Melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris

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FACULTAD DE BIOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL Y CIENCIAS DE LA SALUD
ÁREA DE FISIOLOGÍA
Melatonina en el tracto gastrointestinal de
la trucha arco iris: regulación y papel
fisiológico
TESIS DOCTORAL
José Luis Muñoz Pérez
Universidad de Vigo
2011
Dr..JESÚS M. MÍGUEZ MIRAMONTES, Profesor Titular de Fisiología en
el' Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la
Universidad de Vigo, y el Dr. MARCOS A. LÓPEZ PATIÑO Investigador
del Programa Isidro Parga Pondal, en el Departamento de Biología Funcional
y Ciencias de la Salud de la Universidad de Vigo,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria titulada "Melatonina en el tracto gastrointestinal de
la trucha arco iris: regulación y papel fisiológico" presentada por D. José
Luis Muñoz Pérez para optar al grado de Doctor, ha sido realizada bajo
nuestra dirección y que hallándose concluida autorizamos su presentación
para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente.
y para que así conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente en
Vigo, a 30 de Junio de 2011.
Dr. Jesús M. Míguez Miramontes
Dr. Marcos A. López Patiño
Financiación
La presente Tesis Doctoral ha sido realizada en el Departamento de Biología
Funcional y Ciencias de la Salud de la Facultad de Biología de la Universidad de Vigo,
bajo la dirección de los Doctores Jesús Manuel Míguez Miramontes y Marcos Antonio
López Patiño. La investigación desarrollada en esta Tesis, es parte del proyecto financiado
por el Ministerio de Educación y Ciencia (AGL2007-65744-C03-01) a cargo del Dr. J.M.
Míguez. La realización de la presente Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la obtención
de la Beca para doctorado “Gestión Propia” de la Comisión Nacional de Investigación
Científica y Tecnológica (CONICYT), del Gobierno de Chile, a cargo de José Luis Muñoz
Pérez.
Agradecimientos
Dar las gracias a mis directores, con los cuales siempre he contado,
al Dr. Jesús Miguez y al Dr. Marcos López, por apoyo constante, no solo en lo
académico sino que también en lo personal. Debo agradecer a la Dr. Rosa
Álvarez, y al Dr. José L. Soengas, con los cuales compartí y recibí una gran
ayuda siempre.
Mis grandes amigos y compañeros de laboratorio, Adrián, Rosi,
Arnau, Sergio, Manuel, Ariel, Marta C., cada uno de ustedes de forma distinta,
me apoyó en el día a día del laboratorio. Muchísimas gracias ….. En la última
parte de la Tesis llegaron nuevos amigos y compañeros como Marta L. y Juan a
los que agradezco el apoyo en el final de la Tesis.
Fue una gran experiencia realizar una estancia de investigación en
el laboratorio de la Dra. María Jesús Delgado. Muchas gracias por considerarme
uno más. En especial agradecer a los Drs. María Jesús, Angel Luis, y Esther; a
Laura, Ana, Elena, Clara, Yurena, y Andrea.
Debo agradecer a mi familia en Galicia: Ana, Francisco, Héctor,
Antia, Ninoska, Mónica, Horacio, Helen, Alberto. Siempre apoyándome y
haciéndome sentir en casa.
Dar las gracias a mis amigos, en especial a Consuelo, Sara, Jorge,
Mateus, Vagelis, Fiona, Cristian, Francisco, Sabine, Rebeca, Graciela, Vicky,
Adie, Marcelo, Manolo, Linda, Iris, Rosina. Tuve la suerte de conocerlos y
compartir con ustedes. Estos últimos dos años conocí a tres amigos, Talia,
Corrado y Aída. Muchas gracias por vuestro apoyo y por ser parte de la “piña”.
Agradecer la ayuda de parte del laboratorio de Biología Celular, en
especial a Juan, así como al laboratorio del Dr. Mallo en especial a Eva y Marina
por su ayuda en la realización del western blot. Agradecer también la ayuda del
laboratorio del Dr. Durán, específicamente a Rosa.
A mis amigos de los grupos de investigación en Fisiología Animal de
la Pontificia Universidad Católica de Chile y de la Universidad Católica de la
Ssma. Concepción, los cuales siempre me apoyaron, en especial al Dr. Francisco
Bozinovic y al Dr. Patricio Camus.
Agradecer a las personas de la Comisión Nacional de Investigación
Científica y Tecnológica de Chile, con los cuales siempre conté de forma muy
diligente, en especial agradecer a Carol Armando y Lucia Montero.
Finalmente, dedicar esta tesis a mi familia por estar siempre
apoyándome y estar en las buenas y en las malas junto a mí, para ellos está
dedicada esta Tesis.
Gracias a toda la gente que de una u otra manera me han ayudado
a realizar esta Tesis Doctoral.
Abreviaturas
5HIAA
Ácido 5-hidroxindolacético
5HT
5-hidroxitriptamina (serotonina)
5HT-ir
Inmunoreactividad frente a 5HT
5HTOL
5-hidroxitriptofol
5HTP
5-hidroxitriptófano
5MIAA
Ácido-5-metoxindolacético
5MT
5-metoxitriptamina
5MTOL
5-metoxitriptofol
AAAD
aminoácido aromático descarboxilasa
AANAT
Arilalquilamina N-acetiltransferasa
ACh
Acetilcolina
ADN
Ácido desoxirribonucléico
ADNc
ADN complementario
AMP
Adenosín monofosfato
AMPc
AMP cíclico
ARN
Ácido ribonucléico
ARNm
ARN mensajero
ATP
Adenosín trifosfato
CCK
Colecistoquinina
CMM
Complejos motores mioeléctricos
CT
Tiempo circadiano
EC
Célula enterocromafin
ELISA
Ensayo Inmunoenzimático
DD
Oscuridad constante
DMSO
Dimetil sulfóxido
GABA
Ácido -aminobutírico
GDP
Guanosín difosfato
GH
Hormona de crecimiento
GMP
Guanosín monofosfato
GnRH
Hormona liberadora de gonadotropina
GTP
Guanosín trifosfato
Hr
Receptor de histamina
HCL
Acido clorihídrico
HIOMT
Hidroxindol-O-metiltransferasa
HPLC
Cromatografía líquida de alta resolución
HPLC-DF
Cromatografía líquida de alta resolución con detección fluorimétrica
IA
Intestino anterior
ICC
Célula intersticial de Cajal
Abreviaturas
IM
Intestino medio
IP
Intestino posterior
i.p.
Intraperitoneal
L-Ala
L-Alanina
LD
Ciclo Luz-oscuridad
L-Trp
L-Triptófano
MAO
Monoamino oxidasa
MT
Receptor de melatonina (1,2,3)
MCH
Hormona concentradora de melanina
MSH
Hormona estimuladora de melanocitos
NA
Noradrenalina
NAS
N-acetilserotonina
NO
Óxido nítrico
NSQ
Núcleo supraquiasmático
qRT-PCR
Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real
PACAP
Polipèptido activador de adenilato ciclasa hipofisiaria
PBS
Tampón fosfato salino
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PKA
Proteína quinasa A
PHI
Péptido histidina isoleucina
RIA
Radioinmunoensayo
SBP
Serotonin-binding protein
SERT
Proteína transportadora de serotonina
TGI
Tracto gastrointestinal
TP
Tampón fosfato
TPH
Triptófano hidroxilasa
VIP
Péptido intestinal vasoactivo
ZT
Tiempo zeitgeber
Índice
Introducción
1. El tracto gastrointestinal (TGI)
1.1. Anatomía funcional: aspectos generales
1.2. El tracto gastrointestinal en peces
1.3. Motilidad del TGI de los peces
1.4. Regulación nerviosa y hormonal de la motilidad gastrointestinal.
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3
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9
2. La melatonina y los ritmos biológicos
2.1. Fuentes y Biosíntesis de la melatonina
2.2 Cuantificación de los niveles de melatonina
2.3 Ritmicidad de la síntesis de melatonina: el papel de la luz ambiental.
2.4 La melatonina como componente del sistema circadiano.
2.5. Ambiente no lumínico y síntesis de melatonina
2.6. Funciones de la melatonina
3. La melatonina en el tracto gastrointestinal
3.1. Relaciones serotonina-melatonina
3.2. La serotonina: Aspectos básicos de su metabolismo y regulación
3.3. La serotonina intestinal: localización, regulación e implicaciones
fisiológicas
3.4. La melatonina en el TGI: presencia, origen y distribución
3.5. Regulación de la síntesis de melatonina gastrointestinal
3.6. Papel fisiológico de la melatonina en el TGI
3.7. La melatonina en el sistema hepatobiliar
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4. La trucha arco iris como modelo de pez teleósteo
44
Objetivos
49
Trabajos Experimentales
Trabajo Experimental 1:
Determinación de melatonina en plasma, bilis y tejidos del tracto
intestinal de la trucha arco iris, mediante un método de HPLC con
detección fluorimétrica………………………………………………
55
Trabajo Experimental 2:
Caracterización de la síntesis de melatonina en el tracto
gastrointestinal de la trucha arco iris: niveles, expresión génica,
relación con serotonina e inmunolocalización………………………
67
Trabajo Experimental 3:
Producción rítmica de melatonina en el tracto gastrointestinal de la
trucha arco iris: influencia del fotoperíodo y de la alimentación…….....
91
Trabajo Experimental 4:
Efecto de la ingesta y del paso de alimento por el tracto digestivo
sobre la síntesis local de melatonina en la trucha arco iris……………
109
Índice
Trabajo experimental 5:
Efecto modulatorio del L-triptófano sobre la síntesis de melatonina en
el tracto gastrointestinal de la trucha arco iris………………………….
123
Trabajo experimental 6:
Profundización en la relación entre serotonina y melatonina en el TGI
de la trucha arco iris: estudio in vitro del efecto de L- triptófano y de
fármacos que modulan los niveles de 5HT sobre la síntesis de
melatonina………………………………………………………………
143
Trabajo Experimental 7:
Regulación por melatonina de la contractibilidad intestinal en la trucha
arco iris (Oncorhynchus mykiss). Posible interacción con los sistemas
colinérgico y serotoninérgico……………………….…………………..
158
Discusión
Caracterización de los niveles y de la síntesis de melatonina en el tracto
gastrointestinal (TGI) de la trucha arco iris…………………………………
Regulación de la producción diaria de melatonina intestinal por el
fotoperiodo y el alimento……………………………………………………
Efecto de la administración de L-triptófano sobre la síntesis de melatonina
a nivel gastrointestinal. Relación entre síntesis de serotonina y de
melatonina.………………………………………………………………...
Estudio de la función de la melatonina en la contractibilidad intestinal.........
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185
193
199
Conclusiones
209
Bibliografía
213
Introducción
Introducción
1. EL TRACTO GASTROINTESTINAL (TGI)
Los sistemas digestivos cumplen un papel esencial en la provisión de nutrientes
mediante la digestión y absorción de alimentos. Además, eliminan los productos tóxicos y
no digeribles. El sistema digestivo más primitivo es la membrana plasmática de los
organismos unicelulares, la cual engloba las partículas microscópicas de alimento mediante
endocitosis, y en el interior celular son digeridas mediante enzimas digestivas. En cambio,
los organismos multicelulares han desarrollado verdaderos sistemas digestivos basados en
la digestión extracelular. En los vertebrados, muchas de las características de los sistemas
digestivos son comunes a la mayor parte de los grupos (Figura 1).
1.1. Anatomía funcional: aspectos generales
Morfológicamente, el TGI de los vertebrados consta de cuatro segmentos bien
diferenciados:
a) Tracto cefálico: Es la región craneal del tubo digestivo y la vía de entrada del
alimento. Está constituido por órganos y estructuras especializados en la captura y
deglución del alimento, como las piezas y cavidad bucales, la faringe, así como
estructuras asociadas (pico, lengua y glándulas salivales). En los peces y anfibios esta
zona también incluye la cavidad branquial (Horn 1998; Clements y Raubenheimer,
2005).
b) Tracto anterior: Constituido básicamente por el esófago, el cual conduce mediante
movimientos peristálticos el bolo o masa de alimento masticado y mezclado con la
saliva desde la cavidad bucal o faringe hasta las áreas digestivas, normalmente el
estómago.
c) Tracto medio: Formado por el estómago (salvo algunos peces y larvas de anfibios,
(Harder 1975; Kapoor et al., 1975) el intestino anterior y el intestino medio, así como
las glándulas anexas (hígado y páncreas). En esta región se produce la digestión
química y la absorción de proteínas, grasas y carbohidratos.
d) Tracto posterior: Lo constituye el intestino grueso, que almacena los restos no
digeridos de alimento y recicla iones inorgánicos y el exceso de agua mediante su
absorción, para reincorporarlos a la circulación. En algunos grupos de vertebrados
(reptiles, aves y la mayoría de mamíferos herbívoros) es el principal lugar de
digestión bacteriana (Stevens y Hume, 1995).
La conformación histológica típica del TGI distingue cuatro capas bien
diferenciadas: mucosa, submucosa, capa muscular y serosa. En la mucosa se localizan las
células epiteliales (absortivas, mucosecretoras y endocrinas), la lámina propia, constituida
por tejido conectivo y vascular sobre el que descansan las células de la mucosa, el estrato
granuloso (tejido glandular) y, a veces, una fina capa muscular, la muscularis mucosae,
que puede contener fibras musculares estriadas, lisas o ambas. La submucosa consta de
1
Introducción
tejido conjuntivo laxo con colágeno y láminas de elastina y puede contener glándulas
submucosas. La capa muscular está constituida por dos capas, una circular más interna y
otra longitudinal que recubre a la primera. Ambas contienen de forma típica células
musculares lisas. Finalmente, la serosa está constituida fundamentalmente por tejido
conjuntivo laxo y denso.
Figura 1. Morfología del tracto gastrointestinal en los diferentes grupos de vertebrados:
variación de formas, longitud y complejidad (Modificado de Moyes y Schulte, 2006).
Los procesos secretores son muy abundantes a lo largo del TGI, lo que facilita el
procesado del alimento y ayuda a su conversión en formas fácilmente absorbibles. No
obstante, estas secreciones ocurren de forma diferencial a lo largo del TGI. Por ejemplo, en
el estómago se secretan enzimas (fundamentalmente pepsinógeno) que inician la digestión
de las proteínas, así como HCl que proporciona la acidez adecuada para que estas enzimas
ejerzan su acción catalítica (Randall et al., 2002). Al final del estómago se encuentra el
esfínter pilórico, que se relaja permitiendo el paso del contenido ácido del estómago al
segmento inicial del intestino delgado (Moyes y Schulte, 2006), donde el fluido procedente
del estómago recibe las secreciones del hígado y el páncreas, glándulas originadas a partir
del intestino medio embrionario (Barrington, 1957). Mientras que el sistema hepatobiliar
(hígado y vesícula biliar) secreta la bilis (con función emulsionante esencial para la
2
Introducción
digestión de los lípidos), en el páncreas se secretan enzimas digestivas que degradan
carbohidratos, grasas y proteínas. Todas estas secreciones se encuentran bajo control de
numerosos factores neuroendocrinos que, en la mayoría de los casos, se activan como
consecuencia de la presencia de alimento en el tracto digestivo.
Existe una densa inervación del tracto digestivo por neuronas que se integran en su
pared. Así, el plexo submucoso es una extensa red neuronal situada en la capa submucosa,
mientras que el plexo mientérico se localiza entre las capas circular y longitudinal del
músculo liso. Junto con el resto de neuronas e interneuronas del TGI, ambos plexos
intraparietales conforman el sistema nervioso entérico que contribuye a la integración de
las actividades motoras y secretoras del tracto (Olsson y Holmgren, 2001). Asimismo, las
abundantes células endocrinas que se distribuyen a lo largo del TGI contribuyen mediante
sus secreciones hormonales a la regulación intrínseca de las funciones digestivas. No
obstante, muchas hormonas que son liberadas por células externas a este sistema y por
neuronas cuyos cuerpos celulares se hallan fuera del aparato digestivo (forman parte de los
sistemas simpático y parasimpático), contribuyen de forma decisiva a dicha regulación.
1.2. El tracto gastrointestinal en peces
Tal y como ocurre en el resto de vertebrados, el TGI de los peces consiste en un tubo
muscular revestido por una membrana mucosa, cuya estructura y función varía a lo largo
del mismo. Existen además grandes diferencias entre los tractos digestivos de peces
herbívoros y carnívoros, así como de agua dulce y marinos. Por otro lado, en los peces el
TGI (Figura 2) y sus órganos asociados (hígado con vesícula biliar y páncreas) no solo
desempeñan funciones relacionadas con la digestión de alimento, sino que también
participan en la osmorregulación, inmunidad, regulación endocrina y eliminación de
contaminantes ambientales y metabólicos (Stevens y Hume, 1995). Veamos brevemente
las características más llamativas de cada una de las regiones del tubo digestivo de los
peces:
Figura 2. Esquema del tracto gastrointestinal de la trucha arco iris. Cada área representa las
diferentes regiones: E, esófago; S, estómago; CP, ciegos pilóricos; IA, intestino anterior; H, hígado;
IM, intestino medio; IP, intestino posterior.
3
Introducción
Esófago
El esófago de los peces es generalmente corto, ancho y recto. Destaca la presencia
de fibras estriadas en ambas capas de musculatura, circular y longitudinal, frente a lo que
ocurre en la mayor parte del tubo digestivo, con fibras lisas (Rust, 2002). El revestimiento
de fibras estriadas confiere al esófago una gran elasticidad. También destaca la presencia
de células secretoras de moco que lubrican el alimento facilitando su paso al estómago
(Evans y Claiborne, 2006). La parte distal del esófago puede además presentar glándulas
secretoras de pepsinógeno y ácido clorhídrico (Kapoor y Khawna, 1993).
Estómago
El estómago de los peces posee una gran variedad de formas, si bien predomina el
tipo sigmoideo o en forma de ―U‖. Se divide en una zona anterior o cardial y una zona
posterior o pilórica (Halver y Hardy, 2002), ambas delimitadas por esfínteres (cardias y
píloro; Halver, 1986). La conformación histológica presenta las cuatro capas (mucosa,
submucosa, muscular y serosa) típicas de los mamíferos (Figura 3.1). La característica más
llamativa del estómago de los peces es la presencia de un único tipo de células oxínticas,
productoras de pepsinógeno y HCl (Mattison y Holstein, 1980; Einarsson y Davies 1996).
Además, la muscularis mucosae, localizada entre la mucosa y la submucosa, presenta
fibras lisas y estriadas (zona anterior del estómago, Hibiya, 1982), siendo estas últimas de
contracción voluntaria, lo que confiere al animal la capacidad de retener, regurgitar o
rechazar el alimento (Halver y Hardy, 2002).
Al igual que en el resto de vertebrados, en el estómago de los peces se inicia la
descomposición del alimento mediante la rotura mecánica producida por la contracción
muscular y las secreciones de enzimas y jugos gástricos (Evans y Claiborne, 2006). Dentro
del estómago existen dos tipos de células características: las columnares y las oxínticas.
Las primeras se encuentran en la superficie del estómago y su función es la secreción de
moco (Wilson y Castro, 2011), mientras que las células oxínticas secretan pepsinógeno y
ácido clorhídrico, a diferencia de los mamíferos en los que estas secreciones se producen
en tipos celulares diferentes (Barrington, 1957; Hirschowitz, 1957; Smit, 1968).
Al final del estómago, el esfínter pilórico controla el vaciado del contenido gástrico
al intestino para su posterior procesado. Su apertura y cierre determinan los tiempos de
vaciado gástrico (Halver y Hardy, 2002) y de contacto del alimento con los jugos gástricos,
así como la acidez del quimo gástrico mediante las secreciones pancreáticas y de la
vesícula biliar, ricas en sodio, bicarbonato y enzimas digestivas neutras. Así, el pH es 2-5
en el estómago, siendo 7-8 al comienzo de los ciegos pilóricos (Halver y Hardy, 2002).
Ciegos pilóricos
Son divertículos o apéndices tubulares cuyo número varía dependiendo de la
especie, aunque su presencia no depende de la dieta o la longitud del intestino (Ahearn et
4
Introducción
al., 1992). Se sitúan entre el final de la porción pilórica del estómago y la parte proximal
del intestino anterior de los peces, pudiendo llegar a constituir la mayor parte de la
superficie post-gástrica total (Buddington y Diamond, 1987). A nivel histológico, los
ciegos pilóricos son una extensión del intestino medio y la característica más llamativa con
respecto al patrón típico de vertebrados es la ausencia de la pared muscular (Hibiya, 1982),
que sí aparece en el intestino (Figura 3.2).
En los ciegos pilóricos se realizan la digestión enzimática, la absorción de
nutrientes (mediante los enterocitos y sus microvellosidades), el almacenamiento y la
fermentación, gracias a la secreción de moco, enzimas digestivas y hormonas.
Intestino anterior y medio
En aquellas especies de peces dotadas de estómago, el intestino anterior se localiza
inmediatamente después del píloro y está estrechamente relacionado con los ciegos
pilóricos. A nivel histológico se diferencia una parte anterior, cuyo epitelio de
revestimiento es de tipo columnar y otra posterior, con predominio de células productoras
de moco (Smith, 1989). Existen diferencias dependiendo del patrón alimenticio de los
peces, siendo más cortos y con musculatura más robusta en los carnívoros.
La mucosa intestinal en los peces (Figura 3.3) sigue un patrón típico de mamíferos,
pero no está tan desarrollada. Destacado la baja cantidad de enterocitos que poseen en su
zona apical los ribetes en cepillo implicados en la absorción y digestión (Yamamoto, 1966;
Ezeasor y Stokoe, 1981), así como de células caliciformes asociadas a estas. Dentro del
intestino medio se hallan células entero-endocrinas presentes en el epitelio de todos los
peces y que, junto con el páncreas, forman el sistema endocrino gastropancreático
(Holmgren y Olsson, 2009). También destaca la presencia de células rodlet en la mayoría
de los peces, cuya función se desconoce (Manera y Dezfuli, 2004; Reite, 2005).
Intestino posterior
Es la parte final del tubo digestivo (Figura 3.4). Presenta un patrón histológico
típico, con un aumento del número de células productoras de moco (caliciformes) en
detrimento de las implicadas en la digestión y absorción. Además, disminuye
drásticamente el número de pliegues y la capa de células epiteliales, de tipo columnar en el
intestino medio, cambia a pseudoestratificada. El intestino posterior cumple funciones
osmorreguladoras en los peces, ya que es aquí donde se realiza el intercambio iónico.
Existe una importante absorción de NaCl y agua desde el lumen (Field, 1993) y del
10-15% de Mg2+ y SO42- (Parmelee y Renfro, 1983), secretándose K+ y HCO3- (Mush et
al., 1990) que serán expulsados.
Páncreas
5
Introducción
En los peces, el páncreas puede localizarse como una estructura definida, o
encontrarse de forma difusa entre el mesenterio adiposo y el hígado, o cerca del conducto
biliar (Smith, 1989). Existen dos tipos de tejido pancreático, endocrino y exocrino. En el
primer caso, existen células α, β, δ y otras de similar forma y función que en los mamíferos
(Halver y Hardy, 2002). Forman agregados glandulares llamados cuerpos de Brockmann
(Hibiya, 1982) que secretan hormonas implicadas en la regulación del metabolismo y la
digestión. En cambio, el páncreas exocrino secreta mayoritariamente enzimas digestivas y
bicarbonato hacia los ciegos pilóricos y el intestino (Einarsson y Davies, 1997).
Figura 3. Cortes transversales de las distintas zonas del TGI de la trucha arco iris (tinción de
hematoxilina) (A) Estómago, (B) Ciegos pilóricos, (C) Intestino medio, (D) Intestino posterior.
Abreviaturas: (S) serosa, (MuE) músculo estriado, (EC) estrato compacto, (SM) submucosa, (M)
mucosa, (L) lumen., (Mu) musculatura lisa. Barra: 500 µm (A, B y D), 100 µm (B). Fotografías
realizadas en colaboración con la Dra. R. Álvarez (Laboratorio de Biología Celular, Universidad de
Vigo)
6
Introducción
Vesícula biliar
La poseen la mayoría de las especies estudiadas (Lagler et al., 1977) y muestra el
patrón histológico típico del TGI de los peces (Hibiya, 1982). Se localiza cerca del hígado
y la zona anterior del intestino medio, vertiendo su contenido a través del conducto biliar al
lumen intestinal. Numerosos mecanismos nerviosos y endocrinos regulan la contracción de
la vesícula biliar y la expulsión de la bilis tras el vaciado gástrico (Lagler et al., 1977;
Smith 1989; Takeda y Takii 1992; Aldman y Homgren 1995). El llenado y el color de la
vesícula biliar determinan el tiempo transcurrido desde su última contracción, ya que un
color verde oscuro indica un largo periodo de ayuno (Gwak et al., 1999).
La bilis se sintetiza en el hígado y contiene una mezcla de compuestos de desecho,
inmunoglobulinas y xenobióticos que se concentran en la vesícula (Smith, 1989). Entre los
constituyentes más importantes se encuentran las sales biliares y la biliverdina/bilirrubina
(Baldisserotto et al., 1990). Las primeras sirven para emulsionar los lípidos en pequeñas
gotas y facilitar su posterior absorción, aunque los pigmentos también pueden colaborar en
esta función (Teshima et al., 1999).
Hígado
El hígado de los peces está formado por dos o más lóbulos y se localiza en la
porción anterior de la cavidad peritoneal, en contacto con el septo transversal. Presenta una
morfología muy similar a la de otros vertebrados, si bien no está separado en lóbulos
discretos o en acinos glandulares (Yasutake y Wales, 1983). Está constituido
mayoritariamente por hepatocitos, los cuales almacenan glucógeno y lípidos, dependiendo
de la dieta, el estado de salud, y del estado energético del pez, así como de la presencia y
concentración de productos tóxicos (Gingerich y Weber, 1979; Hilton y Dixon, 1982;
Tucker et al., 1997; Craig et al., 1999). Para llevar a cabo su importante función
metabólica, el hígado recibe los nutrientes procedentes del TGI a través de la vena porta
hepática. El aporte de oxígeno, en cambio, se consigue a través de la arteria hepática.
1.3. Motilidad del TGI de los peces
La función más importante del TGI es la de optimizar la digestión y la absorción.
Para ello el alimento debe ser expuesto a las enzimas y secreciones digestivas en las
mejores condiciones y el tiempo necesario, lo que se consigue gracias a los procesos
integrados de motilidad digestiva. Estos incluyen movimientos de avance peristáltico del
contenido digestivo en sentido anterógrado y procesos de segmentación que favorecen el
mezclado del contenido luminal con las distintas secreciones que tienen lugar en cada
7
Introducción
tramo. La apertura y cierre controlados de los esfínteres localizados a lo largo del TGI
permiten la compartimentalización de las contracciones.
La motilidad implica la aparición de forma coordinada de las actividades
mioeléctrica y contráctil que se generan y controlan de forma local a través del sistema
nervioso entérico, aunque pueden ser modificadas por señales del sistema nervioso central
o de otras regiones intestinales. Gracias a que todas las células musculares de la pared
digestiva se encuentran interconectadas entre si y embebidas en una matriz extracelular de
elastina y colágeno, la contracción y relajación se produce al unísono, comportándose
como un sincitio. La presencia de sensores en las distintas zonas del TGI permite ejecutar
patrones de motilidad específicos (tragar, vaciado gástrico, peristalsis intestinal, etc.). En
general podemos hablar de patrones de motilidad diferentes según la región del TGI y el
estado digestivo, pudiéndose diferenciar los estados digestivo e interdigestivo.
En el intestino de los vertebrados, en general, la motilidad durante el periodo
digestivo viene marcada por la actividad miogénica intrínseca de las células musculares
lisas que origina un tono espontáneo de contracciones. La actividad intrínseca se basa en la
existencia de un ―ritmo eléctrico básico‖ de ondas lentas de despolarización, cuyo origen
parece estar ligado a la actividad mioelétrica de las células intersticiales de Cajal, (ICCs),
que funcionan como osciladores rítmicos de la pared intestinal (Sanders et al., 2006). En
teleósteos, el ritmo de ondas lentas se ha descrito en diversas especies, tales como el
salmón chinock y el pez cebra, pero no en otras como la trucha arco iris (Manera et al.,
2008). Si bien la presencia de las ICCs no se ha demostrado en el intestino de teleósteos
(Holmberg et al., 2007), en el pez cebra se han identificado dos ortólogos de la proteína cKit, la cual parece necesaria para el funcionamiento de las ICCs (Rich et al., 2007).
De forma asociada a las ondas lentas también se originan potenciales de acción
debido a la activación/inactivación de canales iónicos, lo que se asocia con contracciones
fásicas de la musculatura. La amplitud y frecuencia de dichas contracciones está modulada
por influencias reflejas locales, como el estiramiento del tejido muscular, o la estimulación
química de la mucosa, lo que causa que durante el estado de digestión activa exista una
actividad contráctil intensa que facilita el mezclado y la propulsión del alimento. Además,
el tono contráctil espontáneo puede ser modificado por el tono neurogénico procedente de
la inervación intestinal, así como por el propio tono miogénico característico del músculo
liso intestinal (Rumssen y Thuneberg, 1996; Sanders et al., 2006). El grado de motilidad
también puede ser modificado por reflejos cefálicos como la olfacción, la presencia de
alimento o la actividad anticipatoria del pez (Olsson y Holmgren, 2001).
El patrón de motilidad en periodos interdigestivos se caracteriza por la aparición de
los denominados complejos motores mioeléctricos (CMM). Estos son series de
contracciones que se originan juntas y migran en sentido anteroposterior, facilitando el
vaciado del tubo digestivo. Frente a las diferencias observadas en mamíferos entre
animales carnívoros, en los que las CMMs solo se aprecian en periodos interdigestivos y
8
Introducción
los herbívoros, en los que también se aprecian en el recién alimentado (Wingate, 1981), los
pocos estudios existentes en los peces señalan cierta similitud con el patrón de propagación
descrito en mamíferos (Karila y Holmgren, 1995).
Figura 4. Representación de un ritmo eléctrico básico (REB) intestinal en peces. A)
Oscilaciones en el potencial de las células musculares que ocasionalmente originan potenciales de
acción dependientes de Ca2+ (Adaptado de Bortoff, 1976). B) Estimulación por acetilcolina (ACh)
de la contracción del intestino en la trucha arco iris (Modificado de Aronsson y Holmgren, 2000).
1.4. Regulación nerviosa y hormonal de la motilidad gastrointestinal
Inervación
En condiciones de reposo la pared digestiva presenta una tensión contráctil o tono
muscular basal que mantiene un diámetro en la luz intestinal. Esta contracción basal
también se regula a través de vías intrínsecas, que incluyen las redes nerviosas del plexo
mientérico (Figura 5) y, en menor medida, del plexo submucoso. Ambos plexos forman el
sistema nervioso entérico, cuyos somas neuronales están localizados dentro de la pared
intestinal. El plexo mientérico de los peces alberga la mayor parte de los somas neuronales
(Kunze y Furness, 1999) que suelen estar distribuidos de una manera bastante homogénea
(Burnstock, 1958; Olsson y Karila, 1995), a diferencia de los mamíferos en los que se
agrupan en microganglios. Las neuronas mientéricas inervan las capas musculares,
actuando como moto- e interneuronas, además de inervar las ICCs (Kunze y Furness,
1999; Sanders et al., 2006). De forma característica en los peces el plexo submucoso está
pobremente desarrollado a diferencia de lo descrito en mamíferos (Burnstock, 1959) e
incluye fundamentalmente motoneuronas (Olsson y Holmgren, 2001).
El funcionamiento del sistema nervioso entérico es independiente del resto del
sistema nervioso y constituye en si mismo un verdadero ―cerebro intestinal‖ que integra
información sensorial y ejecuta patrones motores complejos. Además, la pared digestiva
9
Introducción
recibe inervación extrínseca que tiene un papel importante en la coordinación de la
actividad intestinal y la integración de sensaciones como el apetito, la saciedad y estímulos
dolorosos (Wood et al., 1999). Se ha visto en peces que el estómago y el intestino anterior
reciben inervación vagal, mientras que los nervios espinales (esplácnicos y pélvicos)
inervan el resto del intestino (Burnstock, 1958; Nilsson, 1983). En cambio, en algunas
especies sin estómago el nervio vago inerva la mayoría del intestino (Olsson, 2009).
En la mayor parte de los vertebrados las aferencias vagales son parasimpáticas e
incluyen, sobre todo, fibras sensoriales que transmiten la información desde el estómago y
glándulas anejas hacia el sistema nervioso central. El neurotransmisor implicado en la
inervación parasimpática del TGI es la acetilcolina (ACh) cuyos efectos son excitadores,
aumentando la motilidad y estimulando las secreciones intestinales (Randall et al., 2002).
Por su parte los nervios esplácnicos son eminentemente simpáticos y ejercen influencias
inhibitorias utilizando como neurotransmisor la noradrenalina (NA). El nervio pélvico
integra aferencias tanto simpáticas como parasimpáticas (Olsson, 2011).
Figura 5. Esquema de una sección transversal de la pared intestinal. Como se puede observar
en la figura, el plexo mientérico se encuentra entre ambas capas musculares longitudinal circular.
Neurotransmisores y hormonas
La motilidad intestinal está regulada por múltiples factores como
neurotransmisores, neuropéptidos y hormonas, cuya acción excitadora o inhibidora está
mediada por receptores localizados en los terminales nerviosos y en las células
enteroendocrinas del epitelio intestinal (Hansen, 2003).
10
Introducción
De todos los neurotransmisores implicados en la regulación de la función del TGI,
la ACh es el más estudiado. Además de su acción reguladora de la motilidad
gastrointestinal, también está implicada en el transporte de agua y electrolitos a través de la
mucosa intestinal (Hubel, 1985). En cuanto a la motilidad, la liberación de ACh desde las
aferencias vagales estimula la contracción de la pared intestinal, bien a través de receptores
muscarínicos (subtipos M2 y M3) localizados en las células musculares lisas (Abrams et
al., 2006), o de receptores nicotínicos presentes en las interneuronas de la pared intestinal
(Uchiyama y Chess-Williams, 2004). En los peces, la respuesta contráctil inducida por
ACh se ha descrito en diversas especies como la trucha (Burnstock, 1958), la carpa
(Kitazawa et al., 1990) y el carpín (Velarde et al., 2010b). La presencia de ambos tipos de
receptores colinérgicos es ambigua, aunque se confirmó en el carpín donde parecen mediar
respuestas excitadoras diferentes que implican otros componentes neurogénicos y
miogénicos (Ito y Kuriyama, 1971). En la trucha, Burka et al., (1989) sugieren la
implicación de receptores muscarínicos en la contracción colinérgica, con predominancia
del subtipo M2 con respecto al M1.
Otro neurotransmisor muy importante en el control de la motilidad digestiva es la
serotonina (5HT). A nivel intestinal, en mamíferos esta amina se sintetiza principalmente
en las células enterocromafines del epitelio intestinal y, en menor medida, en interneuronas
entéricas (Gershon y Tack, 2007). No obstante, en diversas especies de peces se ha visto
que las fibras serotoninérgicas son más abundantes que las células endocrinas (Olsson et
al., 2008; Caamaño-Tubio et al., 2007) e incluso estas últimas podrían estar ausentes en
algunas especies, sobre todo de ciclóstomos (Anderson y Campbell, 1988; Olsson et al.,
2008).
Diversos estímulos desencadenados por la ingesta de alimento o por su presencia en
el lumen digestivo (distensión, estimulación vagal, presencia de ácidos y aminoácidos,
etc.) desencadenan la liberación de 5HT desde las células enterocromafines (ECs), la cual
actúa de forma paracrina regulando diversos procesos secretores y de motilidad. También
se conoce la existencia de proyecciones neuronales serotoninérgicas hacia la mucosa
intestinal (Beattie y Smith, 2008). En general en los peces, la 5HT parece estimular la
contracción intestinal (Kiliaan et al., 1989; Kitazawa et al., 1990), si bien también se han
descrito efectos inhibitorios (Kiliaan et al., 1989). Dada la estrecha relación metabólica de
la 5HT con la melatonina, así como su interés específico para la presente Tesis, las
características de la 5HT en el TGI se tratarán en profundidad en los siguientes apartados.
Al margen de los neurotransmisores ya mencionados, existe una amplia variedad de
compuestos implicados en la regulación de la motilidad intestinal en los peces, de forma
similar a lo que se ha descrito en mamíferos. Entre ellos, la histamina destaca como un
neurotransmisor estimulador de la contracción muscular en el TGI, actuando directamente
sobre las células musculares lisas (Manera et al., 2008). En peces se señala que los
receptores que actúan en la contracción son los Hr1 y Hr3 (Peitsaro et al., 2000; Choich et
al., 2004). Dentro de los compuestos que actúan de manera excitadora también se hallan la
11
Introducción
sustancia P, la neurokinina A y la colecistoquinina (CCK). Las dos primeras se han
encontrado en el intestino de distintos grupos de peces y su acción podría ser directa sobre
el músculo liso o indirecta, vía motoneuronas colinérgicas o serotoninérgicas (Jensen,
1997; Karila et al., 1998). La CCK, en cambio, parece actuar especialmente sobre la capa
de musculatura circular. Además de ser una señal de saciedad, parece regular la respuesta
gastrointestinal al alimento, enlenteciendo el vaciado gástrico y regulando la secreción de
enzimas pancreáticas y el movimiento peristáltico (Nelson y Sheridad, 2006).
Por otro lado, en los peces se han identificado diversos péptidos intestinales tales
como el VIP y el PACAP que ejercen una acción inhibidora de la motilidad actuando a
través de receptores, cuya presencia se ha demostrado en diversas especies de teleósteos
(Olsson y Karila, 1995; Olsson et al., 2008; Matsuda et al., 2000). También se ha
identificado el óxido nítrico (producido por la oxidación de la arginina) como un
neurotransmisor importante que media en la relajación de la musculatura lisa en peces
(Green y Campbell, 1994; Holmberg et al., 2006). En base a estudios inmunohistoquímicos
se ha sugerido que la inervación nitrérgica probablemente actuaría inhibiendo la actividad
de las neuronas motoras (Karila et al., 1998). Por último, cabe citar que la adenina y otros
nucleótidos (ATP, ADP, AMP) son capaces de estimular o inhibir la contracción muscular
del TGI, bien a través de la inhibición de la liberación de ACh o de la NA.
2. LA MELATONINA Y LOS RITMOS BIOLÓGICOS
La melatonina fue descubierta en 1917 por McCord y Allen quienes observaron que
cuando se aplicaban extractos de glándula pineal bovina sobre preparaciones de
melanóforos dérmicos de larvas de anuros se producía la agregación de melanina. Sin
embargo, la estructura de la melatonina no se conoció hasta 1958, tras ser aislada por
Aaron Lerner y cols. e identificada como N-acetil-5-metoxitriptamina (Figura 6). La
denominaron melatonina por su capacidad de alterar la coloración de la piel de anfibios.
Estudios posteriores demostraron que la melatonina se produce principalmente en el
órgano pineal (o la glándula pineal en mamíferos), siendo el compuesto 5-metoxindólico
más representativo y con mayor implicación fisiológica de los producidos en esta
estructura endocrina. En 1960, Weissbach y cols., demostraron que su síntesis en la
glándula pineal de roedores tenía lugar a partir de la 5HT en dos pasos metabólicos: una
acetilación seguida de una metilación. Más tarde se postuló que la acetilación de la 5HT en
la glándula pineal es un proceso dinámico que da lugar a la aparición de claros ritmos
diarios tanto en los niveles de 5HT y melatonina (Quay, 1963).
12
Introducción
Figura 6. Estructura química de la melatonina y su disposición en el espacio.
2.1. Fuentes, biosíntesis y metabolización de la melatonina
La melatonina, tal y como ya se ha comentado, se sintetiza principalmente en el
órgano pineal, aunque también se ha descrito su producción en otros tejidos neurales como
la retina de los vertebrados (Gern y Ralph, 1979). Debido a su carácter lipofílico, la
melatonina pineal apenas se acumula en esta estructura, siendo liberada inmediatamente al
torrente sanguíneo, donde se transporta mayormente unida a albúmina (Pardridge y Mietus,
1980). Por ello, en diferentes órdenes de vertebrados se ha demostrado que los ritmos
diarios de melatonina circulante son paralelos a los del órgano pineal (Reiter, 1991).
La síntesis de la melatonina se inicia con la formación de 5HT a partir del
aminoácido esencial L-triptófano (L-Trp), el cual es captado de la circulación. La enzima
aralquilamina N-acetiltransferasa (AANAT, EC 2.3.1.87) transforma la 5HT en
N-acetilserotonina (NAS), siendo éste el paso limitante en la formación de la melatonina.
La NAS es rápidamente transformada en melatonina por acción de la enzima
citoplasmática hidroxindol-O-metiltransferasa (EC 2.1.1.4, HIOMT), la cual también
participa en la producción de diferentes metabolitos 5‘-metilados típicos del órgano pineal,
aunque de todos ellos se conoce poco su significado biológico (Figura 7).
Como ya se ha mencionado, diversos estudios desarrollados en mamíferos han
propuesto la existencia de fuentes tisulares extrapineales de melatonina, como es el caso de
la retina. Entre ellas es particularmente notoria la implicación del tracto gastrointestinal
(Carrillo-Vico et al., 2004). Otras fuentes de melatonina periférica podrían ser el timo
(Naranjo et al., 2007), las células del sistema inmune (Conti et al., 2000; Carrillo-Vico et
al., 2004), la piel (Kobayashi et al., 2005; Slominski et al., 2008) y las gónadas (Tijmes et
al., 1996; Itoh et al., 1997), entre otros.
En todos los vertebrados estudiados, los niveles circulantes de melatonina muestran
un perfil rítmico diario dependiente del fotoperiodo ambiental, de forma que aumentan de
noche y disminuyen durante el día (Binkley, 1988; Ekström y Meissl, 1997). La regulación
lumínica de la síntesis de melatonina en los tejidos productores (principalmente en pineal y
retina) proporciona un patrón rítmico de la hormona en la circulación general que resulta
13
Introducción
clave para entender sus funciones fisiológicas tanto a nivel diario como estacional. Así,
esta ritmicidad determina que la melatonina sea considerada como el transductor de la
información fotoperiódica ambiental al organismo y permite el ajuste temporal de
numerosos procesos rítmicos diarios (ciclos sueño-vigilia, alimentación, cambios de
coloración, etc.) y estacionales (reproducción, hibernación, etc.) (Reiter, 1993).
La melatonina es rápidamente metabolizada, siendo su vida media de 15-30
minutos (Gibbs y Vriend, 1981; Lang et al., 1983; Hernadez-Ronda et al., 2000). Su
degradación se produce mayoritariamente en el hígado, donde es hidroxilada a 6hidroximelatonina (compuesto carente de actividad biológica), la cual es excretada en
forma de conjugados glucurónicos y sulfatados. Además puede darse su metabolización en
el cerebro, mediante la formación de derivados de la quinuramina (Hirata et al., 1974).
TRP
L-Trp
TPOH
TPH
55- HTP
AAAD
55- HIAL
Ald.DH
55- HIAA
MAO
Alc.DH
55- HTOL
5 5HT
HT
AANAT
NAS
HIOMT
55- MIAA
5.MTOL
5.MTOL
55- MT
MEL
55- MTP
MDA
Figura 7. Esquema de la principal ruta de la síntesis de melatonina. L-Trp: L-triptófano;
TPH: triptófano hidroxilasa; 5HTP: 5-hidroxitriptófano; AAAD: aminoácido aromático
descarboxilasa; 5HT: serotonina; AANAT: arilalquilamina N-acetiltransferasa; NAS:
N-acetilserotonina; MAO: monoamino oxidasa; 5HIAL: ácido 5-hidroxindolacético; Ald.DH:
aldehido deshidrogenasa; Alc. DH: alcohol deshidrogenasa; 5HIAA: ácido 5-hidroxindolacetico;
5HTOL: 5-hidroxitriptofol; HIOMT: hidroxindol-O-metiltransferasa; 5MIAA: ácido 5metoxindolacetico; 5MTOL: 5-metoxitriptofol; MEL: melatonina; MDA: melatonina deacetilasa;
5MT: 5-metoxitriptamina; 5MTP: 5-metoxitriptófano.
14
Introducción
2.2. Cuantificación de los niveles de melatonina
La melatonina es una molécula presente en diferentes líquidos corporales (sangre,
saliva, líquido cefalorraquídeo) y en tejidos centrales (órgano pineal, cerebro, retina) y
periféricos (ovario, tracto gastrointestinal, etc.). La cuantificación de melatonina se ha
llevado a cabo por diferentes metodologías, incluyendo en un primer momento los
bioensayos y, posteriormente, diferentes técnicas de RIA, cromatografía de
gases/espectrometría de masas, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),
HPLC/espectrometría de masas y ELISA (ver rev., Harumi y Matsushima, 2000). Algunas
de estas técnicas, en particular las de RIA y HPLC, también han sido de uso frecuente para
determinar la tasa de síntesis de melatonina en tejidos como la retina y el órgano pineal, en
base a la actividad de los enzimas (AANAT, HIOMT) implicados en la ruta metabólica de
formación de melatonina (Bradford-Thomas et al., 1990; Ceinos et al., 2008; Itoh et al.,
1999).
