST optimizado para
análisis de péptidos secuenciados por espectrometría de masas (MS BLAST).
Éste se encuentra disponible mediante un servicio web http://dove.emblheidelberg.de/Blast2. A diferencia del BLAST y el FASTA, el MS BLAST
permite introducir algunas modificaciones a los péptidos secuenciados que
aumentan la confiabilidad de la identificación, como por ejemplo las puntuaciones
individuales para los aminoácidos isobáricos (Leu/Ile y Gln/Lys) son sustituidas
por sus valores promedios y así la puntuación del péptido T-S-L-V-K-M es
igual a la del péptido T-S-I-V-G-M).
En marzo del 2003 surgió una nueva alternativa para la identificación eficiente
de péptidos provenientes de organismos de genoma desconocido. Esta
herramienta es la secuenciación mediante MultiTag [59] que constituye una
versión modificada de la estrategia de identificación mediante etiqueta de
secuencia (sequence tag). Ésta permite identificar proteínas de muy baja
abundancia y de las que sólo se pueden secuenciar de tres a cuatro aminoácidos,
cuya identificación no sería confiable por MS BLAST.
APLICACIONES DE LA PROTEÓMICA
Las múltiples aplicaciones de estas técnicas pueden agruparse en dos categorías
principales:
1. Caracterización del proteoma de un organismo. El propósito de este estudio
es la identificación del mayor número de proteínas expresadas por un
organismo en una condición biológica particular. En el caso de organismos
unicelulares o de células en cultivo, muchos trabajos se han propuesto la
separación y la identificación de proteínas en preparaciones de proteínas
totales y ya existen mapas en bases de datos para numerosos organismos.
Sin embargo, para lograr un nivel superior de información se prefiere
descomponer el estudio del proteoma en el estudio de subproteomas
correspondientes a organelos subcelulares (Figura 20.9). Actualmente la
Organización del Proteoma Humano (HUPO) tiene en curso 3 proyectos
internacionales destinados a la construcción de los primeros mapas
proteómicos de órganos o tejidos. Estos son: cerebro, hígado y plasma.
2. Proteómica Comparativa (Figura 20.10): consiste en evaluar los cambios en
la expresión de proteínas de un organismo sometido a dos o varias condiciones
biológicas diferentes, generalmente una de ellas es una condición control
que se utiliza como referencia de la expresión de proteínas en condiciones
“normales”. Este tipo de trabajo suministra información a nivel molecular de
los cambios causados por la acción de un agente externo (por ejemplo un
medicamento), por cambios en las condiciones de cultivo, las diferencias
398
CAPÍTULO 20
entre una línea celular normal y una tumoral, la evaluación de los cambios
producidos por un agente infeccioso, el desarrollo de los mecanismos de resistencia
a quimioterapéuticos o antimicrobianos. Este tipo de investigación es de alto
valor en ciencias biomédicas. Para los trabajos de proteómica comparativa es
necesario disponer de un diseño experimental cuidadosamente planificado. Aquí
resulta de gran utilidad la existencia de una hipótesis previa que oriente la búsqueda
hacia determinado tipo de proteínas que pueden ser seguidas por inmunodetección
con anticuerpos específicos o que se suponen localizadas esencialmente en un
organelo subcelular . Por ejemplo, algunos proyectos se orientan específicamente
hacia la identificación de cambios en los patrones de fosforilación de proteínas.
En este caso, la detección del subconjunto de proteínas fosforiladas puede
facilitarse mediante el uso de anticuerpos específicos.
Figura 20.9. Confección de un mapa bidimensional anotado. Como resultado de las identificaciones
efectuadas por espectrometría de masas, el mapa bidimensional de proteínas se
enriquece con abundante información que incluye la identificación de la naturaleza
de las proteínas, el punto isoeléctrico y la masa experimental y teórica, y las
propiedades reportadas anteriormente en la literatura.
PROTEÓMICA
399
Figura 20.10. Proteómica comparativa. El esquema resume los pasos principales que permiten
la comparación de la expresión de proteínas en dos condiciones biológicas y la
consecuente identificación de los cambios.