Sin duda, los procedimientos de RIA son los más frecuentes a la hora de cuantificar
los niveles de la hormona, especialmente en plasma, retina y órgano pineal de diferentes
especies de vertebrados (Vaughan, 1983; Vakkuri et al., 1985). La sensibilidad de esta
metodología permitió determinar los niveles basales y las variaciones diarias de esta
hormona en diferentes especies y condiciones experimentales (Binkley, 1993). En tejidos
periféricos, las mediciones se han llevado a cabo mayoritariamente en TGI de mamíferos
(Bubenik et al., 1996; 2000a; Messner et al., 2001), siendo escasas las aplicaciones en
no-mamíferos (Bubenik y Pang, 1997). Sin embargo, la necesidad de usar anticuerpos
específicos (poco disponibles para especies de no-mamíferos) en las técnicas de RIA, así
como el hecho de la utilización de isótopos radioactivos, ha fomentado el desarrollo de las
técnicas de HPLC que, aunque no tan sensibles, suelen ser más versátiles en cuento a su
aplicabilidad y a la posibilidad de implantarlas en muchos laboratorios.
2.3. Ritmicidad de la síntesis de melatonina: papel de la luz ambiental
La ritmicidad en el proceso de síntesis de melatonina es la clave de la aparición del
ritmo diario de los niveles de esta hormona tanto en tejidos productores como en la
circulación sanguínea. Para ello juegan un papel clave las variaciones diarias de las
enzimas responsables de la síntesis de melatonina, cuyo conocimiento deriva
principalmente de estudios realizados a nivel de la glándula pineal y la retina de diferentes
grupos de vertebrados. En el caso de los peces, solo la aplicación de las técnicas modernas
de biología molecular ha permitido obtener algunos datos iniciales en otros tejidos.
Triptófano hidroxilasa (TPH)
15
Introducción
La TPH es una enzima mitocondrial que transforma el aminoácido L-Triptófano
(L-Trp) procedente de la circulación en 5HTP (Lovenberg et al. 1967). En la rata, la
expresión del gen y la actividad enzimática de la TPH en la glándula pineal presenta
variaciones circadianas, con niveles elevados durante el día que aumentan más (2-3 veces)
durante la noche (Ehret et al., 1991). No está claro si la actividad de esta enzima puede ser
modulada por el sustrato, L-Trp, hecho que podría ser importante dadas las fuertes
variaciones diarias en sus niveles circulante (Sugden, 1979). Algunos estudios han
señalado que la administración del aminoácido por vía intraperitoneal (i.p.), o la
incubación de pineales con elevadas concentraciones de L-Trp, inducen cambios en la
síntesis de 5HT pineal, lo cual podría tener consecuencias en los niveles de melatonina
(Ouichou et al., 1992; Yaga et al., 1993). En los peces se conoce muy poco sobre la
regulación y los cambios diarios de la actividad TPH, aunque se han detectado oscilaciones
diarias en la abundancia de su ARNm en la pineal del lucio y del pez cebra, pero no en la
pineal de la trucha (Bégay et al., 1998).
Monoamino oxidasa (MAO)
En los mamíferos se ha detectado actividad MAO en los pinealocitos (MAO tipo A)
y en las terminaciones nerviosas noradrenérgicas (MAO tipo B) pineales. La actividad
MAO presenta variaciones día/noche con los valores más elevados durante el día (King y
Steinlechner, 1985; Masson-Pévet y Pévet, 1989), aunque estos cambios no parecen afectar
a la producción de melatonina.
Arilalquilamina N-acetiltransferasa (AANAT)
La AANAT pertenece a una familia de enzimas que utilizan acetil coenzima A
como donante de acetilos en la acetilación de grupos amino de compuestos aromáticos
(Deguchi, 1992). Las AANATs se han encontrado en bacterias Gram positivas, hongos,
cefalocordados y vertebrados, pero no en plantas o insectos (Klein, 2006). Las formas más
primitivas de las AANATs carecen de determinadas regiones implicadas en la unión de
ligandos y en la actividad catalítica, lo que sugiere implicaciones en funciones diferentes a
la síntesis de melatonina, tales como la detoxificación de aminas (Coon y Klein, 2006).
Klein y Weller (1970) en la rata y Binkley et al., (1978) en el pollo, han demostrado
que la actividad AANAT es el punto crítico de la síntesis de melatonina. Los cambios en la
actividad de este enzima, típicamente con máximos nocturnos, son responsables de las
variaciones diarias de producción de melatonina. De manera similar, en los peces los
trabajos de Falcón et al., (1987) en lucio (Esox lucius) y Zachmann et al., (1992) en
matalote blanco (Catostomus commersoni), demostraron que el ritmo de síntesis de
melatonina es debido al ritmo paralelo en la actividad AANAT.
En roedores, se ha evidenciado un incremento nocturno de la AANAT que depende
a nivel transcripcional, translacional y postranslacional de un mecanismo regulado por el
incremento intracelular en los niveles de AMPc (Klein et al., 1996; Roseboom et al.,
16
Introducción
1996). Estudios de clonación en mamíferos han permitido descifrar la existencia de un solo
transcrito de ARNm de la AANAT (Coon et al., 1995), pero en la actualidad se conocen
secuencias pertenecientes a otros grupos incluyendo aves (Bernard et al., 1997), anfibios
(Isorna et al., 2006) y peces (Coon et al., 1999; Zilberman-Peled et al., 2004; Vuilleumier
et al., 2007; Isorna et al., 2009). En algunas especies de teleósteos como el lucio, el pez
cebra, el rodaballo o la trucha, se conocen al menos dos transcriptos distintos derivados de
la expresión de dos formas alélicas que codifican para la AANAT, conocidas como
AANAT1 y AANAT2 (Bégay et al., 1998; Coon et al., 1998, Vuilleumier et al., 2007;
Appelbaum et al., 2006). Dado que los teleósteos son el grupo de mayor antigüedad en el
árbol evolutivo de los vertebrados (aparecieron hace 250 millones de años), se cree que la
duplicación de la AANAT, así como de otros genes, debió resultar de la duplicación de su
genoma acaecida en el origen de esta línea dentro de vertebrados. Estudios recientes han
señalado que, al menos en algunas especies de peces como perciformes y salmónidos,
pueden existir varios subtipos de la AANAT1 (a y b) (Falcón et al., 2009).
Las dos formas alélicas de la AANAT de los teleósteos presentan importantes
diferencias, tanto en su localización como en su regulación y función. La AANAT1 se
encuentra principalmente en la retina, mientras que la AANAT2 se expresa
mayoritariamente en el órgano pineal (Coon et al., 1999). A nivel de cinética enzimática se
ha demostrado que la AANAT2 tiene preferencia por la 5HT como sustrato y no muestra
inhibición por sustratos o productos. En cambio la AANAT1 acetila, además de
indolaminas, otras arilalkilaminas y es más afín por sus sustratos, cuyo incremento su
concentración inhibe su actividad catalítica (Benyassi et al., 2000; Zilberman-Peled et al.,
2004). Por otro lado, se ha indicado que las dos isoformas de la AANAT podrían realizar
funciones diferentes. Así, la AANAT2 pineal estaría implicada en la producción de
grandes cantidades de melatonina, teniendo un papel endocrino (Falcón et al., 2009),
mientras que AANAT1 de la retina contribuiría a la síntesis local de melatonina pudiendo,
además, realizar funciones detoxificantes (Klein, 2006), o acetilar otros compuestos como
la dopamina (Zilberman-Peled et al. 2006). Velarde et al., (2010a) ha descrito ritmos
diarios de AANAT2 en tejidos centrales (pineal, retina) y periféricos (hígado, intestino) del
carpín, que podrían condicionarse a la existencia de osciladores periféricos localizados en
estos tejidos. Por lo tanto, la expresión génica de las AANATs, al menos en algunas
localizaciones del organismo, podría ser controlada por mecanismos circadianos, los cuales
a su vez ajustarían su oscilación bien a los ciclos ambientales o a los de alimentación.
Hidroxindol-O-metiltransferasa (HIOMT)
En la literatura se describe tanto la regulación diaria como estacional de la actividad
HIOMT pineal. La existencia de un ritmo día/noche es bastante controvertida, dado que
diversos estudios en roedores han observado su ausencia (Quay, 1976; Sugden y Klein,
1985). Trabajos más recientes describen un ritmo diario del ARNm de la HIOMT con
niveles nocturnos que doblan a los diurnos (Ribelayga et al., 1999). Este ritmo parece tener
un origen circadiano, dado que persiste en oscuridad constante y parece responder a la
17
Introducción
estimulación adrenérgica nocturna en la glándula pineal de roedores. La regulación de esta
enzima parece ser diferente a corto y a largo plazo, siendo en este último caso donde es
más sensible a la estimulación por agonistas -adrenérgicos (Ceinos et al., 2004). Estos y
otros estudios han sugerido un papel determinante de la HIOMT en los cambios
estacionales de la amplitud del pico nocturno de melatonina (Ribelayga et al., 2000).
En peces, los pocos estudios existentes señalan que la actividad HIOMT permanece
constante a lo largo de un ciclo de 24 horas (Falcón et al., 1987; Morton y Forbes, 1988),
aunque en algunas especies de salmónidos se han encontrado variaciones en el contenido
proteico de la enzima (Birks y Ewing, 1981). A nivel génico, estudios recientes en
rodaballo (Vuilleumier et al., 2007) señalan que, a diferencia de la AANAT que presenta
dos isoformas, la HIOMT solo presentaría una forma debido a la pérdida de la HIOMT2
durante el linaje ancestral de esta especie. Sin embargo, Velarde et al. (2010a) en el carpín
mostraron la presencia de dos isoformas del gen de la HIOMT y la existencia de ritmos
circadianos de expresión de hiomt2 en pineal y otros tejidos periféricos como el hígado y la
parte distal del intestino, sugiriendo su papel en la síntesis rítmica de melatonina en dichas
localizaciones. Estos autores proponen que, al menos en intestino, los ritmos de hiomt2
están gobernados por un reloj circadiano encarrilado por señales no fóticas.
2.4. La melatonina como componente del sistema circadiano
El sistema circadiano y las funciones rítmicas
El ambiente al que están expuestos los organismos vivos fluctúa cíclicamente
debido a los cambios geofísicos diarios y estacionales existentes en nuestro planeta, lo que
genera fuertes variaciones de parámetros tales como la luz o la temperatura, entre otros.
Este hecho ha supuesto una gran presión sobre los seres vivos que han adoptado
mecanismos que les capacitan para generar una serie de respuestas rítmicas a nivel
fisiológico (temperatura corporal, secreción hormonal, funciones cardiovasculares y
digestivas, ciclos reproductores, cambios de pelaje, etc.) y de comportamiento (ciclo
sueño-vigilia, periodos de actividad-reposo, etc.) que les permite anticiparse a cualquier
variación ambiental.
La rama de la biología que estudia los procesos cíclicos del medio y los ritmos de
los organismos se denomina cronobiología. Los ritmos biológicos se definen en base a una
serie de parámetros cronobiológicos que permiten no solo representar, sino también
cuantificar el ritmo. Entre estos parámetros destaca el periodo, que representa el tiempo
que dura un ciclo completo, la frecuencia o número de ciclos por unidad de tiempo, la
amplitud, que mide la oscilación del ritmo a partir del valor medio o mesor (para ritmos
sinusoidales) o entre el máximo y el mínimo (para ritmos no sinusoidales), y la fase o
punto de referencia temporal de un ritmo. Los ritmos biológicos también se pueden
18
Introducción
clasificar en base a la duración de su periodo, destacando entre ellos los ritmos con
periodicidad cercana a las 24 horas o circadianos.
En la mayoría de las especies de animales, la existencia de ritmos circadianos no es
un proceso pasivo a la fluctuación ambiental, sino que depende de la existencia de un
sistema circadiano, el cual integra mecanismos a nivel molecular, celular y fisiológico que
permiten la expresión de actividad rítmica en numerosas funciones y comportamientos del
animal. Ya desde 1960 se postuló la existencia de ritmos endógenos, los cuales persistían
bajo condiciones ambientales constantes, lo que llevó a proponer la existencia de un
oscilador circadiano (marcapasos o ―pacemaker‖) o reloj endógeno con un periodo
característico que se mantiene constante en ausencia de estímulos externos (libre curso o
―free running‖). Los estímulos cíclicos externos podrían actuar sincronizando el ritmo del
reloj, lo que permite ajustar (igualar) su periodo de actividad al periodo del agente
ambiental, lo que se conoce como sincronización o encarrilamiento. Algunos estímulos
pueden actuar directamente sobre el sistema efector, de forma independiente al reloj
circadiano, generando situaciones de enmascaramiento de los ritmos finales. La existencia
de un ritmo endógeno y/o enmascaramiento puede verificarse si este persiste cuando se
evita la exposición del organismo al agente ambiental.
Además de dicho reloj, para poder generar un ritmo biológico se requiere de
estructuras que capten la información ambiental fluctuante y la transfieran por vía nerviosa
y/o química al oscilador endógeno. Así, la retina juega un papel fundamental en la
transferencia de información del ciclo luz:oscuridad, principal factor encarrilador
(zeitgeber) del reloj circadiano para el ajuste de la mayor parte de las funciones rítmicas de
los organismos. Por otro lado, el sistema circadiano integra las vías de salida de
información desde el oscilador endógeno hacia los distintos efectores que ejecutan las
funciones rítmicas. Se conocen diferentes mecanismos de salida del reloj principal de
vertebrados, entre los que destaca la hormona melatonina.
Bases moleculares del reloj circadiano. Osciladores centrales y periféricos y su ajuste
El funcionamiento del sistema circadiano se basa en la actividad de reloj/es
endógeno/s. Es un proceso muy conservado filogenéticamente, presente desde organismos
unicelulares a mamíferos. El mecanismo implica una serie de bucles de retroalimentación
entre los procesos de transcripción y transducción de determinados genes, (―genes reloj‖),
y sus productos proteicos. En mamíferos los elementos positivos o activadores del bucle lo
forman proteínas como CLOCK y BMAL, las cuales heterodimerizan en el citoplasma y
son translocadas al núcleo, donde aumentan la tasa de transcripción de elementos negativos
codificados por genes como period (Per1, Per2, Per3) y criptocromo (Cry1, Cry2 y Cry3).
Los complejos que forman los productos proteicos PER y CRY inhiben su propia
transcripción al ligarse al heterodímero CLOCK:BMAL, bloqueando su función. El brazo
negativo permite un ritmo diario de la expresión de Per y Cry, así como de sus productos
proteicos. Estos ciclos de oscilaciones (con brazos positivos y negativos) moleculares
19
Introducción
genera periodos en la expresión de los genes reloj y en la acumulación de sus productos
proteicos de aproximadamente 24 horas (figura 8). La actividad circadiana de los genes
reloj controla la expresión rítmica de otros genes asociados a estos, así como diversos
aspectos de la propia actividad celular (Liu et al., 1997; Okamura et al., 2002).
Elemento
Positivo
Proteína
PER CRY…..
Proteína
Clock, BMAL
Elemento
Negativo
mRNA
Transcripción
Transducción
per, cry……
Figura 8. Esquema de la regulación del reloj circadiano, a través de los genes reloj.
(Modificado de Cymborowski, 2010).
En poiquilotermos, la información de los mecanismos del reloj circadiano es
bastante escasa. Entre los teleósteos, el sistema circadiano del pez cebra ha sido el más
estudiado, existiendo un alto grado de homología con lo descrito en invertebrados y
vertebrados y que muestran expresión rítmica comparable a la de dichos grupos (Pando y
Sassone-Corsi, 2002). Recientemente se han caracterizado genes del sistema circadiano de
otras especies de teleósteos como el carpín (Velarde et al., 2009a) y la trucha arco iris
(López Patiño et al., 2011), hallándose una fuerte homología con los del pez cebra. Una
diferencia importante con mamíferos es la existencia de múltiples formas de los genes reloj
(hasta 6 formas del gen cry, 3 formas de clock, etc.).
En los vertebrados, en general, se ha demostrado la presencia de osciladores
circadianos en la retina, el núcleo supraquiasmático del hipotálamo (NSQ) y la glándula
pineal. En mamíferos es el NSQ el que contiene el reloj circadiano principal de cuya
actividad dependen gran cantidad de ritmos del organismo (Pickard y Turek, 1983),
mientras que oscilador intra-retiniano ajusta numerosas funciones intraoculares
(sensibilidad visual, niveles de segundos mensajeros y neurotransmisores, etc.). En la
pineal, sin embargo, no existe un sistema circadiano, dependiendo su actividad rítmica del
control ejercido por vía nerviosa del reloj principal localizado en el NSQ.
20
Introducción
En vertebrados no mamíferos, el modelo de organización circadiana más aceptado
consta de múltiples osciladores acoplados, localizados en tejidos como la retina, la
glándula pineal y algunos núcleos hipotalámicos equivalentes al NSQ de mamíferos
(Menaker et al., 1997; López Patiño et al., 2011). De todos ellos, la mayoría de estudios se
han realizado en la glándula pineal. En peces, el órgano pineal es una estructura
fotosensible localizada en una evaginación del techo diencefálico y formado por células
fotorreceptoras modificadas (pinealocitos) cuya morfología es similar a los conos
retinianos. Los pinealocitos en peces contienen todos los elementos de un oscilador
circadiano: un sistema fotorreceptor que capta la información lumínica ambiental, un
oscilador con elementos moleculares (‗genes reloj‘), necesarios para generar la ritmicidad
y múltiples vías de salida de información en forma de señales eléctricas y hormonales. Los
impulsos eléctricos circulan por las proyecciones axónicas de los pinealocitos hacia
diversos núcleos cerebrales, aunque no está clara su función dentro del sistema circadiano.
Por su parte, la síntesis y liberación de la hormona melatonina desde los fotorreceptores
pineales es una señal directamente ligada a la actividad rítmica del oscilador intrapineal
(Falcón, 1999).
La localización de osciladores circadianos se abordó mucho después que en el caso
del SNC. El gran desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido evaluar la
expresión rítmica de genes reloj no solo en tejidos centrales, sino también en la mayor
parte de los órganos periféricos de mamíferos, como hígado, tejido adiposo, páncreas,
riñón, pulmón ovario, tracto digestivo, etc. En los peces, la presencia de osciladores
moleculares se ha demostrado en corazón, bazo, vesícula biliar del pez cebra (Kaneko et
al., 2006) y más recientemente en hígado e intestino del carpín (Velarde et al., 2009a).
El ciclo luz oscuridad es fundamental para el ajuste del periodo de los relojes
circadianos, lo que implica una acción de la luz sobre los mecanismos moleculares de los
osciladores celulares, siendo el principal mecanismo de ajuste del reloj circadiano en la
retina y el órgano pineal de los peces (Falcón, 1999). Algo similar ocurre con los ritmos
que dependen del reloj principal de mamíferos (NSQ), el cual recibe la información
lumínica a través de la vía directa retino-hipotalámica (Bartness et al., 1993; Reiter, 1993;
Goldman, 2001). Estudios más recientes han demostrado que la luz, aun siendo el
principal, no es el único zeitgeber del oscilador maestro de mamíferos, sino que otros
factores ambientales que se presentan rítmicamente parecen jugar papeles relevantes,
destacando la alimentación diaria. De hecho, en roedores se ha demostrado que la
restricción el alimento a determinados momentos del ciclo diario provoca una actividad
motora anticipatoria al alimento (FAA, food anticipatory activity). Los ritmos diarios de
FAA son afectados por el momento en que se presenta el alimento, o tras varios días de
ayuno, o si el periodo de presencia de comida excede los límites de interpretación del
sistema circadiano. Todo ello apoya la existencia de un oscilador circadiano encarrilable
por el alimento (FEO, feeding entrained oscillator), cuya relación con el oscilador
encarrilable por la luz (LEO) no está clara. Se ha visto que la ablación del NSQ no afecta a
la FAA (Landry et al., 2006; Mendoza, 2007), aunque el alimento podría sincronizar
21
Introducción
ritmos mediados por el NSQ en situación de luz u oscuridad constantes. También se ha
postulado que el momento de alimentación podría ser el estímulo dominante para los
osciladores periféricos (Stokkan et al., 2001) en los que el NSQ podría regular su fase
directamente o controlando el ritmo diario de ingesta cuando la comida está disponible ―ad
libitum‖.
En diversas especies de peces, tales como la lubina (Sánchez-Vázquez et al., 1995),
el carpín (Velarde et al., 2009a) o la tenca (López-Olmeda et al., 2006b), también se ha
demostrado la existencia de ritmos circadianos de FAA, habiéndose sugerido que reflejan
cambios de comportamiento asociados a un FEO de localización desconocida. Los
antecedentes en el carpín, apoyan la idea de que la sincronización del momento de
alimentación sería un factor fundamental en el ajuste de los osciladores periféricos
(Velarde et al., 2010a); no obstante, en el pez cebra, se ha indicado que los osciladores
periféricos podrían ser sincronizables por la luz, en base al hecho de tener un cuerpo
semitransparente (Kaneko et al., 2006; Whitmore et al., 1998).
La melatonina como señal de salida del reloj circadiano en peces
El modelo vigente de estructura del sistema circadiano postula la existencia de vías
de salida de información rítmica desde los osciladores circadianos a las
células/tejidos/órganos relacionados jerárquicamente para integrar el control de las
distintas funciones y comportamientos circadianos del individuo. En mamíferos está
aceptado que la melatonina es uno de los principales mensajeros que portan información
circadiana a todas las células del organismo. El control por vía nerviosa que ejerce el NSQ
sobre la actividad de la glándula pineal, explica que el ritmo de síntesis y liberación de la
hormona sea circadiano, es decir, que permanece en condiciones de ambiente constante
siempre que el oscilador circadiano o la conexión NSQ-pineal no se alteren. En situación
de ambiente lumínico alternante (ciclo LD), la síntesis de melatonina es máxima durante el
periodo nocturno, siendo su duración lo que determina la duración del pico de producción
de melatonina. Este hecho resulta relevante no solo desde un punto de vista diario, sino
también estacional, razón por la cual la melatonina también ejerce control sobre funciones
estacionales como la reproducción, la hibernación, la termorregulación, etc.
Como ya se ha mencionado, el órgano pineal de los peces recibe directamente la
información fótica de forma independiente de la retina a diferencia de mamíferos, lo que
implica un control directo de la luz sobre la síntesis de melatonina (Cahill, 1996; Falcón,
1999). Estudios con cultivos de órganos pineales de diversas especies de teleósteos
expuestos a ciclos lumínicos, han demostrado la permanencia de un ritmo día:noche en la
síntesis y secreción de melatonina pineal, con máximos nocturnos (Falcón y Collin, 1989;
1992; Kezuka et al., 1989; Zachmann et al., 1991), lo que denota el carácter fotorreceptor
del órgano y la acción prioritaria de la luz regulando su ritmo de producción de melatonina.
En oscuridad constante, la ritmicidad de la síntesis de melatonina en órganos pineales en
cultivo se mantiene con periodos próximos a las 24h, lo que subraya su carácter endógeno
22
Introducción
y su dependencia de un reloj circadiano intrapineal (Bolliet et al., 1996; Cahill, 1996; Iigo
et al., 1991; Zachmann et al., 1992; Falcón et al., 1992; Bolliet et al., 1996; Molina-Borja
et al., 1996). En general se acepta que dicho reloj regula de forma circadiana los cambios
producidos en la actividad AANAT, probablemente a través de la regulación de su
expresión génica (Falcón et al., 1987).
Aunque el carácter circadiano de la síntesis de melatonina pineal se ha demostrado
en gran variedad de teleósteos (lucio, carpín, pez cebra), parecen existir excepciones. Así,
en algunas especies de salmónidos (incluyendo la trucha arco iris) el ritmo de secreción in
vitro de melatonina desaparece en condiciones de iluminación constante (Gern y
Greenhouse, 1988; Iigo et al., 2007). Cuando se incuban los órganos pineales de éstas
especies, los niveles de melatonina permanecen elevados en oscuridad constante y son
inhibidos tras exposición a la luz (Gern et al., 1992). Esta inhibición ocurre de manera
inmediata y se relaciona con la intensidad y el espectro de la luz incidente, apoyando el
carácter típicamente fotorreceptor del órgano. En base a todo ello, se ha propuesto que el
órgano pineal de salmónidos carece de reloj intrapineal (Gern y Greenhouse, 1988; Bolliet
et al., 1996) o al menos que, si existe, no parece ser funcional para la regulación de la
síntesis de melatonina (Coon et al., 1998; 1999).
En el caso de la melatonina de origen periférico, no está claro en vertebrados que su
síntesis se vincule a la existencia del sistema circadiano, ni cual es el papel de otros
factores no-lumínicos. Estudios recientes en el carpín han observado ritmos dependientes
de la luz en la expresión del gen de la aanat2 en hígado e intestino, los cuales se mantienen
en situaciones de luz y oscuridad constantes (Velarde et al., 2010a). Ello ha llevado a
proponer la existencia de una regulación circadiana de la síntesis de melatonina en dichas
localizaciones, así como su ajuste potencial por factores no-fóticos.
2.5. Ambiente no lumínico y síntesis de melatonina
Al margen de la luz, otros factores ambientales parecen estar implicados en la
regulación de la producción de melatonina. Los peces mantienen una relación muy
estrecha con su medio, lo que se refleja en regulaciones específicas por factores como la
temperatura y la salinidad, entre otros. Veamos brevemente algunos de estos factores.
Temperatura
La temperatura es clave en la regulación de la síntesis de melatonina, especialmente
en vertebrados poiquilotermos, capaces de modificar diversas funciones fisiológicas para
adaptarse a los cambios de temperatura ambiental. En reptiles, la temperatura también es
clave para la amplitud del pico nocturno de melatonina circulante (Vivien-Roels et al.,
1979). En anfibios se encontró una correlación entre la temperatura ambiental y el
incremento nocturno de melatonina, llegándose a anular el ritmo diario ocular de
23
Introducción
melatonina tanto a temperaturas bajas propias del invierno (Delgado et al., 1993), como en
cultivos in vitro de copas ópticas (Valenciano et al., 1997). Estudios en pineales de trucha
arco iris sometidas a oscuridad constante han demostrado el incremento de la frecuencia de
descarga de las células fotorreceptoras con la temperatura (Tabata y Meissl, 1993). Bajo
iluminación constante, un ritmo diario de temperaturas puede mantener otro de secreción
de melatonina en Catostomus commersoni y Esox lucius (Zachmann et al., 1991; Falcón et
al., 1994). Los efectos de la temperatura dependen de la intensidad de la luz ambiental
(Max y Menaker, 1992), de la fase del ciclo diario (Zachmann et al., 1991; Falcón et al.,
1994) y de la estación del año (Iigo y Aida, 1995). La temperatura influye además en las
cinéticas enzimáticas: en la trucha arco iris, el incremento de temperatura hasta unos 40ºC
aumenta la actividad HIOMT (Morton y Forbes, 1989). En el caso de la actividad
AANAT, el efecto de la temperatura es diferente en cada forma enzimática; así la actividad
de la AANAT1 tiende a aumentar con la temperatura, mientras que la AANAT2 tiene un
máximo relacionado con la preferencia térmica de la especie, por lo que se ha propuesto un
papel de termosensor que, controlando la cantidad de melatonina que se sintetiza,
proporcionaría información al organismo del momento del día, estación anual y/o posición
en la columna de agua (Falcón y Collin, 1989; Benyassi et al., 2000).
Salinidad del agua
La exposición de diferentes especies de teleósteos a medios de diferente
osmolaridad produce alteraciones de los niveles de melatonina circulantes (Kulczykowska,
2001; 2002; Saito et al, 2004; Kleszczynska et al., 2006). López Olmeda et al., (2009) en la
lubina (Dicentrarchus labrax) indican que el incremento en la salinidad del agua provoca
una reducción de los niveles de melatonina en plasma y diversos tejidos periféricos
(branquias, intestino), así como en la densidad de sitios de unión de melatonina en el SNC.
Mas recientemente, un estudio de López Patiño et al. (2011a) en la trucha arco iris
demuestra que el incremento de osmolaridad resulta en aumentos de los niveles y de la
síntesis (actividad AANAT) de melatonina en el órgano pineal, especialmente durante la
fase nocturna. Asimismo, se ha sugerido que dicho efecto podría estar mediado por la
acción de hormonas relacionadas con la adaptación osmótica, incluyendo el cortisol
(Nikaido et al., 2010) y la arginina-vasotocina (Rodriguez-Illamola et al., 2011).
Alimento
Algunos estudios en mamíferos sugieren que la restricción de alimento puede
modificar los niveles de melatonina circulantes (Challet et al., 1997) y reducir la amplitud
y duración del incremento de melatonina en la glándula pineal (Chik et al., 1987) y la
actividad AANAT (Welker y Vollrath, 1984). La composición de la dieta es otro factor a
tener en cuenta, dado que ratas alimentadas con dietas de bajo contenido proteico
mostraron niveles plasmáticos de melatonina más bajos y menor actividad AANAT que las
alimentadas con dietas normales. Por otro lado, en roedores se ha demostrado que la
administración del aminoácido L-Trp provoca un aumento del contenido de 5HT pineal
24
Introducción
(Young y Anderson, 1982; Reiter et al., 1990), aunque los efectos sobre los niveles
melatonina son contradictorios. Así, mientras que la el aminoácido no produce cambios
drásticos en la melatonina pineal (Ferreti et al., 1990) e incluso induce efectos inhibidores
(Reiter et al., 1990), si causa el aumento de los niveles de la hormona en plasma (Bubenik
et al., 1992; Huether et al., 1993; Yaga et al., 1993). También se ha encontrado que la
administración oral de L-Trp produce mayores incrementos en los niveles de melatonina
plasmática que la inyección i.p. (Huether et al. 1992). Dado que el efecto del L-Trp sobre
la melatonina circulante persiste en ratas pinealectomizadas, se ha sugerido que se debe a
un aumento de la síntesis intestinal de la hormona (Yaga et al., 1993).
En el caso de los peces los estudios del efecto de alimento son más bien escasos.
Ceinos et al. (2008) en la trucha arco iris indican que la disponibilidad de alimento altera
los ritmos de síntesis de melatonina pineal. Así, una semana de ayuno se produce la
reducción del pico nocturno de melatonina y de actividad AANAT en el órgano pineal,
efecto que desaparece tras varios días de realimentación. Otros estudios también han
relacionado la dieta con la producción de la hormona. Así, Herrero et al. (2007) en la
lubina vieron que la suplementación de la dieta con L-Trp incrementa los niveles de
melatonina en plasma durante el día, aunque no está claro el origen de dichos cambios. Por
último, Lepage et al. (2005a) demuestran que el enriquecimiento del medio de cultivo con
L-Trp causa el incremento de los niveles intestinales de melatonina, sugiriendo una
relación entre contenido del aminoácido y la síntesis intestinal de la hormona.
2.6. Funciones de la melatonina
En los vertebrados la melatonina ejerce acciones fisiológicas muy diversas y en
diferentes localizaciones del organismo. En general, esta señal hormonal parece ser clave
para el ajuste temporal de funciones circadianas y estacionales, participando en procesos
bien caracterizados tales como los ciclos diarios de actividad-reposo y sueño-vigilia, la
reproducción estacional o el equilibrio energético, entre otros (Pévet, 2003; Reiter, 2003;
Hardeland, 2003). En gran parte esta amplia variedad de acciones parece estar mediada por
receptores específicos de la hormona, distribuidos por todo el organismo en vertebrados.
Receptores de melatonina
La mayor parte de las acciones fisiológicas de la melatonina se llevan a cabo a
través de receptores de membrana de alta afinidad, clasificados en varios subtipos: MT1,
MT2 y Mel1c, este último presente en todos los mamíferos excepto placentarios y
marsupiales (Reppert et al., 1995; Park et al., 2007b). Todos ellos pertenecen a la
superfamilia de receptores con siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G
(Dubocovich et al., 1998) y su activación resulta, de forma general, en la inhibición de la
actividad adenilato ciclasa y la síntesis de AMPc (Reppert, 1997; Dubocovich et al., 1998),
o en la activación de la fosfolipasa C. Además, en mamíferos se ha descrito la presencia de
25
Introducción
sitios de unión de baja afinidad para la melatonina, denominado como MT3 (Reppert et al.,
1995). Estudios con radioligandos muy selectivos han permitido saber que se trata de una
quinona reductasa, enzima detoxificante del organismo, por lo que se ha propuesto que
estos sitios de unión no son auténticos receptores (Nosjean et al., 2000).
En el caso de los peces, se han clonado secuencias completas o parciales de los
receptores de melatonina en diversas especies, tales como la trucha arco iris (Gaildrat et
al., 2002), pez conejo (Siganis guttatus, Park et al., 2007a,b), pez cebra (Danio rerio,
Falcón et al., 2007), lucio (E. lucius, Falcón et al., 2007), lubina (D. labrax, Sauzet et al.
2008), lenguado (Solea senegalensis, Confente et al., 2010) y carpín (C. auratus, Ikegami
et al. 2009a,b). En alguna de estas especies se ha identificado subtipos de receptores MT1.
La mayor parte de los estudios de localización de los receptores de melatonina se
han llevado a cabo en mamíferos, encontrándose una distribución amplia, tanto en el SNC
como en muchos tejidos periféricos como el ovario (Clemens et al., 2001), testículo
(Frungieri et al., 2005), la glándula mamaria (Ram et al., 2002), la retina (Scher et al.,
2002), vasos sanguíneos (Ekmekcioglu et al., 2001a,b), el hígado y el riñón (Naji et al.,
2004), la vesícula biliar (Aust et al., 2004), la piel (Slominski et al., 2003), el sistema
inmune (Pozo et al., 2004) y el tracto gastrointestinal (Sallinen et al., 2005; Stebelová et
al., 2010). En peces, en comparación con mamíferos, la distribución central de los
receptores de melatonina es muy amplia, extendiéndose por áreas implicadas en la
integración de información sensorial, visual, auditiva, así como en el sistema límbico (Iigo
et al., 2003; López Patiño et al., 2008). También se ha descrito la presencia de los subtipos
MT1, MT2 y Mel1c en el órgano pineal de algunos peces (Park et al., 2006, 2007a,b), así
como variaciones diarias en su expresión génica. A nivel periférico, se han descrito lugares
de unión de melatonina en riñón, branquias, bazo, corazón, tubo digestivo e hígado
(Kulczykowska et al., 2006; López Patiño et al., 2011; Sauzet et al., 2008; Ikegami et al.,
2009a). En la trucha arco iris, el lucio y el Xenopus también se han encontrado potenciales
receptores de melatonina en hipófisis y retina (Gaildrat y Falcón, 1999; Gaildrat y Falcón
2000; Wiechmann, 2003).
Efectos de la melatonina sobre los ritmos circadianos
La melatonina actúa como una molécula señalizadora del tiempo, capaz de influir
sobre la fase y/o el periodo del reloj circadiano. El efecto cronobiótico de la melatonina,
estudiado principalmente en mamíferos, entraña gran complejidad, observándose
resultados variables (retrasos o avances de fase) dependiendo de la hora del día en que se
administre (Wikstrom, 1996; Pévet, 2003). También en algunas especies de aves y reptiles,
la pinealectomía suprime el ritmo de actividad locomotora en oscuridad constante,
mientras que inyecciones diarias de melatonina son capaces de restaurarlo (Murakami et
al., 2001). El efecto sincronizador de la melatonina también se ha observado en otras
funciones rítmicas como su propia producción o la temperatura corporal (Vanecek, 1998;
Murakami et al., 2001; Pévet, 2003).
26
Introducción
En peces todavía no se ha identificado un oscilador central equivalente al del NSQ.
Recientemente nuestro grupo ha demostrado en la trucha arco iris la oscilación rítmica de
genes reloj (clock1, bmal1, per1) en hipotálamo y retina, apoyando la localización de
marcapasos a estos niveles (López Patiño et al., 2011). Estos mecanismos podrían
participar en la generación de ritmos circadianos de actividad locomotora, alimentación,
coloración, etc., en los cuales el ciclo luz:oscuridad sería el encarrilador principal (Spieler,
1992; Sánchez-Vázquez et al., 1995; Aranda et al., 1999). En el caso de la actividad
motora, es conocida la presencia en la mayoría de los peces de patrones diarios
influenciados por la luz (Richardson y McCleave, 1974). La mayoría de los peces son
nocturnos o diurnos, pero su comportamiento diario puede exhibir cierto grado de
plasticidad, cambiando de nocturno a diurno y viceversa (Eriksson, 1978;
Sánchez-Vázquez et al., 1995). La melatonina y su precursor (serotonina), están
relacionados con la respuesta a la actividad motora en diferentes especies de peces y
podrían contribuir a sincronizar estas actividades rítmicas diarias (Falcón et al., 2010). En
el carpín, especie diurna, la administración i.p. de melatonina induce un descenso en su
actividad (López-Olmeda et al., 2006b), al igual que en lubinas alimentadas con una dieta
rica en triptófano (Herrero et al., 2007). En el salmón rojo la 5HT incrementa la actividad
locomotriz solo durante la noche, mientras que la melatonina la disminuye durante el día
(Byrne, 1970). También en la tenca (Tinca tinca), especie nocturna, la respuesta a la
administración periférica de melatonina parece depender del momento de su
administración en el fotociclo diario (López Olmeda et al., 2006a).
Efectos sobre la actividad reproductora
En multitud de especies animales la reproducción es un fenómeno estacional cuyos
patrones dependen del fotoperiodo y la temperatura ambiental. La regulación de la
reproducción requiere fuertes ajustes temporales en los mecanismos de regulación
neuroendocrina, siendo la melatonina un elemento importante. En peces, los estudios sobre
los efectos de la pinealectomía y la administración de melatonina sobre la función
reproductora son poco conclusivos, y dependen de la especie y la estación anual. En el
carpín, la pinealectomía conduce a un pico preovulatorio de gonadotropinas, provocando la
ovulación en la fase no habitual del ciclo luz/oscuridad (Kezuka et al., 1989). En cambio,
en la carpa la pinealectomía no afecta ni a los niveles ni a la fase del ritmo de
gonadotropinas plasmáticas (Popek et al., 1994). En salmón atlántico y trucha arco iris
tratados con implantes de liberación constante de melatonina no se altera el momento del
desove, algo que si provoca la pinealectomía, sugiriendo la importancia de los cambios
rítmicos de secreción de melatonina para el ajuste temporal del desarrollo gonadal
(Bromage et al., 1995; Nash et al., 1995; Randall et al., 1995).
Comportamiento social y agresividad
El comportamiento social de los peces es complejo, afectando a aspectos
relacionados con la existencia de jerarquías sociales, comportamiento dominante27
Introducción
subordinado, agresividad, cambios de pigmentación, etc. Algunos estudios muestran que la
melatonina reduce las respuestas agresivas en la perca, Aequidens pulcher (Munro, 1986).
Larson et al. (2004) demostraron que los peces socialmente subordinados poseen niveles
nocturnos de melatonina más altos y niveles de cortisol similares a los peces no estresados.
Melatonina y pigmentación dérmica
Los vertebrados poiquilotermos pueden presentar una adaptación cromática al
ambiente, principalmente debido a la luz, el color del fondo y al comportamiento social. La
melatonina normalmente produce aclaramiento dérmico de anfibios, reptiles y teleósteos.
En la trucha arco iris el órgano pineal contiene los osciladores que controlan los ritmos
circadianos de cambios de color, interrumpiéndose estas variaciones al realizar una
pinealectomia (Hafeez y Quay, 1970). En el pez lápiz, Nannostomus beckfordi anomalus,
los melanóforos también responden diferencialmente a la melatonina, de forma que los
responsables de la coloración diurna muestran agregación pigmentaria, mientras que los
implicados en la coloración nocturna sufren un efecto dispersor del pigmento (Reed, 1968).
Efectos sobre la ingesta y el metabolismo
La melatonina puede afectar al crecimiento y la alimentación en los peces. La
respuesta varía según la especie, el estado fisiológico del pez y cómo se administre la
hormona. En Salmo salar en etapa de parr, los implantes de melatonina llevan a un
incremento del peso corporal (Porter et al., 1998), mientras que en la trucha reduce su tasa
de crecimiento (Taylor et al., 2005). En el carpín la administración de melatonina en peces
mantenidos bajo fotoperiodo corto conlleva una ganancia en peso y tasa de crecimiento
(De Vlaming, 1980), mientras que la administración aguda produce un descenso de la
ganancia de peso (De Pedro et al., 2008). Estos efectos de la melatonina sobre el
crecimiento podrían resultar de la alteración en los patrones de ingesta de los peces. De
hecho, los tratamientos con melatonina por vía I.P. reducen la tasa de ingesta de alimento
en el carpín (Pinillos et al., 2001; De Pedro et al., 2008), de manera similar al efecto de su
administración oral en la tenca (López-Olmeda et al., 2006a) y la lubina (López-Olmeda et
al., 2009). Los mecanismos por los que la melatonina afecta a la ingesta no están claros. Se
ha postulado que parte de sus acciones serían periféricas dado que se observan tras el
tratamiento i.p. pero no intracerebroventricular (Pinillos et al., 2001). También se ha
observado que la melatonina modifica el patrón de selección de macronutrientes de la dieta
de los peces (Rubio et al., 2004).
Por otra parte, se han descrito efectos de la pinealectomía y de la administración de
melatonina sobre el metabolismo lipídico y de carbohidratos (Soengas et al., 1998).
También se ha demostrado que la hormona puede interactuar con la secreción hipofisaria
de GH, provocando efectos estimuladores o inhibidores, dependiendo del estado de
activación celular y dosis empleadas (Falcón et al., 2003).
Acción antioxidante celular e inmunidad
28
Introducción
El estrés oxidativo de los procesos metabólicos que generan radicales libres es un
factor que afecta a la actividad celular, provocando inactivación de enzimas, daño del
material genético y peroxidación lipídica. Diversos estudios señalan que la melatonina es
un potente agente antioxidante con capacidad intrínseca para actuar directamente sobre los
radicales libres, provocando su neutralización (Ianas et al., 1991; Tan et al., 1993; Ouyang,
1998). Además, diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la melatonina
puede estimular la actividad de otros sistemas antioxidantes, contribuyendo de forma
indirecta a reducir el estrés oxidativo (De Lastra et al., 1997; Kotler et al., 1998; Cabeza et
al., 2001; Antolin et al., 2002; Mayo et al., 2002). La melatonina también podría ser
altamente eficaz para reducir los niveles de oxidación lipídica, tanto basales como
estimulados por diversos mecanismos oxidativos (Reiter et al., 2003).
Por otro lado, la existencia de sitios de unión específicos para melatonina en los
linfocitos sugiere un efecto regulador directo sobre el sistema inmune (García-Pergeñeda et
al., 1997). Se ha propuesto que la melatonina ejerce efectos inmunoestimuladores en
roedores (Guerrero et al., 2000). En los peces se ha sugerido una acción similar en dorada,
Sparus aurata (Cuesta et al., 2008).
3. LA MELATONINA EN EL TRACTO GASTROINTESTINAL
3.1. Relaciones serotonina-melatonina en el TGI.
Como ya se mencionó previamente, la regulación del funcionamiento del TGI es
muy compleja e implica numerosos factores nerviosos y endocrinos cuyas relaciones
funcionales son todavía desconocidas. La melatonina ha adquirido cierta notoriedad en los
últimos años como potencial señal moduladora de las funciones adscritas al TGI (Bubenik,
2002), en gran medida debido a la existencia de estudios demostrando la presencia de
elevadas cantidades de hormona en el TGI, habiéndose postulado este tejido como su
principal fuente periférica (Huether, 1993). Por otro lado, algunas investigaciones han
llevado a sugerir un papel regulador de las funciones digestivas por la melatonina
(Bubenik, 2002). Sin embargo, poco se sabe de los mecanismos básicos que regulan su
presencia en el TGI, en particular respecto a su síntesis y su regulación intrínseca y por
factores ambientales.
La síntesis de melatonina tiene lugar a partir de la 5HT, una indolamina de amplia
distribución en el organismo y con importantes funciones como transmisor en el SNC y en
el intestino, donde podría actuar además como un regulador endocrino/paracrino (Olsson y
Holmgren, 2001). A nivel periférico, la presencia de 5HT es muy extensa en diferentes
tejidos como la sangre, pulmón, riñón, corazón y, sobre todo, el TGI, donde el ambiente
externo, señales neurohormonales y factores metabólicos afectan a su concentración
(Bertrand y Bertrand, 2010). En el tracto digestivo, algunos estudios proponen una relación
funcional entre la 5HT y la melatonina, más allá de la estricta relación metabólica
29
Introducción
(Bubenik. 2002; Matheus et al., 2010). Por ello, en este apartado se abordan los principales
hitos alcanzados en los estudios que se han llevado a cabo en mamíferos y peces en
relación a la 5HT y la melatonina en el TGI.
3.2. La serotonina: Aspectos básicos de su metabolismo y regulación
La 5-hidroxitriptamina (5HT; Figura 9) posee una amplia actividad biológica en
vertebrados (Baumgarten y Grozdanovic, 1997). Inicialmente su presencia fue descrita en
el suero sanguíneo y el intestino, mostrándose además como un potente agente
vasoconstrictor, por lo que se le atribuyó un papel como hormona periférica (Rapport et al.
1948a,b). Más tarde se constató el papel de la 5HT como neurotransmisor tanto a nivel
central como periférico, estableciéndose su relación con procesos tales como el apetito, la
temperatura corporal, el sueño, el comportamiento sexual y la motilidad intestinal, entre
otros (Twarog y Page 1953; Amin et al. 1954). La 5HT está presente en altas
concentraciones también en la glándula pineal, donde sirve como precursor de la
melatonina (Quay et al., 1967; Snyder y Axelrod, 1965).