3. Interacción de Proteínas. En los últimos años ha quedado evidenciada la
importancia de identificar las interacciones entre proteínas y de proteínas
con otras moléculas. En varias publicaciones se han reportado los resultados
de aislamiento de complejos de proteínas y la posterior identificación de las
proteínas componentes. Estos resultados contribuyen significativamente al
establecimiento de mapas de interacciones y al esclarecimiento del mecanismo
de determinadas funciones biológicas.
Es posible predecir que las herramientas que se emplean en proteómica se irán
perfeccionando e incluso aparecerán nuevos procedimientos y equipos que
solucionarán las principales limitaciones actuales. Sin lugar a dudas la proteómica
fortalecerá su posición actual en las investigaciones médicas, farmacéuticas,
agrícolas y en otros campos y se multiplicarán sus aplicaciones.
400
CAPÍTULO 20
REFERENCIAS
1. Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan
MW, Harris R, Williams KL, Humphery-Smith I. Progress with gene-product mapping of
Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 1995, 16:1090-1094.
2. Humphery-Smith I, Cordwell SJ, Blackstock WP. Proteome research: Complementarity and
limitations with respect to the RNA and DNA worlds. Electrophoresis I, 1997, 18, 12171242.
3. Kettman JR, Coleclough C, Frey JR, Lefkovits I. Clonal proteomics: One gene-family of
proteins. Proteomics 2002, 2, 624-631.
4. 2D Gel electrophoresis tutorial. http://www.aber.ac.uk/~mpgwww/Proteome/Tut_2D.html
5. Protocols for sample preparation and 2D-PAGE. http://www.abdn.ac.uk/~mmb023/
protocol.htm
6. Technical information on 2D-PAGE. http://expasy.hcuge.ch/ch2d/technical-info.html
7. Gorg A, Obermaier GB, Boguth G, Harder A, Scheibe B, Wildgruber R, Weiss W. The current
state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis
2000, 21, 1037-1053.
8. Westermeier R, Naven T (Editors). Proteomics in practice. Willey-VCH Verlag, Weinheim
2002.
9. Link AJ (Editor). Methods in Molecular Biology, Vol 112: 2D proteomics analysis protocols.
Humana Press, New Jersey, 1999.
10. Klose J. Protein mapping by combined isolectric focusing and electrophoresis of mouse
tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik
1975, 26, 211-234.
11. O’Farrell, P H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem.
1975, 250, 4007-4021.
12. Gonzalez LJ, Castellanos-Serra L, Badock V, Diaz M, Moro A, Perea S, Santos A, Paz-Lago
D, Otto A, Muller EC, Kostka S, Wittman-Liebold B, Padron G. Identification of nuclear
proteins of small cell lung cancer cell line H82: An improved procedure for the analysis of
silver-stained proteins. Electrophoresis 2003, 24, 237-252.
13. Corthals GL. Exploitation of specific properties of trifluoroethanol for extraction and
separation of membrane proteins. Presented at the Proteomics forum 2003, September
2003, Munich, Germany.
14. Castellanos-Serra L and Paz-Lago D. The inhibition of unwanted proteolysis during sample
preparation. Its evaluation in challenge experiments. Electrophoresis 2002, 23, 1745, 1753.
15. Klose J, Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: An update protocols and
implications for functional analysis of the genome. Electrophoresis 1995, 16, 1034-1059.
16. Gauss C, Kalkum M, Lowe M, Lehrach H, Klose J. Analysis of the mouse proteome. (I)
Brain proteins: Separation by two-dimensional electrophoresis and identification by mass
spectrometry and genetic variation. Electrophoresis 1999, 20, 575-600.
PROTEÓMICA
401
17. Corthals GL, Wasinger VC, Hochstrasser DF, Sanchez JC. The dynamic range of proteins
expression: A challenge for proteomic research. Electrophoresis 2000, 21, 1104-1115.
18. Anderson NL and Anderson NG. The human plasma proteome. Molecular and Cellular
Proteomics 2002, 1, 845-867.
19. Pieper R, Gatlin CL, Makusky AJ, Russo PS, Schatz CR, Miller SS, Su Q, McGrath AM,
Estock MA, Parmar PP, Zhao M, Huang ST, Zhou J, Wang F, Esquer-Blasco R, Anderson
NL, Taylor J, Steiner S. The human serum proteomic display of nearly 3700
chromathographically separated protein spots on two-dimensional electrophoresis gel and
identification of 325 distinct proteins. Proteomics 2003, 7, 1345-1364.