Figura 9. Estructura química de la 5HT y su disposición tridimensional.
Metabolismo de la serotonina
El metabolismo de la 5HT es bien conocido a nivel neuronal. Se sintetiza a partir
del aminoácido neutro esencial L-Triptófano (Figura 10), que es captado al interior celular
por un mecanismo de transporte activo de aminoácidos neutros. El L-Trp es hidroxilado a
5-hidroxitriptófano (5HTP) por la enzima citoplasmática triptófano hidroxilasa (EC
1.14.16.4, TPH), que requiere de O2, Fe2+ y el cofactor tetrahidrobiopterina (BH4) para su
funcionamiento. Este paso es considerado como limitante de la ruta biosintética de la 5HT
(Friedman et al., 1972) y un punto importante en la regulación de su liberación neuronal
(Auerbach et al., 1989). A continuación el 5HTP es transformado a 5HT mediante la
acción enzimática aminoácido aromático descarboxilasa (EC 4.1.1.28; AADC), que
requiere piridoxal fosfato como cofactor. Esta transformación es inmediata, por lo que los
niveles de 5HTP son muy bajos en condiciones normales (Tison et al., 1991). De forma
similar a otras monoaminas, la 5HT se acumula dentro de las neuronas en estructuras
30
Introducción
granulares o vesículas sinápticas, formando complejos con proteínas tales como la
―serotonin-binding protein‖ (SBP), cationes divalentes y ATP (Kruk y Pycock, 1991).
La liberación neuronal de 5HT ocurre por dos mecanismos: i) en respuesta a la
despolarización presináptica mediante mecanismos exocitóticos Ca2+-dependientes, ii) por
un mecanismo dependiente del transportador de recaptación de 5HT, sensible a
inhibidores, no exocitótico, independiente de Ca2+ y modulado por autorreceptores que
actuaría desde el citoplasma hacia el espacio extraneuronal (Levi y Raiteri, 1993).
Figura 10. Ruta biosontética y de degradacion de la serotonina.(Modificada de Gesto,
2008).
La 5HT sináptica es recaptada por la proteína transportadora de serotonina (SERT),
presente a nivel central y periférico (Gershon, 2004), finalizando su acción
neurotransmisora y siendo, por tanto, un punto de modulación de la señal serotoninérgica
(Wang et al., 2006). El proceso de recaptación requiere de energía en forma de ATP y un
gradiente electroquímico de Na+ y Cl+ (von Bohlen und Halbach y Dermietzel, 2002).
La metabolización de la 5HT es intracelular y se produce básicamente mediante
desaminación oxidativa por la enzima citoplasmática monoamina oxidasa (MAO), de la
que existen dos formas, MAO-A y B, con distinta preferencia por sustratos. En teleósteos
31
Introducción
se ha sugerido la existencia de una única forma de MAO (Senatori et al., 2003). El
aldehído resultante de la desaminación es altamente reactivo, pudiendo oxidarse a 5HIAA
por la acción de la aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) o reducirse a 5-hidroxitriptofol
por la aldehído reductasa (EC 1.1.1.21). Otras rutas menores de metabolización de la 5HT
neuronal son la formación de conjugados sulfatados y glucorónicos. Además, las células
que producen melatonina metabolizan la 5HT mediante N-acetilación.
En circunstancias normales la ruta metabólica principal de la 5HT lleva a la
formación de 5HIAA, su principal metabolito inactivo. Mediante el empleo de técnicas de
microdiálisis cerebral in vivo en roedores se ha observado que la despolarización y el nivel
de actividad neuronal afectan a los niveles neuronales de 5HIAA, pudiendo reflejar
cambios en la cantidad de neurotransmisor recaptado desde la hendidura sináptica. Si bien
la formación de 5HIAA depende de la recaptación de 5HT, una cierta cantidad parece
provenir de la 5HT sintetizada de novo que permanece algún tiempo en el citoplasma antes
de ser almacenada en vesículas, siendo accesible a la degradación por la MAO (Auerbach
et al., 1989; Thorré et al., 1996; Paz-Valiñas et al., 2002). La relación entre los niveles de
5HIAA y 5HT (5HIAA/5HT) ha sido usada en algunos estudios como un indicador de la
tasa de actividad y liberación de las neuronas serotoninérgicas (Datla y Curzon, 1996;
Stenfors y Ross, 2002). El uso de esta relación es más frecuente en vertebrados donde no
es posible monitorizar la actividad neuronal in vivo, como es el caso de los peces (Winberg
y Lapage, 1998; Ruibal et al., 2002; Gesto et al., 2009).
Regulación de la síntesis y liberación de 5HT
Como ya se mencionó, la TPH es limitante y el punto de regulación para la síntesis
de 5HT. De hecho, al inhibir su actividad la concentración de 5HT decrece
inmediatamente, lo que no ocurre cuando se inhibe en magnitud similar la AADC. La
disponibilidad de cofactores enzimáticos también parece limitar la actividad de la TPH
(Kuhn et al., 1980). Además, existen otros mecanismos de regulación dependientes de
Ca2+/calmodulina, AMPc o Ca2+-fosfolípidos, que están asociados a la fosforilación de la
enzima (Ehret et al., 1989, 1991). Se ha demostrado que la estimulación nerviosa de los
somas neuronales serotoninérgicos genera un aumento de la síntesis de 5HT en las
terminales (Auerbach et al., 1989) mediado por el incremento de la fosforilación de la
TPH. Por otro lado, la actividad de esta enzima no está sujeta a inhibición por la 5HT
intracelular (Winberg et al., 2001), pero la 5HT extracelular si puede inhibir la actividad
neuronal y su propia liberación actuando sobre autorreceptores somatodendríticos y/o
presinápticos (De Vry, 2000). En los peces, también hay evidencias de que la TPH tiene un
papel limitante en la síntesis de 5HT, concretamente en el hígado de Thunnus albacares
(Nagai et al., 1997b), así como en trucha arco iris (Aldegunde et al., 2000).
En mamíferos, existen dos genes que codifican para la enzima TPH: TPH1 (Darmon
et al. 1986) y TPH2. Mientras que la expresión del TPH2 es neuronal, la del TPH1 se ha
descrito como no neuronal (Côté et al., 2003; Walther et al., 2003). A nivel periférico, la
32
Introducción
5HT es sintetizada por la TPH1, que se expresa fundamentalmente en las células
enterocromafines (CE) del TGI (Côté et al., 2004). Existen diferencias entre la enzima
cerebral y la intestinal. Así la TPH cerebral (TPH2) nunca hidroxila D-Trp, algo que sí
hace la intestinal (Côté et al., 2004), aunque a una tasa que supone tan solo un tercio
respecto a la tasa de hidroxilación del L-Trp (Tyce, 1990).
Otro factor de gran importancia en la regulación de la tasa de síntesis de 5HT es la
cantidad de L-Trp disponible en el citoplasma neuronal (Kruk y Pycock, 1991; Winberg et
al., 2001), que depende de la concentración de L-Trp circulante a resultas de sus cantidades
ingeridas en la dieta y de su tasa de captación por el cerebro y las terminales nerviosas. La
captación del L-Trp al interior de las neuronas serotoninérgicas puede disminuir ante
elevadas concentraciones en plasma de otros aminoácidos neutros de cadena larga
(L-valina, L-tirosina, L-alanina, L-fenilalanina, L-leucina, L-isoleucina y L-metionina) ya
que compiten con el Trp en su unión al transportador (Fernstrom y Wurtman, 1972;
Pardridge, 1977). Se ha demostrado que la modificación de los niveles de L-Trp en la dieta
y/o su inyección alteran los niveles cerebrales de 5HT y de su metabolito ácido, el 5HIAA
(Fernstrom y Wurtman, 1972; Gibson, 1985), así como la liberación de 5HT a la hendidura
sináptica (Sharp et al., 1992; Thorré et al., 1996). En condiciones fisiológicas normales la
actividad del enzima TPH no alcanza la saturación (Tyce, 1990; Winberg et al., 2001).
En otros vertebrados la síntesis de 5HT también parece depender de los niveles
circulantes de L-Trp. En los peces, donde la mayoría del L-Trp plasmático está en forma
libre (Rozas et al., 1990), parece que las características de su transporte al cerebro son
similares a los mamíferos (Aldegunde et al., 1998) y que tanto la administración de Trp en
la dieta y la propia alimentación, pueden alterar el metabolismo cerebral de 5HT (Jonhston
et al., 1992; Aldegunde et al., 1998). Además, la administración sistémica de L-Trp
aumenta la tasa de síntesis de 5HT en el cerebro de la trucha arco iris (Aldegunde et al.,
1998; 2000).
3.3. La serotonina intestinal: localización, regulación e implicaciones fisiológicas
En mamíferos se ha estimado que más del 90% del contenido total de 5HT del
organismo es sintetizado, almacenado y liberado desde las células enterocromafines (CE)
intestinales (Erspamer, 1954; Forsberg y Miller, 1983; Legay et al., 1983; Gerson y Tack,
2007). En menor medida, la 5HT se localiza en neuronas que inervan el intestino, sobre
todo en el plexo mientérico neuronal (Gershon et al., 1977; Costa et al., 1982).
Las CE se encuentran dispersas en el epitelio intestinal (Figura 10) y forman
poblaciones de células neuroendocrinas que a su vez integran varias subpoblaciones
diferenciables según la forma, la presencia de gránulos de secreción y las terminaciones
luminales (Gustafsson et al., 2006). Las CE contienen numerosos gránulos electrón-densos
que almacenan la 5HT (Polak et al., 1976; Mourre et al., 1981; Ahlman y Dahlström, 1982;
33
Introducción
Nemoto et al., 1982), así como un mecanismo de captación de 5HT de alta afinidad
(SERT) comparable al del cerebro (Mourre et al., 1981; Ternaux et al., 1981; Legay et al.,
1983). Pero además, las CE pueden sintetizar 5HT, demostrarondose mediante estudios
farmacológicos (Grübe, 1976; Legay et al., 1983) y moleculares (Coates et al., 2004) la
presencia de actividad TPH. Al igual que a nivel neuronal, la hidroxilación del Trp parece
ser el paso limitante de la síntesis de 5HT en las CE (Legay et al., 1983b). Bertrand y
Bertrand (2010) señalan para el intestino que la 5HT de nueva síntesis se almacena en
gránulos o vesículas, proceso mediado por un transportador vesicular de monoaminas
(VMAT1) (Figura 11). La liberación de 5HT contenida en ellos ocurre sobre todo en la
zona basal de la CE, pero también podría darse en la zona apical (Nilsson et al., 1987).
Figura 11. Funcionamiento de la producción y recaptación de la serotonina en una célula
enterocromafín (Tomado de Bertrand y Bertrand, 2010). EC cell: Célula enterocromafin; Tryp:
triptófano; 5-HTP: 5-hidroxitriptófano; 5-HT: serotonina; Epithelial cell: célula epitelial; Vesicle:
vesícula; 5-HT transporter (SERT, HHT): transportadores de 5HT; Vesicular transporter
(VMAT1): transportador vesicular.
Las altas concentraciones de 5HT presentes en las CE sugieren su papel como
almacen (pool) de 5HT. Se ha sugerido que funcionalmente podrían coexistir 2 pooles, uno
más grande con 5HT almacenada, procedente sobre todo de la recaptación y con baja tasa
de liberación, y otro más pequeño, derivado principalmente de nueva síntesis y más
accesible a su liberación extracelular (Simon y Tenaux, 1990). Los depósitos de 5HT
intestinal pueden alterarse por la administración de dietas enriquecidas y carentes de Trp, o
farmacológicamente mediante inhibidores de TPH, MAO y SERT, o con reserpina,
fármaco que causa el vaciado de los depósitos de 5HT (Furness y Costa, 1987; Gershon,
34
Introducción
2003; Van Nieuwenhoven et al., 2004). Aunque se ha demostrado la presencia de MAO en
las CE, los niveles de 5HIAA intestinal son bajos (Legay et al., 1983), probablemente
porque es retirado rápidamente del intestino. La administración de inhibidores de la
recaptación provoca un aumento de la concentración de 5HT intestinal y la disminución de
5HIAA en el flujo portal. Por ello se propuso que gran parte del 5HIAA procede de la
recaptación de la 5HT previamente liberada (Schrwörer et al., 1987).
La distribución de 5HT en el intestino varía dependiendo de las especies y del
segmento intestinal, probablemente reflejando diferencias en la anatomía, la alimentación y
el ambiente microbiano. Por ejemplo, en humanos la mayor presencia de 5HT se adscribe
al duodeno, en la rata predomina en el colon y en aves se distribuye de manera regular en
el TGI (Hansen y Witte, 2008). La concentración de 5HT también varía con las capas de la
pared intestinal, siendo unas 100 veces más elevada en la mucosa que en la pared
muscular. La distribución de neuronas serotoninérgicas también es variable, con mayor
presencia en el plexo mientérico y muy escasas en la mucosa (Kurian et al., 1983).
Las CE pueden liberar 5HT tanto al lumen intestinal como al torrente sanguíneo
(Ahlman y Dahlström, 1982), aunque es más probable su liberación hacia el espacio
basolateral y la circulación portal. La liberación podría ser mediada por mecanismos
exocitóticos dependientes de AMPC y de la entrada de Ca2+ a través de múltiples canales
de membrana (Forsberg y Miller, 1983) y estar condicionada por diversas señales
neuronales y no neuronales. Así, la estimulación vagal incrementa la liberación de la 5HT
enterocromafín, posiblemente mediado por receptores β-adrenérgicos (Petterson et al.,
1979; Ahlman y Dahlström, 1982; Racké et al., 1988), mientras que la estimulación
-adrenérgica inhibe su liberación (Racké et al., 1988). La ACh produce la liberación de
5HT, mediada por receptores muscarínicos y nicotínicos (Forsberg y Miller, 1982).
Diversas señales no neuronales, como VIP e histamina, inhiben la liberación de 5HT,
mientras que otros como el ácido--amino butírico (GABA) y los péptidos opioides
estimulan dicho proceso (Schwörer et al., 1989).
Fisiológicamente, el estímulo luminal principal para la liberación de 5HT desde las
CE parece ser mecánico, debido a la distensión intraluminal que se produce en respuesta a
la presión que ejerce el bolo alimenticio sobre la pared intestinal (Bertrand y Bertrand,
2010). Sin embargo la estimulación química (ej., cambio de pH, soluciones
hiperosmóticas, ácidos biliares y glucosa) parece ser importante, determinando la cantidad
de 5HT liberada al lumen intestinal (Smith et al., 2006).
En los peces, hay evidencias de la presencia de CE en estómago e intestino de
varias especies de teleósteos (Read y Burnstock, 1968; Watson, 1979; Burkhardt-Holm y
Holmgren, 1989). En la trucha arco iris se encontraron CE en el estómago, pero no en el
intestino (Read y Burnstock, 1968; Anderson y Campbell, 1988). Algunos estudios
inmunohistoquímicos han mostrado una distribución topográfica diferencial de las CE en
35
Introducción
el intestino de varias especies de teleósteos (Holmgren, 1989; Beorlegui et al., 1992), lo
que probablemente esté relacionado con diferentes hábitos de alimentación.
Las referencias a la 5HT intestinal son mucho más escasas en peces que en
mamíferos, aunque se han propuesto una gran variedad de acciones fisiológicas para esta
amina (Nilsson, 1983). Se ha demostrado la existencia de células endocrinas conteniendo
5HT en el TGI de varias especies, tales como el híbrido del pargo y dentón (Dentex dentex
x Pagrus major, Radaelli et al., 2001), la perca koreana (Coreoperca herzi; Lee et al.,
2004), la anguila (Anguilla anguilla, Domeneghini et al., 2000), el carpín y la tilapia
(Oreochromis mossambicus) (Kiliaan, et al., 1989, 1997). En algunas de estas especies la
presencia de 5HT se limita a las abundantes células endocrinas de la mucosa intestinal, sin
evidencias de una asociación con neuronas. No obstante, en otras especies, tales como el
carpín y la tilapia existen numerosos cuerpos neuronales y fibras nerviosas varicosas
inmunoreactivos a 5HT, asociados al plexo mientérico (Anderson y Campbell, 1988). En
Platycephalus bassensis, especie carente de CE, se ha señalado que toda la 5HT presente
en el intestino sería de origen neuronal. Con respecto a la trucha arco iris, en la que la
presencia de CE asociadas a la capa de mucosa es escasa, parece poseer una rica inervación
serotoninérgica que alcanza el epitelio de la mucosa intestinal (Read y Burnstock, 1968;
Anderson, 1983; Anderson y Campbell, 1988, Beorlegui et al., 1992). Por todo ello se ha
propuesto que las CE podrían estar ausentes del intestino, solo en aquellas especies que
presentan inervación serotoninérgica abundante de la mucosa, que correspondería a
motoneuronas que regulan la musculatura circular y el epitelio mucoso (Anderson y
Campbell, 1988). También se ha indicado la existencia de una distribución topográfica de
las neuronas serotoninérgicas en el TGI, con disminución en sentido distal (Balashov et al.,
1992).
Los estudios de Anderson et al. (1991) mostraron por primera vez en intestino
aislado que las neuronas entéricas del teleósteo Platycephalus bassensis podrían sintetizar
5HT a partir de L-Trp y liberarla probablemente como sustancia transmisora. La liberación
de 5HT, pero no la de 5HIAA responde a la estimulación eléctrica, siendo esta inhibida por
TTX y la omisión de Ca2+. Asimismo, presentaron pruebas de que la fluoxetina (inhibidor
de la captación de 5HT) incrementa la liberación espontánea de 5HT y la inducida
eléctricamente, mientras que la reserpina reduce los niveles tisulares de 5HT y 5HIAA, así
como la liberación espontánea y evocada de la amina. Mas recientemente, Caamaño-Tubio
et al. (2007) muestran que la trucha arco iris posee elevadas concentraciones de 5HT
intestinal, localizadas mayoritariamente en la pared muscular, por lo que proponen que las
células que contienen 5HT en la trucha se corresponderían con fibras nerviosas
serotoninérgicas ubicadas en las capas musculares de la pared intestinal.
Funciones de la 5HT en el TGI
La 5HT puede participar en una amplia variedad de acciones fisiológicas diferentes,
que afectan sobre todo a los procesos de secreción y motilidad asociados al tracto
36
Introducción
digestivo. En mamíferos se ha demostrado que la 5HT podría ser un potente estimulador de
la secreción de electrolitos y moco al lumen intestinal, así como de la secreción de
bicarbonato desde la mucosa duodenal en respuesta al ácido gástrico (Hansen y Witte,
2008), sugiriéndosele un papel como señalizador sensorial de los procesos intraluminales y
protector de la mucosa gástrica. Los efectos secretores intestinales de la 5HT parecen ser
mediados por receptores epiteliales tipo 5HT2 y probablemente por receptores neuronales
de los tipos 5HT1b, 5HT3 y 5HT4 (Gershon, 2003; Gerson y Tack, 2007).
Con respecto al control de la motilidad intestinal, la 5HT actuaría como modulador
del patrón cíclico de motilidad originado por los complejos motores migratorios (Plaza,
2001). Así, las acciones más destacadas de la 5HT implican aumento de la contractilidad
del TGI, interviniendo los receptores del tipo 5HT2a presentes en las células musculares
lisas y los 5HT3 y 5HT4 que estarían predominantemente en neuronas colinérgicas (Briejer
et al., 1995; Woollard et al., 1994). La 5HT también puede producir relajación de la pared
intestinal mediante la liberación de neurotransmisores inhibidores, o por efectos directos
sobre las células musculares. Se ha sugerido que los receptores 5HT2-like, 5HT4 y/o 5HT7
podrían mediar esta acción relajadora (Briejer et al., 1995).
En los peces la 5HT también es un importante modulador de la contractilidad
intestinal, con efectos predominantemente estimuladores en la mayoría de las especies de
peces, incluyendo ciclóstomos, elasmobranquios y teleósteos (Johnels y Östlund, 1958;
Young, 1980, 1982; Nilsson y Holmgren, 1983; Jense y Holmgren, 1994; Velarde et al.,
2010b). En la trucha arco iris, se ha sugerido que los receptores involucrados en la
contracción muscular son los 5HT2, ya que ni los antagonistas 5HT1 ni los 5HT3,
modificaron la respuesta contráctil inducida por 5HT (Burka et al., 1989). Además, en esta
especie el efecto de la 5HT puede ser directo sobre la musculatura lisa. En contraste, la
estimulación de neuronas colinérgicas podría mediar parcialmente el efecto intestinal de
5HT en otros teleósteos (Jensen y Holmgren, 1991).
Estudios recientes en el carpín han demostrado que la contracción inducida por
5HT es bloqueada por metisergida, un antagonista general de receptores de 5HT. También
la presencia de atropina (antagonista de receptores muscarínicos) bloquea la respuesta
intestinal a la 5HT, sugiriendo la implicación de la transmisión colinérgica (Velarde et al.,
2010b). Sin embargo, estudios previos en la trucha arco iris muestran que ni la atropina ni
la TTX afectan la contractibilidad generada por 5HT (Grove y Campbell, 1979; Holmgren
et al., 1985), en contra de lo visto en el bacalao (Burka et al., 1989; Grove y Holmgren,
1992a). Por tanto, existen diferencias inter-específicas en los mecanismos que integran la
respuesta serotoninérgica en el intestino, pudiendo variar dependiendo de las
características anatomo-funcionales (ej., presencia/ausencia de estómago) o de la dieta de
cada especie.
37
Introducción
3.4. La melatonina en el TGI: presencia, origen y distribución
La melatonina fue detectada por primera vez en el TGI mediante cromatografía de
papel en mucosa inflamada del apéndice humano (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; 1976).
Posteriormente, empleando técnicas inmunohistológicas se confirmó su presencia en todos
los segmentos del TGI de roedores, incluyendo esófago, estómago y diferentes regiones
intestinales (Bubenik et al., 1977; Holloway et al., 1980). Las primeras mediciones que se
llevaron a cabo mediante RIA (Vakkuri et al., 1985; Bubenik, 1980) revelaron la existencia
de elevadas concentraciones de melatonina en el TGI de roedores y aves, sobrepasando
ampliamente (de 10 a 100 veces) las halladas en el plasma. Estudios posteriores con la
misma técnica (Bubenik y Brown, 1997; Bubenik et al., 1999) y con HPLC (Huether et al.,
1992; Huether, 1994) confirmaron dichos resultados. Comparado con la glándula pineal, se
estimó que la concentración de melatonina en TGI sería del orden de unas 20 veces más
baja (Messner et al., 2001), aunque la cantidad total de melatonina producida en el TGI
podría ser 400 veces mayor que la presente a nivel pineal (Huether, 1993).
El origen de la melatonina presente en el tejido gastrointestinal permaneció en
entredicho durante años, barajándose la posibilidad de una síntesis local in situ, frente a
otros estudios que apoyaban la idea de que la melatonina de origen pineal secretada a la
circulación periférica podría acumularse en el TGI. De hecho, en estudios donde se
administró melatonina por vía peritoneal y oral se halló un aumento de los niveles de la
hormona en el TGI, lo que fue interpretado como un papel de dichos tejidos como
reservorio de melatonina, especialmente de aquella sintetizada en la glándula pineal
(Bubenik, 1980; Huether et al., 1998; Messner et al., 1998). No obstante, varios estudios
con animales pinealectomizados parecen indicar que al menos parte de la melatonina
presente en el intestino podría ser de formación local e independiente de la de origen
pineal. Así, en aves y ratas, la pinealectomía reduce los niveles de melatonina en plasma,
pero no los de melatonina en el intestino (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997; Van`t
Hof y Gwinner, 1999). Adicionalmente, en ratas tratadas oralmente con Trp se hallaron
incrementos de unas 6 veces en los niveles de melatonina en el órgano pineal y de unas 10
veces en el intestino y el hígado (Bubenik, 2006). En esta situación, la pinealectomía
reduce los niveles de melatonina en el plasma sin afectar a los presentes en el tejido
intestinal, lo que indirectamente apoya la existencia de una síntesis activa de la hormona en
el propio TGI, que es inducida por el aminoácido precursor (Yaga et al., 1993). Otro dato
que respalda fuertemente esta posibilidad es la presencia de las dos enzimas finales del
proceso de formación de la hormona (AANAT y HIOMT), que ha sido demostrada
inicialmente por métodos enzimológicos en la mucosa digestiva (Quay y Ma, 1976) y más
recientemente mediante técnicas moleculares que han permitido evaluar la expresión de
AANAT en numerosos tejidos periféricos, incluidos el estómago y el intestino de la rata
(Stefulj et al., 2001).
El contenido de melatonina en el TGI varía tanto entre especies como entre las
diferentes regiones digestivas. Por ejemplo, en la rata las concentraciones más bajas se
38
Introducción
encontraron en yeyuno e íleon, siendo más altas en el ciego y todavía mayores en colon y
recto (Bubenik et al., 1977). Mientras, en el ratón los mayores niveles fueron encontrados
en el estómago, seguido del íleon, yeyuno y colon (Bubenik et al., 1992). En fetos bovinos
las mayores concentraciones de melatonina GI, se encontraron en el colon en comparación
con el resto de los segmentos estudiados (Bubenik et al., 2000a), mientras en adultos no se
hallaron diferencias antero-posteriores (Bubenik et al., 1999). Sin embargo en el cerdo, se
encontraron valores más elevados en el intestino posterior (ciego y colon) que en el
anterior (Bubenik et al., 1999). Las variaciones regionales de las concentraciones de
melatonina en el TGI y la variabilidad interespecífica indican que, aún estando presente en
todos los segmentos del TGI, sus niveles podrían tanto estar sometidos a influencias
reguladoras diversas y de diferente origen. A nivel de circulación digestiva, los niveles de
melatonina fueron más elevados en la vena portal que en la circulación sistémica, siendo
incrementados tras administrar Trp, mientras que el ligamiento parcial de la vena hepática
los redujo en el TGI de la rata (Huether et al., 1992).
Los primeros estudios histológicos realizados en humanos y otros mamíferos
(perro, rata, ratón) para localizar la melatonina el TGI señalaron una presencia preferente
de la hormona en las CE (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; Bubenik et al., 1977; Raikhlin et al.,
1978), las cuales pueblan densamente el epitelio de la mucosa intestinal y producen el 95%
de la 5HT intestinal. Dada la relación metabólica entre melatonina y 5HT se asume en
mamíferos que estas células son la principal fuente de producción de melatonina intestinal
(Kvetnoy et al., 2002; Konturek et al., 2007). A pesar de estos resultados, no hay trabajos
actuales que colocalicen con precisión melatonina y serotonina en el TGI ni que muestren
una distribución tisular específica de la síntesis de la hormona dentro de la pared digestiva.
Bubenik et al., (1999) en estudios en tracto digestivo de vacas y cerdos, mostraron la
presencia de melatonina en las capas mucosa y muscular, aunque con valores mayores en
la primera. También demostraron la presencia de una elevada cantidad de melatonina
(altamente lipofílica) en el fluido luminal, la cual podría proceder de su vertido desde el
tejido al lumen e incluso, en parte, ser producida por la flora microbiana intestinal.
En los peces, estudios iniciales de Gern et al. (1986) no detectaron melatonina en el
intestino de la trucha arco iris, relacionando este hecho con la baja presencia de células que
contienen serotonina en el TGI de los peces en comparación con los tetrápodos. Sin
embargo, Bubenik y Pang (1997) aportaron las primeras evidencias de la presencia de
melatonina en todos los segmentos del TGI de esturiones, carpas y trucha arco iris,
indicando que algunas de estas especies poseen la capacidad de convertir 5HT en
melatonina. Estos autores hallaron la mayor concentración de melatonina en el intestino
proximal de las tres especies, seguido del intestino distal, el esófago y el estómago.
Estudios in vitro más recientes de Lepage et al. (2005a) en intestino de trucha arco
iris muestran que la melatonina es producida in situ en el tejido intestinal y que dicho
proceso no sufre inhibición por producto (melatonina acumulada en el medio de cultivo).
Asimismo, nuestro grupo ha demostrado, por primera vez en los peces, la presencia en el
39
Introducción
TGI de la trucha arco iris del transcrito de la enzima AANAT2 (Fernández-Durán et al.,
2007). En este trabajo se pudieron localizar los productos de expresión del gen en la mayor
parte de las regiones del TGI (esófago, estómago, ciegos pilóricos e intestino proximal,
medial y distal) y su expresión diferencial en la pared muscular y la capa mucosa. Este
hecho puede resultar relevante para comprender el origen de la hormona a nivel
gastrointestinal, facilitando la compresión de sus mecanismos de regulación. Además,
Velarde et al. (2010a) observaron tanto la presencia de los transcritos de AANAT2 y
HIOMT2 en el intestino del carpín, como la existencia de ritmos diarios de su expresión en
intestino posterior e hígado, que dependieron de las condiciones de luz ambiental. Por
último, Velarde (2010) describió en su tesis doctoral las características enzimáticas de la
AANAT en el intestino y el hígado del carpín, viendo una fuerte presencia de AANAT1 en
función de sus preferencias por el sustrato, variaciones día/noche (mayor actividad durante
el día) y un patrón regional en la distribución de dicha actividad enzimática en el intestino.
Conviene señalar, también, que aunque en peces se sabe que la 5HT está presente y
ejerce importantes funciones reguladoras en el intestino (Caamaño-Tubio et al., 2007), no
existen estudios concretos que relacionen la presencia de melatonina con células que
contienen 5HT, ni que profundicen en la relación metabólica entre ambos indoles.
3.5. Regulación de la síntesis de melatonina gastrointestinal
Los estudios de regulación de la síntesis de melatonina en el TGI se han centrado
en la existencia de variaciones diarias en su contenido y la influencia del alimento,
considerando de este último diferentes aspectos relacionados con la ingesta, el paso del
alimento por el tracto digestivo y la influencia del aminóacido L-Trp, entre otros. Con
respecto a las existencia de ritmos diarios en los niveles de melatonina en TGI, los
resultados varían en función de la especie y de la región del TGI estudiada (Vakkuri et al.,
1985; Bubenik et al., 1992; Bubenik y Brown, 1997; Bubenik et al., 1998). Por ejemplo,
Bubenik (1980) no observó cambios diarios significativos en los niveles de melatonina en
TGI de la rata, mientras que en el ratón se describieron variaciones día:noche en yeyuno
(mayor concentración durante la noche) pero no en otras regiones intestinales (Bubenik et
al., 1993). En los peces no existen referencias sobre ritmos de melatonina intestinal, si bien
Velarde et al. (2010a) describen ritmos diarios de expresión de AANAT2 y de HIOMT2 en
intestino posterior e hígado del carpín. Los ritmos de expresión de AANAT2 en intestino
posterior no se alteraron en condiciones de luz y oscuridad constante, sugiriendo su
dependencia de un oscilador circadiano periférico. No obstante, no hay pruebas claras que
indiquen que ello pueda condicionar la aparición de variaciones rítmicas de melatonina
intestinal, ni de cómo pueden verse afectados los niveles plasmáticos de la hormona.
Otro posible factor regulador de la síntesis de melatonina en el TGI es el alimento.
Bubenik et al., (1992) observaron que en ratones ayunados durante 24 y 48 horas aumentó
40
Introducción
el contenido de melatonina en estómago e intestino (especialmente en colon), así como en
el plasma sanguíneo, mientras que disminuían en el cerebro. Además, el ayuno provocó un
aumento de los niveles de 5HT y de metabolito (5HIAA) en intestino, probablemente
asociado a un incremento del contenido local de L-Trp. A nivel plasmático, el aumento de
los niveles de melatonina coincide con el hallado tras la ingesta por De Boer et al. (1988)
en cerdo, así como por Rice et al. (1995) en saliva de humanos. Por otra parte, en el cerdo
se ha señalado que la ingesta de alimento (realimentación tras ayuno) resulta en un rápido
aumento de los niveles plasmáticos de melatonina en diversos segmentos del TGI. A nivel
digestivo, este efecto se asoció con el tránsito del alimento, dado que dependió del tiempo
post-ingesta. Asimismo, en el íleon se encontró una relación entre el contenido luminal
acumulado en el tracto y los niveles de melatonina en el tejido digestivo (Bubenik et al.,
1996). La ingesta de alimento también incrementa rápidamente los niveles de melatonina
en la vena porta (Huether et al., 1992; Bubenik et al., 2000b). En los peces los pocos
antecedentes relativos al efecto de la alimentación señalan una tendencia a aumentar el
contenido intestinal de melatonina a las 3 y 8 horas tras la ingesta en la lubina, sin cambios
en su contenido biliar (Herrero et al., 2007).
La composición del alimento, específicamente la presencia de L-Trp, es un factor
que parece afectar a la síntesis de melatonina en el TGI. En mamíferos, la administración
oral del aminoácido genera un aumento de melatonina en el TGI (Bubenik, 1980; Bubenik
et al., 1998; DeBoer, 1988, Huether et al., 1992). Huether et al. (1992) demostraron que
este efecto del L-Trp se reduce fuertemente tras ligadura de la vena porta, sugiriendo una
dependencia del aporte nutricional del aminoácido por vía sanguínea. Por otro lado, en la
trucha arco iris la dieta suplementada con L-Trp generó un aumento de los niveles
plasmáticos de melatonina durante el día (Lepage et al., 2005a), lo que concuerda con el
incremento en la producción de hormona en segmentos intestinales cultivados in vitro en
presencia de diferentes concentraciones del aminoácido. Sin embargo, en la lubina la
administración de L-Trp en la dieta no parece afectar a los niveles de melatonina intestinal,
ni a los plasmáticos, aunque si aumenta los niveles plasmáticos de 5HT (Herrero et al.,
2007).
3.6. Papel fisiológico de la melatonina en el TGI
Receptores de melatonina
Mediante técnicas de autorradiografía se detectaron sitios de unión de melatonina
en el TGI de diversas especies de mamíferos y aves (Bubenik et al., 1993; Lee y Pang,
1993), mayoritariamente en la capa de mucosa y las vellosidades intestinales. No obstante,
la presencia de los potenciales receptores de melatonina parece depender de la zona del
TGI. Así, en rata la mayor densidad de receptores MT1 se observa en la zona del duodeno,
seguido de ileón y yeyuno. En el pato ocurre algo similar siendo la densidad de receptores:
41
Introducción
íleon, yeyuno> duodeno, colon> ciegos> esófago (Lee y Pang, 1993). Específicamente en
humanos se han identificado sitios de unión en la mucosa de yeyuno y colon (Pontoire et
al., 1993; Poon et al., 1996).
Además de la capa de mucosa, también se ha descrito la presencia de sitios de
unión de melatonina en las capas submucosa y muscular de la pared del TGI (Bubenik et
al., 1993; Chow et al., 1996; Lee y Pang, 1993), aunque en menor número que en la
mucosa. Por ello se ha propuesto que la melatonina, cuya producción en mamíferos se
asocia mayormente a la capa mucosa, podría llegar a capas más profundas a través de
vasos sanguíneos y actuar regulando la musculatura intestinal (Bubenik, 2001). Estudios
recientes en rata muestran la distribución diferencial de dos subtipos de receptores de
melatonina, MT1 y MT2, de forma que los MT1 se asociarían a la mucosa y submucosa,
mientras que los MT2 se localizarían en la capa muscular (Stebelová et al., 2010). Esta
distinta la ubicación de los receptores podría asociarse a diferentes funciones de la
melatonina en el TGI.
En peces, Kulczykowska et al., (2006) han descrito la presencia de lugares de unión
de 2-[125I]Iodomelatonina en el TGI de tres especies de teleósteos (trucha arco iris,
lenguado y dorada), apoyando la idea del potencial papel fisiológico de la melatonina
gastrointestinal, posiblemente similar entre los vertebrados. Más recientemente, Confente
et al., (2010) detectaron la expresión del receptor MT1 en el intestino del lenguado, siendo
esta mayor a media noche. En el carpín, las evidencias farmacológicas utilizando
antagonistas (luzindol y 4-P-PDOT) sugieren la existencia de dos subtipos de receptores
melatoninérgicos, de alta y baja afinidad respectivamente (Velarde et al., 2009b).
Acciones fisiológicas de la melatonina intestinal
La mayor parte de los estudios sobre la función de la melatonina en el TGI se han
centrado en su papel como potencial regulador de la motilidad. Ya en 1965 Quastel y
Rahamimoff mostraron en estudios in vitro que la melatonina reducía las contracciones
inducidas por 5HT en el duodeno de rata, lo que fue confirmado posteriormente en
estómago (Fioretti et al., 1974), yeyuno e íleon (Bubenik, 1986) y algunas regiones del
colon (Harlow y Weekly 1986), indicándose su dependencia del Ca2+ y su relación con
mecanismos mediados por canales de K+ (Kachi et al., 1999; Storr et al., 2000). En
preparaciones de musculatura lisa intestinal se ha observado que la melatonina reduce la
frecuencia de contracciones espontáneas (Quastel y Rahamimoff, 1965; Bubenik, 1986;
Merle et al., 2000). Otros estudios in vivo también describieron el efecto relajante de la
melatonina sobre el músculo liso visceral, contrarrestando el efecto facilitador de la 5HT
sobre el tiempo de tránsito del alimento en ratones (Bubenik y Dhanvantari, 1989).
Algunos autores indicaron que la 5HT y la melatonina podrían ejercer una acción
reguladora negativa mutua, siendo la melatonina un inhibidor natural de la 5HT en el
intestino (Bubenik, 1986; Harlow y Weekly, 1986; Reyes-Vázquez et al., 1997). Sin
42
Introducción
embargo, otros estudios señalan un efecto estimulador de la melatonina sobre la
contractilidad intestinal (Drago et al., 2002).
En peces, los estudios de Velarde et al. (2009b) en el carpín demuestran la
necesaria presencia de Ca2+ en el medio extracelular para que la melatonina, de manera
dosis-dependiente, relaje la contracción de la musculatura intestinal inducida por ACh.
Este grupo también demostró el efecto inhibidor de la melatonina sobre la contracción de
la musculatura intestinal inducida por 5HT en el carpín (Velarde et al., 2010b), asi como
que los antagonistas específicos de receptores de alta afinidad de melatonina bloquearon
parcialmente estos efectos. Otra vía por la cual la melatonina generaría su efecto relajante
sería el sistema nitrogénico (NO), si bien no parece tan eficaz como las anteriores (Velarde
et al., 2011). No existen datos concretos sobre la regulación de la motilidad intestinal por
melatonina en otros teleósteos.
Al margen de su papel en la motilidad, la melatonina intestinal también podría
regular otras funciones digestivas, por ejemplo, estimulando la secreción de bicarbonato en
el duodeno y las secreciones pancreáticas (Jaworek et al., 2004; Bubenik, 2006). Por otra
parte, se ha indicado que tanto la administración de melatonina como la pinealectomía
tienen influencia sobre la actividad mitótica epitelial del TGI (Bogoeva et al., 1998;
Callaghan, 1991), pudiendo existir mediación vagal o simpática (Callaghan, 1995).
La melatonina es un potente neutralizador de radicales libres (Stankov y Fraschini,
1993) ejerciendo por tanto una acción protectora frente al daño oxidativo. Existen diversos
trabajos acerca del papel protector de la melatonina en el intestino. Por ejemplo, la
melatonina aplicada intragástricamente en rata protege la mucosa contra el daño producido
por sustancias como el sulfato dextrano sódico (Pentney y Bubenik, 1995). También parece
ser efectiva en la prevención de úlceras gástricas inducidas por estrés o por etanol,
atribuyéndosele una acción antiserotoninérgica (Otsuka et al., 2001; Melchiorri et al.,
1997; Ercan et al., 2004). La melatonina también parece proteger la mucosa intestinal
estimulando la secreción de bicarbonato, con la posible mediación de receptores MT2
localizados en los enterocitos (Sjoblom et al., 2001). También se ha propuesto que podría
actuar mejorando la microcirculación del epitelio digestivo (Malinovskaja et al., 2001) o
reduciendo la formación de productos de la peroxidación lipídica (Akbulut et al., 1997).
3.7. La melatonina en el sistema hepatobiliar
El hígado es el principal lugar de metabolización de la melatonina, que es
mayormente degradada a 6-hidroximelatonina (Kachi y Kurushima, 2000). Pardridge y
Mietus (1980) señalan que el 92-97% de la melatonina circulante se degrada en su primer
paso por el hígado, si bien estudios más recientes no confirman estos resultados si no que
sugieren que una cierta cantidad de melatonina circulante puede escapar a la
metabolización hepática (Huether et al., 1998; Bubenik et al., 2000a). Se han estimado en
43
Introducción
el hígado concentraciones de melatonina 15 veces superiores a las del plasma (Messner et
al., 2001), con niveles elevados de la hormona en los hepatocitos (Menendez-Pelaez, et al.,
1993).
Mediante RIA (confirmado por HPLC) se ha visto que la bilis concentrada de
mamíferos posee altas concentraciones de melatonina (2 a 11 ng/ml), 2-3 veces superiores
a las presentes durante el día en el plasma y 10-40 veces las observadas en la mucosa del
TGI de cerdo y vaca (Bubenik et al., 1999). Por otro lado, Messner et al. (2001) han
descrito niveles de hormona mucho más bajos (sobre 85 pg/ml) en la bilis no concentrada
humana, similares a los detectados en plasma. No existe una clara definición de la función
de la melatonina biliar si bien, debido a su alta capacidad antioxidante, podría participar en
la prevención el daño oxidativo que provocan los ácidos biliares y los derivados oxidados
del colesterol en la mucosa de la vesícula biliar y del TGI (Tan et al., 1999).
En los peces, Herrero et al. (2007) describen la existencia de altas concentraciones
de melatonina en la vesícula biliar de la lubina (desde 803 a 2287 pg/ml), la cuales no
fueron afectadas por una dieta enriquecida con L-Triptófano. Sin embargo, las lubinas que
recibieron alimento suplementado con melatonina presentaron niveles 40 veces superiores
a los de peces alimentados con la dieta estándar (Herrero et al., 2007), indicando que la
bilis podría actuar como reservorio de parte de la melatonita administrada.
4. LA TRUCHA ARCO IRIS COMO MODELO DE PEZ TELEÓSTEO
Para la realización de los experimentos se ha utilizado la trucha arco iris, especie
que sirve habitualmente como modelo experimental de pez teleósteo y de la que se posee
abundante información sobre sus mecanismos de regulación fisiológica.
La trucha arco iris (Onchorhynchus mykiss, Walbaum, 1792) es un teleósteo de la
familia Salmonidae (Orden Salmoniformes) que engloba unas setenta especies de tres
subfamilias, Coregoninae, Thymallinae y Salmoninae. En esta última se incluyen los
géneros Brachymystax, Hucho, Parahucho, Salmo, Salvethymus y Salvelinus, además del
género Oncorhynchus, si bien existe cierta controversia (Grewe et al., 1990; Phillips et al.,
1992; Oakley y Phillips, 1999; Matveev et al., 2007). Incluida originariamente en el género
Salmo como Salmo gairdneri, la trucha arco iris es originaria de la costa Pacífica
norteamericana, habitando una franja comprendida entre el Norte de México y Alaska
(Smith y Stearly, 1989). Desde 1874 se introdujo para cultivo y uso recreacional en las
aguas de todos los continentes, excepto la Antártica. Así, la trucha arco iris llegó a Europa
a partir de stocks importados de América a finales del siglo XIX. Presenta dos variedades
conocidas como ―rainbow‖ (arco iris) y ―steelhead‖ (cabeza de acero). Esta última es la
forma anádroma de la especie.Pese a que no migra de forma natural al mar puede adaptarse
al medio marino, mostrando tasas de crecimiento superiores a las medidas en agua dulce.
44
Introducción
Figura 12. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss).
Debido a su resistencia relativamente elevada a altas temperaturas (óptimo de
crecimiento por debajo de los 21ºC) y bajos niveles de oxígeno y a su alta tasa de
crecimiento (puede pesar entre 7 y 10 Kg en el mar en tan solo 3 años frente a los 4,5 kg en
agua dulce), la trucha arco iris se ha convertido en una especie de gran importancia en la
industria de la acuicultura (McKay y Gjerde, 1985). Estas mismas razones, que facilitan su
supervivencia en cautividad, hacen de la trucha una de las especies de peces teleósteo más
empleadas en investigación científica. Se utiliza de forma habitual como modelo
experimental de pez teleósteo ya que existe abundante información sobre sus mecanismos
fisiológicos (Smith et al., 1991). A nivel de estudios circadianos, se conocen sus
comportamientos locomotor y alimenticio, eminentemente diurnos (John, 1983; Bolliet,
2001). También es bien conocidad la fisiología del órgano pineal y de diferentes aspectos
de la regulación de la producción de melatonina (Morton y Forbes, 1988; Falcón, 1999,
Ceinos et al., 2005, 2008).
45
Objetivos
Objetivos
Objetivos
En vertebrados, la síntesis de melatonina que ocurre rítmicamente en el órgano
pineal y la retina es fundamental para mantener los ritmos de la hormona en plasma y su
papel como potente regulador de los ritmos diarios y estacionales. Desde hace ya tres
décadas han ido aumentando las evidencias sobre la existencia de una síntesis extrapineal
de melatonina, muy extensa en cuanto a su localización, abarcando órganos tales como la
piel, células del sistema inmune, ovario y tracto digestivo, entre otros. Específicamente en
mamíferos se han realizado estudios de cierta profundidad sobre la presencia de melatonina
en el TGI, su independencia de la producción pineal/retinal y la influencia que puede tener
en los niveles de melatonina en el plasma (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). Todos
estos datos permitieron postular la existencia de una síntesis activa de melatonina en el
TGI. Esta síntesis en mamíferos se asocia a las células enterocromafines del epitelio
intestinal que contienen gran cantidad de serotonina, y está afectada por señales relativas al
proceso de alimentación. También se han sugerido diversas implicaciones para la
melatonina en la fisiología digestiva (regulación de la motilidad y secreciones, función
protectora, etc.), así como en aspectos patológicos relativos al TGI (Bubenik, 2002). A
pesar de ello, los mecanismos de actuación de la hormona a nivel digestivo no han sido
explorados en profundidad.
En vertebrados no mamíferos la información existente sobre la melatonina
gastrointestinal es escasa. No obstante, hay evidencias de que la melatonina está presente
en el TGI de peces (Bubenik, 1997), siendo probablemente de origen local (Lepage et al.,
2005a, Fernández-Durán et al., 2007; Velarde et al., 2010a). Sin embargo se conoce muy
poco de su regulación ambiental y de la interacción con factores relacionados con la
actividad alimenticia y digestiva. Aunque hay estudios que demuestran un papel de la
melatonina en la actividad contráctil en teleósteos, estos se limitan a una sola especie, el
carpín (Velarde et al., 2009b).
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo general de la presente Tesis
Doctoral es caracterizar la producción intestinal de melatonina en la trucha arco iris
como modelo de pez teleósteo, así como su regulación por factores asociados al ambiente
lumínico y la alimentación. Además, se estudió la implicación de la hormona en la
49
Objetivos
modulación de la actividad contráctil intestinal. Este objetivo se ha desglosado en cinco
líneas de actuación:
1.- Cuantificación de los niveles de melatonina en el tracto gastrointestinal de la trucha
arco iris. No planteamos elaborar un método analítico sencillo de HPLC que facilite la
determinación de melatonina en diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos.
2.- Localización de los lugares de síntesis de melatonina en el TGI. En base al uso de
diferentes técnicas (HPLC, qPCR, inmunohistoquímica) se pretende estudiar la
distribución de los niveles de melatonina, de los enzimas de su síntesis y de las células
melatoninérgicas, así como su relación con la serotonina en el TGI de la trucha.
3.- Regulación de la producción gastrointestinal de melatonina por el fotoperiodo y el
alimento. En primer lugar se pretenden establecer los patrones diarios de síntesis de
melatonina y la influencia del ambiente lumínico, tratando de esclarecer una posible
regulación circadiana de este proceso. En segundo lugar, se pretende estudiar si la ingesta y
la presencia de alimento en el TGI condicionan la síntesis de la hormona en lugares
intestinales y órganos asociados a la función digestiva.
4.- Efecto del L-triptófano sobre la producción de melatonina a nivel gastrointestinal:
relación entre la síntesis de serotonina y de melatonina. Con este objetivo se trata de
constatar hasta qué punto la presencia de L-Trp en la dieta y/o tras su administración
parenteral, puede afectar a la síntesis intestinal de melatonina. De forma adicional, se
desarrollarán estudios in vitro sobre segmentos de intestino para profundizar en la relación
entre los procesos de síntesis de serotonina y de melatonina a nivel celular.
5.- Estudio de la función de la melatonina sobre la contractilidad del músculo liso
intestinal. Se pretende caracterizar la respuesta contráctil intestinal a la melatonina,
comparándola con la que ejercen distintos agentes reguladores de la motilidad (Ach y
5HT). Además, se tratará de buscar el mecanismo de acción de la hormona a través de
receptores de membrana, así como la posible interacción con otros neurotransmisores que
regulan la actividad motora intestinal en la trucha.
50
Trabajos Experimentales
Trabajo Experimental 1
Determinación de melatonina en plasma, bilis y tejidos
del TGI de la trucha arco iris, mediante un método de
HPLC con detección fluorimétrica
Trabajo Experimental 1
Introducción y objetivos
La melatonina (n-acetil-5-metoxitriptamina) es una hormona sintetizada en las
células fotorreceptoras de la glándula pineal y de la retina en la mayoría de los vertebrados
y está relacionada con la regulación de numerosas funciones que tienen en común una
expresión rítmica (Reiter, 1993; Falcón, 2007). La melatonina es sintetizada a partir de la
5HT, la cual es sometida a N-acetilación y posterior metilación. En la mayoría de las
especies estudiadas, el incremento de la actividad enzimática AANAT durante la noche
parece ser la responsable de los ritmos diarios observados en los niveles de melatonina
(Klein et al., 1996; Ceinos et al., 2005).
Varios trabajos recientes han puesto de manifiesto la presencia de melatonina en
tejidos periféricos y fluidos corporales, como las células del sistema inmune (Carrillo-Vico
et al., 2004), la piel (Kobayashi et al., 2005; Slominski., 2008), las gónadas (Tijmes et al.,
1996; Itoh et al., 1997) y el TGI (Huether, 1993; Bubenik et al., 2000a). En relación con el
TGI, se ha hipotetizado que la melatonina sintetizada a este nivel podría contribuir a
mantener los niveles circulantes de la hormona (Bubenik et al., 1999; Messner et al.,
2001). En los humanos, también se ha detectado la presencia de melatonina en la bilis, el
hígado y en la circulación portal, por lo que se ha sugerido que podría realizar una acción
mediadora bidireccional entre las funciones intestinales y hepáticas (Bubenik, 2002).
Además, la melatonina del TGI podría también estar implicada en la regulación de
numerosas funciones, como la contracción de la musculatura lisa, la ingesta de alimento, el
transporte de electrolitos, e incluso tener un efecto antioxidante debido a su capacidad
como aceptor de radicales libres (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). En peces pocos
estudios han evaluado el contenido de melatonina en el TGI.
Debido a que los niveles diurnos de melatonina son muy bajos, particularmente en
el plasma, se han tenido que desarrollar metodologías analíticas más sensibles y precisas
que permitan su detección. La mayor parte de los estudios existentes cuantifican la
melatonina en muestras de pineal, retina y plasma mediante radioinmunoensayo (RIA),
técnica altamente sensible y que también ha sido empleada para la cuantificación de
melatonina en el TGI de mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces (Huether, 1993;
Bubenik et al., 2000; Bubenik y Pang, 1997). Como alternativa al uso de radioisótopos, se
emplearon de forma satisfactoria las técnicas de espectrometría de masas (GC-LC/MS) y
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Harumi y Matsushima, 2000). Con
respecto a los sistemas de HPLC, es habitual el uso de detectores electroquímicos de alta
sensibilidad (Vieira et al., 1992; Harumi y Matsushima, 2000; Chanut et al., 1998). Sin
embargo, ello acarrea el problema de que la oxidación/reducción de la melatonina requiere
de la aplicación de altos potenciales eléctricos (0.5-1 voltio), con el consiguiente
incremento del ruido de fondo, inestabilidad del sistema y disminución de la sensibilidad.
El uso de detectores de fluorescencia (FD) que, aún no siendo tan sensibles como los
electroquímicos, ha permitido aprovechar las características de fluorescencia naturales de
dicha molécula para llegar a su cuantificación en muestras complejas (por ejemplo, plasma,
55
Trabajo Experimental 1
y tejidos centrales y periféricos). Habitualmente dichos procedimientos requieren de una
extracción y concentración previa de la muestra, dado su bajo contenido en melatonina
(Bechgaard et al., 1998;Kulczykowska y Iuvone, 1998; Iiunuma et al., 1999; Sastre-Toraño
et al., 2000; Rizzo et al., 2002; Hamase et al., 2004), lo que suele encarecer y enlentecer el
procedimiento analítico.
El objetivo del presente Trabajo fue desarrollar un método de HPLC con detección
fluorimétrica altamente sensible, sencillo y reproducible, a la vez que económico, que
permita cuantificar la melatonina presente en fluidos (plasma y bilis) y tejidos periféricos
(intestino) de la trucha arco iris.
Materiales y métodos
Reactivos
La melatonina utilizada para la preparación de los estándares fue obtenida de Sigma
(St. Louis, MO, USA). El cloroformo y el acetonitrilo (grado HPLC) fueron comprados a
VWR Prolabo (Fontenay sous bois, Francia). Se prepararon soluciones stock de melatonina
a una concentración de 50 ng/ml en etanol-agua (1:10 v/v) y se mantuvieron a -4ºC. A
partir de esta solución se prepararon diariamente soluciones patrón a la concentración de 5
ng/ml, diluyendo en fase móvil.
Animales de experimentación y recolección de muestras
Para el presente trabajo se utilizaron truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss)
sexualmente indiferenciadas con un peso medio de 99 ± 12 g (media ± E.E.M.). Los
animales fueron obtenidos en una piscifactoría situada en Soutorredondo (Lousame, A
Coruña) y se transportaron en tanques dotados de suministro continuo de oxígeno hasta las
instalaciones en la Facultad de Biología de la Universidad de Vigo, donde se mantuvieron
en cubas de fibra de vidrio de 120 litros, dotadas de sistemas de circulación continua de
agua y difusión de aire en cada cuba. Los peces fueron aclimatados a condiciones
artificiales de iluminación, 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12, encendido
de las luces a las 8:00 h a.m.) y con una intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del
agua durante la fotofase. La temperatura del agua se mantuvo en 14 ± 1ºC durante todo el
periodo experimental. Las truchas fueron alimentados una vez al día (11:00 h) con pienso
seco comercial especial para trucha (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, Spain). Todos los
experimentos cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión
Europea (86/609EU), así como con las leyes españolas para el uso de animales en
investigación (RD 1201/2005).
Para cuantificar las diferencias día: noche en el contenido plasmático y tisular de
melatonina, se tomaron muestras de peces sacrificados en las horas centrales del día (1256
Trabajo Experimental 1
14h) y de la noche (23-01h). Antes de cualquier manipulación, las truchas fueron
capturadas en el tanque y anestesiadas mediante inmersión en una solución de MS-222
(50mg/L) tamponada con bicarbonato sódico (500 mg/L).
Tras la anestesia de los animales, se procedió a la toma de muestras, comenzando
por la extracción de sangre (1ml) que se llevó a cabo por punción directa en la vena caudal,
con aguja humedecida en heparina. La sangre recogida fue centrifugada a 13200 rpm
durante 10 minutos, para luego separar los plasmas sanguíneos (500-600µl por pez) que
fueron congelados a -80ºC hasta su posterior procesado. Una alicota (200 µl) de cada uno
de los plasmas fue desproteinizada añadiendo 200 l de ácido perclórico 0.4 M, siendo
posteriormente centrifugadas (13200 rpm., 10 min). Al sobrenadante obtenido se le añadió
bicarbonato sódico, para ajustar su pH a 7.4, tras lo cual fue almacenado a -80ºC hasta su
posterior procesado.
Tras la toma de sangre, los animales fueron sacrificados mediante decapitación para
extraer muestras de bilis y TGI. La bilis (0.2-0.5 ml) fue obtenida directamente de la
vesícula biliar, mediante punción con jeringas. Por su parte las muestras de tejido
gastrointestinal fueron extraídas en condiciones de esterilidad y lavadas con solución salina
(NaCl 0.6%, p/v) a 4ºC. Inmediatamente después se separaron las diferentes regiones:
esófago, estómago, ciegos pilóricos y los intestinos anterior, medio y posterior. Todas estas
las muestras fueron inmediatamente congeladas en hielo seco y almacenadas a -80ºC hasta
su posterior procesado.
Extracción de melatonina en plasma, bilis y tracto gastrointestinal
Para poder cuantificar el contenido plasmático de melatonina se realizó una doble
extracción con cloroformo. Para ello, una alícuota de 200 l de cada muestra fue mezclada
(1:1 v:v) con tampón acético acetato 0.1M (pH 4.6). A continuación se añadieron 2 ml de
cloroformo, y se agitó la mezcla durante 1 minuto, siendo posteriormente centrifugada
(3800 rpm/15 min) para separar las fases orgánica y acuosa. Tras eliminar la fase acuosa
mediante aspiración, se añadieron 500 l de NaOH 0.1N y la mezcla se agitó durante 30
segundos. Tras una nueva centrifugación y aspiración de la fase acuosa, se procedió a
evaporar completamente la fase orgánica restante mediante corriente de aire a temperatura
ambiente, en ausencia de luz. El residuo resultante fue disuelto en 100 l de fase móvil y
filtrado (0.5m de tamaño de poro, Dismic-3, Toyo Roshi Kaisha). El producto obtenido
fue inmediatamente congelado a -80ºC hasta su posterior análisis. Para la cuantificación
del contenido en melatonina se inyectó una alícuota (50 l) del filtrado en el sistema de
HPLC. En el caso de muestras de bilis se utilizó un protocolo similar, con la salvedad de
que para la extracción se utilizó una alícuota de 100 l de bilis mezclada con un volumen
idéntico de tampón acético acetato. Además, solo se añadió 1 ml de cloroformo a la
mezcla.
57
Trabajo Experimental 1
Para la cuantificación de melatonina en el TGI de la trucha, las muestras de cada
región (40 a 50 mg) se homogenizaron mediante sonicación en 500 l de tampón acético
acetato y se centrifugaron a 13200 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Una fracción de 500 l
del sobrenadante se depositó en tubos de vidrio de 10 ml a los que se añadieron 2.5 ml de
cloroformo (1:5 v:v). Tras un periodo de agitación de 30 segundos, la mezcla se centrifugó
a 3800 rpm/15 min. La capa orgánica así obtenida fue sometida a un proceso de lavado,
para lo que se añadieron 500 l de NaOH 0.1N. Tras una nueva centrifugación, la fase
orgánica fue transferida a un tubo limpio y secada bajo una corriente de aire en ausencia de
luz. El residuo contenido en el fondo del tubo se disolvió en 100 l de fase móvil. A
continuación fue filtrado (0.5m) y congelado a -80ºC hasta su análisis. El contenido en
melatonina se evaluó en una alícuota de 50 l inyectada en el sistema de HPLC.
La eficiencia de la extracción fue determinada en muestras charcolizadas de
plasma, bilis e intestino. Para ello, se añadieron 50 mg de charcol por ml de plasma o bilis,
o del homogeneizado de intestino. Las muestras fueron agitadas durante 1 hora a 20ºC y
posteriormente sometidas a estabilización durante 24 horas a 4ºC. Transcurrido este
tiempo, las muestras fueron centrifugadas a 7000 rpm durante 45 minutos a 4ºC. Para
eliminar los restos de charcol, el sobrenadante se filtró dos veces a través de filtros con
tamaño de poro de 0.45m (Millex-HV, Millipore). Con el fin de realizar las curvas de
calibración sobre muestras charcolizadas, se añadieron diferentes concentraciones de
melatonina (5-500 pg/ml en plasma y bilis, y 5-200 pg/g en los tejidos intestinales) a las
muestras charcolizas, procediéndose a continuación a su extracción mediante el método
descrito previamente. La curva de calibración se realizó por triplicado para cada una de las
concentraciones y tejidos analizados.
Descripción del sistema HPLC y sus condiciones
El análisis de los niveles de melatonina se realizó mediante un sistema de HPLC en
fase inversa similar al descrito por Vieira et al., (1992), con modificaciones. El sistema
consistió en una bomba Gilson 321 conectada a un amortiguador de pulsos, a un inyector
Rheodyne 7725i (50 l) y a un detector de fluorescencia Jasco FP-1520, en el cual se
fijaron longitudes de onda de excitación y emisión de 285 y 360 nm, respectivamente. La
separación se llevó a cabo en una columna cromatografía Beckmann Ultrasphere ODS (75
x 4.6 mm y partículas de relleno de 3 m). La composición de la fase móvil fue acetato
sódico 30 mM, ácido acético 100 mM, ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA-Na2)
85.6 M y 20% de acetonitrilo (V/V). La fase móvil fue filtrada (0.20 m) y desgasificada
mediante burbujeo de helio, y el pH se ajustó a 4.7. Todos los ensayos se realizaron a
temperatura ambiente y a un flujo de 1 mL/min. Para su análisis, las muestras fueron
filtradas, inyectándose 50 l de cada una en el sistema de HPLC. La adquisición e
integración de los cromatogramas se realizó con ayuda del software Biocrom XP (Jasco
analítica, Madrid). La cuantificación de los picos de la muestras se estimó mediante la
comparación de las áreas de los picos con las de sus respectivos estándares.
58
Trabajo Experimental 1
Análisis estadístico de los resultados
Los datos fueron expresados como la media ± error estándar (E.E.M.) (N=815/grupo). Se utilizó un análisis de varianza ANOVA de una vía (Sigma Stat v3.0) para
verificar la presencia de diferencias significativas entre los grupos de muestras. En el caso
de la existencia de diferencias significativas se utilizó el test SNK de comparaciones
múltiples. En todos los caso, el grado de significación se estableció en P <0.05.
Resultados
Extracción de muestras y recuperación de la melatonina
La cuantificación de los niveles de melatonina en muestras complejas, tales como
sangre y otros fluidos corporales, requiere de una extracción previa que permita eliminar
las interferencias y a la vez concentrar el contenido de los componentes de interés
presentes en las mismas. Para ello se han descrito diversos protocolos de extracción, siendo
los más habituales el uso de disolventes orgánicos y la extracción en fase sólida (SPE)
empaquetada en columnas (Vieira et al., 1992). La SPE se ha mostrado como un proceso
selectivo para la extracción de melatonina, aunque es más costoso económicamente que los
solventes orgánicos. Además, cuando se usa sobre matrices biológicas complejas (ej.,
plasma, tejidos) requiere de una limpieza previa de la muestra para evitar el colapso de las
columnas. También se ha indicado que la tasa de recuperación de la melatonina en
cartuchos SPE es susceptible de variaciones según el fabricante y el batch de fabricación
(Harumi y Matsushima, 2000). Como alternativa, la extracción líquido-líquido con
solventes orgánicos tales como el cloroformo y el diclorometano, es un método más barato,
reproducible y fácilmente adaptable a diferentes tipos de muestras biológicas (fluidos,
tejidos). En nuestro caso se escogió la extracción con cloroformo, puesto que se comprobó
previamente que favorece la eliminación (o la no aparición) de residuos que podrían
generar interferencias con el pico de melatonina en el cromatograma.
Gracias a una doble extracción con cloroformo y un paso intermedio de limpieza de
la fase orgánica con 0.1 N NaOH se pudieron minimizar dichas interferencias, con lo que
no se hallaron picos que coeluyeron con la señal cromatográfica de la melatonina. Para
calcular la eficiencia de la extracción se utilizaron muestras charcolizadas de plasma, bilis
e intestino a las que se les añadió cantidades conocidas de melatonina (5, 50, 500 pg),
comparando la señal obtenida con la proporcionada por estándares normales. Las tasas de
recuperación fueron del 94  6 %, 89  5 % y 91  4 % para el plasma, el intestino y la
bilis, respectivamente (Tabla 1). También se obtuvieron valores similares de eficiencia en
la extracción de melatonina de muestras desproteinizadas de plasma.
59
Trabajo Experimental 1
Tabla 1. Valores de recuperación de melatonina en extractos de muestras de plasma, bilis y tejidos
del TGI de la trucha arco iris sobrecargadas con diversas concentraciones de la hormona.
[Mel] añadida
Plasma
(total)
Plasma
desproteinizado
Tejido intestinal
Bilis
5
94.2 ± 8.0
92.1 ± 6.0
86.1 ± 6.1
87.5 ± 3.7
10
96.3 ± 4.6
50
92.6 ± 3.9
100
98.5 ± 6.9
200
98.8 ± 2.3
500
95.3 ± 4.8
(pg/ml fluido o pg/g
tejido)
90.2 ± 7.1
91.6 ± 4.1
91.8 ± 4.5
93.0 ± 2.7
88.6 ± 3.7
93.6 ± 5.4
89.5 ± 5.3
94.6 ± 5.6
Los valores expresan el porcentaje de recuperación de las cantidades de melatonina añadidas a las
muestras. Los datos representan el promedio ± E.E.M. de tres muestras ensayadas para cada
concentración de melatonina.
Optimización y calidad del ensayo cromatográfico
Los perfiles de elución obtenidos a partir de la inyección de estándares de
melatonina y de los diferentes tejidos analizados se muestran en las Figuras 1 (plasma) y 2
(intestino y bilis). Tal y como se aprecia en las gráficas, no se observaron picos que
interfieran en la separación de la melatonina en ninguna de las muestras. En nuestro
sistema cromatográfico, hemos optado por columnas analíticas cortas (7.5 cm) y con
rellenos de pequeño tamaño (3 m partícula) dado que proporcionan un incremento en la
eficiencia, un menor tiempo de análisis y, por tanto, un coste más reducido. Bajo nuestras
condiciones experimentales, la retención de la melatonina en la fase estacionaria (C18) fue
9-10 minutos, si bien podría acortarse aún más, mediante el incremento en el porcentaje del
solvente orgánico.
Con el fin de evaluar la selectividad del sistema de HPLC-FD, se constató que la
señal cromatográfica producida por ciertos derivados 5‘-metilados relacionados
estructuralmente con la melatonina (5-metoxitriptamina, 5-metoxitriptofol y ácido 5metoxiindolacético) y que también son resueltos bajo estas condiciones cromatográficas
(Ceinos et al., 2005), no afectaban a la separación de la hormona. En ningún caso se
observó coelución de los picos de estos compuestos con el de la melatonina. Además, se
constató que sus niveles en plasma y bilis de trucha arco iris eran muy reducidos, siempre
por debajo del nivel de detección de nuestra técnica.
60
Trabajo Experimental 1
mV
50
A
C
B
Fluorescence Response
40
30
20
10
0
-10
0
2
4
6
8
10
12
0
2
4
6
8
10
12 0
2
4
min
min
6
8
10
12
min
Figura 1. Determinación de melatonina en el plasma de la trucha tras extracción con
cloroformo. Los cromatogramas representan: (A) Plasma charcolizado libre de melatonina, (B) La
misma muestra pero con melatonina añadida hasta una concentración de 166.5 pg/ml plasma, (C)
Muestra extraída de un plasma obtenido durante el día (contiene 88.7 pg/ml de plasma).
mV
50
A
C
B
Fluorescence Response
40
30
20
10
0
-10
0
2
4
6
min
8
10
12
0
2
4
6
min
8
10
12 0
2
4
6
8
10
12
min
Figura 2. Cromatogramas obtenidos a partir de extractos de: (A) Estándar acuoso de
melatonina (50 pg), (B) Tejido homogenizado de intestino medio de trucha (C) Muestra de bilis.
Las concentraciones de melatonina fueron 117.3 pg/g en el intestino medio y de 1783 pg/ml en
bilis.
61
Trabajo Experimental 1
MEL detectada en Plasma (pg/ml)
1200
1000
800
600
MEL intestinal detecteda (pg/g tejido)
Tanto los tiempos de retención como los valores del área de los picos mostraron
una gran reproducibilidad, lo que se determinó mediante los coeficientes de variación (CV)
intraensayo (plasmas sobrecargados con varias concentraciones de melatonina y extraídos
el mismo día, CV= 3.14%) e interensayo (plasmas sobrecargados con dos concentraciones
de melatonina y extraídos en días diferentes CV= 4.13%). Además se encontró una
excelente correlación lineal (r2 ≈ 0.99) entre la concentración de melatonina añadida en las
muestras tratadas con charcol y la cantidad de melatonina recuperada tras el proceso de
extracción (Tabla 1). Tal y como se mencionó anteriormente, las curvas de calibración
(Figura 3) cubrieron un rango de 5-500 pg/ml para muestras de plasma, bilis, y de
5-200 pg/ml en muestras procedentes del intestino. Por otro lado, el límite de detección
(LOC, basado en un coeficiente señal/ruido de 3:1) fue estimado en 12 pg/ml en muestras
de estándares acuosos inyectados sin extracción, mientras que el límite de cuantificación
(LLOQ) fue de 8 pg/ml calculado sobre muestras extraídas (y concentradas) de fluidos o
tejidos. En términos de cantidad inyectada, el método actual con detección por
fluorescencia permite cuantificar 0.8 pg/inyección de un estándar de melatonina.
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
Melatonin Añadida (pg)
400
200
0
0
200
400
600
800
1000
Melatonina Añadida (pg)
Figura 3. Correlación entre la melatonina añadida a las muestras y la detectada tras su
extracción. Las ecuaciones de la regresión lineal obtenida fueron y = 0.9399X + 8.1365, r2=0.992
(plasma); y = 0.8872x + 1.2964, r2=0.989 (intestino).
62
Trabajo Experimental 1
Análisis cuantitativo de las muestras
El método analítico puesto a punto permite mediciones fiables de niveles muy bajos
de melatonina plasmática, tales como los que se observan típicamente durante la fase
lumínica del fotociclo diario (Tabla 2). Los valores basales obtenidos concuerdan con los
descritos en trucha utilizando distintos métodos cromatográficos (Kulczykowska y Iuvone,
1998), así como mediante RIA (Gern et al., 1978). Consecuentemente, los datos muestran
que los niveles nocturnos de melatonina plasmática fueron significativamente mayores (del
orden de unas tres veces) a los diurnos (Tabla 2). Los valores plasmáticos fueron similares
en muestras libres de proteína que en muestras de plasma no tratadas, de forma que ni los
valores diurnos ni los nocturnos de melatonina fueron afectados significativamente por el
proceso de desproteninzación al que fueron sometidas las muestras (Tabla 2).
Tabla 2. Concentración de melatonina durante el día y la noche, en plasma desproteinizado,
plasma total, bilis y homogeneizados de tejidos intestinales (intestino medio y posterior).
Plasma libre de proteínas (pg/ml)
Dia (12- 14h)
103.1±2.0 (n = 15)
Noche (23-01 h)
453.9±31.7 (n=15) *
Plasma total (pg/ml)
123.1±18.8 (n = 15)
422.1±36.2 (n=15) *
Bilis (pg/ml)
1259.8±123.4 (n = 8)
1550.5±91.4 (n=8)
Intestino Medio (pg/g tejido)
262.1±31.6 (n = 10)
218.6±38.4 (n=10)
Intestino Posterior (pg/g tejido)
161.6±32.6 (n = 10)
174.3±32.3 (n=10)
Los valores se expresan como el promedio ± E.E.M. Las unidades (pg/ml, pg/g tejido) y el tamaño
muestral (n) son indicados en paréntesis. * P < 0.05 vs. respectivo valor diurno.
Los resultados obtenidos también indican que existe una importante cantidad de
melatonina a lo largo del TGI de la trucha arco iris (160-260 pg/g tejido), aunque ni en el
intestino medio ni en el posterior se aprecian diferencias significativas entre las muestras
tomadas de día y de noche. Con respecto a la bilis, la concentración de melatonina se situó
entre 1259 y 1550 pg/ml, es decir unas 10 veces más que los valores hallados en plasma
durante el día y unas 3 veces más que los nocturnos, indicando que probablemente la
concentración de la bilis dentro de la vesícula biliar también supone un incremento de la
concentración de melatonina a este nivel. Al igual que en intestino, los datos día:noche no
permiten ver la existencia de variaciones diarias en el contenido de melatonina en la bilis.
63
Trabajo experimental 2
Caracterización de la síntesis de melatonina en el
tracto gastrointestinal de la trucha arco iris:
niveles, expresión génica, relación con serotonina e
inmunolocalización
Trabajo Experimental 2
Introducción y objetivos
La melatonina es una hormona clave en la regulación de numerosos procesos
fisiológicos, sobre todo aquellos que se desarrollan de forma rítmica. Si bien su producción
rítmica diaria se realiza fundamentalmente en las células fotorreceptoras del órgano pineal
y de la retina en la mayoría de las especies estudiadas (Klein et al., 1983; Falcón et al.,
1987), la melatonina también se puede sintetizar en determinados órganos periféricos,
principalmente el TGI, habiéndose sugerido que tanto las alteraciones en el patrón
alimentario como el tránsito de alimento podrían estar involucradas en la regulación de la
síntesis de la hormona en este tejido (Bubenik et al., 1996; Martin et al., 1998). La
melatonina fue detectada por primera vez en el TGI de mamíferos mediante cromatografía
de papel a partir de muestras de mucosa inflamada del apéndice humano (Raikhlin y
Kvetnoy, 1974; 1976). Estudios inmunohistológicos posteriores confirmaron su presencia
en todos los segmentos del tracto digestivo de la rata (Bubenik et al., 1977; Holloway et
al., 1980). Mas tarde, fue descrita la presencia de receptores MT2 para la hormona en
diferentes regiones del TGI (estómago, duodeno, colon) de la rata (Stebelová et al., 2010),
así como de sitios de unión de melatonina en el colon de humanos (Poon et al., 1997),
sugiriendo un importante papel de la hormona en la fisiología gastrointestinal.
La síntesis gastrointestinal de melatonina parece factible debido a la presencia de
elevados niveles de su precursor, la serotonina (Gershon y Tack, 2007). Los análisis
enzimáticos también han demostrado la presencia de dos enzimas cruciales de la ruta
biosintética de la hormona en el tracto digestivo de aves y mamíferos, la AANAT (Hong y
Pang, 1995) y la HIOMT (Quay y Ma, 1976). En mamíferos, al igual que en aves, la
pinealectomía provoca un descenso en el contenido intestinal de melatonina, si bien aun en
estas condiciones todavía son detectadas cantidades importantes de la hormona. Todos
estos datos en mamíferos, aves y peces han llevado a sugerir la existencia de una síntesis
local de melatonina en el TGI (Bubenik y Brown, 1997; Van`t Hof y Gwinner, 1999).
De forma complementaria, en los peces se ha descrito la presencia de melatonina en
diversos segmentos del tracto gastrointestinal del esturión así como en ciertos teleósteos
como la trucha arco iris, lo que pone de manifiesto la capacidad del TGI de convertir la
5HT en melatonina (Bubenik y Pang, 1997). Además, estudios recientes llevados a cabo en
nuestro laboratorio han demostrado, por primera vez en los peces, la expresión génica de la
enzima AANAT en el tejido gastrointestinal de la trucha arco iris, con niveles diferentes en
los distintos tramos y capas tisulares (Fernández-Durán et al., 2007). En el carpín, también
se ha demostrado que la expresión AANAT en intestino posterior e hígado muestra un
perfil rítmico diario (Velarde et al., 2010a), por lo que se ha sugerido que existe una
síntesis local rítmica de melatonina en el TGI de los peces.
No obstante, a pesar de la existencia de trabajos pioneros, el conocimiento de los
procesos de síntesis de melatonina en el TGI de los peces, así como su regulación, es muy
limitado. Por todo ello, en el presente trabajo nos planteamos caracterizar el contenido de
67
Trabajo Experimental 2
melatonina, su precursor (5HT) y su principal metabolito (5HIAA), en las diferentes zonas
del TGI y órganos asociados en la trucha arco iris. Además, se pretende localizar la
expresión génica de las enzimas AANAT (aanat1 y aanat2) y HIOMT, como enzimas
finales de la ruta biosintetica de la hormona. Por último, se presentan evidencias
inmunohistoquímicas de la localización celular de la síntesis de melatonina en el TGI de la
trucha arco iris.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
Al igual que en el capítulo anterior nuestro modelo animal para abordar dicho
estudio fue la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Se utilizaron ejemplares inmaduros
(110 ± 15 g; media ± E.E.M.) obtenidos en la piscifactoría situada en Soutorredondo
(Lousame, A Coruña). Los peces fueron transportados en tanques con suministro continuo
de oxígeno, hasta nuestras instalaciones donde se mantuvieron en cubas de 120 litros con
aporte de agua filtrada libre de cloro y difusión continua de aire. Los animales se
mantuvieron bajo una condición de fotoperiodo artificial con 12 horas de luz y 12 horas de
oscuridad (L:D 12:12), siendo la intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del agua.
La temperatura del agua se mantuvo controlada a 14±1 ºC durante todo el periodo
experimental. La alimentación se realizó una vez al día (10:00h) con pienso seco comercial
(Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, Spain; composición aproximada: 48% proteína cruda,
6% carbohidratos, 5% grasa cruda, y 15% ceniza). Los experimentos realizados
cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea
(86/609EU), así como con las leyes españolas para el uso de animales en investigación
(RD 1201/2005).
Experimentos y análisis
Experimento 1. Niveles de indolaminas y expresión génica de los enzimas de síntesis de
melatonina en diferentes regiones del TGI
Para la determinación de los niveles de indolaminas (melatonina, 5HT y 5HIAA) y
de los transcritos de las enzimas de la ruta biosintética de la melatonina (aanat1, aanat2 y
hiomt) presentes en los diferentes regiones del TGI, se utilizaron un total de 16 truchas
arco iris (n=12 para la determinación de niveles de indolaminas; n=4 para expresión
génica) que fueron ayunadas durante 24 horas y posteriormente sacrificadas en mitad de la
fase luminosa del ciclo diario (alrededor de las 13:00 horas). La recolección de muestras,
se realizó tras anestesiar a los peces mediante inmersión en MS-222 (50 mg/L tamponado
con bicarbonato sódico, pH 7.4) y su posterior decapitación. Tras ello se realizó una
incisión a lo largo del vientre de los peces que permitió extraer la mayor parte del tejido
gastrointestinal, cuyo contenido se vació mediante infusión de solución salina (NaCl 0,6%,
68
Trabajo Experimental 2
p/v) fría, y posteriormente el tejido se mantuvo en una placa sobre hielo. También se
extrajo una muestra de hígado (50 mg aprox.), así como la vesícula biliar llena de bilis para
posteriormente separar la bilis mediante una jeringa.
Con respecto al TGI se separaron las siguientes regiones: esófago, estómago, ciegos
pilóricos y segmentos intestinales anterior, medio y posterior. En cada uno de los tejidos se
separó la capa de mucosa interna de la pared muscular externa con ayuda de un bisturí. En
relación con este proceso, se realizaron previamente estudios histológicos a fin de
identificar el protocolo menos agresivo para la separación de las capas de mucosa y
muscular (Figura 1). Concretamente se observó que un raspado suave del intestino permite
extraer prácticamente todo el moco del intestino sin afectar apenas a la capa de mucosa,
mientras que un raspado profundo separa y arrastra la casi totalidad de la mucosa
intestinal, siendo marginal el daño sobre la pared muscular que incluyó la lamina propia, la
capa de submucosa y la capa muscular externa (Figura 1C). Así pues, para el muestreo se
optó por este último procedimiento.
De cada tejido gastrointestinal (pared y mucosa), del hígado y de la pared de la
vesícula biliar, se tomó una fracción (40-50mg) para la posterior cuantificación de su
contenido de indolaminas mediante HPLC. Todas estas muestras, al igual que la bilis,
fueron congeladas inmediatamente y almacenadas a -80ºC, hasta su procesado.
Una segunda fracción de las muestras de cada tejido se usó para determinar la
expresión de los genes de las enzimas de la ruta biosintética de la melatonina (aanat1,
aanat2 y hiomt). Estas muestras fueron tomadas en condiciones de esterilidad, congeladas
inmediatamente en hielo seco y almacenadas a -80ºC hasta la cuantificación de la
expresión génica.
Análisis de los niveles de melatonina, serotonina y 5HIAA mediante HPLC
La cuantificación de melatonina en el TGI de la trucha se llevó a cabo de acuerdo
con el protocolo descrito en el Capítulo 1 de la presente Memoria, encontrándose ya
publicado (Muñoz et al., 2009).
El contenido de 5HT y su principal metabolito (5HIAA) en los diferentes
segmentos del TGI se cuantificó mediante HPLC con detección electroquímica
(HPLC-EC) según el método descrito por Gesto et al. (2006), con algunas modificaciones.
El sistema de HPLC consistió en una bomba Jasco PU-2080 Plus, una columna
cromatográfica Phenomenex Nucleosil C18 (5 µm, 150 mm longitud x 4.6 mm diámetro
interno) y un detector electroquímico ESA Coulochem II, el cual incluyó una célula
analítica (M5011) con potenciales de oxidación configurados a +40 mV (primer electrodo)
y +340 mV (segundo electrodo). La fase móvil utilizada fue una solución acuosa de
NaH2PO4 (63.9 mM) Na2EDTA (0.1 mM) y 1-octanosulfonato de sodio (1.63 mM), con un
14.9% de metanol (v/v). El pH de la fase móvil se ajustó a 2.79 con ácido ortofosfórico.
69
Trabajo Experimental 2
Finalmente la fase móvil fue filtrada (0.2 µm de poro; Millipore, Bedford, EE.UU) y
desgasificada mediante vacio antes de su uso.
B
A
C
Figura 1. Efecto del raspado sobre la estructura tisular de la pared del Intestino medio A) sin
raspado, B) tras raspado suave, C) tras raspado profundo con hoja del bisturí. Tinción
Hematoxilina. Barra: 100 µm (A, B y C). Fotografías realizadas en colaboración con la Dra. R.
Álvarez (Laboratorio de Biología Celular, Universidad de Vigo)
Para la determinación de los niveles de indoles (5HT y 5HIAA) en las muestras,
40-50 mg de cada uno de los tejidos fueron sonicados en 0.5 ml de PCA (0.3 mM) y
centrifugados a 13200 rpm durante 7 minutos. Una alícuota de 40 µl del sobrenadante fue
disuelta en fase móvil (1:10 v/v) e inyectada en el sistema de HPLC. En la Figura 2 se
puede observar un ejemplo de cromatograma de patrones indólicos y de una muestra de
intestino. Aunque nuestra técnica también permite cuantificar los niveles de 5hidroxitriptófano (5HTP), precursor inmediato de la 5HT, esta medida no se llevó a cabo
70
Trabajo Experimental 2
en los tejidos analizados debido a los bajos niveles (en muchos casos por debajo del límite
de detección) de este compuesto.
Todos los cromatogramas fueron recogidos en un sistema informático equipado con
el software de análisis cromatográfico Biocrom XP (Jasco Analítica, Madrid). La
cuantificación de los picos de las muestras fue estimada en comparación con las áreas de
los picos de sus respectivos estándares.
A
B
Figura 2. (A) Cromatograma de una muestra de patrones (100 pg) de 5-hidroxitriptofano
(8.41 min); acido 5-hidroxindolacético (11.24 min) y serotonina (13.06 min). (B) Muestra de
intestino medio: 5HTP (2.20 pg; 8.47 min); 5HIAA (24.15 pg; 10.85 min); 5HT (187.51 pg; 12.50
min).
Expresión génica de aanat1, aanat2 y hiomt mediante RT-PCR (qPCR)
Para la cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt se utilizaron
cebadores específicos diseñados previamente en nuestro laboratorio (Fernández-Durán et
al., 2007) y otros diseñados a partir de secuencias publicadas por otros autores.
En primer lugar, se procedió a la extracción del ARN total, siguiendo el método
TRI-ReagentTM. Dicho método es un protocolo sencillo de extracción de ARN en un único
paso, usando una solución monobásica de fenol e isotiocianato de guanidina (TRIReagentTM), combinada con la precipitación de ARN mediante isopropanol en presencia de
un alto contenido en sales (Chomczynsky y Sacchi, 1987). Siguiendo las instrucciones del
fabricante, se sumergieron las muestras en reactivo TRIzol® (Invitrogen), se sonicaron
(UP200H Ultraschallprozessor, Dr. Hielscher, GMBH) durante 3 segundos y se incubaron
71
Trabajo Experimental 2
durante 5 min a temperatura ambiente para asegurar la completa disolución de los
complejos nucleotídicos. A continuación se añadieron 300 l de cloroformo a cada vial, se
agitó vigorosamente y se incubaron nuevamente las muestras durante 15 min a temperatura
ambiente. Pasado este tiempo, los viales se centrifugaron (5415R, Eppendorf) durante 15
min a 12000 g y 4ºC. Dicha centrifugación separa la muestra en tres fases: una orgánica
rosada de fenol-cloroformo (contiene proteínas y ADN), una interfase sólida, y una tercera
fase acuosa superior e incolora, que contiene el ARN. Dicha fase acuosa fue
inmediatamente transferida a nuevos viales estériles y libres de ARNasa, a los que se
añadió 0.5 ml de 2-propanol (Sigma). Tras una nueva agitación vigorosa, los extractos de
ARN fueron incubados a temperatura ambiente (10 min) y posteriormente centrifugados a
12000 g durante 10 min (4ºC). Tras descartar el sobrenadante mediante decantación, el
precipitado fue nuevamente resuspendido con ayuda de un agitador en 1 ml de etanol al
75% durante 2 segundos. Inmediatamente después, los viales fueron centrifugados a 12000
g y 4ºC durante 7.5 minutos. A continuación se eliminó el etanol por decantación,
permaneciendo los viales abiertos y a temperatura ambiente durante 5 min, hasta la
completa evaporación del etanol. Finalmente, dichos extractos fueron reconstituidos y
diluidos en 20 l de agua grado MilliQ estéril y libre de ARNasa.
La cantidad de ARN y su pureza fue determinada mediante espectrofotometría a
260 nm y 280 nm. Para ello, 5 l de ARN extraído se diluyeron en 1.5 ml de solución Tris.
La composición de dicho tampón fue: 3.027 g de Trizma Base (Sigma) y 0.93 g de EDTA,
diluidos en 1 L de agua grado MilliQ estéril libre de ARNasa (pH 7.6). Tras medir la
absorbancia de la solución Tris-ARN a 260 y 280 nm, se calculó el ratio entre dichas
absorbancias (260/280 nm). Un valor entre 1.7 y 2.0 se consideró óptimo.
En segundo lugar, se procedió a la síntesis del ADN complementario a partir de los
extractos de ARN purificado. Para ello se pipeteó un volumen previamente calculado de
cada muestra (conteniendo 2 µg de ARN) en un nuevo vial estéril y libre de ARNasa. A
continuación, se añadió 1 µl de la solución de random primer (Promega) y se completó con
agua MilliQ estéril libre de ARNasa, hasta un volumen final de 11 µl. A continuación los
viales conteniendo estas soluciones fueron incubados durante 5 min a 70ºC en un
termociclador para PCR (PTC-200, MJ Research). Transcurrido este tiempo a cada vial se
le añadió 9 µl de una solución conteniendo 0.2 l de inhibidor de la ARNasa
(RNAguard™ RNase inhibitor, porcine (Amersham Biosciences), 1 l de transcriptasa
inversa (M-MLV reverse transcriptasa, Promega), 1 l de dNTP Mix 10 mM (Promega), 4
l de tampón (M-MLV RT 5x Buffer, Promega) y 2.8 l de agua grado MilliQ estéril libre
de ARNasa. El volumen final en cada vial fue, por tanto, de 20 l. Esta solución resultante
se incubó a 37ºC durante 60 min, seguido de 5 min a 65ºC. El producto resultante se
almacenó a -80ºC hasta el posterior análisis de las muestras mediante la técnica de PCR en
tiempo real (qPCR).
Para la cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en las muestras del
TGI de la trucha arco iris, se utilizó una solución de 15 l conteniendo 2 l del
72
Trabajo Experimental 2
concentrado de ADN, 1 l de cada uno de los cebadores (forward y reverse, ver a
continuación), 3.5 l de agua grado MilliQ estéril libre de ARNasa y 7.5 l de una
solución con el fluoróforo (MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix, 2x, Fermentas).
Los cebadores se diseñaron en base a secuencias conocidas de la trucha arco iris y fueron
suministrados por Sigma. Las secuencias y las referencias (―genbank accesion number‖)
para los genes cuantificados fueron las siguientes:
 aanat1 (AB007294): Forward, 5´-CAGCCAAGAGAGAAGACTTG-3´, Reverse, 5´GGAGAAACAGAAGGGGAGAA-3´
 aanat2 (AF106006): Forward, 5´-CATTCGTCTCTGTGTCTGGT-3´, Reverse, 5´TTTCTGGGATATGCTGGGT-3´
 hiomt:
Forward,
5´-CTTCCAGGAAGGGGACTTTT-3´,
Reverse,
5´TGTCTGCACCAGCATGTTCA-3´. Secuencia amablemente cedida por el Dr. J.
Falcón.
 β-actina (AJ438158): Forward, 5´-GATGGGCCAGAAAGACAGCTA-3´, Reverse,
5´-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3´.
La expresión de cada uno de los genes estudiados se calculó de forma relativa a la
medida del gen de referencia, β-actina, empleando para ello el método de las delta-Cts.
Cada una de las soluciones conteniendo ADN, cebadores y reactivos fue pipeteada en
placas de 96 pocillos (HSS9601, Bio-Rad) que se incubación en el equipo de RT-PCR
cuantitativa (MyiQ, Bio-Rad). El protocolo de qPCR se realizó en tres pasos: el primero
constó de una incubación de 3 min a 95ºC; el segundo paso consistió en 50 repeticiones de
40 segundos de duración, exponiéndose los pocillos a 95ºC durante 10 segundos, seguido
de un descenso de la temperatura a 55ºC durante 30 segundos. Con el fin de valorar la
pureza de las muestras, un tercer paso adicional consistió en la repetición sucesiva de 79
ciclos de un proceso de calentamiento de las muestras a 94ºC durante 10 segundos y el
subsiguiente enfriamiento durante 30 segundos hasta los 55ºC.
Experimento 2. Inmunolocalización de serotonina, melatonina y AANAT en el TGI de la
trucha arco iris
Para el estudio histológico se utilizaron muestras de tejidos (intestino anterior,
ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior) procedentes de 10 truchas
sacrificadas igual que en el Experimento 1, si bien en este caso no se procedió a separar la
capa de mucosa de la pared muscular. Una porción de cada muestra fue fijada en Bouin,
mientras que la porción restante fue fijada por inmersión en paraformaldehído al 4% en
tampón fosfato 0.1M (TP 0.1M) durante 24 horas.