20. Graham JM and Rickwood D (Editors). Subcellular fractionation: A practical Approach.
Oxford University Press 1997, New York.
21. Molloy MP, Herbert BR, Walsh BJ, Tyler MI, Traini M, Sanchez JC, Hochstrasser, DF,
Willians KL, Gooley AA. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for
separating using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 1998, 19, 837-844.
22. Schagger H and Von Jagow G. Tricine-Sodium Dodecyl Sulphate gel electrophoresis for the
separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 1987:166,
368-379.
23. Opiteck, G, J and Jorgenson, J, W Two-dimensional SEC/RPLC coupled to mass spectrometry
for the analysis of peptides, Anal.Chem., 1997,69(13), 2283-2291
24. Raida M, Schulz-Knappe P, Heine G, Forssmann WG. Liquid chromatography and
electrospray mass spectrometric mapping of peptides from human plasma filtrate, J Am Soc
Mass Spectrom. 1999, 10(1), 45-54.
25. Washburn MP, Wolters D, Yates JR 3rd. Large-scale analysis of the yeast proteome by
multidimensional protein identification technology, Nat Biotechnol. 2001, 19(3), 242-247.
26. Wolters DA, Washburn MP, Yates JR 3rd. An automated multidimensional protein
identification technology for shotgun proteomics, Anal. Chem. 2001, 73(23), 5683-5690.
27. Davis MT, Beierle J, Bures ET, McGinley MD, Mort J, Robinson JH, Spahr CS, Yu W,
Luethy R and Patterson SD. Automated LC–LC–MS–MS platform using binary ion-exchange
and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses,
J.Choromatogr.B Biomed .Sci. Appl. 2001, 752(2), 281-291.
28. Pang JX, Ginanni N, Dongre AR, Hefta SA, Opitek GJ. Biomarker discovery in urine by
proteomics, J.Proteome Res. 2002, 1(2), 161-169.
29. Bushey,M,M and Jorgenson,J,W. Automated instrumentation for comprehensive twodimensional high-performance liquid chromatography of proteins, Anal Chem. 1990, 62(2),
161-167.
30. Anderson, L, and Porath J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+)
affinity chromatography, Anal. Biochem. 1986, 154(1), 250-254
31. Li, S and Dass, C. Iron(III)-immobilized metal ion affinity chromatography and mass
spectrometry for the purification and characterization of synthetic phosphopeptides, Anal.
Biochem. 1999, 270(1), 9-14
32. Ficarro SB, McCleland ML, Stukenberg PT, Burke DJ, Ross MM, Shabanowitz J, Hunt DF,
White FM. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to
Saccharomyces cerevisiae, Nat. Biotechnol. 2002, 20(3), 301-305
402
CAPÍTULO 20
33. JiJ, A. Chakraborty, M. Geng, X, Zhang, A. Amini, M.Bina and F.Regnier. Strategy for
qualitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides, J. Chromatogr.
2000, 745(1), 197-210.
34. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., and Aebersold, R Quantitative
analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags., Nat. Biotechnol.
1999, 17(10), 994–999.
35. Gevaert K, Van Damme J, Goethals M, Thomas GR, Hoorelbeke B, Demol H, Martens L,
Puype M, Staes A, Vandekerckhove J. Chromatographic Isolation of Methionine-containing
Peptides for Gel-free Proteome Analysis: Identification Of More Than 800 Escherichia Coli
Proteins. Mol .Cell Proteomics. 2002,1(11), 896-903.
36 .M. Barber, R. S. Bordoli, R. D. Sedgwick and A. N. Tyler. Fast Atom Bombardment: A New
Ion Source for Mass Spectrometry, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1981, 325.
37. Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM, Electrospray ionization for mass
spectrometry of large biomoléculas, Science. 1989, 246(4926), 64-71.
38. Tanaka K, Waki H, Ido Y, Akita S, Yoshida Y and Yoshida T. Protein and polymer analysis
of up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun.
Mass Spectrom., 1988, 2, 151–153.
39. Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses
exceeding 10,000 daltons, Anal Chem. 1988, 60(20):2299-301.