Un primer grupo de muestras de cada tejido fue deshidratado en alcoholes de
gradación creciente e incluido en parafina. Los bloques así obtenidos fueron seccionados
transversalmente en un microtomo tipo Minot (Leica), oscilando el grosor de las secciones
entre 5-10 m. Un segundo grupo de muestras fue crioprotegido mediante inmersión
73
Trabajo Experimental 2
secuencial en sacarosa al 15% y al 30% en TP 0.1M, incluido en Tissue-Tek y
posteriormente seccionado en un criostato (Micron) con grosor de 20 m. En ambas
modalidades de inclusión, se realizaron series de cortes, continuos y alternos, estos últimos
destinados a detectar la presencia de 5HT, melatonina y AANAT en secciones de tejido
contiguas.
La citoarquitectura del TGI fue estudiada en secciones desparafinadas, rehidratadas
y teñidas con hematoxilina-eosina. Las secciones de tejido destinadas a estudios
inmunohistoquímicos fueron sometidas a un tratamiento con H2O2 (0.03%) durante 30
minutos, con el fin de eliminar la peroxidasa endógena. Tras varios lavados con PBS
(tampón fosfato salino), al cual se añadió gelatina, tritón X-100 y azida sódica (PBS-G-TA), se procedió a las incubaciones con distintos anticuerpos:
- Primer anticuerpo: Anti-5HT (Diasorin), anti-melatonina (AbD Serotc), de conejo
diluidos 1/5000 en PBS-G-T-A o anti-AANAT de conejo (Millipore), diluido 1/100
en PBS-G-T-A. La incubación se realizó durante toda la noche a temperatura
ambiente y en agitación a baja velocidad.
- Segundo anticuerpo: Ig de cabra anti-conejo biotinizado (GAR, Vector) diluido 1/100
en PBS-G-T, incubado durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Tercer anticuerpo: Complejo-Avidina-Biotina (ABC Kit, Vector) diluido 1/100 en
PBS-G-T, incubado durante 1 hora a temperatura ambiente.
Entre todas las incubaciones se efectuaron varios lavados con PBS-G-T.
Para el revelado de la reacción, se utilizó 3´3´-diaminobencidina tetraclorhidrato
(DAB), cromógeno que en presencia de H2O2 al 0.03% se transforma en un precipitado
marrón insoluble. La reacción fue expuesta al microscopio y posteriormente parada con
TRIS 0.1M. La especificidad de los tres anticuerpos se puso de manifiesto mediante la
incubación de secciones en paralelo y en ausencia del primer anticuerpo. En todos los
casos, el resultado fue negativo. Tras la inmunotinción, parte de las secciones fueron
contrastadas con hematoxilina, deshidratadas en una escala de alcoholes de gradación
creciente y montadas con DePeX.
Para detectar la colocalización de 5HT/melatonina y 5HT/ANAAT, se utilizaron
técnicas de inmunofluorescencia en series de cortes alternos, cuyo protocolo fue el
siguiente:
- Incubación de las secciones en anti-5HT, anti-melatonina y anti-AANAT diluidos
en PBS-G-T como se ha indicado previamente.
- Incubación en presencia de los anticuerpos secundarios específicos marcados con
rodamina y fluoresceína, Alexa 488 y Alexa 594 anti-conejo, respectivamente,
(Molecular Probes) diluidos 1/600 en PBS-G-T, durante 1 hora, a temperatura
ambiente.
74
Trabajo Experimental 2
- Montaje de las secciones con ProLong Gold (Molecular Probes).
Todas las secciones fueron observadas, estudiadas y fotografiadas usando una
cámara digital (DP71) conectada a un microscopio Olympus BX51 equipado con una
combinación de filtros para rodamina y fluoresceína. La edición de las imágenes y láminas
se realizó mediante el software Adobe Photoshop 8.0.
Validación por western blot del anticuerpo anti-AANAT para la detección de AANAT en
intestino de la trucha
La presencia de la proteína AANAT se evaluó en extractos de órgano pineal
(control interno) e intestino medio (tejido a estudiar) de la trucha arco iris mediante la
técnica de western blot, utilizando para ello un anticuerpo comercial anti-AANAT
(Millipore) obtenido en conejo y con reactividad demostrada frente a la AANAT de peces
(Ganguly et al., 2005). Los tejidos fueron homogenizados mecánicamente en 1 ml de
tampón RIPA (PBS 1x, NP-40, dexicolato sódico y 10% SDS), al que se añadió en fresco
una mezcla de inhibidores de proteasas (aprotinina, leupeptina, PMSF 200 mM y
ortovanadato sódico 100 mM). La mezcla obtenida fue centrifugada durante 15 minutos a
4ºC. A continuación se cuantificó el contenido en proteínas del sobrenadante mediante el
método de Bradford (Bio-Rad laboratorios, Inc.), siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Seguidamente se realizó una electroforesis, pipeteando para ello una cantidad del
homogenado de tejido conteniendo 15 µg de proteína. La electroforesis se realizó en geles
de SDS-PAGE al 7.5%, con una corriente de 120 V durante 90 minutos. La composición
del tampón de electroforesis fue 25 mM Trizma Base, 192 mM Glicina y 0.1% SDS.
Transcurrida la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF
(difluoruro de polivinildeno) previamente activada con metanol en un sistema de
transferencia semi-seco y en un tampón compuesto por 25 mM Tris, 192 mM Glicina y
20% metanol. La transferencia se realizó bajo una corriente eléctrica de 15 V durante 2
horas. Al cabo de este tiempo, la membrana se incubó en una solución de bloqueo (3%
leche baja en grasa y Tween 20 al 0.1% en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente y
en agitación. A continuación se añadió el primer anticuerpo (anti-AANAT, Millipore) a
una dilución 1/500 y la mezcla se incubó a 4ºC durante toda la noche. Como control de
carga se utilizó un anticuerpo frente a β-actina (Sigma). Posteriormente se realizaron 3
lavados de 5 minutos con una solución de lavado (0.1% Tween 20 PBS). A continuación se
añadió el segundo anticuerpo unido a HRP (dilución 1:5000) y la membrana se mantuvo
sumergida en la solución durante 1 hora con agitación constante. Tras tres nuevos procesos
de lavado, la membrana fue finalmente sumergida en ECL Plus (GE HealthcareAmersham, UK) durante 5 minutos sin agitación y posteriormente colocada en un cassette
autorradiográfico para su revelado.
Análisis estadísticos de los resultados.
75
Trabajo Experimental 2
Todos los datos fueron expresados como la media ± E.E.M. (n = 8-10 para los
estudios de indolaminas; n =4 para los análisis de expresión génica). Para evaluar tanto la
existencia como la presencia de diferencias significativas en el contenido de indolaminas
entre los distintos tramos del TGI analizados se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) de
una vía (Sigma Stat v3.0) tanto para las porciones de pared como de mucosa, de forma
independiente. Se aplicó el test de Student Newman Keuls (SNK) de comparaciones
múltiples cuando las diferencias fueron significativas. En todos los casos, el grado de
significación se estableció en P < 0.05.
La expresión de los distintos genes analizados se representó como la expresión
relativa respecto de la porción (mucosa o pared) del tejido que mostró la expresión más
baja para cada uno de ellos, concretamente el esófago. Se utilizó el análisis de varianza
ANOVA de una vía para verificar la presencia de diferencias significativas entre regiones
del TGI tanto en las porciones de pared como de mucosa. En el caso de existir diferencias
significativas se aplicó el test de Tukey de comparaciones múltiples. En todos los casos, el
grado de significación se estableció en P <0.05.
Resultados
Niveles de serotonina, 5HIAA y melatonina en distintas regiones del TGI de la trucha
arco iris
La Figura 3 muestra el contenido de melatonina en las capas de mucosa y pared
muscular de las distintas regiones del TGI estudiadas. En general, los valores detectados en
pared fueron superiores a los hallados en mucosa, si bien se puede establecer alguna
diferencia entre regiones. Mientras que en el estómago y los ciegos pilóricos no hubo
diferencias significativas entre pared y mucosa, los niveles de melatonina fueron
significativamente superiores en la pared del intestino anterior, medio y posterior, con
respecto a sus respectivas mucosas. La mayor diferencia se apreció en el intestino anterior,
siendo el contenido de melatonina un 275% superior en la pared muscular que en la capa
de mucosa. El contenido de melatonina en las diferentes zonas del TGI fue menor en el
estomago que en el intestino, con una tendencia en los niveles de esta neurohormona a
decrecer hacia la zona mas distal del TGI.
Con la excepción del estómago, el contenido de 5HT fue siempre superior en la
capa de pared muscular de todos los tejidos estudiados en comparación con la capa de
mucosa (Figura 4). Además, todas las regiones intestinales mostraron niveles muy
elevados de 5HT (alrededor de 4 ng/g tejido) en la pared muscular, siendo 150-160 veces
superiores a las presentes en la capa de mucosa. En los ciegos pilóricos, el contenido de
5HT en la pared fue 18 veces superior al hallado en la mucosa. Esta diferencia fue menor
que en el caso del intestino, debido a los valores relativamente elevados de 5HT en la
76
Trabajo Experimental 2
mucosa de los ciegos pilóricos (6 veces mayores que los medidos en intestino en dicha
capa). En contraste con los tejidos intestinales, en el estómago los niveles de 5HT en la
mucosa fueron 3 veces superiores a los de la pared muscular.
200
Mucosa
Pared
b
150
*
400
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a
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200
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a
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Melatonina pg/g tejido
Melatonina pg/g tejido
600
Figura 3. Contenido de melatonina en pared muscular y mucosa de las diferentes regiones del
TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 8 a 10 animales.
Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes tramos del TGI. *,
Diferencias significativas (P < 0.05) con respecto a la correspondiente porción de pared.
b
6000
Pared
b
1100
Mucosa
a*
b
1000
c
900
2000
800
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a
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400
c*
300
400
5HT ng /g tejido
5HT ng /g tejido
4000
200
200
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b*
b*
100
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0
Figura 4. Evaluación del contenido de 5HT en las porciones de pared y mucosa de las
diferentes zonas del TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M. de
8 a 10 animales. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes
tramos del TGI. *, Variaciones significativas (P < 0.05) con respecto a la correspondiente porción
de pared.
77
Trabajo Experimental 2
Con respecto a los niveles de 5HIAA, se halló una distribución muy similar a la
observada para la 5HT (Figura 5). En consecuencia, el contenido de 5HIAA en la porción
de pared del intestino medio y posterior fue de 20 y 13 veces superior al medido en las
respectivas porciones de mucosa. En cambio, en los ciegos pilóricos el contenido de
5HIAA fue muy similar en mucosa y pared. Por otro lado, la porción de mucosa del
estómago mostró valores de 5HIAA unas 2 veces superiores a los observados en la pared
de este tejido.
b
Mucosa
Pared
5 HIAA ng/g tissue
1500
250
b
b
200
1000
b
500
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r
0
5 HIAA ng/g tissue
2000
Figura 5. Contenido de ácido 5-hidroxindolacético (5HIAA) en pared y mucosa de las
diferentes regiones del TGI de la trucha arco iris. Los datos se representan como la media ± E.E.M.
de 8 a 10 animales. Letras distintas indican diferencias significativas (P < 0.05) entre los diferentes
tramos del TGI. *, Variaciones significativas (P < 0.05) con respecto a la pared del mismo tejido.
En el hígado y la vesícula biliar, tejidos anexos al tracto digestivo, las
concentraciones de indolaminas (melatonina, 5HT y 5HIAA), expresadas por gramo de
tejido fueron muy diferentes (Tabla 1). En el hígado se observaron valores bajos de
melatonina comparado con lo medido en otras regiones del TGI. Por su parte, el contenido
de melatonina en la vesícula biliar fue el más elevado de entre todos los tejidos evaluados,
siendo incluso 3-4 veces superior al medido en las porciones de pared del resto de
regiones intestinales. Es importante señalar el contraste entre los niveles bajos de
melatonina en hígado y los altos niveles observados en la vesícula biliar.
Los niveles de 5HT y 5HIAA, en el hígado de la trucha son muy bajos con respecto
a otras zonas del TGI (11.67 y 158.7 ng/g de tejido, respectivamente), alcanzándose el
grado de significación únicamente en el caso de la 5HT (P < 0.05) con respecto al resto de
tejidos del TGI. Por otro lado, los niveles de 5HT en la vesícula biliar son bajos en
comparación con los otros tejidos estudiados (aproximadamente 40 veces más bajos que en
78
Trabajo Experimental 2
el intestino). Además, se observó que el contenido de 5HIAA en la vesícula biliar fue
relativamente alto (349 pg/g tejido), en contraste con lo observado para la 5HT.
Tabla 1. Contenido de melatonina (pg/g tejido), 5HT y 5HIAA (ng/g tejido) en el hígado y la
vesícula biliar de la trucha arco iris.
Tejido
Melatonina
5HT
5HIAA
Hígado
88.5 ±21.6
11.6 ±1.13
158.7 ±25.4
Vesícula biliar
754.3 ±105.9
113.0 ±52.6
344.6 ±102.2
Los datos se representan como el promedio ± E.E.M. (n = 8-10 animales).
Estudios inmunohistoquimicos y cuantificación de AANAT mediante Western Blot
Inmunoreactividad a 5HT (5HT-ir)
En las Figuras 6-8 se puede observar la presencia de 5HT-ir en las cuatro regiones
del TGI estudiadas -estómago, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino posterior-.
Dicha positividad se localiza tanto a nivel celular como fibrilar, pudiéndose catalogar
dichos elementos por su forma y ubicación como células endocrinas y neuronas o fibras
serotoninérgicas (Caamaño-Tubio et al., 2007).
En el estómago en general y en su mucosa en particular se observaron células
fuertemente positivas a 5HT. Estas células endocrinas se ubican preferentemente en las
zonas más internas de la mucosa (Figura 6B) y a nivel de la submucosa (estrato compacto
más granuloso), mientras que en la capa muscular sólo se evidenciaron elementos fibrosos
5HT-positivos, correspondientes a fibras nerviosas (Figura 6A). No se detectó, sin
embargo, la presencia de elementos serotoninérgicos a nivel de la lámina propia.
En los ciegos pilóricos los elementos 5HT positivos se localizaron en la lámina
propia, la submucosa y la capa muscular. Raramente se encontró positividad a nivel de las
células endocrinas del epitelio mucosal. Atendiendo a la morfología de los elementos
inmuno-teñidos, estos podrían ser células y fibras nerviosas (Figura 6C, D).
79
Trabajo Experimental 2
Figura 6. Microfotografías mostrando la presencia de serotonina en estómago (A y B) y en
ciegos pilóricos (C y D). Las puntas de flecha señalan células 5HT-ir en la mucosa estomacal (A y
B) y las flechas fibras posiblemente nerviosas en la submucosa (A) lamina propia (C y D) y capa
muscular (C). Barra: 100 µm (A, B, C y D).
En el intestino medio, tal y como se muestra en la Figura 7, la presencia de 5HT fue
detectada en las tres zonas de la pared intestinal. En la mucosa, la mayor positividad se
detectó en la lámina propia y en elementos de morfología fibrosa. Nuestros resultados
muestran además la existencia de células endocrinas positivas en el epitelio mucosal
(Figura 7 C, D y E), y células y fibras 5HT-ir en la capa muscular. Los resultados
80
Trabajo Experimental 2
obtenidos con inmunofluorescencia y detección inmunoenzimática nos permiten definir
elementos nerviosos con morfología similar a la neuronal (Figura 7 F y G).
Con respecto al intestino posterior, se observó una distribución similar del marcaje
serotoninérgico a la del intestino medio (Figura 8). Sin embargo es de destacar que la
estimación cuantitativa de las células endocrinas de la capa epitelial de la mucosa fue
menor que el intestino medio. (Figura 8 A, B). Algo similar ocurrió con la presencia de
células y fibras 5HT-positivas (Figura 8 C y D) en la capa muscular.
Inmunorreactividad a la melatonina
La evaluación de la presencia de elementos inmunopositivos a melatonina se
presenta en la Figura 9. Se pueden observar imágenes panorámicas de estómago (A),
ciegos pilóricos (B), intestino medio (C) intestino posterior (D), y en la figura (E) se puede
observar una célula melatonina-ir del intestino posterior. En todas ellas se puede constatar
la presencia de células positivas a melatonina. El hecho de presentar inmunorreactividad a
la hormona no significa necesariamente que en ellas se localice la síntesis activa de
melatonina, ya que esta indolamina difunde inmediatamente después de ser sintetizada a
través de la mucosa. Al comparar las distintas zonas del TGI se comprobó que la mayor
proporción de células positivas a melatonina se halla en el intestino medio, seguido por los
ciegos pilóricos, el intestino posterior y el estómago. En todas las regiones del TGI, la
presencia de células inmunorreactivas a melatonina se localizó en la capa epitelial de la
mucosa. No hemos detectado elementos positivos a melatonina en las porciones de lamina
propia, submucosa y capa muscular.
Los estudios inmunohistoquímicos en cortes adyacentes o contiguos de intestino
medio mostraron que ambas indolaminas (5HT y melatonina) podrían estar colocalizadas
en las mismas células del epitelio mucoso (Figura 10). Por analogía de la inmunotinción
con 5HT, se podría señalar que la célula melatonina-positiva también sería una célula
endocrina (Caamaño-Tubio et al., 2007).
Inmunorreactividad a la AANAT en intestino medio
Mediante técnicas de inmunoblot se validó el anticuerpo anti-AANAT para la
trucha arco iris. Tanto en las muestras procedentes de glándula pineal como en las de
intestino medio se pudo observar una banda con un peso molecular de 23 Kda, el cual
corresponde con el peso molecular de la proteína AANAT (Figura 11).
El análisis inmunohistoquímico para localizar AANAT se realizó inicialmente en
el intestino medio como ejemplo de tejido intestinal (Figura 12). Los resultados obtenidos
muestran que las células positivas a AANAT se localizaron a nivel del epitelio de la
mucosa intestinal (Figura 12A, B). De forma específica estas células se encuentran
mayoritariamente en la base de las vellosidades intestinales. No se detectaron células
AANAT-positivas en las porciones de la lamina propia, submucosa y capa muscular.
81
Trabajo Experimental 2
Figura 7. Intestino medio. (A y B) Panorámicas mostrando 5HT-ir a nivel de mucosa,
submucosa y músculo. Destaca la abundante presencia de elementos positivos en la lámina propia y
en la capa muscular (flechas). (C, D y E) Detalle de posibles células endocrinas 5HT-positivas a
nivel de la mucosa (punta de flecha) y de fibras serotoninérgicas a nivel de la lamina propia
(flechas). Elementos nerviosos (F: fibras y G: neurona) 5HT-ir a nivel de capa muscular. (A, C, D y
F): detección inmunoenzimática; (B, E y G): inmunofluorescencia. Barra: 25 µm (C, D, F y G), 50
µm (E), 100 µm (A y B).
82
Trabajo Experimental 2
Figura 8. Micrografías de secciones transversales del intestino posterior donde se pueden
observar detalles de una célula posiblemente endocrina, inmunorreactiva a 5HT (A). Nótese
también la presencia de abundantes fibras 5HT-positivas en la lámina propia de la mucosa (B) y en
menor número a nivel de la submucosa (C) y de la capa muscular (D) (Flechas). Barra: 25 µm (A y
D); 50 µm (C y B).
83
Trabajo Experimental 2
Figura 9. Secciones a diferentes niveles del TGI: Estómago (A), ciegos pilóricos (B),
intestino medio (C) e intestino posterior (D) mostrando la presencia de posibles células endocrinas
melatonina-positivas en la mucosa (flechas). Nótese la mayor abundancia de estas células en el
intestino medio. (E) Detalle de una célula melatonina-ir formando parte del epitelio mucosal en
intestino posterior. Barra: 25 µm (B y E); 50 µm (A y D); 100 µm (C).
84
Trabajo Experimental 2
Figura 10. Inmunotinción en secciones adyacentes de intestino medio. La superposición de
las imágenes refleja una posible colocalización en una posible célula endocrina positiva a 5HT (A)
y melatonina (B). Barra: 25 µm (A y B)
Órgano
pineal
Intestino
medio
23 kDa
Figura 11. Fotografía mostrando las bandas con un peso aproximado a 23 kDa
correspondiente a la proteína AANAT en el órgano pineal y el intestino medio de la trucha arco
iris, obtenida tras la realización de ensayos de western blot.
85
Trabajo Experimental 2
Figura 12. Presencia de AANAT en el intestino medio. Nótese que los elementos AANATir se localizan en la capa epitelial de la mucosa. Detección (A) inmunoenzimática, (B)
inmunofluorescencia. Barra: 100 µm (A y B).
Expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en el TGI de la trucha
La expresión de los genes de las enzimas finales de la ruta biosintética de la
melatonina fue analizada en muestras procedentes de las diferentes regiones del TGI
(Figura 13), así como en el hígado (Tabla 2) de la trucha arco iris. Todos los datos se
representaron como la expresión relativa respecto de la cuantificación realizada en el tejido
en el que se observó la expresión más baja para cada uno de los genes analizados (aanat1,
aanat2 y hiomt), que en todos los casos correspondió al esófago. La expresión de aanat1
fue más elevada en el estómago y el intestino posterior, con valores intermedios en
intestino anterior, medio y ciegos pilóricos. En las regiones intestinales, la capa de mucosa
mostró valores de expresión de aanat1 más elevados que la pared (4 veces superior en
intestino medio, 1.5 veces superior en intestino posterior) (Figura 13A).
La expresión de aanat2 en los diferentes tejidos estudiados se muestra en la Figura
13B. Entre las porciones de pared, la mayor expresión relativa se halló en las regiones
proximales del intestino (intestino anterior y ciegos pilóricos), mientras que el estómago
mostró valores bajos similares a los hallados en el esófago. Tal y como ocurrió con la
aanat1, la expresión de aanat2 fue mayor en la mucosa, tanto en el intestino medio (≈ 4
veces) como en el posterior (≈ 1.5 veces), en relación a la detectada en la pared de ambos
tejidos.
86
Trabajo Experimental 2
Con respecto a la hiomt, la mayor expresión entre las porciones de pared
correspondió a los ciegos pilóricos, seguido del estómago, midiéndose valores intermedios
en las regiones intestinales (Figura 13C). Tanto en el intestino medio como en el posterior,
la expresión de hiomt fue superior (aproximadamente 4 veces mayor) en la capa mucosa
que en la pared muscular.
Sorprendentemente, la expresión relativa de todos estos genes (aanat1, aanat2 y
hiomt) fue muy superior en el tejido hepático de la trucha arco iris, en comparación con
todos los tejidos del TGI analizados (Tabla 2).
Tabla 2. Expresión del mRNA de aanat1, aanat2, hiomt en el hígado de la trucha arco iris.
Expresión de las enzimas
aanat1
aanat2
hiomt
32.08 ±6.92 *
30.7 ±5.5 *
11.46 ±1.05 *
Los datos representan el promedio ± E.E.M. de 4 muestras. Los valores muestran la expresión
relativa comparada a la medida en el esófago de la trucha para cada uno de los genes cuantificados.
87
Trabajo Experimental 2
aanat1 (Expresión relativa)
30
A
Mucosa
Pared
a*
25
20
b*
15
b
a
10
a
a
a
5
a
0
16
Pared
Mucosa
c
14
aanat2 (Expresión relativa)
B
*
12
*
10
b
8
b
6
a
4
2
a
a
0
12
Pared
Mucosa
C
hiomt (Expresión relativa)
*
10
b
8
*
b
6
4
2
a
a
a
a
Es
óf
ag
o
Es
tó
m
ag
In
o
t.
a
nt
C
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po
st
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In
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t.
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In
o
t.
po
st
er
io
r
0
Figura 13. Localización de la expresión génica de aanat1 (A), aanat2 (B) y hiomt (C) en el
tubo digestivo de la trucha arco iris. Los datos representan la media ± E.E.M. de 4 peces. Letras
distintas significan diferencias significativas (P < 0.05) entre las diferentes secciones del TGI. *,
Variaciones significativas (P < 0.05) entre las porciones de pared y mucosa en la misma zona del
TGI.
88
Trabajo experimental 3
Producción rítmica de melatonina en el tracto
gastrointestinal de la trucha arco iris: influencia
del fotoperíodo y la alimentación.
Trabajo Experimental 3
Introducción y objetivos
En el Trabajo 2 se ha puesto en evidencia la existencia de un sistema
melatoninérgico en el TGI de la trucha arco iris, con diferencias topográficas relevantes en
cuanto a los niveles de la hormona y los procesos enzimáticos que median su formación.
Estos datos concuerdan con estudios llevados a cabo en humanos (Messner et al., 2001) y
otros mamíferos (Bubenik et al., 1996; Bubenik y Pang, 1997), pero también con los
escasos estudios realizados en especies de peces tales como el esturión, la carpa, y la
trucha arco iris (Bubenik y Pang, 1997), complementando la información existente sobre la
capacidad del TGI de los vertebrados para convertir 5HT en melatonina. Estudios recientes
llevados a cabo en cultivos de segmentos intestinales de la trucha arco iris indican que la
melatonina existente en TGI depende de una síntesis local de la hormona (Lepage et al.,
2005a), la cual puede responder a cambios en la concentración del aminoácido Ltriptófano, que inicia la ruta de síntesis (Lepage et al., 2005a; Herrero et al., 2007). Por otro
lado, tanto en mamíferos (Bubenik, 1980; Huether et al., 1998) como en peces (Herrero et
al., 2007) se han presentado evidencias de que la administración de melatonina exógena
conlleva un aumento de los niveles de la hormona en el TGI, sugiriendo que este tejido
tiene cierta capacidad de almacenar melatonina y, por tanto, que una cierta cantidad de
hormona presente en el tejido intestinal podría ser originada en otros tejidos del organismo,
fundamentalmente el órgano pineal. Los estudios de pinealectomía realizados en
mamíferos parecen decantarse porque la mayor parte de la melatonina intestinal es de
síntesis local (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997), mientras que esto no ocurre así en
algunas especies de aves (Van‘t Hof y Gwinner, 1999). En peces, sin embargo se carece de
este tipo de estudios.
En la mayoría de los vertebrados, la melatonina es producida de forma rítmica en
órganos típicamente asociados a la formación de la hormona, tales como la retina y el
órgano pineal (Falcón et al., 2007), con niveles generalmente más elevados durante la
noche que durante el día. Este patrón rítmico está muy conservado filogenéticamente y
desempeña un papel importante en la organización circadiana de los organismos (Pévet et
al., 2006) y en el ajuste temporal de numerosos procesos rítmicos diarios (ciclo sueñovigilia, alimentación, cambios de coloración, etc.) y estacionales (reproducción,
hibernación, etc.) (Reiter, 1993; Falcón, 2009; 2010). En los peces, el ritmo diario de
síntesis de melatonina está determinado por el incremento nocturno del contenido de la
proteína AANAT y de su actividad enzimática (Iuvone et al., 2005; Klein, 2007), la cual
durante el día es inhibida por la acción de la luz que actúa sobre los fotorreceptores
pineales y retinales (Falcón et al., 2010), con excepciones (Besseau et al., 2006). Un papel
menor en la regulación de la síntesis rítmica de melatonina parece desempeñar la enzima
HIOMT, aunque esto ha sido menos estudiado. En teleósteos se conoce la existencia de al
menos dos genes que codifican para la AANAT, denominados como aanat1 (expresada en
retina y similar a las AANATs de otros vertebrados) y aanat2 (expresada en pineal y que
no es ortóloga con otras clases de vertebrados) (Begay et al., 1998; Vuilleumier et al.,
2007). En la trucha arco iris, se han puesto de manifiesto las características enzimáticas de
91
Trabajo Experimental 3
las dos isoformas de la AANAT, mostrando diferente preferencia por el sustrato y
comportamiento de inhibición por producto final (Benyassi et al., 2000). A nivel periférico,
no está clara la presencia de una o de ambas formas enzimáticas, aunque recientemente
Velarde et al., (2010a) han descrito la existencia de ritmos diarios de expresión de aanat2
en hígado e intestino posterior del carpín, así como también de hiomt2. Asimismo este
grupo ha presentado evidencias de actividad AANAT1 en hígado e intestino del carpín
(Velarde, 2010), lo que sugiere que ambas formas de la AANAT podrían participar en la
síntesis de melatonina a nivel periférico.
El hecho de que se haya descrito la existencia de ritmos de expresión de genes reloj
en el tejido hepático e intestinal del carpín (Velarde et al., 2009a), ha llevado a sugerir que
la síntesis de melatonina en TGI pueda estar asociada a la actividad de osciladores
circadianos que, en última instancia, serían responsables de generar ritmos locales de
expresión de los enzimas aanat y hiomt. Dichos ritmos podrían estar ajustados por la
acción de factores externos, tales como el ciclo luz-oscuridad y/o el alimento o, por efecto,
de componentes neuroendocrinos internos. No obstante, a pesar de estos datos, poco se
conoce en los peces del carácter rítmico de la producción de melatonina a nivel del TGI, ni
de su regulación endógena y ambiental.
Por todo ello, el presente Trabajo pretende explorar en la trucha arco iris varios
objetivos que se enumeran a continuación: i) estudiar la contribución de la melatonina
pineal a los niveles de melatonina existentes en el TGI, así como la relevancia de la
producción intestinal en los niveles plasmáticos de la hormona; ii) evaluar la existencia de
ritmos de síntesis de melatonina (niveles, expresión de genes de enzimas de síntesis) en el
TGI; iii) evaluar la naturaleza endógena de la síntesis de melatonina en el TGI mediante
experimentos en condiciones de oscuridad constante; iv) estudiar el efecto del alimento
(ayuno prolongado) sobre el contenido de melatonina en el intestino.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
En todos los experimentos se utilizaron truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de
120 ± 10 g (media ± E.E.M.) obtenidas de una piscifactoría local (Soutorredondo, A
Coruña) y transportadas en tanques con suministro continuo de oxígeno hasta las
instalaciones experimentales en la Universidad de Vigo. Los peces se distribuyeron en
cubas de fibra de vidrio de 120 litros, dotadas de circulación continua de agua y burbujeo
de aire, bajo fotoperiodo artificial de 12 horas de luz (intensidad lumínica de 400 lux en la
superficie de los tanques) y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12). La temperatura del agua
fue controlada a 14 ± 1ºC durante todo el periodo experimental y la alimentación se realizó
una vez al día (10:00 hrs) con pienso seco comercial, a la dosis del 1% de alimento con
92
Trabajo Experimental 3
respecto a la masa corporal. Los animales fueron mantenidos en estas condiciones durante
al menos dos semanas antes de cualquier manipulación. Los experimentos realizados
cumplieron con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU)
y con las leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005).
Diseños experimentales
Experimento 1. Efecto de la pinealectomía sobre los niveles plasmáticos e intestinales de
melatonina en la trucha arco iris
Se utilizaron tres grupos de peces (n=12/grupo) que fueron asignados a los
siguientes tratamientos: control (animales intactos), pinealectomizados y grupo sham
(simulación de pinealectomía). La pinealectomía fue realizada siguiendo el método
descrito por Sánchez-Vázquez et al., (2000). Para ello, cada trucha fue capturada,
anestesiada y situada sobre una placa envuelta en un paño húmedo. Con la ayuda de un
bisturí se retiró la piel y el hueso en la zona de la fontanela craneal, bajo el cual se localiza
el órgano pineal. Con ayuda de una lupa binocular y pinzas de microdisección se retiró el
órgano pineal, aspirando a continuación suavemente con una cánula conectada a una
bomba a vacío, a fin de eliminar posibles restos de tejido pineal no tomados con las pinzas.
Finalizada la operación, se procedió a reponer la parte ósea, rellenando los finos espacios
adyacentes con un agente adhesivo de acción rápida. La misma operación se realizó en el
grupo de animales sham, si bien en estos no se llegó a extraer el órgano pineal. La duración
media de la operación en cada una de las truchas fue de alrededor de 2 minutos, tiempo
durante el cual se aplicó un ligero chorro de agua con anestésico sobre las branquias y la
piel del animal (excepto en la zona craneal). Transcurrido un periodo de 2 días, se
comprobó la recuperación de los animales operados, con ausencia de alteraciones del
comportamiento, así como la aparente ausencia de infección en la zona operada y se
procedió a su sacrificio en mitad de la fase luminosa (ZT6) y oscura (ZT18) del fotociclo
diario. Los peces de cada grupo se capturaron con red y se anestesiaron mediante
inmersión en una solución de metanosulfito ácido 3-aminobenzoico (MS-222, Sigma) a
una concentración de 50mg/L, tamponado con bicarbonato sódico a pH 7.4, y aireada de
forma continua. Se tomaron muestras de sangre (1 ml) mediante punción directa en la vena
caudal con jeringas heparinizadas. Seguidamente se diseccionó ventralmente el animal
para extraer el intestino que fue vaciado de su contenido y lavado con solución de NaCl
0.6% fría, para finalmente tomar muestras (40-50 mg tejido) de la zona media y posterior
que fueron congeladas a -80ºC.
Experimento 2. Variaciones diarias del contenido de melatonina, 5HT y de la expresión
génica de aanat1, aanat2 y hiomt
93
Trabajo Experimental 3
Las truchas, de características similares a las usadas en el Experimento 1, fueron
divididas en 2 grupos (n= 72 peces por grupo) distribuidos cada uno en 9 tanques (n= 8
peces) y fueron adaptados durante al menos dos semanas a las condiciones de laboratorio
(12L:12D, encendido de luces a las 8 h a.m.; 14ºC temperatura del agua). En los tanques
del primer grupo los peces fueron alimentados de forma rutinaria, con una ración diaria
(10:00 h a.m.) de pienso, incluso en el propio día del experimento. Las truchas de cada uno
de los tanques fueron capturadas, anestesiadas y sacrificadas cada 3 horas (un tanque por
punto temporal) a lo largo de un ciclo diario completo, comenzando en ZT0 (ZT = tiempo
zeitgeber, 8:00 h a.m.), de forma que los puntos muestreados fueron ZT0, ZT3, ZT6, ZT9,
ZT12, ZT15, ZT18, ZT21 y ZT0‘ (primer punto del día siguiente). En los muestreos
nocturnos se facilitó la toma de muestras mediante el uso de una lámpara de luz roja de
baja intensidad (<0.4 lux).
El segundo grupo de peces (9 tanques de 8 animales cada uno) fue adaptado a las
condiciones del laboratorio de forma similar al grupo 1, pero en este caso en el día del
experimento se evitó el encendido de las luces, de forma que los animales permanecieron
en situación de oscuridad constante durante 24 horas, no recibiendo alimento en este
periodo de tiempo. En estos peces la toma de muestras se realizó en los mismos intervalos
que en el caso anterior, pero empezando en CT3 (puntos muestreados: CT3, CT6, CT9,
CT12, CT15, CT18, CT21, CT0, CT3‘) y siempre con ayuda de una lámpara de luz roja.
En todos los peces incluidos en el experimento se tomaron muestras de sangre tras
anestesia, así como de las regiones del intestino medio y posterior (40-50 mg tejido). En el
caso de las muestras intestinales, se tomó una porción adicional de ambas regiones (media
y posterior) en condiciones de asepsia (material y viales estériles) con el fin de cuantificar
la expresión génica de los enzimas de la síntesis de melatonina.
Experimento 3. Efecto del ayuno prolongado y la posterior realimentación sobre los
ritmos diarios del contenido de melatonina intestinal
Los peces fueron adaptados a las condiciones de estabulación mencionadas en el
Experimento 1 (alimentados de forma rutinaria; una sola toma diaria a las 10:00 h a.m., 1%
del peso del pez). Se establecieron tres grupos de peces que se llevaron en paralelo,
distribuyéndose los animales de cada grupo en 8 tanques, cada uno conteniendo 8 peces,
los cuales permanecieron en aclimatación durante al menos 10 días. Los grupos
experimentales recibieron uno de estos tratamientos: i) peces alimentados normalmente
(grupo control); ii) peces ayunados durante siete días; en el momento del alimento se
realizaron las maniobras propias de la administración del mismo, es decir acercamiento del
personal al tanque e izado de la red superior; iii) peces ayunados durante 7 días (similar al
grupo anterior) y posteriormente realimentados (régimen alimenticio normal) durante otros
5 días.
94
Trabajo Experimental 3
Al término de cada periodo experimental (7 días de alimento normal en grupo
control, 7 días de ayuno en grupo ayunado; 7 días de ayuno + 5 días de alimentación
normal en grupo realimentado) se procedió al muestreo de los peces de cada tanque que
fueron sacrificados a diferentes tiempos (n=8/punto) durante un ciclo de 24 horas: 14:00
(ZT6), 18:00 (ZT10), 21:00 (ZT13), 00:00 (ZT16), 04:00 (ZT20), 07:00 (ZT23), 10:00
(ZT3) y 14:00 (ZT6) horas del día siguiente. De cada animal se tomaron muestras de
plasma y de intestinos medio y posterior, siguiendo los procedimientos descritos
previamente. En las fases de oscuridad el muestreo se realizó con ayuda de una lámpara de
luz roja de baja intensidad.
Procedimientos analíticos
Análisis de melatonina en plasma e intestino
Inmediatamente tras la extracción de las muestras de sangre de los peces incluidos
en cada uno de los experimentos, se procedió a su centrifugación a 12000 g durante 10
minutos. El plasma obtenido de cada muestra (500-600µl) fue dividido en alícuotas (200
µl) que fueron congeladas a - 80ºC hasta su posterior procesado.
La extracción y cuantificación de melatonina en el plasma y en el TGI se realizó de
acuerdo con el método descrito por Muñoz et al., (2009) y presentado en el Capítulo 1.
Cuantificación de la expresión de aanat1 aanat2 y hiomt mediante qPCR
En el Experimento 2 se obtuvieron muestras de intestino medio y posterior con el
fin de cuantificar la expresión de los genes que codifican para las enzimas implicadas en la
ruta biosintética de la melatonina. Los procedimientos de extracción de ARN y de
cuantificación de la expresión génica de aanat1 aanat2 y hiomt mediante qPCR fueron
idénticos a los descritos en el Capítulo 2 de la presente Memoria.
Análisis estadísticos
Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. En el Experimento 1 el
análisis estadístico incluyó un ANOVA de dos vías con las variables ―grupo‖ y ―tiempo‖
para verificar el efecto de la pinealectomía sobre el contenido plasmático e intestinal de
melatonina, seguido de un test de Student Neuwman Keuls (SNK) de comparaciones
múltiples. En el Experimento 2, la existencia de variaciones diarias en el contenido de
melatonina intestinal, así como en la expresión de genes, fue evaluado mediante un
ANOVA de una vía seguido del test SNK para establecer comparaciones entre puntos
concretos del ciclo diario. En el Experimento 3, se realizó una comparación entre las
variaciones rítmicas diarias de melatonina en plasma e intestino de los distintos grupos de
tratamiento mediante ANOVA de dos vías, seguido de un test SNK para comparación entre
grupos en cada uno de los puntos diarios muestreados. En todos los análisis realizados, el
grado de significación se estableció en P < 0.05.
95
Trabajo Experimental 3
Resultados
Efecto de la pinealectomía sobre los niveles plasmáticos e intestinales de melatonina
La Figura 1 muestra el contenido plasmático de melatonina en los grupos control,
pinealectomizado y sham (operación simulada). Tanto en el grupo control como en el de
operación simulada los niveles nocturnos de melatonina fueron significativamente
superiores a los medidos en muestras procedentes de animales sacrificados durante el día.
En cambio, dicha variación diaria en los niveles plasmáticos de melatonina desapareció
completamente en el grupo de animales pinealectomizados.
Melatonina en plasma (pg/ml)
400
b
Dia
Noche
b
300
200
a
a
c
100
c
0
Control
Pinealectomizado
Sham
Figura 1. Variaciones día: noche en los niveles de melatonina plasmática en truchas control,
pinealectomizadas y sham. Las diferentes letras indican diferencias significativas entre grupos (P <
0.05).
Por otra parte, no se detectaron diferencias significativas entre los valores de
melatonina en el intestino medio de los animales del grupo control y sham muestreados de
día y de noche (Figura 2), aunque si hubo una tendencia a mayores valores durante la
noche. En el intestino posterior los valores nocturnos fueron significativamente mayores
que los diurnos, hecho que también se constató en el grupo de animales sham. Además, la
pinealectomía provocó la desaparición, en términos estadísticos, de la diferencia día/noche
en dicha región intestinal, aunque se mantuvo una clara tendencia a mayores valores
nocturnos que diurnos.
96
Trabajo Experimental 3
Melatonina (pg/ g tejido)
250
Dia
Noche
A
200
150
100
50
0
Control
350
Melatonina (pg/ g tejido)
300
Pinealectomizado
Sham
Dia
Noche
B
*
*
250
200
150
100
50
0
Control
Pinealectomizado
Sham
Figura 2. Contenido de melatonina en intestino medio (A) y posterior (B) de truchas control,
pinealectomizadas y sham sacrificadas en mitad del día (ZT6) y de la noche (ZT18). *, Variaciones
significativas (P < 0.05) con respecto al día.
Variaciones diarias del contenido intestinal de melatonina y 5HT y efecto de la
oscuridad constante sobre los ritmos de melatonina en plasma e intestino
En la Figura 3 se muestran las variaciones diarias del contenido de melatonina en
intestino medio y posterior de animales mantenidos en condiciones lumínicas normales
(ciclo L:D). El contenido de la hormona fue muy similar en ambos tejidos, no existiendo
diferencias significativas entre ellos en ninguno de los intervalos de tiempo analizados. En
ambos casos se observó un incremento de la hormona desde las primeras horas del día
hasta la segunda mitad de la fase de luz, con un primer pico a ZT9, comenzando a
descender hasta valores basales el inicio de la noche. Posteriormente se hallaron un
segundo pico con valores máximos, en la mitad del periodo nocturno (ZT18).
97
Trabajo Experimental 3
Int. Medio
Int. Posterior
500
Melatonina (pg/g tejido)
*
400
*
300
200
100
0
3
6
9
12
15
18
21
0'
Tiempo ZT
Figura 3. Variaciones rítmicas diarias del contenido de melatonina en intestino medio y
posterior de truchas arco iris mantenidas en condiciones normales de luz y oscuridad (n= 7-8/ por
tiempo). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores medidos en ZT0.
El perfil diario del contenido de 5HT (Figura 4) también fue bastante similar en el
intestino medio y posterior de la trucha. Sin embargo, dicho perfil fue bastante diferente al
descrito para la melatonina, observándose los máximos valores en los peces sacrificados en
mitad de la fase de luz (ZT6), previos al pico diurno hallado para la melatonina,
alcanzándose el grado de significación en este intervalo en ambos tejidos (P < 0.05
respecto de ZT0 en cada tejido). Durante la noche no se hallaron variaciones significativas,
aunque en intestino posterior la 5HT tendió a incrementar en las horas centrales de la
noche (ZT18).
Tal y como cabría esperar los niveles plasmáticos de melatonina (Figura 5) en
animales aclimatados a condiciones normales de iluminación (L:D) se incrementaron
significativamente durante la fase oscura del ciclo diario y permanecieron elevados durante
toda la noche (Figura 5A).
Con el fin de evaluar el carácter endógeno de las variaciones diarias en el contenido
intestinal de melatonina, se expuso un grupo adicional de peces a condiciones de oscuridad
constante (D:D) durante 24 horas. En estos animales, a nivel plasmático, se observó la
ausencia de ritmo diario de los niveles de melatonina, con valores ligeramente superiores
durante la fase nocturna en relación a la diurna (Figura 5B).
98
Trabajo Experimental 3
12000
Int. Medio
Int. Posterior
5HT (ng/g tejido)
10000
*
8000
6000
4000
2000
0
3
6
9
12
15
18
21
0'
Tiempo ZT
Figura 4. Variaciones rítmicas diarias en el contenido de serotonina en intestino medio y
posterior de la trucha arco iris (n= 7-8/ grupo). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores
medidos en ZT0.
El efecto de la situación de oscuridad constante a nivel de intestino solamente pudo
ser constatado en el intestino medio, debido a problemas técnicos surgidos durante el
procesamiento de las muestras de intestino posterior. Tal y como se muestra en la Figura 6,
el perfil de melatonina intestinal también mostró un aumento durante la fase de luz
subjetiva, con un máximo a CT9. Adicionalmente se observó un segundo pico de mayor
amplitud que alcanzó el grado de significación en la fase subjetiva de oscuridad a CT15, es
decir 3 horas antes del pico de melatonina presente el peces mantenidos bajo situación de
L:D.
Variaciones diarias en la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en tejido intestinal de la
trucha arco iris
En la Figura 7 se muestran las variaciones diarias en la expresión del mRNA de
aanat1, aanat2 y hiomt en intestino medio y posterior de la trucha. A excepción de la
aanat2 en intestino posterior, los niveles de los transcrítos analizados exhibieron un claro
ritmo diario, con un pico nocturno cuyo máximo fue localizado a ZT18. En relación a la
hiomt, los valores de expresión relativa fueron similares en intestino medio y posterior,
mientras que para la aanat1 y aanat2 fueron mayores en la región media. De manera
sorprendente, la expresión de aanat2 en intestino medio no mostró aumento nocturno.
99
Trabajo Experimental 3
700
A
Melatonina en plasma pg/ml
600
*
*
500
*
*
12
15
400
300
200
100
0
0
3
6
9
18
21
0'
Tiempo ZT
Melatonina en plasma pg/ml
1000
B
800
*
*
12
15
600
400
200
0
0
3
6
9
18
21
0'
Tiempo CT
Figura 5. Variaciones diarias en los niveles plasmáticos de melatonina, en truchas sometidas a
condiciones normales de iluminación (A) (L:D), o bajo condiciones de oscuridad constante (D:D),
durante 24 horas (B). *, P < 0.05, con respecto a los respectivos valores medidos en ZT0.
100
Trabajo Experimental 3
600
Melatonina (pg/g tejido)
*
500
400
300
200
100
3
6
9
12
15
18
21
0
3'
Tiempo CT
Figura 6. Variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino medio de truchas
arco iris sometidas a oscuridad constante (D:D) durante 24 horas. * P < 0.05 con respecto a los
respectivos valores observados en CT3.
La Figura 8 muestra el patrón rítmico diario de expresión de aanat1, aanat2 y
hiomt en el intestino medio de peces sometidos durante un periodo adicional de 24 horas a
oscuridad constante. A efectos de comparación con la situación de L:D, la figura también
muestra la localización del máximo diario hallado bajo un ciclo lumínico normal. En
condiciones de D:D se observó un perfil rítmico de expresión de aanat1, aanat2 y hiomt,
cuyo pico se localizó durante la noche subjetiva (CT15), es decir con 3 horas de adelanto
con respecto a lo observado en animales mantenidos bajo un ciclo L:D. No se halló cambio
alguno durante la fase de día subjetivo. Los valores de amplitud medidos para aanat1 y
hiomt fueron similares en D:D y L:D, mientras que para la aanat2, la amplitud del ritmo
fue significativamente menor en oscuridad constante en comparación con la situación
lumínica normal (L:D).
101
Trabajo Experimental 3
Int. Medio
Int. Posterior
aanat1 (Expresión relativa)
50
A
*a
40
30
20
*
*
10
0
0
3
9
12
15
18
21
0'
Int. Medio
Int. Posterior
60
aanat2 (Expresión relativa)
6
B
*a
50
*a
40
30
*a
*a
20
a
a
10
0
0
3
6
9
12
15
18
21
0'
Int. Medio
Int. Posterior
14
C
hiomt (Expresión relativa)
12
**
10
8
**
*
*
6
4
2
0
0
3
6
9
12
15
18
21
0'
Tiempo ZT
Figura 7. Variación rítmica diaria del contenido de mRNA de aanat1 (A), aanat2 (B) y
hiomt (C) en condiciones normales L:D, en intestino medio y posterior de la trucha arco iris. * P <
0.05 con respecto a los respectivos valores basales de cada región intestinal; a P < 0.05 respecto al
intestino posterior.
102
Trabajo Experimental 3
aanat1 (Expresión relativa)
50
A
Condición D:D
Condición L:D
*
40
30
*
*
20
10
0
3
6
9
12
15
18
21
0
3´
aanat2 (Expresión relativa)
60
B
Condición D:D
Condición L:D
50
40
30
*
*
20
10
0
3
6
9
12
15
18
21
0
3´
hiomt (Expresión relativa)
14
C
Condición D:D
Condición L:D
12
*
10
8
*
*
6
4
2
0
3
6
9
12
15
18
21
0
3´
Tiempo CT
Figura 8.Variaciones diarias de la expresión genica de las enzimas aanat1(A), aanat2 (B) y
hiomt (C) en el intestino medio de truchas arco iris aclimatadas durante 2 semanas a condiciones de
luz normales (L:D) y luego sometidas durante 24 horas a oscuridad constante (D:D). * P < 0.05
respecto de los valores basales. Con el fin de facilitar la comparación con los datos en L:D, se
insertaron los valores de la franja horaria en la que se obtuvo el pico de expresión en L:D (Línea
discontinua, círculos blancos).
103
Trabajo Experimental 3
Efecto del ayuno y la realimentación sobre las variaciones diarias de melatonina en
plasma y tracto gastrointestinal de la trucha
A nivel plasmático, se observó un claro ritmo diario en los niveles de melatonina en
todos los grupos experimentales (peces control, ayunados durante 7 días, realimentados),
siendo los valores nocturnos significativamente superiores a los diurnos (Figura 9). El
periodo de valores elevados de melatonina fue más prolongado en los animales ayunados
que en los del grupo control, dado que en los primeros ya se apreció un incremento
significativo al final de la fase luminosa (18:00 horas; P < 0.05 respecto del grupo control),
hecho que no aconteció en los restantes grupos. Por otro lado, la amplitud del pico
nocturno también fue diferente según el tratamiento. Así, los niveles máximos nocturnos
observados en el grupo ayunado fueron significativamente superiores (21:00 y 00:00
horas) a los detectados en el grupo control (P < 0.05). Por su parte, la realimentación (5
días tras el ayuno) revirtió parcialmente el efecto del ayuno sobre los niveles plasmáticos
de melatonina, siendo sus valores similares a los del grupo control.
Melatonina plasmatica (pg/ml)
1000
*
Control
Ayunados
Realimentados
*
800
*#
600
400
*
200
0
14:00
18:00
21:00
00:00
04:00
07:00
10:00
14:00
Tiempo (horas del dia)
Figura 9. Ritmo diario de los niveles de melatonina en plasma de truchas alimentadas de
forma normal (grupo control), ayunadas durante 7 días y realimentadas (5 días de alimentación tras
7 días de ayuno). En el gráfico los valores representan la media ± EEM de 5-7 muestras. * P < 0.05
vs. grupo control. #, P < 0.05 vs. grupo ayunado.
Con respecto al efecto de la condición alimenticia sobre los niveles de melatonina
en intestino, los resultados se muestran en la Figura 10. Tanto en el intestino medio como
en el posterior, el perfil diario de los niveles de melatonina fue similar al observado en el
Experimento 2, con ligeros aumentos durante la fase de luz (18:00 h) y en mitad de la fase
de oscuridad (04:00 h) del fotociclo diario. A nivel del intestino medio, los peces ayunados
104
Trabajo Experimental 3
durante 7 días mostraron valores mayores que los del grupo control durante gran parte de
la fase diurna, siendo significativamente más elevados a las 14:00 h y 18:00 h, así como al
inicio de la noche (21:00 h). A partir de ese momento, los niveles de melatonina en
intestino medio descendieron drásticamente en el grupo ayunado, alcanzando valores
visiblemente menores, aunque no significativos, que el control a las 04:00 h. La
realimentación de los animales revirtió parcialmente el incremento diurno del contenido de
melatonina observado en los ayunados y provocó un incremento de la amplitud de los
niveles nocturnos de la indolamina (04:00 horas; P < 0.05 vs ayunados).
Al igual que en el intestino medio, el perfil diario del contenido de melatonina en el
intestino posterior se vio alterado en los animales ayunados con respecto a los controles
(figura 11), presentando valores significativamente mayores durante la primera mitad de la
noche (21:00 h; 00:00 h, P < 0.05 vs control). A continuación se observó una fuerte
disminución de los mismos coincidiendo el mínimo con el máximo nocturno del grupo
control (04.00 h, P < 0.05), recuperándose en los sucesivos intervalos. La realimentación
de los animales revirtió casi por completo el efecto del ayuno sobre el perfil rítmico del
contenido de melatonina en el intestino posterior de la trucha, no existiendo diferencias con
respecto al grupo control en ninguno de los tiempos estudiados.
1000
Melatonina (pg/ g tejido)
800
*
Control
Ayunados
Realimentados
*#
600
*#
e
400
200
#
0
14:00
18:00
21:00
00:00
04:00
07:00
10:00
Tiempo (Horas del dia)
Figura 10. Variaciones diarias en el contenido de melatonina en el intestino medio de truchas
control (alimentación normal), ayunadas durante 7 días, y realimentadas (5 días tras 7 días de
ayuno). Los valores representan la media ± EEM de 7-8 animales. * P < 0.05 vs control en cada
uno de los tiempos; # P < 0.05 respecto del grupo de animales realimentados en cada uno de los
tiempos.
105
Trabajo Experimental 3
Control
Ayunados
Realimentados
600
Melatonina (pg/ g tejido)
500
400
*#
*#
300
200
*#
100
0
14:00
18:00
21:00
00:00
04:00
07:00
10:00
Tiempo (Horas del dia)
Figura 11. Variación diaria del contenido de melatonina en el intestino posterior de grupos
de truchas control (alimentadas normalmente), ayunadas (durante 7 días) y realimentadas (5 días
tras 7 días de ayuno). Los valores representan la media ± EEM de 7-8 datos. * y # P < 0.05 respecto
de los grupos control y realimentados, respectivamente, en cada uno de los tiempos estudiados.
106
Trabajo experimental 4
Efecto de la ingesta y el paso de alimento por el
tracto digestivo sobre la síntesis local de
melatonina en la trucha arco iris.
Trabajo experimental 4
Introducción y objetivos
En los trabajos previos hemos presentado evidencias claras de que la melatonina es
sintetizada en el tracto digestivo de la trucha arco iris, incluyendo la descripción de los
niveles de melatonina en diferentes regiones del TGI, pruebas histológicas de la presencia
de células conteniendo melatonina, serotonina y AANAT en la pared digestiva, efecto de la
pinealectomía, expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt, así como la existencia de
cambios diarios en los niveles de melatonina intestinal y en la expresión génica, pudiendo
ser modulados por el fotoperiodo y el alimento. De estos últimos resultados (Trabajo 3)
hemos extraído la idea de un posible control circadiano de la síntesis de melatonina
intestinal, mostrándose los ritmos de la indolamina ajustados al ciclo lumínico al cual se
expone el animal. En los peces, sin embargo, la información disponible sobre los
mecanismos circadianos a nivel periférico es escasa, aunque Velarde et al., (2009a)
demuestran en el intestino de carpín la existencia de expresión rítmica de genes
(cryptochrome y period) que forman parte de la maquinaria molecular del reloj circadiano.
Este grupo también aportó evidencias de expresión rítmica de aanat y hiomt en el intestino
posterior del carpín (Velarde et al., 2010a), indicando que en el caso de la aanat2 los
ritmos de expresión permanecen inalterados bajo condiciones lumínicas constantes, lo que
sugiere la existencia de una regulación circadiana de la síntesis intestinal de melatonina.
Algo similar podría ocurrir en la trucha arco iris, dado que nuestros datos claramente
muestran que los ritmos de expresión de aanat y hiomt en intestino medio persiste en un
ambiente lumínico constante (Trabajo 3). Sin embargo no se puede descartar la existencia
de un posible efecto modulador del factor alimenticio, independiente del mecanismo
circadiano.
La luz, bien sea actuando de forma directa o a través del ajuste del sistema
circadiano, es el principal factor regulador de la síntesis de melatonina en tejidos
fotorreceptores tales como el órgano pineal y la retina (Falcón, 1999; Ceinos et al, 2005),
provocando una inhibición de la expresión y actividad de la enzima AANAT (Falcón,
1999; Ceinos et al., 2008). No obstante, es improbable que la síntesis de melatonina a nivel
del TGI responda al estímulo lumínico, tal y como lo hacen las células fotorreceptoras
pineales y retinales. Por tanto, un efecto modulador de la formación intestinal de
melatonina por estímulos no fóticos parece ser más consecuente con la naturaleza no
fotorreceptora de este tejido. En los peces, aunque existen algunos datos del efecto del
ayuno sobre la melatonina a nivel del TGI (ver Trabajo 3), se ha postulado que el acceso a
la comida podría también contribuir al ajuste circadiano de la síntesis de esta hormona, al
igual que ocurre con otras funciones circadianas periféricas (Sánchez-Vázquez et al., 1996;
Bolliet et al., 2001; Velarde et al., 2010a).
La funcionalidad digestiva está condicionada por los patrones de ingesta y por el
discurrir del alimento ingerido a lo largo del tubo digestivo, por lo que el factor alimenticio
ha recibido atención como potencial modulador de la síntesis de melatonina en el TGI.
Así, Bubenik et al., (2002) en ratón demuestran que el ayuno durante 24 y 48 h aumenta
109
Trabajo experimental 4
los niveles de melatonina en estómago e intestino, hecho que también parece ocurrir en la
trucha arco iris a nivel intestinal y pineal a los 7 días de ayuno (Ceinos et al., 2008; Trabajo
3). No obstante, el comportamiento inmediato tras la ingesta podría ser diferente. Así, en
humanos y cerdos se ha descrito que los niveles de melatonina periférica, que en parte
podrían provenir de la síntesis intestinal, se incrementan poco tiempo tras la ingesta
(DeBoer, 1988; Rice et al., 1995). Asimismo, el paso de alimento a lo largo del TGI
redunda en un aumento considerable del contenido estomacal e intestinal de melatonina en
el ratón (Bubenik y Pang, 1994), algo similar a lo que ocurre con los niveles de la hormona
en la circulación portal hepática del cerdo (Bubenik et al., 2000b). El mecanismo por el
cual la presencia de alimento en el TGI afecta al contenido de melatonina no está claro. Sin
embargo, se sabe que la estimulación mecánica de la mucosa, los nutrientes y diversos
factores neurohormonales liberados al lumen del tracto digestivo, junto con la presencia de
alimento, son potentes reguladores de la actividad neuroendocrina intestinal, en general y,
en particular, de la serotoninérgica (Bertrand y Bertrand, 2010). Ello nos ha llevado a
hipotetizar que estos factores u otros relacionados con el transito digestivo del alimento,
puedan también afectar a la síntesis de melatonina en el TGI de la trucha arco iris.
Por todo ello, el objetivo general del presente Trabajo se ha centrado en evaluar el
efecto de la ingesta y de la presencia de alimento en el tracto digestivo sobre la producción
de melatonina en el propio intestino y otros órganos relacionados con la actividad digestiva
en la trucha arco iris.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
En el presente estudio se utilizaron ejemplares inmaduros de trucha arco iris
(Oncorhynchus mykiss) de 100 ± 4 g de peso corporal. Los peces se obtuvieron de una
piscifactoría (Soutorredondo, Lousame, A Coruña) y se trasladaron en tanques con
suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones experimentales en la Universidad de
Vigo, donde fueron transferidos a cubas de fibra de vidrio de 120 litros dotadas de sistemas
de circulación continua de agua declorada y filtrada (14  1ºC) y difusión de aire. Los
peces se mantuvieron bajo un fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 horas de
oscuridad (L:D 12:12) y con una intensidad lumínica de 400 lux durante el día. El alimento
se suministró una vez al día (ZT3) y consistió en pienso seco comercial (Dibaq-142
Diproteg SA., Segovia; Composición aproximada: 48% proteína, 14% carbohidratos, 25%
grasas, y 11.5% extracto seco; 20.2 MJ/kg de pienso). La cantidad diaria de alimento
suministrado fue del 1% de la masa corporal de los animales. Los experimentos fueron
acordes con la directiva de manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y
con las Leyes españolas para el uso de animales en investigación (RD 1201/2005).
110
Trabajo experimental 4
Diseño experimental y toma de muestras
Se usaron dos grupos de 50 truchas cada uno, distribuidas en 10 tanques
(n=10/tanque). Todos los animales recibieron alimento a las 10 h de la mañana (ZT2)
durante al menos 2 semanas previas del inicio del experimento. Transcurrido dicho
periodo, uno de los grupos recibió alimento a la hora habitual (grupo control), mientras que
el segundo grupo se mantuvo en ayunas durante 72 horas (grupo ayunado), con el fin de
asegurar la ausencia de restos del alimento en todo el TGI. Transcurrido ese tiempo, los
animales de ambas grupos fueron sacrificados en los siguientes momentos, tomados en
referencia a la hora habitual de suministro del alimento: -120 minutos (pre-ingesta, solo en
animales del grupo control), 20 minutos, 120 minutos, 240 minutos y 360 minutos (postingesta). Estos tiempos fueron elegidos, en base a observaciones previas sobre la
cronología del paso del alimento por el TGI de la trucha arco iris (Tabla 1).
Tabla 1. Cronología del paso del alimento a través de las diferentes zonas del TGI
Tiempo post
ingesta
0-2 hora
Zona del TGI donde se
encuentra el alimento
Esófago y estómago
Observaciones
2 horas
Estómago, intestino anterior y
ciegos pilóricos
4 horas
Estómago (en menor
cantidad), intestino anterior,
ciegos y intestino medio
Intestino anterior, Ciegos
pilóricos, intestino medio
5 horas
6 horas
8 horas
El alimento es tragado y comienza su
acumulación en el estomago, en el cual es
triturado y ablandado.
Comienza el paso del alimento desde el
estomago hacia el intestino anterior y ciegos
pilóricos, liberación de bilis en el paso del
estomago hacia el intestino anterior y ciegos.
El alimento llega al intestino medio, junto
con bilis liberada, y se termina el vaciado del
estomago.
El alimento se encuentra en su mayoría en la
zona del intestino anterior, ciegos pilóricos e
intestino medio.
El alimento comienza a llegar a la zona del
intestino posterior
Intestino anterior, Ciegos
pilóricos, intestino medio y
intestino posterior
Ciegos pilóricos, intestino
medio y posterior
El alimento se encuentra, en todas las zonas
intestinales.
24 horas
Intestino medio y posterior
Restos de alimentos se encuentran en el
intestino medio y su gran mayoría está en el
intestino posterior
48 horas
Intestino posterior
Al cabo de este tiempo, aun se encuentra
alimento en el intestino posterior. La zona del
intestino anterior y medio, ya sin alimento,
presentan una coloración amarilla verdosa.
111
Trabajo experimental 4
Para la toma de muestras las truchas fueron anestesiadas por inmersión en una
solución de MS-222 (50mg/L) y pesadas previamente a la extracción de sangre, que se
realizó mediante punción en la vena caudal con jeringas heparinizadas. Inmediatamente
después, se sacrificaron y se extrajo el intestino en su integridad, procediéndose de forma
inmediata al vaciado del contenido luminal que se recogió en viales para análisis
posteriores. En el caso de los animales que recibieron alimento (grupo control), se constató
la presencia del mismo en el tubo digestivo como señal evidente de que todos habían
ingerido alimento. En el caso de los peces ayunados, el volumen luminal recogido fue muy
pequeño y básicamente estaba formado por una secreción mucosa amarillenta (indicativo
de la secreción de bilis al lumen intestinal). Posteriormente, el tejido intestinal fue
seccionado para obtener diferentes regiones (intestino anterior, medio y posterior). Para la
cuantificación de la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt y el efecto de la presencia de
alimento se tomaron muestras de intestino medio a diferentes tiempos (120 min) o después
de la ingesta (20, 120, 240 y 360 min), tanto en animales ayunados como alimentados.
También se extrajo una muestra de hígado, así como la vesícula biliar (con todo su
contenido) que se introdujo en un vial con el fin de vaciar la totalidad de bilis contenida. El
volumen de bilis se midió con una micropipeta, e inmediatamente después se separó una
muestra para su congelación. Todas los viales de las muestras obtenidas en el
procedimiento fueron congelados inmediatamente en hielo seco y posteriormente a -80ºC
hasta su procesado.
Procedimientos analíticos
La muestras de sangre fueron centrifugadas (13200 rpm, 10 min a 4ºC) tras su
obtención a fin de separar el plasma, el cual fue dividido en alícuotas que se congelaron a
-80ºC. El proceso de extracción de melatonina en el plasma, así como en la bilis y en los
tejidos intestinales, se realizó conforme a los protocolos previamente establecidos (Muñoz
et al., 2009) y descritos en el Capítulo 1 de la presente Memoria. Con respecto a las
muestras de contenido luminal, se tomó un volumen de 200 l de cada una (o un volumen
menor en algunas muestras de animales ayunados) que fue mezclado con HCl 0.1N y
centrifugado (13200 rpm, 5 min a 4ºC). El sobrenadante obtenido se sometió al mismo
proceso de extracción de melatonina con cloroformo que el plasma y la bilis.
El análisis de melatonina se llevó a cabo siguiendo los procedimientos descritos en
Muñoz et al., (2009) y descritos en el Capítulo 1 de la presente Memoria, con
modificaciones. En este caso, aunque las características generales del sistema de HPLC
fueron similares, se utilizó una columna analítica Phenomenex Kinetex C-18 de 2.6 m de
diámetro de partícula y 50 mm de longitud, a través de la cual se hizo pasar la fase móvil
(igual composición a la indicada en el Trabajo 1) a un flujo de 0.7 ml/minuto y a
temperatura ambiente. Aunque la menor longitud y diámetro de esta columna, en relación a
la usada previamente, exige un volumen de carga menor, las características de su relleno
(partículas de diámetro muy reducido, gran empaquetamiento) permiten obtener una
resolución muy elevada y una mayor sensibilidad (incremento de hasta 3 veces) al acelerar
112
Trabajo experimental 4
la salida de los compuestos separados. De hecho, con el uso de esta columna se consiguió
un tiempo de análisis por muestra muy reducido (cromatogramas de 6-7 minutos, ver
figura 1) y una considerable reducción en los costes analíticos (flujo reducido de la fase
móvil, menor tiempo de análisis).
A
B
Figura 1. Comparación de resolución y tiempos de análisis entre las columnas utilizadas. (A)
Patrón de melatonina con 100 pg inyectado en columna utilizada con anterioridad (Beckmann
Ultrasphere ODS) (B) Melatonina 100 pg inyectada en columna (Phenomenex Kinetex C-18).
La expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt se evaluó siguiendo los
procedimientos de extracción, retrotranscripción y cuantificación descritos en el Capítulo 2
de la presente Memoria.
Análisis estadísticos
Todos los datos se muestran como el promedio ± E.E.M. para cada tejido evaluado.
Dentro de cada grupo de tratamiento (alimentado y ayunado) se compararon los distintos
tiempos mediante un ANOVA de una vía seguido de un test SNK de comparaciones
múltiples. En cada uno de los intervalos de tiempo, las comparaciones entre ambos grupos
se realizaron mediante la prueba de la T de Student para muestras independientes. En todos
los análisis realizados, el grado de significación se estableció en P < 0.05.
113
Trabajo experimental 4
Resultados
Niveles de melatonina en intestino, hígado y bilis
Como se muestra en la Figura 1, las truchas que recibieron alimento mostraron
cambios dependientes del tiempo en el contenido intestinal de melatonina. Tomando como
referencia el punto de muestreo pre-ingesta (2 horas antes de administrar alimento) se
observa un aumento significativo en el contenido de melatonina en intestino anterior (120
y 360 min), medio (120, 240 y 360 min) y posterior (20 y 360 min). También es importante
señalar que en el grupo de animales alimentados, el incremento del contenido de
melatonina se produjo en el intestino anterior y en el intestino medio (Figura 1A y 1B) a
los 120 minutos después de la toma de alimento, mientras que en el intestino posterior
(Figura 1C) dicho incremento no fue significativo hasta pasados 360 minutos, lo que
podría indicar la existencia de un patrón temporal de aumento de los niveles de melatonina
en relación con el tránsito del alimento por las distintas regiones. Además en el intestino
posterior se observó un incremento significativo del contenido de melatonina a los 20
minutos post-ingesta, el cual podría estar asociado a una respuesta reguladora que afectaría
únicamente a este patrón intestinal.
Sin embargo, en los peces que no recibieron alimento (ayuno durante 72 horas), no
se observaron aumentos dependientes del tiempo, e incluso en intestino anterior y posterior
se observó una tendencia al descenso (intestino anterior: P < 0.05 a 360 min vs 20 min;
intestino posterior: P < 0.05 a 240 y 360 min vs 20 min). Al igual que en el grupo control,
el intestino posterior de los animales ayunados mostró un incremento significativo del
contenido de melatonina en los primeros 20 minutos, lo que indicaría la persistencia del
mismo mecanismo regulador local en el intestino posterior que el observado en los peces
control.
La Figura 2 muestra el volumen de bilis existente en la vesícula biliar en cada
grupo experimental en el momento de sacrificio de los animales. Como era de esperar, el
volumen de bilis varió significativamente a lo largo del tiempo en el grupo de animales
alimentados, de modo que disminuyó de forma rápida y continua tras la ingesta,
alcanzándose los valores mínimos en los animales sacrificados 360 min después de ser
alimentados. En el grupo de animales ayunados, el volumen de bilis fue estable y los
valores similares a los hallados en los animales alimentados en el periodo pre-ingesta (-120
min) e inmediatamente tras la ingesta (20 min).
Los niveles de melatonina presentes en el contenido luminal del intestino, así como
la concentración de la hormona en el tejido hepático y la bilis se muestran en la Figura 3.
Cuando se analizó el contenido de melatonina presente en el contenido luminal de los
peces alimentados (Figura 3A), se observó un incremento significativo a los 120 minutos
tras recibir el alimento (P < 0.05 respecto del grupo -120 min; P < 0.05 respecto al grupo
ayunado), el cual se mantuvo elevado hasta los 240 minutos (P < 0.05 respecto del grupo
114
Trabajo experimental 4
ayunado). A partir de ese momento se observó una disminución paulatina del contenido de
melatonina, hasta alcanzar valores pre-ingesta a los 360 min. En cambio, el grupo de peces
ayunados no mostró variaciones en el contenido de melatonina a lo largo del tiempo.
El contenido hepático de melatonina (Figura 3B) no se vio significativamente
alterado a lo largo del tiempo en ninguno de los grupos analizados (alimentados y
ayunados). Únicamente a los 240 minutos post-ingesta el contenido hepático de melatonina
en los animales control tendió a ser superior al medido en los peces ayunados.
Con respecto a la concentración de melatonina en la bilis (Figura 3C), no hubo
cambios dependientes del tiempo en ninguno de los grupos estudiados. Sin embargo, la
concentración de melatonina fue siempre superior en las truchas alimentadas que en las
ayunadas. Así, tanto a 20 como a 240 y 360 minutos post-ingesta el contenido de biliar de
la indolamina fue significativamente superior en los animales alimentados (P < 0.05
respecto al grupo de ayunadas en dichos intervalos). Es importante señalar que en el
hígado y vesícula biliar, el incremento en los niveles de melatonina en los peces
alimentados se produjo tanto a tiempos cortos (20 min) como largos (a partir de los 240
minutos post-ingesta), con respecto a lo observado en el grupo de animales ayunados.
115
Trabajo experimental 4
500
Ayunado
Alimentados
A
Melatonina (pg/g tejido)
*
#
400
*#
300
a
200
100
0
Melatonina (pg/g tejido)
500
B
*
*
*
400
300
#
200
100
0
400
C
Melatonina (pg/g tejido)
#
*$
300
*
200
100
0
-120
20
120
240
360
Tiempo(minutos)
Figura 1. Contenido de melatonina en muestras de intestino (A) anterior, (B) medio y (C)
posterior procedentes de dos grupos de truchas arco iris, ayunadas y alimentadas, sacrificadas a
diferentes tiempos en relación al momento de la ingesta (tiempo 0). * P < 0.05 con respecto al
grupo de ayunadas (n=8/grupo). # P< 0.05 respecto de los demás tiempos dentro del mismo grupo
(n=8/grupo).
116
Trabajo experimental 4
350
Ayunados
Alimentados
Volumen de Bilis (µl)
300
250
200
$
150
*$
100
*#
50
0
-120
20
120
240
360
Tiempo (minutos)
Figura 2. Variación temporal del volumen de la vesícula biliar en truchas alimentadas y
ayunados. Los tiempos se tomaron en relación al momento de la ingesta (tiempo 0) * P < 0.05
respecto del grupo de peces ayunados (n=8/grupo). # P < 0.05 con respecto a los demás tiempos del
mismo grupo.
Expresión de aanat1, aanat2 y hiomt en intestino medio
La expresión génica de annat1, aanat2 y hiomt en el intestino medio (Figura 4),
cambió de forma drástica a lo largo del tiempo en el grupo de animales alimentados, no
observándose cambios apreciables en los peces ayunados. Hay que mencionar que solo se
procesaron muestras procedentes de intestino medio, debido a que esta zona es la que
presentó una mayor producción de melatonina con respecto al resto de regiones del TGI.
En los animales alimentados, la expresión de aanat1 (Figura 4A) sufrió variaciones
dependientes del tiempo. Así, a los 20 y 120 minutos de recibir el alimento la expresión de
aanat1 se incrementó de forma significativa con respecto a lo observado en el resto de
intervalos temporales (P < 0.05 para cada uno de ellos). Además, en estos mismos
intervalos la expresión de aanat1 en los animales alimentados fue muy superior a la
medida en los peces ayunados (P < 0.05 para cada uno de ellos).
Por otro lado, la expresión de aanat2 (Figura 4B) en las truchas alimentadas fue
significativamente mayor a la observada en las ayunadas en todos los tiempos analizados,
salvo a los 360 minutos. Además, la expresión de aanat2 se mantuvo elevada en el grupo
de animales alimentados desde dos horas antes de la ingesta hasta los 240 minutos postingesta con respecto a la expresión medida a los 360 minutos en el mismo grupo (P<0.05
respectivamente), momento este último en el cual la expresión de aanat2 disminuyo
drásticamente hasta valores similares a los del grupo ayunados.
117
Trabajo experimental 4
La expresión de hiomt (Figura 4C) también fue afectada únicamente en el grupo de
animales alimentados. La expresión de hiomt se incrementó de forma significativa a los 20
minutos post-ingesta en los animales alimentados, comparado tanto con el resto de
intervalos en el mismo grupo (P < 0.05) como con respecto al grupo de truchas ayunadas
(P < 0.05). Durante el resto de intervalos temporales, la expresión de hiomt no se modificó
en ambos grupos de peces.
118
Trabajo experimental 4
7000
A
Ayunados
Alimentados
*#
Melatonina (pg/ml)
6000
5000
*
4000
3000
2000
1000
0
180
-120
20
120
240
360
-120
20
120
240
360
B
Melatonina (pg/g tejido)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
4000
C
Melatonina (pg/ml)
*
*
240
360
*
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-120
20
120
Tiempo (minutos)
Figura 3. Variaciones temporales en el contenido luminal intestinal de melatonina (A) y
niveles de la hormona en hígado (B) y en bilis (C) de peces alimentados y peces ayunados durante
72 h. Los tiempos se tomaron en relación al momento de la ingesta (tiempo 0). Los datos se
expresan como el promedio ± EEM (n=8/grupo). * P < 0.05 con respecto al grupo de animales
ayunados. # P < 0.05 con respecto al resto de tiempos dentro del mismo grupo experimental.
119
Trabajo experimental 4
aanat1 (Expresión relativa)
12
A
*#
10
Ayunados
Alimentados
8
6
*#
4
2
0
-120
18
20
B
120
240
360
*
aanat2 (Expresión relativa)
16
*
14
12
*
10
8
6
4
#
2
0
-120
hiomt (Expresión relativa)
4
20
120
240
360
120
240
360
*#
C
3
2
1
0
-120
20
Tiempo (minutos)
Figura 4. Variaciones temporales en la expresión de aanat1 (A), aanat2 (B) y hiomt (C) en el
intestino medio de truchas arco iris alimentadas o ayunadas (72h). Los tiempos se tomaron en
relación al momento de la ingesta (tiempo 0). Los datos se representan como la media ± EEM
(n=4/grupo) * P < 0.05 con respecto a los animales ayunados. # P < 0.05 respecto al resto de
intervalos temporales en el mismo grupo.
120
Trabajo experimental 5
Efecto modulador del L-triptófano sobre la síntesis
de melatonina en el tracto gastrointestinal de la
trucha arco iris.
Trabajo experimental 5
Introducción y objetivos
La ruta de síntesis de la melatonina implica en primer lugar la hidroxilación del
aminoácido esencial L-Triptófano (L-Trp), por acción de la enzima triptófano hidroxilasa,
rindiendo 5-hidroxitriptófano (Lovenberg et al., 1967), el cual es descarboxilado para
formar serotonina. La transformación de este indol hacia melatonina conlleva su Nacetilación y la posterior ortometilación (Reiter, 1991). En todo este proceso, hay dos
pasos que podrían actuar como limitantes: el primero es la actividad de la TPH que
determina la tasa de síntesis de 5HT (Boadle-Biber, 1993); el segundo es la actividad
enzimática AANAT, que limita la formación de melatonina al menos en el órgano pineal y
la retina (Klein et al., 1997; Klein, 2007). En el órgano pineal de los peces, principal fuente
de melatonina en el organismo, la regulación de la actividad AANAT es crítica en el
proceso de síntesis de melatonina, en particular durante la noche cuando la mayor parte de
la 5HT acumulada en las células pineales es transformada a melatonina (Falcón et al.,
2009; 2010). En el cerebro, sin embargo, la mayor parte de la 5HT es degradada mediante
una monoamino oxidasa para formar un producto inactivo, el ácido 5-hidroxiindolácetico
(5HIAA).
Tanto en mamíferos como en peces, el TGI también realiza una importante síntesis
de melatonina a partir de la 5HT presente en el propio tracto, bien en las células
enterocromafines (EC, en particular en mamíferos), bien en terminaciones neuronales que
inervan la pared intestinal, como ocurre en la trucha arco iris, (ver Caamaño-Tubio et al.,
2006; Trabajo 2). En trabajos previos hemos demostrado la presencia de elevados niveles
de 5HT en el TGI de la trucha arco iris (Trabajo 2), superiores en un rango 1000:1 a la
concentración de melatonina medida en estos tejidos. También los niveles de 5HIAA a
nivel intestinal son muy bajos en relación al contenido de 5HT, sugiriendo que una gran
cantidad de este indol podría no ser accesible a la acción de enzimas. Este hecho anima a
pensar que tanto la actividad de la enzima AANAT como la de la HIOMT podrían tener un
papel de menor relevancia, en comparación con la disponibilidad de 5HT, en los cambios
que ocurren en los niveles de melatonina.
La disponibilidad del aminoácido L-Trp determina la tasa de síntesis de 5HT a
nivel central (Fernstrom, 1983), al igual que lo hace en la glándula pineal (Ehret et al.,
1991; Bessancon et al., 1996). Así, se ha descrito que, tanto una dieta rica en L-Trp como
la administración del aminoácido por vía i.p. resultan en un aumento de sus niveles
intracelulares, promoviendo un incremento de la síntesis de 5HT en cerebro (Fernstrom y
Wurtman, 1972) y pineal (Young y Anderson, 1982; Reiter et al., 1990). Sin embargo, en
roedores este aumento de la 5HT apenas modifica los niveles de melatonina en la glándula
pineal (Reiter et al., 1990; Paz-Valiñas, 2009), aunque si aumenta de forma considerable la
concentración plasmática de la hormona tanto en animales normales (Huether et al., 1992;
Yaga et al., 1993) como en pinealectomizados (Yaga et al., 1993). En base a ello se ha
postulado que la administración exógena de L-Trp produce un aumento de la síntesis de
123
Trabajo experimental 5
melatonina en el intestino, la cual podría repercutir posteriormente en el incremento de los
niveles de la hormona en la circulación periférica (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993;
Bubenik et al., 1996).
Los peces son animales con un elevado metabolismo proteico, siendo el L-Trp un
aminoácido esencial en su dieta (Johnston y Glanville, 1991; Navarro et al., 1996). Se ha
demostrado que la alimentación de truchas arco iris con dieta suplementada con L-Trp
resulta en la supresión del comportamiento agresivo (Winberg et al., 2001) y una
disminución de la respuesta de estrés (Lepage et al., 2002; 2003; Höglund et al., 2007),
efectos que podrían derivar del incremento de la disponibilidad y liberación de 5HT
cerebral inducido por el tratamiento (Johnston y Glanville, 1991; Aldegunde et al., 2000;
Hseu et al., 2003), aunque también se ha propuesto un papel de la melatonina en estos
efectos (Azpeleta et al., 2010). Menos información existe sobre la capacidad del L-Trp
para modular los niveles de 5HT y melatonina a nivel intestinal. Estudios in vitro recientes
realizados en la trucha han demostrado un efecto estimulador del L-Trp sobre la síntesis
intestinal de melatonina (Lepage et al., 2005a), hecho que contrasta con los débiles
cambios observados por Herrero et al., (2007) en la lubina alimentada con una dieta
suplementada con L-Trp.
En el presente Trabajo hemos evaluado en la trucha arco iris la hipótesis de un
posible papel modulador del L-Trp en el contenido intestinal de melatonina, así como en el
de su precursor, la 5HT. Dado que en mamíferos se ha postulado que los efectos de este
aminoácido están condicionados por la vía de administración (Huether et al., 1992), hemos
procedido a explorar los efectos derivados de la administración oral (en la comida) y
parenteral (i.p.). En el primer caso también hemos obtenido algunos datos adicionales
relativos a los patrones de ingesta y de estrés derivados del tratamiento con el aminoácido.
Materiales y métodos
Animales de experimentación y recolección de muestras
Los ejemplares de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) se obtuvieron en una
piscifactoría situada en Soutorredondo (Lousame, A Coruña) y fueron transportados en
tanques dotados de suministro continuo de oxígeno hasta las instalaciones en la
Universidad de Vigo, donde se mantuvieron en cubas de 120 litros, con circulación
continua de agua y dotadas de un sistema de difusión de aire. Los peces, con una masa de
160 ± 6 g (media ± E.E.M.) fueron mantenidos en fotoperiodo artificial de 12 horas de luz
y 12 horas de oscuridad (L:D 12:12; intensidad lumínica de 400 lux en la superficie del
agua). La temperatura del agua se mantuvo en 14±1ºC. Durante el periodo de aclimatación,
nunca inferior a los 15 días, los peces fueron alimentados con pienso seco comercial
(Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia, España; composición aprox.: 48% proteína cruda, 6%
carbohidratos, 5% grasa cruda, y 15% ceniza), suministrado una vez al día (10:00 horas).
Todos los experimentos realizados cumplen con la directiva de manipulación de animales
124
Trabajo experimental 5
de la Unión Europea (86/609EU) y con las leyes españolas para el uso de animales en
investigación (RD 1201/2005).
Experimento 1. Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre la ingesta, el contenido
intestinal de melatonina y 5HT, así como en los niveles de melatonina y cortisol en
plasma
Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron 3 grupos de truchas que fueron
distribuidas en 9 cubas de 120 litros cada una (n=10/cuba). Una vez aclimatados los
animales a las nuevas condiciones, se procedió a alimentar a los peces de cada grupo con
dietas diferentes: i) pienso normal (control); ii) pienso suplementado con 0.5 g de LTrp/100 g de pienso; iii) pienso suplementado con 2.5 g de L-Trp/100 g. Para preparar
estos tratamientos, se procedió a desmenuzar una cierta cantidad de pienso comercial para
luego mezclarla con la concentración oportuna de L-Trp preparada en solución acuosa, o
solo con la solución acuosa (control). Una vez mezclado, se empaquetó de manera manual
en pellets similares a los de origen comercial, tras lo cual se procedió al secado del pienso
a 40ºC durante 24 h.
La duración del experimento fue de 7 días, durante los cuales la ingesta fue
evaluada en cada uno de los grupos. Para ello, primero se cuantificó la ingesta basal de
cada grupo, estimándose como la media de la cantidad de alimento ingerido por los peces
de cada cuba durante los 7 días previos al inicio del experimento. En el momento de la
alimentación, cada grupo de animales recibió una cierta cantidad de alimento en exceso.
Transcurridos diez minutos se retiró la comida sobrante, la cual fue secada en una estufa a
40ºC durante 24 horas y posteriormente pesada. Restando el peso de la comida sobrante al
del suministrado al tanque, se obtuvo la cantidad de alimento ingerido por las truchas cada
día. Una vez estimada la ingesta basal y comprobada la ausencia de diferencias en la
misma entre los distintos grupos experimentales, el mismo protocolo se realizó para la
cuantificación de la ingesta en cada uno de ellos. La ingesta fue inicialmente calculada en
gr/kg de pez y posteriormente como % acumulado de alimento ingerido diariamente con
respecto al nivel basal (medido 3 dias previos al experimento).
Transcurridos los 7 días del experimento, los animales de cada grupo fueron
capturados y anestesiados mediante inmersión en MS-222 (50mg/L; tamponado con
bicarbonato sódico) a diferentes tiempos (1 hora, 3 horas y 5 horas post-ingesta) desde el
momento de ingesta. Una vez anestesiados, se procedió a la toma de sangre, mediante
punción directa sobre la vena caudal, con jeringas previamente heparinizadas. La sangre
fue centrifugada a 12000 g durante 10 minutos a fin de obtener el plasma que se dividió en
alícuotas que se congelaron a -80ºC hasta su posterior procesado.
125
Trabajo experimental 5
Inmediatamente después de la toma de sangre los animales fueron decapitados,
procediéndose a la toma de las diferentes regiones intestinales: ciegos pilóricos, intestinos
anterior, medio y posterior, así como una muestra de hígado y de bilis mediante punción de
la vesícula biliar. Todas las muestras fueron inmediatamente congeladas en hielo seco y
almacenadas a -80ºC hasta ser analizadas.
Con el fin de comprobar el efecto de las dietas enriquecidas se midieron los niveles
de triptófano en plasma y en intestino medio, para esto se determino la concentración de
triptófano mediante cromatografía líquida con detección por fluorescencia (HPLC-FD),
con derivatización pre-columna en condiciones isocráticas (Aswad, 1984; Cervantes et al.
2009).
Experimento 2. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp y de 5HTP sobre los niveles de
indolaminas y melatonina intestinales
Se evaluó el efecto agudo de la administración intraperitoneal de L-Trp y de 5HTP
sobre el contenido intestinal de melatonina y 5HT. Para ello se establecieron cuatro grupos
de truchas (n=8/grupo) que recibieron como tratamientos: solución salina (grupo Control),
L-Trp a la dosis de 20 mg/kg; L-Trp a la dosis de 80 mg/kg; 5HTP a la dosis de 25 mg/kg.
Los tratamientos fueron preparados en solución salina a las concentraciones deseadas,
administrándose un volumen de 0.2 ml a cada trucha. Transcurridas 2 horas desde la
inyección, los animales fueron sacrificados, procediéndose a la toma de muestras de
intestino anterior, medio y posterior, hígado y bilis, tal y como se relató en el experimento
anterior.
Procedimientos analíticos
Determinación de los niveles de indolaminas y melatonina
La cuantificación de los niveles de 5HT y 5HIAA en las muestras de ciegos
pilóricos, intestino e hígado se realizó mediante HPLC con detección electroquímica
(HPLC-EC), siguiendo el protocolo descrito por Gesto et al. (2006) con algunas
modificaciones (ver Capitulo 2). En las muestras procedentes del Experimento 2 se
analizaron también los niveles de 5HTP siguiendo el mismo procedimiento analítico.
Para la cuantificación de la concentración de melatonina en plasma, bilis e intestino
se procedió a su extracción con cloroformo y el posterior análisis mediante HPLC con
detección fluorimétrica tal y como se detalla en Muñoz et al. (2009) y en el Capítulo 4 de
la presente Memoria.
Determinación de los niveles plasmáticos de cortisol
Una alícuota de plasma (200 l) fue utilizada para cuantificar mediante ELISA el
contenido plasmático de cortisol, para lo que se utilizó un kit comercial (Cayman chemical,
126
Trabajo experimental 5
USA) siguiendo las indicaciones del fabricante. Previamente en nuestro grupo de
investigación se realizo la validación de dicha técnica, mediante el estudio de la linealidad
en diluciones seriadas de un pool de plasma con elevada concentración de cortisol. Además
fueron calculadas las variaciones interensayo, que fueron cercanas al 7.5% y la media del
porcentaje de recuperación, que fue del 92.3 ± 11.5%.
Análisis estadísticos
Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. Para evaluar el efecto de la
dieta enriquecida con L-Trp se realizó un análisis de varianza de dos vías, tomando ―dosis
de L-Trp‖ y ―tiempo post-ingesta‖ como factores principales. Para la comparación entre
grupos en cada intervalo de tiempo se utilizó un ANOVA de una vía seguido de un test
SNK.
Para el análisis estadístico de los datos derivados del efecto de la administración i.p.
de L-Trp y 5HTP, se utilizó un ANOVA de una vía. En el caso de la existencia de
diferencias significativas entre grupos, se realizó el test SNK de comparaciones múltiples.
El grado de significación se estableció en P < 0.05.
Resultados
Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre la ingesta, los niveles de cortisol y
melatonina en plasma
La ingesta de las truchas no sufrió cambios significativos relacionados con la
concentración de L-Trp en el alimento (Figura 1). Cabe destacar que el grupo control,
presento un porcentaje acumulado menor que los animales alimentados con dieta
enriquecida. Ambas dietas suplementadas con el aminoácido presentaron una ingesta
similar sin observarse cambios significativos entre ambas. Al medir los niveles del
aminoácido en plasma y intestino medio, confirmamos un aumento en su concentración en
plasma: Control: 45.5 ± 5.4; L-Trp 0.5: 56.9 ± 6.3; L-Trp 2.5: 65.1 ± 5.4 (ng/µl). En el
intestino medio el aumento de los niveles de L-Trp fue más marcado: Control: 5.8 ± 1.1; LTrp 0.5: 7.8 ± 0.2; L-Trp 2.5: 10.8 ± 1.1 (ng/mg de tejido).
Con respecto a los niveles plasmáticos de cortisol, solo se observó un efecto
significativo con el alimento que llevaba incorporada la concentración más alta de L-Trp
(Figura 2). En este grupo se observó un descenso significativo de los niveles plasmáticos
de cortisol en todos los tiempos muestreados, con una máxima inhibición del 55% en
comparación con el grupo control 5 horas después de la ingesta.
Los niveles plasmáticos de melatonina por su parte no se modificaron
significativamente tras la adición al alimento de distintas concentraciones de L-Trp (Figura
3). No obstante, se apreció una ligera tendencia al incremento de la melatonina plasmática
127
Trabajo experimental 5
en el grupo tratado con la dosis más alta de L-Trp (2.5 g/100 g), en todos los tiempos, si
bien no se alcanzó el grado de significación.