40. Whitehouse CM, Dreyer RN, Yamashita M, Fenn JB., Electrospray interface for liquid
chromatographs and mass spectrometers. Anal Chem. 1985, 57(3), 675-9
41. Hayes, R. N.; Gross, M. L. Collision-induced dissociation, Methods Enzymol. 1990,193,
237.
42. Biemann, K. Contributions of mass spectrometry to peptide and protein structure, Biomed
Environm. Mass Spectrom. 1988, 16, 99-111.
43. Roepstorff, P.; Fohlman, J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass
spectra of peptides, Biomed. Mass Spectrom. 1984,11(11), 601.
44. Medzihradszky KF, Campbell JM, Baldwin MA, Falick AM, Juhasz P, Vestal ML, Burlingame
AL. The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance
MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer, Anal Chem., 2000, 72(3), 552-8.
45. Yergey AL, Coorssen JR, Backlund PS Jr, Blank PS, Humphrey GA, Zimmerberg J, Campbell
JM, Vestal ML. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF., J Am Soc Mass
Spectrom. 2002, 13(7):784-91.
46. Adams, J.; Gross, M. L. Energy requirement for remote charge site ion decompositions and
structural information from collisional activation of alkali metal cationized fatty alcohols, J.
Am. Chem. Soc. 1986, 108(22), 6915.
47. Clauser KR, Baker P, Burlingame AL. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in
protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal
Chem. 1999, 71(14):2871-82.
48. Wool A, Smilansky Z. Precalibration of matrix-assisted laser desorption/ionization-time of
flight spectra for peptide mass fingerprinting. Proteomics. 2002, 2(10):1365-73.
PROTEÓMICA
403
49. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein
identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis,
1999, 20(18), 3551-3567.
50. Zhang, W., Chait, B.T. ProFound: an expert system for protein identification using mass
spectrometric peptide mapping information, Anal. Chem., 2000, 72(11), 2482-2489.
51. Mann, M.; Hojrup, P.; Roepstorff, P. Use of mass spectrometric molecular weight information
to identify proteins in sequence databases, Biol. Mass Spectrom. 1993, 22(6), 338.
52. Gevaert, K.; Verschelde, J.; Puype, M.; Van Damme, J.; Goethals, M.; De Boeck, S.;
Vandekerhove, J. Structural analysis and identification of gel-purified proteins, available in
the femtomole range, using a novel computer program for peptide sequence assignment, by
matrix-assisted laser desorption ionization-reflectron time-of-flight-mass spectrometry,
Electrophoresis. 1996, 17(5), 918.
53. Mann, M and Wilm, M. Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by
peptide sequence tags. Anal Chem. 1994, 66(24), 4390-4399.
54. Ducret A, Van Oostveen I, Eng JK, Yates JR 3rd, Aebersold R. High throughput protein
characterization by automated reverse-phase chromatography/electrospray tandem mass
spectrometry. Protein Sci. 1998, 7(3):706-19.
55. Gatlin CL, Eng JK, Cross ST, Detter JC, Yates JR 3rd. Automated identification of amino
acid sequence variations in proteins by HPLC/microspray tandem mass spectrometry. Anal
Chem. 2000, 72(4):757-63.
56. Mackey AJ, Haystead TA, Pearson WR., Getting more from less: algorithms for rapid
protein identification with multiple short peptide sequences. Mol Cell Proteomics. 2002,
1(2):139-47.
57. Schevchenko, A., Sunyaev, S., Loboda, A., Schevchenko, A., Bork, P., Ens W., Standing K. G.
Charting the proteomes of organisms with unsequenced genomes by MALDI-quadrupole
time-of-flight mass spectrometry and BLAST homology searching, Anal. Chem. 2001, 73(9),
11917-1926.
58. Liska, A. J., Schevchenko, A. Expanding the organismal scope of proteomics: cross-species
protein identification by mass spectrometry and its implications. Proteomics. 2003, 3(1),
19-28.
59. Sunyaev, S., Liska, A. J., Golod, A., Schevchenko, A., Schevchenko, A. MultiTag: multiple
error-tolerant sequence tag search for the sequence-similarity identification of proteins by
mass spectrometry, Anal. Chem. 2003, 75(6), 1307-1315.