700
Ingesta (Porcentaje Acumulado)
600
Control
L-trp 0.5 /100g
L-trp 2.5/100g
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Dias
Figura 1. Valoración de la ingesta en truchas alimentadas con pienso normal (control) o
enriquecido con diferentes concentraciones de L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso). Cada punto
representa la media ± E.E.M. de valoraciones realizadas por triplicado en cada uno de los grupos
experimentales. La ingesta esta expresada en porcentaje acumulado.
128
Trabajo experimental 5
Control
L-trp 0.5g/100g
L-trp 2.5g/100g
120
Cortisol (ng /ml plasma)
100
80
*
60
*
*
40
20
0
1
3
5
Horas post ingesta
Figura 2. Niveles plasmáticos de cortisol en animales alimentados con dietas sin suplementar
con L-Trp (Control) o suplementadas con diferentes concentraciones del aminoácido (0.5 y 2.5
g/100 g pienso) a diferentes tiempos post ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se representan como la
media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto de los demás grupos experimentales en
cada uno de los tiempos estudiados.
Melatonina en plasma (pg /ml)
120
Control
L-trp 0.5g /100g
L-trp 2.5g /100 g
100
80
60
40
20
0
1
3
5
Horas post ingesta
Figura 3. Niveles plasmáticos de melatonina en truchas alimentadas con dietas sin
suplemento de L-Trp (Control) o suplementadas con diferentes concentraciones del aminoácido
(0.5 y 2.5 g/100 g pienso) a diferentes tiempos post ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se
representan como la media ± E.E.M. de 10 animales por punto.
129
Trabajo experimental 5
Efecto de dietas enriquecidas con L-Trp sobre los niveles de indoles y melatonina en
intestino, hígado y bilis
El contenido de melatonina en las diferentes regiones del TGI y en bilis evaluadas
se muestra en la Figura 4. De todas ellas, los valores más elevados de la indolamina se
midieron en la bilis (Figura 4F), con valores medios cercanos a los 2.5 ng/ml, seguido del
intestino anterior (Figura 4A), con valores que oscilaron entre los 400 pg/g tejido (grupo
Control) y 1 ng/g tejido (grupo L-Trp 2.5 g/100 g pienso).
En general, las dietas enriquecidas con L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) provocaron
incrementos significativos en el contenido de melatonina en todos los tejidos analizados
(ciegos pilóricos, intestino anterior, medio y posterior e hígado) y en la bilis. En la casi
todos los casos, los mayores efectos se hallaron con la dosis más elevada de L-Trp, siendo
esta la única que produjo efectos en los ciegos pilóricos en cualquiera de los tiempos
muestreados. En las tres regiones intestinales (anterior, media y posterior; Figura 4A, C y
D), la dosis más alta de L-Trp produjo efectos independientes del tiempo (1, 3 y 5 horas),
incrementándo el contenido de melatonina con respecto al grupo control (P < 0.05
respecto a su control). Además, en el intestino medio, los animales control (sin L-Trp)
presentaron niveles más elevados de melatonina a 5 horas con respecto a los medidos a 1
hora (P < 0.05 respecto a control a 1 hora).
En los ciegos pilóricos (Figura 4B) la adición de L-Trp provocó un incremento
dosis-dependiente del contenido de melatonina (P < 0.05 respecto a los controles), si bien
dicho incremento fue independiente del tiempo post-ingesta.
Con respecto al hígado (Figura 4E), cabe reseñar la ausencia de efectos
significativos a 1 hora, mientras que las dos dosis de L-Trp incrementaron los niveles de
melatonina a 3 y 5 horas (P < 0.05 respecto a su control). Al igual que en el intestino
medio, el grupo control muestreado a 5 horas presentó valores de melatonina superiores a
los hallados en los peces sacrificados a 1 hora post-ingesta (P < 0.05). En cuanto a la bilis,
los cambios observados fueron de menor magnitud, aunque los tratamientos con la dosis
más elevada de L-Trp aumentaron siempre la concentración de melatonina, mientras que la
dosis menor solo tuvo efecto a las 5 horas post-ingesta.
El enriquecimiento de las dietas con L-Trp provocó incrementos en el contenido de
5HT en la mayoría de los tejidos analizados (Figura 5), que dependieron tanto del tiempo
como de la dosis de aminoácido utilizada. Las mayores concentraciones de 5HT se
observaron casi siempre en el grupo que recibió L-Trp 2.5 g/100 g de pienso y, en general,
fueron medidas en muestras tomadas 5 horas después de la ingesta, a excepción del hígado
donde los mayores efectos se alcanzaron a las 3 horas. Además, en los ciegos pilóricos se
observó un incremento significativo de los niveles de 5HT en el grupo control a lo largo
del tiempo, hecho que también aconteció en el intestino medio. En general, en todos los
130
Trabajo experimental 5
tejidos se aprecia una tendencia al aumento de los niveles de 5HT con el tiempo postingesta, con independencia de los tratamientos recibidos.
En términos generales, el enriquecimiento de las dietas con L-Trp provocó el
descenso del contenido de 5HIAA con respecto a los animales control en la mayoría de los
tejidos estudiados, salvo el hígado donde no hubo cambios significativos (Figura 6), con
respecto a su control. Dicho descenso en el contenido de 5HIAA fue observado a
diferentes tiempos dependiendo del tejido analizado. Así, a 1 hora post-ingesta solo se
observó un descenso en el nivel de 5HIAA con la dosis mayor de L-Trp en los ciegos
pilóricos, efecto que se repitió a las 5 horas. Las dos dosis de L-Trp generaron un descenso
en el nivel de este metabolito en intestino anterior (3 y 5 horas), mientras que en el
intestino medio ambas dosis de L-Trp produjeron dicho efecto (3 horas). En el posterior, en
cambio, el descenso fue causado por la dosis mayor de L-Trp a las 3 horas. Por último,
conviene destacar que los niveles de 5HIAA en el intestino anterior y medio de las truchas
control muestreadas a las 3 horas post-ingesta fueron más elevados que en las muestreadas
a 1 hora. Algo similar ocurrió en el hígado, independientemente del tratamiento aportado
en la dieta.
131
Trabajo experimental 5
1400
Melatonina (pg/g tejido)
1200
600
A
*
*
500
1000
* *
*
*
*
400
300
600
200
400
200
100
0
0
*#*
600
Melatonina (pg/g tejido)
B
*
800
700
600
C
D
*
500
#
*#*
*
500
#
*
*
#
*
*
400
400
300
300
200
200
100
100
0
0
500
4000
E
*#
*# *# *
*
*
3000
#
300
#
200
F
#
Melatonina (pg/ml)
400
Melatonina (pg /g tejido)
Control
L-trp 0,5g/100g
L-trp 2.5 g/100g
*
* *
2000
1000
100
0
0
1
3
5
1
Horas post ingesta
3
5
Horas post ingesta
Figura 4. Contenido de melatonina, en intestino anterior (A), ciegos pilóricos (B), intestino
medio (C), intestino posterior (D), hígado (E) y bilis (F) de truchas alimentadas con dietas sin
suplemento de L-Trp (Control), o tras añadir diferentes concentraciones del aminoácido (0.5 y 2.5
g/100 g pienso) y sacrificadas a diferentes tiempos post-ingesta (1, 3 y 5 horas). Los datos se
representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto del grupo Control
en el mismo intervalo de tiempo; # P < 0.05 respecto del mismo grupo a 1 hora.
132
Trabajo experimental 5
10000
Control
L-trp 0.5g/100g
L-trp 2.5g/100g
3000
A
*
5HT (ng/g tejido)
8000
2500
*
*
#
2000
6000
*
1500
4000
1000
2000
500
0
0
3500
10000
C
*
3000
5HT (ng/g tejido)
#
*
B
*
*
D
*
*
*
8000
*
2500
#
#
2000
6000
1500
4000
1000
2000
500
0
0
1
3
5
1
Horas post ingesta
3
5
Horas post ingesta
200
E
*
180
5HT (ng/g tejido)
160
140
*
120
100
80
60
40
20
0
1
3
5
Horas post ingesta
Figura 5. Contenido de serotonina (5HT) en muestras de intestino anterior (A), ciegos
pilóricos (B), intestino medio (C), intestino posterior (D) e hígado (E) de truchas alimentadas con
pienso no suplementado con L-Trp (Control), o suplementado con concentraciones diferentes del
aminoácido (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) y sacrificadas a diferentes tiempos post-ingesta (1, 3 y 5
horas). Los datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05
respecto del grupo Control; # P < 0.05 respecto del mismo grupo a 1 hora.
133
Trabajo experimental 5
5000
#
A
5 HIAA (ng/g tejido)
4000
B
2000
3000
1500
*
*
2000
*
1000
*
*
*
1000
500
0
3500
0
3000
#
D
C
3000
5HIAA (ng/g tejido)
Control
L-trp 0.5g/ 100g
L-trp 2.5 g/100g
2500
2500
2500
2000
*
2000
1500
1500
*
1000
1000
500
500
0
0
1
3
5
1
Horas post ingesta
180
5
E
160
#
#
140
5 HIAA (ng/g tejido)
3
Horas post ingesta
#
120
100
80
60
40
20
0
1
3
5
Horas post ingesta
Figura 6. Contenido de ácido 5-hidroxindol acético (5HIAA) en muestras de intestino
anterior (A), ciegos pilóricos (B), intestino medio (C), intestino posterior (D) e hígado (E) de
truchas alimentadas con pienso no enriquecido (Control), o suplementado con dos concentraciones
diferentes de L-Trp (0.5 y 2.5 g/100 g pienso) y sacrificadas a 1, 3 y 5 horas post ingesta. Los
datos se representan como la media ± E.E.M. de 10 peces por grupo. * P < 0.05 respecto del grupo
Control a la misma hora. # P < 0.05 respecto de los grupos del mismo tratamiento sacrificados a 1
hora post ingesta.
134
Trabajo experimental 5
Efecto de la inyección i.p. de L-Trp y de 5HTP sobre los niveles de indolaminas
intestinales
La inyección intraperitoneal de L-Trp a las dosis de 20 y 80 mg/kg no modificó, en
general, el contenido de melatonina en las distintas secciones del intestino analizadas
(Figura 7). Solo en el intestino posterior se aprecia un incremento (+40%, no significativo)
en el contenido del indol tras la inyección de L-Trp (Figura 7C), que fue independiente de
la concentración del aminoácido inyectada. Tampoco se hallaron cambios significativos
derivados del tratamiento con L-Trp en los niveles de melatonina en hígado (Figura 7D) ni
en la bilis (Figura 7E). En cambio, la administración i.p. del precursor inmediato de la
serotonina, el 5HTP (25 mg/kg), promovió un fuerte incremento en los niveles de
melatonina en todas las secciones intestinales (+50-100% vs control), así como en el
hígado (+100% vs control) y en la bilis (+ 20% vs control).
De forma análoga a lo observado para la melatonina, el contenido intestinal de 5HT
no se modificó tras la administración i.p. de ambas dosis de L-Trp en ninguna de los
tejidos analizados (intestinos anterior, medio y posterior e hígado) (Figura 8). En cambio,
el 5HTP (25 mg/kg) provocó el incremento en el contenido intestinal de 5HT (+40-60%)
con respecto al grupo control, que fue especialmente fuerte en el hígado con aumentos de
más de 100 veces respecto al control. Con respecto a los niveles de 5HIAA (Figura 9), se
observó un patrón de respuesta muy similar al de la 5HT, con ausencia de cambios
significativos con respecto al grupo control tras la administración de L-Trp (20 y 80
mg/kg) y el tratamiento con 5HTP produjo un brusco incremento en el contenido de
5HIAA en todos los tejidos analizados, especialmente en el hígado donde el contenido de
5HIAA fue del orden de 140 veces superior al observado en el grupo control.
En la Figura 10 se muestran los niveles de 5HTP en todos los grupos
experimentales y tejidos analizados. En este sentido, solo la dosis de 80 mg/kg de L-Trp
provocó un incremento significativo del contenido de 5HTP en el intestino medio (Figura
10B) y en el hígado (figura 10D). Además, tal y como sucedió con los otros parámetros
serotoninérgicos, la administración de 5HTP provocó un espectacular incremento en el
contenido de sus niveles en todos los tejidos analizados (100-520 veces), con respecto a lo
observado en el grupo control. Este dato confirma claramente que el 5HTP administrado
por vía i.p. fue fácilmente absorbido por las células intestinales y hepáticas, lo que justifica
los fuertes incrementos provocados por su administración en los niveles de 5HT y 5HIAA.
135
Trabajo experimental 5
800
*
A
800
*
600
600
400
400
200
200
0
700
0
1600
C
*
600
*
D
1400
1200
500
1000
400
800
300
600
200
m
25
20
LTr
p
m
g/
kg
/k
g
g
C
on
t
g/
kg
25
5H
TP
LTr
p
20
80
m
m
m
g/
kg
/k
g
g
C
on
t
LTr
p
1600
5H
TP
0
80
0
LTr
p
200
ro
l
100
g/
kg
400
ro
l
Melatonina (pg/g tejido)
B
m
Melatonina (pg/g tejido)
1000
*
E
Melatonina (pg/ml)
1400
1200
1000
800
600
400
200
g/
kg
m
g/
kg
25
5H
TP
80
LTr
p
LTr
p
20
m
m
g
C
on
t
/k
g
ro
l
0
Figura 7. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5HTP (25 mg/kg) sobre el
contenido de melatonina en intestino anterior (A), intestino medio (B), intestino posterior (C),
hígado (D) y bilis (E) de la trucha arco iris. Los datos se representan como media ± E.E.M.
(n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control.
136
Trabajo experimental 5
5HT ng/g tejido
8000
*
A
10000
B
*
8000
6000
6000
4000
4000
2000
2000
0
10000
0
*
C
6000
*
D
5000
6000
4000
200
4000
100
2000
m
g/
kg
25
5H
TP
LTr
p
80
20
m
m
g
C
on
/k
g
tro
l
g
m
25
80
g/
k
m
g/
kg
g
m
LTr
p
20
5H
TP
/k
g
tro
l
C
on
LTr
p
g/
kg
0
0
LTr
p
5HT ng/g tejido
8000
Figura 8. Efecto de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25
mg/kg) sobre el contenido de serotonina (5HT) en intestino anterior (A), intestino medio (B),
intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos se representan como media ±
E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control.
137
Trabajo experimental 5
5HIAA ng/g tejido
24000
*
A
40000
*
B
32000
16000
24000
16000
8000
1500
5000
4000
1000
3000
2000
500
1000
0
40000
0
*
C
8000
5HIAA ng/g tejido
32000
*
D
7000
24000
6000
16000
5000
2000
200
1500
1000
100
500
0
g/
kg
5H
TP
80
25
m
g
m
LTr
p
20
LTr
p
m
g/
kg
/k
g
l
C
on
tro
5H
TP
80
LTr
p
25
m
g
m
20
m
g/
kg
/k
g
l
C
on
tro
LTr
p
g/
kg
0
Figura 9. Variaciones en el contenido de ácido 5-hidroxindolacético (5HIAA) a las 2 horas
de la inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25 mg/kg) en intestino anterior
(A), intestino medio (B), intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos
representan la media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control.
138
Trabajo experimental 5
*
A
10000
8000
8000
6000
6000
200
500
150
400
200
50
100
0
0
*
*
16000
14000
C
D
12000
8000
10000
8000
6000
6000
200
*
400
100
200
25
TP
5H
p
80
m
m
g
Tr
20
p
Tr
L-
g/
kg
/k
g
l
C
on
tro
25
TP
5H
Tr
p
80
m
m
g
m
L-
20
p
Tr
g/
kg
/k
g
l
C
on
tro
L-
g/
kg
0
g/
kg
0
L-
5HTP ng/g tejido
*
300
100
10000
*
B
m
5HTP ng/g tejido
10000
Figura 10. Variaciones en el contenido de 5-hidroxitriptófano (5HTP) a las 2 horas de la
inyección i.p. de L-Trp (20 y 80 mg/kg) o 5-hidroxitriptófano (25 mg/kg) en intestino anterior (A),
intestino medio (B), intestino posterior (C) e hígado (D) de la trucha arco iris. Los datos se
representan como media ± E.E.M. (n=10/grupo). * P < 0.05 respecto del grupo Control
139
Trabajo experimental 6
Profundización en la relación entre serotonina y
melatonina en el TGI de la trucha arco iris: estudio
in vitro del efecto de L- triptófano y de fármacos
que modulan los niveles de 5HT, sobre la síntesis
de melatonina.
Trabajo experimental 6
Introducción y objetivos
En teleósteos, el triptófano es un aminoácido esencial y su ausencia en la dieta
puede ser causa de la aparición de malformaciones y erosiones (Poston y Rumsey, 1983;
Walton et al., 1984). Al igual que en mamíferos, el L-Trp es el único precursor de la 5HT
(Russo et al., 2004) en los peces. Si bien en estos la mayor parte del L-Trp en el plasma se
encuentra en forma libre, a diferencia de lo descrito en mamíferos (Walton et al., 1984b;
Rozas et al., 1990), la elevación de sus niveles mediante administración exógena redunda
en un aumento de la concentración neuronal de 5HT (Aldegunde et al., 1998) al mismo
tiempo que induce cambios en el comportamiento y el nivel de estrés (Winberg et al.,
2001; Höglund et al., 2007). En el capítulo anterior, hemos observado que el
enriquecimiento de la dieta con L-Trp pero no su administración i.p. provoca un aumento
del contenido de 5HT intestinal, lo que se asocia a un aumento de los niveles de
melatonina. Estudios llevados a cabo in vitro con tejidos intestinales de trucha arco iris
también demostraron un efecto estimulador del L-Trp sobre la producción de melatonina
(Lepage et al., 2005a), sugiriendo que la síntesis de 5HT en las células intestinales
productoras de melatonina podría condicionar la cantidad de hormona formada.
En los vertebrados el TGI contiene las concentraciones más elevadas de 5HT
periférica (Vandermaelen, 1985; Verbeuren, 1989). Mientras que la 5HT intestinal es
producida y almacenada principalmente en las EC en los mamíferos (Erspamer, 1954;
Gerson y Tack, 2007) y en menor medida en neuronas que inervan el intestino (Costa et
al., 1982; Gershon et al., 1990), en algunas especies de peces no está clara la existencia de
EC, por lo que la mayor parte de la 5HT podría asociarse a neuronas, al menos en aquellos
teleósteos que presentan una inervación serotoninérgica abundante de la mucosa intestinal
(Anderson y Campbell, 1988). En el caso de la trucha arco iris, nuestros estudios señalan
que las mayores concentraciones de 5HT y de su principal metabolito, el 5HIAA, se hallan
en la pared muscular, probablemente asociadas a una densa inervación serotoninérgica que
forma parte del plexo mientérico, mientras que las bajas concentraciones de 5HT de la
mucosa podrían ser debidas a la presencia debil de EC, o bien a algunas fibras
serotoninérgicas que alcanzan esta capa epitelial. Estos resultados concuerdan con los
presentados por Caamaño-Tubio et al., (2007) en esta misma especie. En nuestro trabajo,
sin embargo, hemos obtenido pruebas histológicas y bioquímicas de que la mayor síntesis
de melatonina acontece en la capa de mucosa, a pesar de su bajo contenido en 5HT. Una
vez más, esto sugiere que mas que el contenido tal de 5HT, su disponibilidad en el
citoplasma celular podría ser un factor un factor limitante de la formación de melatonina en
el intestino.
Una vez sintetizada, la 5HT entra en gránulos o vesículas que almacenan
temporalmente la amina y facilitan su liberación al espacio extracelular (Nilsson et al.,
1987). Tanto a nivel central como intestinal, la mayor parte de la 5HT liberada es
recaptada por una proteína transportadora (SERT) (Gershon, 2004), que también está
presente en peces (Wang et al., 2006), para ser metabolizada in situ mediante una MAO
143
Trabajo experimental 6
cuya actividad en el intestino de los peces es muy elevada (Senatori et al., 2003; CaamañoTubio et al., 2007). En el intestino aislado de la trucha se ha demostrado que la 5HT es
sensible a fármacos que interfieren con la dinámica intracelular y sináptica de la amina,
alterando sus niveles intracelulares (Anderson et al., 1991). Por ello, el uso de estos
fármacos puede ser útil para vislumbrar el grado de relación entre la disponibilidad de 5HT
y la formación de melatonina a nivel del intestino.
El presente Trabajo pretende profundizar en las relaciones entre 5HT y melatonina
a nivel intestinal en la trucha arco iris. Para ello se estudió en primer lugar el efecto del LTrp sobre los niveles de 5HT y de melatonina en segmentos intestinales cultivados in vitro,
así como la influencia de un aminoácido neutro (L-Alanina) que compite con el L-Trp por
el mismo transportador celular (Baumrucker et al., 1989). Por otro lado, se estudió el
efecto de la pargilina y de la fenfluramina, fármacos que interfieren con el metabolismo
oxidativo y con la liberación/recaptación celular de 5HT, respectivamente.
Materiales y métodos
Animales de experimentación
Se emplearon truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) de 180±10 g (media ±
E.E.M.) obtenidas en una piscifactoría local (Soutorredondo, A Coruña). Una vez en las
instalaciones de la Universidad de Vigo, los peces fueron mantenidos en cubas de fibra de
vidrio de 120 litros, dotadas con sistemas de circulación continua de agua y burbujeo de
aire. Se estableció un régimen de fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 horas de
oscuridad (12L:12D), siendo la temperatura del agua de 14±1ºC. Las truchas fueron
alimentadas una vez al día (10:00 am) con pienso seco comercial (Dibaq Diproteg,
Segovia) con una dosis de alimento del 1% de su masa corporal/día. Los animales fueron
mantenidos en estas condiciones durante al menos dos semanas antes del inicio de los
experimentos. Todos los protocolos experimentales realizados cumplen con la directiva de
manipulación de animales de la Unión Europea (86/609EU) y con las leyes españolas para
el uso de animales en investigación (RD 1201/2005).
Preparación de cultivos de intestino
Previamente a la toma de muestras, las truchas fueron anestesiadas mediante
inmersión en una solución continuamente aireada de MS-222 (Sigma) con una
concentración 50 mg/L, tamponada con bicarbonato sódico a pH 7.4. Los animales fueron
sacrificados mediante decapitación, procediéndose a extraer la región del intestino medio,
que fue abierto longitudinalmente, vaciado de su contenido y lavado con solución salina. A
continuación el tejido se seccionó longitudinalmente en tiras que se depositaron en medio
de cultivo fresco. En base a los estudios in vitro de Lepage et al., (2005a) en intestino de
trucha, se usó un medio de cultivo RPMI-1640 (Sigma; R8005) a una concentración de
144
Trabajo experimental 6
16.4 g/L, siendo tamponado con bicarbonato (2.2 g/L, pH 7.2). Al medio se le añadió una
mezcla de antibióticos (10000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina, Sigma) a
una concentración final de 5 ml/L.
En cada ensayo, se usaron fragmentos de intestino medio procedentes de 8 truchas,
los cuales fueron mezclados en un único pool y depositados en placas de cultivo de tejidos
de 48 pocillos (diámetro 10 mm/pocillo, IWAKI, Japan), de forma que cada pocillo
contenía 4-5 tiras de intestino. Antes de introducir el tejido en los pocillos, se pipeteó en
cada uno un volumen (500 l) de medio de cultivo fuertemente oxigenado (99% O2: 1%
CO2). Las placas se incubaron en una estufa de cultivos a una temperatura de 15.5± 0.5ºC y
agitación suave de forma continua. El tiempo de incubación fue variable según el
experimento. No obstante, se hicieron ensayos previos a fin de constatar los mejores
tiempos de incubación, monitorizando el contenido de melatonina en el tejido. Usando
tiempos de incubación de 3, 6, 12 y 18 horas, se constató que la acumulación de
melatonina en el tejido intestinal fue lineal. Al final de los ensayos, las muestras fueron
extraídas, pesadas e inmediatamente congeladas en hielo seco antes de ser almacenadas a
-80ºC hasta su posterior procesado.
Diseño experimental
Efecto del L-Trp sobre la producción de melatonina en el tejido intestinal. Competición
con L-Alanina (L-Ala)
Para evaluar el efecto del L-Trp se prepararon medios de cultivo enriquecidos con
cinco dosis diferentes de L-Trp, 0; 0.1; 0.5; 1.0 y 2.0 mM, de acuerdo con lo descrito en la
bibliografía (Lepage et al., 2005a). De cada tratamiento se realizaron al menos seis réplicas
y los cultivos se hicieron por triplicado. Por tanto, cada uno de los tratamientos fue
realizado en un mínimo de 18 muestras de intestino medio de trucha. Transcurrido un
periodo de incubación de 12 horas a 15.5±0.5ºC, los fragmentos de intestino fueron
recolectados, congelados y almacenados a -80ºC hasta su posterior análisis.
Conocido el efecto del L-Trp sobre la síntesis intestinal de melatonina, se realizó un
ensayo de competición en el que se emplearon medios conteniendo L-Trp (se seleccionó la
concentración de 1 mM por ser la más efectiva) conjuntamente con L-Ala. Las condiciones
experimentales ensayadas fueron: i) Medio control (0 mM L-Trp + 0 mM L-Ala), ii)
Medio con 0 mM L-Trp + 1 mM L-Ala, iii) Medio con 1 mM L-Trp + 0 mM L-Ala, iv)
Medio con 1 mM L-Trp + 0.5mM L-Ala, v) medio con 1 mM L-Trp + 1mM L-Ala, vi)
Medio con 1mM L-Trp + 2 mM L-Ala. En todos los casos el periodo de incubación, la
temperatura y el número de muestras fueron los indicados anteriormente (12 horas, 15.5ºC;
n=18 muestras/tratamiento). En todas las muestras se midió el contenido de melatonina, y
de 5HT y 5HIAA.
145
Trabajo experimental 6
Efecto de la adición de pargilina y fenfluramina al medio de cultivo sobre la producción
intestinal de melatonina
La pargilina es un inhibidor de la actividad enzimática monoamino oxidasa (MAO),
lo que impide la degradación de la 5HT por esta vía (Fowler et al., 1981). La fenfluramina,
a su vez, ha sido definida como un inhibidor de la liberación y de la recaptura de la
serotonina (Garattini, 1987; Cammaño-Tubio et al., 2007), lo que favorece su acumulación
en el interior celular. Para evaluar el efecto de ambos compuestos sobre la síntesis de
melatonina en el intestino medio de la trucha in vitro, se realizaron ensayos independientes
con fragmentos de intestino expuestos a diferentes concentraciones de pargilina (5 y 50
mM) y de fenfluramina (4 y 25 mM). En ambos casos se dispuso un grupo control
expuesto a medio de cultivo sin fármacos adicionales. La duración de los cultivos fue de 6
horas, mientras que la temperatura y tamaño muestral fueron iguales que en los casos
anteriores (15.5ºC; n=18 muestras/tratamiento). Una vez concluido el ensayo, se retiró el
tejido y se evaluó su contenido de melatonina, 5HT y 5HIAA, y así se calculo la relación
5HIAA/5HT. Con el fin de evaluar el efecto de ambos fármacos sobre la función
serotoninergica, se evaluó el contenido de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Las
mediciones se relativizaron en relación al peso del tejido.
Procedimientos analíticos
El análisis de los niveles tisulares de melatonina se llevó a cabo mediante HPLC
con detección fluorimétrica, tal y como se describe en capítulos anteriores de la presente
Memoria (ver capitulo 1 y 4).
Los niveles de 5HT y 5HIAA fueron medidos mediante HPLC con detección
electroquímica tal y como describen en Gesto et al. (2006) con modificaciones (ver
Capítulo 2).
Análisis estadístico
Todos los datos se expresan como el promedio ± E.E.M. Antes de la aplicación de
cualquiera de los métodos de análisis estadístico, los datos fueron analizados mediante una
prueba de normalidad (Shapiro-Wilks) y de homogeneidad de varianzas (prueba C de
Cochran).
Se realizaron análisis de varianza de una vía (ANOVA) para comprobar la
existencia de variaciones significativas en la producción intestinal de melatonina, 5HT,
5HIAA y en el cociente 5HIAA/5HT con los distintos tratamientos, siendo la
concentración de ―L-Trp‖ ―L-Ala‖, ―pargilina‖ y ―fenfluramina‖, las correspondientes
variables. En el caso de existir diferencias significativas, se realizo un test Tukey de
146
Trabajo experimental 6
comparaciones múltiples. En todos los análisis realizados, el grado de significación se
estableció en P < 0.05.
Resultados
Efecto del L-Trp y la competición con aminoácidos neutros sobre la producción
intestinal de melatonina en la trucha.
Tal y como se observa en la Figura 1, la adición de L-Trp al medio de cultivo
provocó un incremento dosis-dependiente en el contenido intestinal de melatonina tras 12
horas de cultivo. Dicho incremento alcanzó el grado de significación con concentraciones
de 0.5 mM de L-Trp y superiores, en comparación con el grupo control (sin L-Trp añadido
al medio). Si bien los niveles de melatonina encontrados en los ensayos in vitro son
bastante más elevados que los observados en condiciones in vivo, los resultados obtenidos
con la adición de L-Trp sobre cultivos de intestino de trucha son similares a los descritos
por otros autores (Lepage et al., 2005a).
Con respecto a los niveles de 5HT y de 5HIAA, se apreció una tendencia
dosis-dependiente al alza, que no alcanzó el grado de significación con ninguna de las
concentraciones utilizadas de L-Trp (Figura 2A). Conviene destacar, sin embargo, que la
magnitud del cambio neto en la concentración de 5HT, en relación a la hallada para
melatonina, fue alrededor de 1000 veces superior. Así, por ejemplo, para una
concentración de L-Trp 1mM se produjo casi un 100% de incremento en los niveles de
melatonina, lo que supone 600 pg de melatonina más por gramo de tejido en relación a los
valores hallados en el grupo sin L-Trp. Cuando se midieron en esos grupos los niveles de
5HT, se vio un aumento inducido por el L-Trp 1mM del 12% con respecto al grupo
incubado sin el aminoácido. Este pequeño efecto supuso un incremento neto de 400 ng de
5HT por gramo de tejido. A pesar de estos valores, conviene destacar que los niveles de
melatonina en el tejido aumentaron de forma continua con la dosis de L-Trp, mientras que
en el caso de la 5HT se observó un estancamiento a partir de la concentración de L-Trp
0.5mM.
Debido a que tanto la 5HT como su metabolito (5HIAA) se comportaron de forma
similar frente a la adición de diferentes concentraciones de L-Trp, la relación entre ambos
compuestos (5HIAA/5HT) tampoco mostró variaciones significativas (Figura 2B), aunque
se aprecia una ligera y continua tendencia al descenso con el aumento de la concentración
de L-Trp en el medio.
En la Figura 3 se muestra el efecto de un medio de cultivo que lleva incorporado LTrp y/o L-Ala sobre el contenido de melatonina en el tejido intestinal de la trucha. En
concordancia con los resultados mostrados anteriormente, la adición de L-Trp (1 mM) al
medio de cultivo provocó un fuerte incremento de la síntesis de melatonina, mientras que
si el medio lleva incorporado L-Ala (sin L-Trp) no se produce ningún efecto. Cuando se
147
Trabajo experimental 6
combinaron ambos aminoácidos, se observó un efecto competitivo de manera que
incrementos en la concentración de L-Ala reducen de forma dosis-dependiente el efecto
estimulador del L-Trp sobre el contenido intestinal de melatonina.
De manera análoga la adición de L-Trp (1 mM) al medio de cultivo también
provocó un ligero incremento (aunque no significativo) en los niveles de 5HT, hecho que
no fue evidente para el 5HIAA (Figura 4A), mientras que la incubación del tejido con LAla sola induce un descenso significativo en los niveles de ambos compuestos (P < 0.05).
La incubación del intestino con dosis crecientes de L-Ala en presencia de 1 mM L-Trp
origina una reducción paulatina (aunque no significativa) de los niveles de 5HT y 5HIAA,
contrarrestando el ligero efecto producido por la administración de L-Trp solo. Los
tratamientos con ambos aminoácidos no afectaron significativamente a la relación
5HIAA/5HT (Figura 4B).
2600
*
2400
Melatonina (pg /g tejido)
2200
2000
*
1800
1600
1400
*
1200
1000
800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Concentracion de L- Trp (mM)
Figura 1. Contenido de melatonina en el tejido intestinal de trucha arco iris cultivado in vitro
y tratado con diferentes concentraciones de L-Triptófano. * P < 0.05 vs control (0 mM de L-Trp).
Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras de cada
tratamiento.
148
Trabajo experimental 6
A
5HT
5HIAA
5HT (ng/g tejido)
5000
250
200
4000
150
3000
100
2000
50
1000
0
5HIAA (ng/g tejido)
6000
0.0
0.1
0.5
1.0
2.0
0
Concentración de L- Trp (mM)
0,07
B
Relación 5HIAA / 5HT
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
0.0
0.1
0.5
1.0
2.0
Concentración de L- Trp (mM)
Figura 2. Efecto del L-Trp sobre el contenido de 5HT y 5HIAA en el intestino medio de
trucha cultivado in vitro (A) y sobre la relación 5HIAA/5HT (B). Los datos están expresados como
la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras de cada tratamiento.
149
Trabajo experimental 6
2500
a
Melatonina (pg /g tejido )
2000
1500
*a
*
1000
*
500
0
L-Trp
---
---
1
1
1
1
(mM)
L-Ala
---
1
---
0.5
1
2
(mM)
Figura 3. Efecto de la adición de L-Trp y L-Ala al medio de cultivo sobre la producción de
melatonina intestinal. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de un total de 18
muestras de cada tratamiento. * P < 0.05 vs 1 mM L-Trp, a, P < 0.05 vs control (sin L-Trp).
150
Trabajo experimental 6
5HT
5HIAA
A
5HT (ng /g tejido)
1400
100
1200
*
1000
80
*
800
60
600
40
400
20
200
0
L-Trp
---
---
1
1
1
1
(mM)
0
L-Ala
---
1
---
0.5
1
2
(mM)
0,12
Relacion 5HIAA /5HT
120
5 HIAA (ng/g tejido)
1600
B
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
L-Trp
L-Ala
-----
--1
1
---
1
0.5
1
1
1
2
(mM)
(mM)
Figura 4. Variaciones en los niveles de 5HT y 5HIAA (A), así como en la tasa de recambio
5HIAA/5HT, (B) en ausencia o presencia de L-Trp y L-Ala en el medio de cultivo. Los datos están
expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras en total para cada tratamiento. * P < 0.05 vs 1
mM L-Trp y control.
En la Figura 5 se muestra el efecto de la adición de pargilina al medio de
incubación sobre el contenido intestinal de melatonina. Se observa que la pargilina produjo
un aumento dosis-dependiente en este parámetro, que casi llega a duplicar su valor con la
dosis más elevada de pargilina (50mM), con respecto a lo observado en el grupo control.
La pargilina también produjo cambios significativos en el contenido de 5HT y
5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT (Figura 6). Mientras que los niveles de 5HT
aumentaron fuertemente (+25% con la dosis más baja y +70% con la dosis mayor de
pargilina), los de su metabolito ácido fueron afectados negativamente de una forma dosisdependiente, llegando casi a anularse con la dosis más elevada de pargilina (Figura 6A).
Como consecuencia, la relación 5HIAA/5HT también disminuyo de forma drástica y de
forma dosis-dependiente, indicando una disminución de la actividad serotoninérgica
(Figura 6B) causada por la adición de pargilina. En el medio de cultivo los niveles de 5HT
151
Trabajo experimental 6
se incrementaron significativamente (Figura 6C), en relación a los tratamientos con
pargilina.
Los resultados obtenidos tras la inclusión de fenfluramina al medio de cultivo se
muestran en la Figura 7. La fenfluramina no produjo cambios significativos en los niveles
intestinales de melatonina, aunque con la dosis mayor se notó una caída importante (25%
vs control) en este parámetro.
Tal y como se observa en la Figura 8, el contenido de 5HT en el tejido incubado
tampoco mostro cambios significativos tras aplicar las diferentes dosis de fenfluramina al
medio de cultivo (Figura 8A). En cambio, el contenido de 5HIAA se incrementó de manera
dependiente de la concentración del fármaco (P <0.05, respecto del control). En
consecuencia, la relación entre el metabolito y el precursor (5HIAA/5HT) se incrementó de
forma progresiva con la concentración empleada de fenfluramina (Figura 8B), siendo estos
aumentos significativos en relación al grupo control. A diferencia de los niveles de 5HT en
el tejido, el contenido de este neurotransmisor en el medio de cultivo se incremento
significativamente en relación al control (Figura 8C), este resultado nos confirma la acción
del fármaco sobre la liberación de la 5HT, generando similar efecto ambas concentraciones
de fenfluramina.
300
*
Melatonina pg /g tejido
250
*
200
150
100
50
0
0
5
50
Pargilina (mM)
Figura 5. Variaciones del contenido de melatonina en tejido intestinal de trucha arco iris
cultivado in vitro tras la adición de diferentes concentraciones de pargilina al medio de cultivo. Los
datos están expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras en total para cada tratamiento. * P
< 0.05 vs Control.
152
Trabajo experimental 6
5HT
5HIAA
A
*
350
0,18
250
*
200
2000
150
*
100
1000
*
0
0
5
50
Relación 5HIAA / 5HT
3000
0,14
0,12
0,10
0,08
*
0,06
0,04
*
0,02
0
50
B
0,16
5 HIAA (ng /g tejido)
5HT (ng / g tejido)
300
0,00
0
5
Pargilina (mM)
100
En el medio de cultivo
C
5HT
5HIAA
100
*
80
5HT ng/g tejido
50
Pargilina (mM)
80
60
60
**
40
40
20
20
0
5HIAA ng /g tejido
4000
0
0
5
50
Pargilina (mM)
Figura 6. Variaciones en el contenido de 5HT, 5HIAA (A) y la relación 5HIAA/5HT (B) en
el intestino de la trucha cultivado in vitro, tras la adición de pargilina al medio de cultivo (C)
variaciones en el contenido de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Los datos están expresados
como la media ± E.E.M. de un total de 18 muestras para cada tratamiento. * P < 0.05 con respecto
al respectivo grupo control.
153
Trabajo experimental 6
Melatonina (pg/g tejido)
800
600
400
200
0
0
4
25
Fenfluramina (mM)
Figura 7. Efecto de la adición del inhibidor de la liberación de 5HT (fenfluramina) al medio
de cultivo sobre la producción intestinal in vitro de melatonina en la trucha arco iris. Los datos
están expresados como la media ± E.E.M. de 18 muestras para cada tratamiento.
5HT
5HIAA
*
*
1000
80
800
60
600
40
400
200
0
4
25
0,10
*
0,08
0,06
0,04
20
0,02
0
0,00
0
Fenfluramina (mM)
7
5HT ng/g tejido
6
B
4
25
Fenfluramina (mM)
En el medio de cultivo
5HT
5HIAA
C
*
*
140
120
5
100
4
80
3
60
2
40
1
20
0
5HIAA ng/g tejido
5HT (ng/g tejido)
100
1200
*
0,12
120
1400
0
0,14
140
Relación 5HIAA / 5HT
1600
A
5HIAA (ng/g tejido)
1800
0
0
4
25
Fenfluramina mM
Figura 8. (A) Efecto de la adición de fenfluramina sobre el contenido de 5HT y su principal
metabolito, 5HIAA, en preparaciones in vitro del intestino medio de la trucha. (B) Relación
5HIAA/5HT en el grupo control y en los tratados con fenfluramina (C) variaciones en el contenido
de 5HT y 5HIAA en el medio de cultivo. Los datos están expresados como la media ± E.E.M. de
un total de 18 muestras para cada tratamiento. * P < 0.05 respecto al control (0 fenfluramina).
154
Trabajo experimental 7
Regulación por melatonina de la contractibilidad
intestinal en la trucha arco iris (Oncorhynchus
mykiss). Posible interacción con los sistemas
colinérgico y serotoninérgico.
Trabajo experimental 7
Introducción y objetivos
La melatonina es una molécula implicada en numerosos aspectos fisiológicos y
patológicos del TGI en los vertebrados, (Bubenik, 2002; Konturek et al., 2007). A modo de
ejemplo, posee una destacada capacidad aceptora de radicales libres (Stankov y Fraschini,
1993) por lo que se ha postulado su papel protector de la mucosa gastrointestinal (Akbulut
et al., 1997; Konturek et al., 2007), pero también parece ser un regulador de la secreción de
bicarbonato (Sjobom et al., 2001) y de la proliferación celular digestiva, entre otros
(Bubenik, 2001). Un aspecto que también ha recibido atención ha sido su implicación en la
regulación de la motilidad intestinal. En este sentido, Bubenik (1986) mostró en íleon de
rata que la melatonina provoca una disminución del tono contráctil, efecto que podría
implicar una interacción con la regulación serotoninérgica. Por su parte, Merle et al.,
(2000) proponen que la melatonina altera los patrones de motilidad pre- y postprandiales
durante la noche en la rata. Asimismo, dosis bajas de melatonina i.p. provocan el
incremento del vaciado intestinal en ratas (Drago et al., 2002), mientras que dosis altas lo
retrasan (Kasimay et al., 2005). A pesar de estos datos, se desconocen en gran parte los
mecanismos a través de los que la hormona ejerce su acción reguladora de la motilidad
intestinal.
Los estudios acerca del papel de la melatonina en la fisiología digestiva de
vertebrados no mamíferos son mucho más escasos. Recientemente se ha descrito que la
melatonina atenúa el incremento de las contracciones inducidas por ACh en intestino del
carpín, especie de teleósteo carente de estómago (Velarde et al., 2009b). Asimismo, estos
autores muestran que el efecto de la melatonina es bloqueado por antagonistas de
receptores de membrana de la hormona, los cuales también parecen mediar un efecto
modulador de la melatonina sobre la contractilidad intestinal inducida por la 5HT (Velarde
et al., 2010b).
Dado que en peces, al igual que en mamíferos, existe una producción endógena de
melatonina a nivel del TGI (trabajos precedentes incluidos en esta Memoria), no cabe duda
de que todos estos resultados apoyan una relación funcional entre la melatonina y la
actividad motora digestiva. Por otro lado, se ha de tener en cuenta que una parte de la
melatonina presente en el TGI podría provenir de la secreción biliar, fruto de su síntesis
hepática (Trabajo 3) y cuya liberación al lumen intestinal acontece tras la ingesta. En todo
este proceso de integración fisiológica, es posible que sea el propio desplazamiento del
alimento por el tubo digestivo el que active reflejos neuroendocrinos que, en primera
instancia, promuevan de manera secuencial las actividades secretoras y motoras asociadas
al TGI y, en segunda instancia, modulen la síntesis de melatonina en el intestino (ver
Trabajos 4 y 5). Constatar la existencia de una regulación funcional de la melatonina sobre
la actividad contráctil intestinal podría suponer establecer un nexo funcional cuya
relevancia es todavía una incógnita. De hecho, la melatonina ha sido propuesta como una
señal neuroendocrina periférica con efecto anorexigénico en teleósteos (Pinillos et al.,
2001; López Olmeda et al., 2006b), por lo que no es descartable que sus efectos sobre la
157
Trabajo experimental 7
actividad motora intestinal formen parte del sistema señalizador que contribuye a regular la
ingesta alimenticia.
La motilidad intestinal está dirigida a facilitar el tránsito del alimento y los procesos
de digestión y absorción. La extensa regulación intrínseca y extrínseca del TGI contribuye
a regular su motilidad desencadenando patrones específicos pre- y post-absortivos (Olsson
y Holomgren, 2001; 2010). De manera similar a lo que ocurre en mamíferos, la inervación
extrínseca vagal contribuye a coordinar la actividad digestiva en los peces, considerándose
la ACh liberada desde las neuronas motoras parasimpáticas como el principal responsable
de la contracción del músculo liso intestinal (Aronsson y Holmgren, 2000; 2010; Olsson,
2009). Otro neurotransmisor que parece tener un papel destacado en la regulación de la
motilidad intestinal es la 5HT, cuya presencia en las neuronas entéricas es muy extensa
(Karila et al., 1998; Burka et al., 1989). Aunque en el carpín se ha demostrado que la 5HT
regula la actividad contráctil a través de receptores localizados sobre neuronas
colinérgicas, la función de este neurotransmisor en otras especies de teleósteos es aún poco
conocida.
En trucha arco iris y alguna otra especie de teleósteo se ha descrito la presencia de
sitios de unión para 2-[125I]-melatonina en el intestino, postulándose un papel de la
hormona como modulador de la motilidad digestiva. El objetivo del presente trabajo ha
sido esclarecer las acciones potenciales directas de la melatonina sobre la motilidad
intestinal de la trucha arco iris realizando para ello las siguientes aproximaciones
experimentales: i) Caracterizar la actividad contráctil intestinal y el efecto regulador de la
ACh y la 5HT; ii) Evaluar la acción de la melatonina y la especificad de su efecto
(mediación por receptores de membrana de la hormona) iii) Evaluar la implicación del
Ca2+ extracelular en el efecto de la melatonina y de la 5HT; iv) evaluar la posible
interacción de la melatonina con mecanismos colinérgicos y/o serotoninérgicos
reguladores de la actividad contráctil intestinal.
Materiales y métodos
Animales
Se utilizaron trucha arco iris con un peso aproximado de 150 ±10 g que
permanecieron durante al menos 3 semanas en el en las instalaciones habilitadas en el
Centro de Cultivo Experimental de la Universidad Politécnica de Madrid (Escuela Técnica
Superior de Ingenieros de Montes), dotado de piscinas con sistemas de flujo constante de
agua declorada. Los peces fueron mantenidos bajo condiciones naturales de fotoperiodo y
temperatura oscilando esta última entre 13ºC y 16ºC. El alimento fue suministrado a diario,
a las 09:30 h y consistió en pienso seco comercial (Dibaq-142 Diproteg SA., Segovia). La
cantidad diaria de alimento suministrado fue del 1% de la masa corporal de los peces. Los
158
Trabajo experimental 7
experimentos se realizaron conforme a la directiva de manipulación de animales de la
Unión Europea (86/609EU) y las Leyes españolas para el uso de animales en investigación
(RD 1201/2005).
Baño de órganos e incubación de los tejidos
Para abordar los objetivos marcados en el presente Capitulo se dispuso de un
sistema de incubación en baño de órganos, técnica utilizada con frecuencia en fisiología
animal y farmacología y que permite medir cambios en la fuerza contráctil de
preparaciones aisladas de músculo liso tras la adición de distintos fármacos al medio en el
que está sumergido el tejido (Velasco Martín, 2001). Esta técnica también permite conocer
la respuesta de los distintos componentes de la musculatura (circular y longitudinal), en
función de la posición del fragmento de intestino aislado en la preparación (Sarr et al.,
2001).
El baño de órganos, cuyo esquema se representa en la Figura 1, tiene la ventaja
fundamental de permitir que el tejido se mantenga funcional durante varias horas, debido a
que está constantemente inmerso en el medio de cultivo apropiado (Ringer específico para
teleósteos), burbujeado constantemente con carbógeno (O2 95%, CO2 5%) y mantenido a
una temperatura controlada de 15ºC. La cámara de cultivo está recubierta de un vidrio
doble y alberga en su interior un espacio que se llena con el medio de cultivo. Entre las dos
paredes se produce un flujo continuo de agua a 15ºC, gracias al cual se mantiene constante
la temperatura del cultivo (Hollands, 1974). En el interior de la cámara de incubación se
introduce el tejido conectado a un sistema sensor, el cual mediante un transductor
isométrico (Pre205, Cibertec) envía la señal a un computador para ser recogida con un
software de registro (ADQ2C, CromaNec).
Figura 1. Representación esquemática del sistema de baño de órganos utilizado en el
presente estudio.
159
Trabajo experimental 7
Antes del inicio de los cultivos de intestino las cámaras del baño fueron llenadas
con 10 ml de medio de cultivo, el cual se encontraba previamente mantenido a 15ºC, (al
igual que los 500 ml de medio almacenado en un matraz Erlenmeyer) y con burbujeo
constante de carbógeno. A continuación se anestesiaron los peces mediante inmersión en
hielo, se pesaron, e inmediatamente se sacrificaron por decapitación. Tras abrir la cavidad
abdominal y extraer el intestino medio, este fue vaciado y limpiado de restos de alimento
(haciendo pasar una solución Ringer) y de tejido adiposo, con ayuda de unas pinzas.
Posteriormente se procedió a fragmentar el intestino medio en segmentos de 1.5 a 2 cm de
longitud, que fueron colocados en la preparación en sentido longitudinal. Inmediatamente
después se realizó una ligadura con hilo de sutura en uno de los extremos del segmento y
se aprovecharon los cabos del hilo para fijarlo al alambre del soporte. Mediante punción el
otro extremo del segmento intestinal fue fijado a un gancho móvil. Una vez conseguido, la
preparación se situó en la cámara de cultivo, ajustándose la tensión del tejido para un
correcto registro de la actividad contráctil. La tensión óptima estimada utilizada para la
trucha arco iris fue de 10 mN, que equivale a 1 g de peso. Para aplicar dicha tensión, en
cada sensor de cada cámara se cuelga una pesa de 1 g, con lo que se genera una respuesta
en el sistema de adquisición de datos, con valores esperados de 500 mV para 1 g de peso.
En estas condiciones se ajusta la señal a 0 mV con el botón de ―balance‖ del transductor.
Esto permite que, al retirar la pesa, el registro sea de aproximadamente -500 mV.
Al colgar el alambre móvil que está unido al tejido con el sensor, se genera una
señal en el sistema de adquisición. El tejido debe estar sometido a una tensión de 10 mN y
la señal en 0 mV, lo que se consigue aumentando o disminuyendo la tensión con el uso de
los tornillos micrométricos situados sobre el sensor.
Solución de incubación y preparación de los compuestos ensayados
La composición del medio de cultivo Ringer empleado para la incubación del
intestino de trucha arco iris fue el siguiente: NaCl 140 mM, KCl 2.5 mM, CaCl2 1.5 mM,
MgSO4 0.8 mM, NaHCO3 15mM, KH2PO4 1 mM, HEPES 5 mM y glucosa 10 mM. El pH
de la solución se ajustó a 7.8 con NaOH 10% (p/v).
Los fármacos cuyo efecto se deseaba ensayar fueron incorporados en alícuotas de
100 l a la cámara de incubación, de manera que la concentración añadida se diluyó 100
veces. Todas las diluciones madre fueron preparadas a una concentración 10 mM en H2O y
a partir de estas se realizaron diluciones seriadas con un factor de dilución 1:10.
Los fármacos no solubles en agua pero si en solución alcohólica, como la
melatonina o el luzindol, se disolvieron primero en una pequeña cantidad de etanol,
completándose con agua hasta alcanzar la concentración 10 mM. Así, la concentración
final de etanol en el baño fue siempre del 0.05%. Otros fármacos como la metisergida, se
prepararon directamente a 10 mM en dimetil sulfoxido (DMSO), para posteriormente
realizar diluciones en agua hasta abarcar las concentraciones deseadas. En el caso de la
160
Trabajo experimental 7
atropina se acidificó ligeramente el agua con una gota de HCl 1N, lo que facilitó su
completa disolución.
Registro de la contractilidad
Al inicio de cada día de experimentación los primeros registros se realizaron en
muestras de tejido no tratadas, con el fin de definir la contracción basal y su variación a lo
largo del día. Antes de la realización de cada registro (basal o tras la adición de cualquier
fármaco) se realizó un registro basal de al menos 2-5 minutos para cada tejido ensayado,
obteniéndose la línea base de referencia con la cual se compararon los cambios obtenidos
tras los distintos tratamientos. Un ejemplo se puede apreciar en la Figura 2 que muestra un
registro de la contractibilidad basal del intestino, seguido del incremento en la
contractilidad generado tras la adición de melatonina.
En cambio, cuando se realizaron ensayos de agentes reguladores en presencia de
agentes bloqueantes (luzindol y metisergida), estos fueron añadidos al inicio del ensayo, se
incubaron las muestras durante 10 minutos y a continuación se añadió el fármaco regulador
cuyo efecto se deseaba estudiar.
Todos los datos presentados en el presente Trabajo están expresados en unidades de
fuerza (mN). En nuestras condiciones experimentales 50 mV del registro equivalen a 1
mN, mientras que un gramo de tensión equivale a 10 mN.
Figura 2. Ejemplo de un registro de contractilidad del intestino de trucha arco iris, en el se
explica cómo se obtuvo el diferencial medido.
A la hora de cuantificar los resultados, no fueron evaluados ni el número de
contracciones de la musculatura por minuto (frecuencia), ni la amplitud de la onda
contráctil, ya que los registros obtenidos en intestino de trucha presentaron una elevada
variabilidad entre tejidos y dentro del mismo ensayo. En este sentido, nuestros resultados
161
Trabajo experimental 7
concordaron con estudios previos (Johansson y Holmgren, 2003) que demostraron que en
la trucha arco iris no se observa de forma clara un ritmo basal de ondas contráctiles
(―ondas lentas‖) e incluso el patrón de registro varía de forma considerable entre ensayos,
pero también dentro de un mismo ensayo con los cambios de medio, estabilizándose la
señal tras largo tiempo. Puesto que el diferencial de la línea base de las ondas fue un
parámetro muy estable, los resultados se evaluaron teniendo en cuenta dicho parámetro.
Diseño experimental
Caracterización de la respuesta contráctil del intestino de la trucha arco iris a ACh, 5HT
y melatonina
En primer lugar se caracterizó la respuesta contráctil del intestino frente a los
tratamientos con distintas concentraciones de ACh, 5HT y melatonina. El rango de
concentraciones para cada fármaco fue: ACh, desde 10-11 a 10-5 moles/l; 5HT, desde 10-10 a
10-5 moles/l; melatonina, desde 10-11 a 10-3 moles/l. Para cada una de las concentraciones
se realizaron un mínimo de 5 ensayos.
Efecto de la ausencia de C2+ y de la adición de atropina en el medio de incubación sobre
la contractilidad inducida por 5HT y melatonina
Una vez caracterizada la respuesta contráctil del intestino frente a la adición de
diferentes concentraciones de 5HT y melatonina, se realizaron ensayos con medio de
cultivo sin Ca2+, con el fin de conocer la dependencia de la respuesta contráctil al ión. Para
ello se preparó medio de cultivo libre de Ca2+ cuya concentración se sustituyó por NaCl
(concentración final: 143mM). Se utilizaron cuatro dosis de 5HT, desde 10-8 a 10-5 moles/l
y de melatonina, desde 10-7 a 10-4 moles/l. En paralelo se realizaron los mismos
tratamientos en muestras cultivadas en presencia de Ca2+ en el medio.
Con el fin de evaluar la implicación de mecanismos colinérgicos en la estimulación
inducida por 5HT y melatonina en la fuerza contráctil basal del intestino de la trucha, se
realizaron cultivos en los que se incluyó atropina (bloqueante de receptores muscarínicos)
a una concentración final de 10-4 moles/l. Previamente se constató que la atropina añadida
al medio de cultivo inhibía eficazmente la respuesta contráctil colinérgica. Posteriormente
se evaluó el efecto de la 5HT (10-8 a 10-5 moles/l) y de la melatonina (10-7 a 10-4 moles/l)
sobre la actividad contráctil de segmentos de intestino preincubados con atropina. Como
control, se realizaron experimentos sin atropina en el mismo ensayo.
Efecto del antagonista luzindol sobre la estimulación de la fuerza contráctil basal
inducida por melatonina
162
Trabajo experimental 7
Para identificar los mecanismos de acción de la melatonina sobre la contractilidad
del intestino, el efecto de la hormona se ensayó en presencia de luzindol, un antagonista
específico de receptores de melatonina. Se realizaron cultivos en los que el intestino se pretrató con cuatro concentraciones distintas del antagonista (10-9 a 10-6 moles/l), añadiéndose
posteriormente melatonina a la concentración de 10-6 moles/l.
Posible interacción de la melatonina con mecanismos serotoninérgicos reguladores de la
contractilidad intestinal
Para estudiar una posible interacción entre la melatonina y la 5HT en la regulación
de la contractilidad intestinal, se realizaron dos tipos de ensayos. Por una parte se
expusieron cultivos de intestino a una única concentración de 5HT (10-8 moles/l),
añadiéndose a continuación diferentes concentraciones (10-7 a 10-3 moles/l) de melatonina.
Por otra parte, se realizaron los mismos ensayos pero cambiando el orden de
administración de los indoles, siendo el intestino pre-tratado con diferentes dosis de
melatonina (10-7 a 10-3 moles/l) y posteriormente expuesto a 5HT (10-8 moles/l).
En otra serie de ensayos se evaluó una posible acción inespecífica de la melatonina
modulando la motilidad intestinal a través de receptores de 5HT. En estos ensayos se
monitorizó el efecto de la melatonina en presencia de metisergida, inhibidor específico de
los receptores 5HT1 y 5HT2 de serotonina. En primer lugar se estudió el efecto de
metisergida (de 10-8 a 10-5 moles/l) sobre la estimulación contráctil inducida con 5HT (10-8
moles/l). Dado que la metisergida, incluso a concentraciones relativamente bajas, produce
un efecto general bloqueante de la actividad muscular intestinal, en una siguiente tanda de
cultivos se realizó una curva dosis-respuesta con cinco concentraciones de metisergida (de
10-8 a 10-5 moles/l), evaluándose su efecto sobre la actividad contráctil basal del intestino.
Esto permitió conocer la dosis del inhibidor que, siendo efectiva sobre la actividad
serotoninérgica, no llegase a bloquear el tono contráctil basal. La dosis seleccionada (10-8
moles/l) fue empleada como pre-tratamiento en cultivos sucesivos con tres dosis de
melatonina (de 10-7 a 10-5 moles/l).
Finalmente, para verificar si la melatonina modula la respuesta contráctil intestinal
generada por la ACh, se realizó un nuevo diseño experimental en el que se cultivaron
fragmentos de intestino en presencia de una concentración baja de ACh (10-8 moles/l) y
diferentes concentraciones de melatonina (de 10-9 a 10-5 moles/l).
Análisis estadísticos
La actividad contráctil fue medida en mN y los datos se muestran como la media ±
E.E.M. de al menos 4-5 réplicas/tratamiento. Antes de realizar cualquier análisis
estadístico todos los datos obtenidos fueron sometidos previamente a los tests de
normalidad (Shapiro-Wilks) y de homogeneidad de varianzas (prueba C de Cochran). Para
la caracterización de la actividad contráctil intestinal en la trucha arco iris, se realizaron
163
Trabajo experimental 7
curvas dosis-respuesta con distintos neurotransmisores u hormonas. Los resultados
obtenidos fueron evaluados mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía. En el caso
de existir diferencias significativas, se realizó el test de Tukey de comparaciones múltiples.
En cambio, cuando se analizó el efecto de dos compuestos diferentes sobre la
contracción intestinal de la trucha, el análisis de varianza de dos vías fue el método elegido
con el fin de cuantificar el efecto de cada variable por separado, así como la interacción
entre ambas. En el caso de que existieran diferencias significativas inducidas por alguno de
los tratamientos se aplicó un test de Tukey de comparaciones múltiples. Para todos los
análisis el grado de significación se estableció en P < 0.05.
Resultados
Efecto de ACh, 5HT y melatonina sobre la actividad miogénica espontánea en el
intestino de la trucha
En la Figura 3 se muestra el efecto de diferentes dosis de ACh (A), 5Ht (B) y
melatonina (C) sobre la contractilidad intestinal de la trucha. Tanto la adición de ACh
como la de 5HT produjeron una estimulación significativa dosis-dependiente de la
contracción en los segmentos de intestino. La concentración mínima que produjo un efecto
contráctil significativo fue de 10-8 moles/l para ambos fármacos. En ambos casos, la dosis
mayor ensayada (10-5 moles/l) incrementó la fuerza contráctil en unas 40 veces sobre la
contracción basal, sin que se observara una meseta en la respuesta a estas dosis.
La melatonina mostró un claro efecto estimulador de la contracción muscular que
dependió de la concentración del indol empleada. La dosis mínima efectiva fue de 10-7
moles/l, aumentando progresivamente la fuerza contráctil hasta 10-5 moles/l. Sin embargo,
concentraciones más altas de la hormona (10-4 y 10-3 moles/l) produjeron un claro descenso
en su potencia estimuladora de la contractilidad intestinal.
Efecto de la ausencia de Ca2+ y de la adición de atropina en el medio de incubación
sobre la contractilidad inducida por melatonina y 5HT
Tal y como se aprecia en la Figura 4, la incubación del intestino en medio carente
de Ca extracelular provocó una fuerte atenuación del efecto estimulador de la contracción
muscular intestinal ejercido por la melatonina (Figura 4A) y la 5HT (Figura 4B). La
magnitud de la reducción en el efecto de la melatonina en ausencia de Ca2+ se mantuvo
constante con todas las concentraciones ensayadas de ambos compuestos, pudiendo
observarse todavía una cierta dosis-dependencia de la contracción inducida por melatonina
y por 5HT en estas condiciones.
2+
164
Trabajo experimental 7
Por otro lado, la Figura 4 también muestra el efecto de la atropina sobre la
estimulación de la fuerza contráctil intestinal inducida por melatonina (Figura 4C) y 5HT
(Figura 4D). La atropina bloqueó el efecto de ambos compuestos, poniendo de manifiesto
una interacción de la melatonina con los mecanismos colinérgicos implicados en la
regulación del tono contráctil intestinal.
Efecto de la melatonina sobre la estimulación intestinal colinérgica
El efecto de la melatonina (10-9 a 10-5 moles/l) sobre el incremento de la fuerza
contráctil intestinal inducido por ACh solo se ensayó en presencia de una concentración
débil de ACh (10-8 moles/l) dado que el gran efecto estimulador inducido por
concentraciones más elevadas impide ver cualquier cambio (de mucho menor rango)
promovido por la melatonina. Tal como se muestra en la Figura 5, la melatonina indujo un
efecto estimulador concentración-dependiente de la respuesta contráctil inducida por la
dosis baja de ACh. La mínima concentración efectiva de melatonina fue 10 -7 mol/l, similar
a la que produjo efectos sobre la motilidad espontánea (ver Figura 3C).
165
Trabajo experimental 7
A
60
*
Tensión muscular (mN)
50
*
40
30
*
20
*
10
0
-10
0
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-1
Acetilcolina, Log [mol l ]
B
50
*
Tensión muscular (mN)
40
30
*
*
20
*
10
0
0
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-1
5HT, Log [mol l ]
5
C
*
Tensión muscular (mN)
4
*
3
*
2
*
1
*
0
-1
0
-11
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-1
Melatonina, Log [mol l ]
Figura 3. Caracterización del efecto concentración-dependiente inducido por ACh (A), 5HT
(B) y melatonina (C) en cultivos de intestino medio de trucha arco iris. Los datos se presentan
como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones independientes. * P < 0.05 respecto del medio sin
añadir el compuesto testado.
166
Trabajo experimental 7
Tensión muscular (mN)
5
Medio con Ca2+
Medio sin Ca2+
A
4
40
30
3
20
2
*
1
-7
10
*
*
0
*
*
-6
-5
-8
-4
2,5
*
*
*
0
-7
-6
-5
5HT, Log [mol l-1]
Melatonina, Log [mol l-1]
3,0
Tensión muscular (mN)
B
Medio con Ca 2+
Medio sin Ca 2+
C
Medio sin atropina
Medio atropina
25
Medio sin atropina
Medio atropina
D
20
*
2,0
15
1,5
10
1,0
0,5
*
*
5
*
*
*
0,0
*
0
-7
-6
-5
-4
-8
Melatonina, Log [mol l-1]
*
-7
-6
-5
5HT, Log [mol l-1]
Figura 4. Efecto de la ausencia de Ca2+ extracelular (A y B) y de la presencia de 10-4 moles/l
atropina (C y D) en la acción estimuladora de la contractilidad intestinal inducida por melatonina y
5HT en la trucha. Los datos se presentan como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones
independientes. * P < 0.05 respecto del respectivo control incubado con calcio y sin atropina,
respectivamente.
167
Trabajo experimental 7
6
Ach 10-8 en medio
*
Tensión muscular (mN)
5
*
4
*
3
2
1
0
0
-9
-8
-7
-6
-5
-1
Melatonina, Log [mol l ]
Figura 5. Efecto de la melatonina sobre la respuesta contráctil (tensión muscular) inducida
por ACh (10-8 moles/l). El intestino se incubó en presencia de ACh y posteriormente se expuso a
diferentes concentraciones de melatonina. La línea punteada señala el valor de la respuesta
colinérgica. Los datos se muestran como la media ± E.E.M. de 4 experimentos independientes. * P
< 0.05 respecto del intestino incubado sin melatonina.
Efecto del luzindol sobre la estimulación intestinal inducida por melatonina
Conocido el efecto estimulador de la contractilidad intestinal ejercido por la
melatonina, el siguiente paso fue conocer si dicho efecto está mediado por receptores
específicos de la hormona. Para ello se realizaron cultivos de intestino expuesto a
diferentes concentraciones del antagonista general de dichos receptores, luzindol, y
posteriormente tratados con una dosis de melatonina que mostró un fuerte efecto
estimulador de la contracción intestinal (10-6 moles/l). Como se aprecia en la Figura 6, el
pre-tratamiento con luzindol bloquea la estimulación de la contracción intestinal provocada
por la melatonina. No obstante dicho efecto no pareció depender de la dosis de antagonista
empleada, al menos en el intervalo de concentraciones estudiado.
168
Trabajo experimental 7
1,8
Melatonina 10-6 en medio
Tensión muscular (mN)
1,6
1,4
1,2
1,0
*
0,8
0,6
*
*
0,4
*
0,2
0,0
0
-9
-8
-7
-6
-1
Luzindol, Log [mol l ]
Figura 6. Efecto del antagonista general de los receptores de melatonina, luzindol, sobre la
estimulación de la contracción intestinal ejercida por la adición de melatonina (10-6 moles/l). Los
datos se presentan como el promedio ± E.E.M. de 4 valoraciones independientes. * P < 0.05
respecto del control incubado sin luzindol.
Posible interacción de la melatonina con los mecanismos serotoninérgicos reguladores
de la contractilidad intestinal
Con el fin de cuantificar una posible interacción entre la melatonina y la 5HT como
moduladores de la fuerza contráctil intestinal, se realizaron experimentos en los que se
cuantificó, en primer lugar, el efecto de diferentes concentraciones de la hormona en
intestinos incubados previamente con una concentración débil (10-8 moles/l) de 5HT
(Figura 7). El hecho de seleccionar esta concentración se debió, al igual que en caso de la
ACh, a la desproporción de cambios que inducen ambos compuestos a dosis elevadas,
siendo el efecto de la 5HT de tal magnitud que impide ver cualquier efecto de la
melatonina, de rango mucho menor. Conforme a los resultados obtenidos, solo
concentraciones altas de melatonina, concretamente 10-5 moles/l, inhiben el potencial
incremento de la fuerza contráctil causado por la adición de 5HT al medio de incubación.
Dicho efecto se observó de forma independiente al orden de la adición de ambos
compuestos (melatonina y serotonina, datos no mostrados).
En una segunda serie de ensayos se evaluó el efecto del pre-tratamiento del medio
de incubación con metisergida, sobre la contracción inducida por melatonina. Como en
ensayos previos, se evaluó el efecto de la metisergida sola sobre la contractilidad
espontánea basal y sobre el aumento de la fuerza contráctil en respuesta a 5HT. La
metisergida aplicada sola provocó una fuerte reducción en la tensión muscular basal,
visible ya a concentraciones de 10-8 moles/l (70% inhibición) y todavía incrementada con
169
Trabajo experimental 7
concentraciones mayores (10-5 moles/l; 92% inhibición) (Figura 8A). En presencia de 5HT
(10-8 moles/l), la metisergida inhibió la estimulación contráctil serotoninérgica de una
manera concentración-dependiente (Figura 8B), siendo el efecto ya visible con 10-7 moles/l
de metisergida (40% inhibición) y máximo a 10-5 moles/l (95% inhibición). Para evitar un
posible enmascaramiento del efecto de la metisergida sobre el efecto de la melatonina
(presumiblemente de menor rango), se decidió emplear la dosis efectiva más baja de
metisergida (10-8 moles/l). Tal como se aprecia en la Figura 9, el pre-tratamiento con
metisergida no solo impidió el incremento de la tensión contráctil intestinal que
normalmente debería inducir la melatonina, si no que también disminuyo la respuesta
contráctil basal. Esto pone de manifiesto la posible mediación de receptores
serotoninérgicos en la acción reguladora de la melatonina, sobre la contractibilidad
intestinal de la trucha.
Tensión muscular (mN)
4
Control (no 5HT en medio)
5HT 10-8 en medio
3
*
2
1
0
0
-7
-6
-5
-4
Melatonina, Log [mol l-1]
Figura 7. Respuesta contráctil intestinal frente a la adición de melatonina en presencia o
ausencia de 5HT (10-8 moles/l) en el medio de cultivo. Los datos se presentan como la media ±
E.E.M. de 4 experimentos. * P < 0.05 respecto al respectivo valor control (sin 5HT en el medio).
170
Trabajo experimental 7
A
Tensión muscular (% basal con 5HT)
Tensión muscular (% basal)
140
120
100
80
60
*
40
*
*
20
*
0
0
-8
-7
-6
140
B
5HT 10-8 en medio
120
100
80
*
60
*
40
20
*
0
-5
0
Metisergida, Log [mol l-1]
-8
-7
-6
-5
Metisergida, Log [mol l-1]
Figura 8. (A) Efecto del antagonista de los receptores de 5HT (metisergida) sobre la tensión
muscular basal en el intestino medio de la trucha arco iris. (B) Inhibición por metisergida de la
respuesta contráctil inducida por 5HT (10-8 moles/l). Los datos (promedio ± E.E.M, 4 replicas) se
presentan como el porcentaje de la tensión basal promedio (100%) (A) y tensión basal estimulada
con 5HT (B). * P < 0.05 respecto del valor obtenido sin metisergida (control).
0,5
-8
Tensión muscular (mN)
Metisergida 10 en medio
0,4
0,3
*
*
*
-6
-5
0,2
0,1
0,0
0
-7
-1
Melatonina, Log [mol l ]
Figura 9. Inhibición por metisergida (10-8 moles/l) del efecto de la melatonina sobre la fuerza
contráctil en intestino de trucha. Los datos representan la media ± E.E.M. de 4 réplicas. * P < 0.05
respecto valores obtenidos en la incubación sin melatonina.
171
Discusión
Discusión
Caracterización de los niveles y de la síntesis de melatonina en el tracto
gastrointestinal (TGI) de la trucha arco iris.
Puesta a punto de un método de HPLC con detección fluorimétrica para detección de
melatonina en diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos.
Actualmente la determinación de melatonina en muestras experimentales se lleva a
cabo por diferentes técnicas analíticas, principalmente RIA, EIA y HPLC. Al margen de la
mayor o menor complejidad de cada una de las técnicas, los métodos basados en RIA y
EIA están sujetas a la existencia de anticuerpos específicos anti-melatonina, lo que no
resulta frecuente en vertebrados no mamíferos a nivel comercial, con el consiguiente riesgo
de imprecisión en la cuantificación cuando se usan anticuerpos de otras especies. Los
métodos de HPLC tienen la ventaja de que, con pequeñas adaptaciones, pueden ser
aplicados a diferentes tipos de muestras independientemente de su origen biológico.
Aunque estas técnicas suelen ser altamente eficaces en cuanto a su sensibilidad, las bajas
concentraciones de melatonina presentes en muchas muestras (especialmente durante el
día) hacen necesario desarrollos adecuados a cada tejido y/o fluido corporal, a fin de
optimizar el análisis.
El primer objetivo de la presente tesis ha sido el desarrollar un método sencillo de
cuantificación de melatonina por HPLC, pero con suficiente sensibilidad como para medir
los niveles de la hormona en plasma, bilis y tejidos intestinales de la trucha arco iris. La
técnica desarrollada cumplió estos objetivos, pero también puede ser usada sin
modificaciones para medidas de melatonina en órgano pineal y retina de peces y, con
ligeras modificaciones, en mamíferos. Recientemente ha sido incluso utilizada de manera
exitosa para la cuantificación de melatonina en hemolinfa y tejidos nerviosos del
cefalópodo Octopus vulgaris (Muñoz et al., 2011).
En muestras biológicas complejas (plasma, bilis, tejidos,..) el análisis de melatonina
requiere de una extracción previa, normalmente mediante el uso de solventes orgánicos
(cloroformo, diclorometano) o columnas de extracción en fase sólida (SPE). En nuestro
caso hemos seleccionado cloroformo para extraer la melatonina, aunque se requiere un
doble proceso de extracción con este orgánico y un posterior lavado con NaOH, a fin de
eliminar impurezas que surgen en el proceso. El posterior secado y re suspensión del
extracto en volúmenes pequeños de solvente permitió elevar la concentración de la
melatonina, lo cual es útil para aquellas muestras muy diluidas de las que se requiere usar
volúmenes elevados para alcanzar una cantidad mínimo cuantificable de la hormona. En
este sentido, el procedimiento de extracción empleado resulta de bajo coste (menor que el
uso de columnas SPE), altamente reproducible y de fácil adecuación a los diferentes tipos
de muestras biológicas, ya sean fluidos o tejidos.
Los sistemas de detección aplicables a HPLC determinan en gran medida la
selectividad en la cuantificación de un compuesto y el nivel de detección que se puede
alcanzar. La detección electroquímica (DE) es un sistema altamente sensible para la
175
Discusión
cuantificación de indoles y sus derivados oxidados (Harumi & Matsushima, 2000) y es
usada de forma rutinaria con este fin en nuestro laboratorio. No obstante para la detección
de compuestos metilados, tales como la melatonina, la DE resulta poco ventajosa, ya que
se es necesario aplicar elevados potenciales de oxidación/reducción (Ceinos et al., 2005).
En esta situación, las altas corrientes generadas tienden a desestabilizar la señal en los
cromatogramas, cuya consecuencia es una baja reproducibilidad y sensibilidad. Este
problema no ocurre cuando se emplean detectores fluorimétricos, por lo que fue este tipo
de detección el usado para la puesta a punto del método de cuantificación de melatonina
aprovechando la fluorescencia nativa de este compuesto y sin necesidad de derivatización
de las muestras.
El procedimiento descrito se basa en el uso de fases móviles con un contenido
relativamente bajo de solvente orgánico (14% acetonitrilo), en comparación con otros
procedimientos que utilizan una mayor proporción de este solvente o de metanol para la
medición de melatonina (Vieira et al., 1992; Chanut et al., 1998; Kulczykowska y Iuvone,
1998; Rizzo et al., 2002). El hecho de usar columnas analíticas de alta eficacia (elevado
número de platos teóricos) con relleno de partículas de sílice de pequeño tamaño (3 µm)
facilita la separación del compuesto ligado a la fase estacionaria. Teniendo en cuenta que
los métodos fluorimétricos no alteran los componentes activos de la muestra, la fase móvil
usada en la separación cromatográfica no puede ser reutilizada, lo que encarece el proceso
analítico. En este sentido, el uso de columnas cortas y estrechas proporciona una clara
ventaja en la reducción de costes, puesto que no requieren elevados flujos de fase móvil
que incluso, de tener que usarse, serían contraproducentes (incremento de la presión en el
sistema). En este sentido, debemos hacer referencia a que la técnica descrita inicialmente
(Muñoz et al., 2009, trabajo 1) ha sido modificada de forma reciente (ver Trabajo 4),
introduciéndose un nuevo modelo de columnas (Kinetex C18, Phenomenex) de menor
longitud (5 cm) y con relleno de partículas todavía más pequeñas (2,6 m). Ello permite
una mejora de hasta un 300% en la sensibilidad en la detección de la melatonina, sin
detrimento de la resolución (no interferencias con otros compuestos). Además de su
eficacia, estas columnas requieren de flujos bajos de fase móvil (0,5-0,6 ml/min) y/o de un
menor porcentaje de solvente orgánico; en ambos casos, ello se traduce en una reducción
importante del coste analítico.
La valoración de los niveles de melatonina plasmática es el parámetro más usado
para evaluar los cambios en la función hormonal, si bien ésta es sintetizada y liberada
mayoritariamente desde el órgano pineal. Por este motivo la mayoría de los métodos de
HPLC se diseñaron para medir el contenido de melatonina en el órgano pineal (Reiter,
1993; Ceinos et al., 2005). Cuando se aplican estos métodos al plasma sanguíneo, una de
las dificultades que surgen es que no poseen la sensibilidad necesaria para su detección,
especialmente de los bajos niveles diurnos. Para mejorarla se han usado procesos
complejos de enriquecimiento y derivatización de las muestras de plasma (Hamase et al.
2004; Bechgaard et al., 1998; Iinuma et al., 1999), lo que enlentece y reduce la
176
Discusión
reproducibilidad del análisis. Como alternativa, se pueden usar volúmenes mayores de
plasma, pero esta alternativa suele presentar limitaciones en animales de pequeño tamaño
con reducido volumen circulatorio. Por ello, una de las ventajas del actual método es que
permite cuantificar melatonina en volúmenes pequeños de plasma (100-150 l), incluso
durante el día. En este sentido, el método es incluso más eficaz que las técnicas de EIA que
empiezan a ser de uso frecuente para monitorizar melatonina en el plasma de peces.
Un alto porcentaje de la melatonina plasmática se encuentra asociada a proteínas, lo
que debe ser considerado a la hora de un análisis preciso de su concentración circulante. A
menudo ello implica la necesidad de realizar un proceso de desproteinización de las
muestras para evitar subestimar el contenido de melatonina (Rizzo et al., 2002). Bajo
nuestras condiciones experimentales hemos encontrado contenidos de melatonina similares
en plasma libre de proteínas y en plasma normal, lo que indica que la extracción con
cloroformo tiene la capacidad de remover la melatonina asociada a proteínas. La
consecuencia más inmediata es la eliminación del protocolo de desproteinización, lo que
facilita la preparación de la muestra y minimiza la presencia de precipitados que puedan
interferir en los análisis.
La importancia del TGI como fuente de melatonina en vertebrados ha sido objeto
frecuente de estudio (Huether, 1993; Bubenik et al., 1999). Por ello uno de los objetivos
del procedimiento analítico ha sido su validación en muestras de tejido de diferentes
regiones del TGI, así como en la bilis (como ejemplo de fluido asociado a la actividad
digestiva) en la trucha arco iris. Los resultados obtenidos en dicha validación, corroborados
en posteriores estudios, indican la presencia de melatonina en diversas zonas del TGI:
esófago, estómago, intestino anterior, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino
posterior. La cantidad de melatonina encontrada está en el rango de la descrita en diversas
especies de mamíferos (Bubenik et al., 1992; 1999), así como en las pocas especies de
peces en las que se dispone de resultados (Bubenik y Pang, 1997; Herrero et al., 2007),
realizándose en todas ellas la cuantificación de melatonina mediante RIA o EIA. Aunque
en estos estudios iniciales se observaron ligeras variaciones día-noche en el contenido de
melatonina en tejido digestivo, estas son mucho menores de las halladas en el plasma. Por
su parte, los niveles de melatonina en bilis son hasta 10 veces superiores a los encontrados
en plasma durante el día y triplican a los nocturnos, lo que corrobora la hipótesis planteada
en mamíferos del almacenamiento de la hormona en la bilis (Tan et al., 1999). Estos
valores de melatonina en bilis son similares a los detectados en otras especies de teleósteos
(Herrero et al., 2007) Algunos de los aspectos relativos a la localización y regulación de la
melatonina en TGI y órganos anexos, así como su posible función, serán discutidos más
adelante.
Distribución de los niveles de melatonina y de la expresión génica de las enzimas
implicadas en su síntesis en el TGI de la trucha. Relación con los niveles de serotonina.
177
Discusión
Los resultados presentados en el Trabajo Experimental 2 demuestran que existe una
distribución diferencial de melatonina en las regiones del TGI, así como entre las capas
tisulares que conforman dicho tracto. De manera general el contenido de melatonina en la
pared muscular en cada zona del TGI fue superior a la encontrada en la respectiva capa de
mucosa. Esta diferencia fue más evidente en el intestino anterior, región que presentó el
mayor contenido de melatonina a nivel de la pared muscular. En el resto de regiones, el
contenido de melatonina (tanto en mucosa como en pared) fue similar entre regiones, con
tendencia a valores menores en estómago que en intestino y a decrecer desde la parte más
próximal del intestino hacia la región más distal. En los peces existe un único estudio que
hace referencia a la distribución de melatonina en TGI del esturión, la carpa y la trucha
arco iris, sin diferenciación entre pared y mucosa. En todas estas especies la mayor
concentración de melatonina se asoció con la zona del intestino proximal, seguido del
intestino distal (Bubenik y Pang, 1997). Una distribución similar decreciente en sentido
anteroposterior también fue descrita en ratón, siendo los niveles más elevados en el
estómago y el íleon y los más bajos en el yeyuno y el colon (Bubenik et al., 1992). Por el
contrario, en el cerdo se describió un gradiente inverso, midiéndose las más altas
concentraciones de melatonina en el colon, seguido del ciego, yeyuno e íleon, mientras que
en la vaca los mayores valores se asocian con el estómago multicameral y el íleon
(Bubenik et al., 1977). Por tanto, parece existir un cierto patrón topográfico de
acumulación de melatonina en el TGI, pero las características del mismo parecen variar
sustancialmente con la diversidad anatomo-fisiológicas de cada especie.
En mamíferos, hay datos sobre la presencia de concentraciones diferentes de
melatonina en la mucosa y en la capa muscular del intestino. Estudios inmunohistológicos
iniciales en la rata mostraron concentraciones mucho más elevadas en la capa de mucosa
que en la submucosa y la muscular (Bubenik et al., 1977; Bubenik, 1980; Lee y Pang,
1993) y asociaron la presencia de melatonina con su síntesis a nivel de las células
enterocromafines intestinales. Estudios más recientes en vacas y cerdos, mostraron niveles
mucho más equilibrados de melatonina entre las capas tisulares del TGI, aunque con una
cierta tendencia a mayores concentraciones en la mucosa que en la capa muscular
(Bubenik et al., 1999), siendo las relaciones entre ambos tejidos muy variables con la
especie y región digestiva. Asimismo, estos autores mostraron la existencia de
concentraciones muy elevadas de melatonina en el fluido del lúmen intestinal, en particular
en la región del colón, las cuales exceden a las halladas en la mucosa y capa muscular. En
el mismo sentido, los resultados incluidos en el trabajo 4 de la presente memoria también
demuestran una importante presencia de melatonina en el lumen digestivo, siendo sus
niveles modulables por la ingesta de alimento y su tránsito digestivo. El origen de esta
melatonina extratisular será tratado más adelante en detalle.
Las características químicas de la melatonina como molécula altamente lipofílica
facilitan su difusión desde el plasma a los espacios intersticiales y a los tejidos y cavidades
178
Discusión
próximas. Por ello, el origen de la melatonina detectada a nivel del TGI ha sido objeto de
controversia, hipotetizándose una relación entre los niveles plasmáticos e intestinales de la
hormona. De hecho, en la rata la pinealectomía, la cual elimina el ritmo día-noche en los
niveles plasmáticos de melatonina, produce un ligero descenso en el contenido intestinal de
esta hormona, sin llegar a su total desaparición (Bubenik, 1980; Bubenik y Brown, 1997).
Por otro lado, la administración de L-Trp a ratas pinealectomizadas lleva a un aumento de
los niveles plasmáticos de melatonina que podría derivar de un aumento en la síntesis a
nivel del intestino (Huether et al., 1992; Yaga et al., 1993), postulándose que la melatonina
liberada desde el intestino podría contribuir al mantenimiento de sus niveles plasmáticos.
En los peces, no hay estudios tan precisos, aunque en la lubina se ha indicado que el
intestino tiene cierta capacidad para acumular melatonina exógena (Herrero et al., 2007),
mientras que en incubaciones de fragmentos intestinales de la trucha arco iris, las
concentraciones de melatonina en el medio de incubación varían en presencia de diferentes
concentraciones del aminoácido L-Trp (Lepage et al., 2005a), sugiriendo una síntesis local
en el tejido intestinal.
La posibilidad de un origen local de la melatonina intestinal en la trucha arco iris
fue corroborada tras evaluar el efecto de la pinealectomía sobre los niveles de la hormona
en plasma e intestino medio y posterior. Los resultados obtenidos mostraron que la
pinealectomía eliminó el incremento nocturno en los valores plasmáticos de melatonina,
reduciendo además de forma significativa los valores diurnos, lo que concuerda con datos
previos mostrados en el carpín (Kezuka et al., 1992, la lubina (Bayarri et al., 2003) y la
trucha arco iris (Gern et al., 1978; Sanchez-Vazquez et al., 2000). Además, nuestros
resultados muestran la ausencia de efecto de la pinealectomía sobre el contenido de
melatonina en intestino, en coincidencia con lo descrito en mamíferos (Bubenik y Brown,
1997) y aves (Vakkuri et al., 1985). Estos datos justifican además que la melatonina
presente a nivel del intestino de la trucha es independiente de la que se produce en el
órgano pineal de esta especie. Por otro lado, parece descartarse que el intestino contribuya
de manera importante al mantenimiento de los niveles basales de melatonina en plasma. De
hecho, los bajos niveles de melatonina detectados en animales pinealectomizados podrían
derivar del aporte ocular, sin contribución destacada del tejido intestinal.
Una prueba más a favor de la existencia de una producción activa de melatonina en
el TGI de los peces es la caracterización de la expresión de las enzimas implicadas en su
síntesis. Así, los estudios realizados en el carpín por Velarde et al., (2010a) muestran la
presencia de aanat2 en zonas periféricas como intestino anterior y posterior, la vesícula
biliar, el riñón, las gónadas, el hígado y el corazón, así como la presencia de hiomt2 en
varios de estos órganos. En cuanto a la trucha arco iris, estudios recientes de nuestro grupo
demostraron, por primera vez en los peces, la presencia en el tejido gastrointestinal de la
trucha arco iris de expresión aanat2 (Fernández-Durán et al., 2007). Como una
continuación de dicho estudio, en el trabajo 2 de la presente Memoria se han presentado
evidencias de la expresión de las dos isoformas génicas que codifican para la enzima
179
Discusión
AANAT de la trucha, la aanat1 y la aanat2, así como de la hiomt, caracterizándose su
distribución en la mucosa y pared muscular de diferentes regiones digestivas.
Nuestros resultados son consistentes con los mostrados previamente en la trucha
arco iris, confirmando que la porción de mucosa (solo evaluada en intestino medio y
posterior) presenta una mayor expresión de los genes implicados en la síntesis de
melatonina (aanat1, aanat2 y hiomt) que la pared muscular (evaluada en diferentes
segmentos gastrointestinales). En cuando a la expresión génica en la pared digestiva, se
observó un cierto gradiente longitudinal decreciente en la expresión de hiomt,
alcanzándose los mayores niveles en el estómago y ciegos pilóricos, seguido del intestino
anterior y de las porciones intestinales más distales. También para la aanat2 se detectó una
cierta graduación similar en su expresión, con la excepción de los bajos niveles presentes
en el estómago en relación con las regiones proximales del intestino. Sin embargo, para la
aanat1 solo se hallaron valores elevados en estómago, en comparación con el resto de
regiones intestinales estudiadas. A partir de estos datos podemos concluir que en todo el
TGI de la trucha arco iris están presentes los mecanismos enzimáticos necesarios para la
producción de melatonina, así como que existen concentraciones variables de esta
hormona. Aunque no ha sido posible establecer una relación clara entre los niveles de
expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt, y los niveles de la hormona en los
diferentes tramos del TGI estudiados, se sugiere la existencia de un cierto gradiente
decreciente en sentido antero-posterior, en particular para la aanat2 y la hiomt. Por otro
lado, se hace notar el contraste de la existencia de valores más elevados de melatonina en
la pared muscular que en la capa de mucosa que recubre internamente el tubo digestivo,
mientras que la expresión de los genes aanat1, aanat2 y hiomt es mayor en la región
mucosal que en la pared muscular. Entre las razones que podrían motivar este resultado,
destacamos estas posibilidades: i) que exista una mayor capacidad de la pared muscular
para acumular la melatonina producida localmente o proveniente de la mucosa, ii) que
existan modificaciones postranscripcionales que regulen de manera diferencial la actividad
enzimática en las células de la pared muscular y en las del epitelio de la mucosa, iii) que
exista una distribución diferencial en la disponibilidad del sustrato metabólico (5HT) para
la formación de melatonina, lo que condicione cuantitativamente la capacidad de síntesis
de la hormona.
Debido a que la 5HT es clave para la síntesis de melatonina, hemos evaluado el
contenido de esta amina en las diferentes zonas del TGI de la trucha. Los niveles de 5HT
detectados en el presente trabajo son similares a los descritos previamente en mamíferos
(Martin et al., 1995; Côte et al., 2003), asi como a las mostradas en la trucha y otras
especies de teleósteos (Bogdanski et al., 1963; Caamaño-Tubio et al., 2007). Además,
nuestros resultados muestran diferencias en el contenido de 5HT en las distintas zonas del
TGI. Aunque los menores valores corresponden al esófago y estómago, a nivel intestinal se
observa una cierta tendencia a una disminución en sentido antero-posterior, con valores
más elevados en la parte proximal (ciegos pilóricos e intestino anterior) y más bajos en la
180
Discusión
parte distal (intestino medio y posterior). Esta distribución de los niveles de 5HT a lo largo
del intestino coincide en líneas generales con la descrita en mamíferos (Hansen y
Skadhauge, 1997) y en la trucha arco iris (Caamaño-Tubio et al., 2007), así como con la
distribución observada en nuestro trabajo de los niveles de melatonina y la expresión
génica de algunos enzimas de su síntesis.
Al igual que sucedió para la melatonina, las concentraciones de 5HT en el TGI de
la trucha fueron superiores en la pared de los diferentes tejidos evaluados, con respecto a la
porción de mucosa, con excepción del estómago donde los niveles medidos en pared
fueron incluso superiores a los de la mucosa. Cabe reseñar, sin embargo, la enorme
diferencia (unas cien veces más) del contenido de 5HT detectado a nivel de la pared de las
regiones intestinales con relación a la mucosa, lo que confirma datos presentados
previamente por Caamaño-Tubío et al. (2007), aunque con ciertas discrepancias relativas a
la distribución en las diferentes regiones intestinales. En mamíferos se ha descrito la
presencia de 5HT en los plexos nerviosos entéricos y las células enterocromafines de la
mucosa, siendo esta capa la que contiene el 95% de la 5HT intestinal (Gershon, 1982;
Tyce, 1990; Sanger, 2008; Bertrand y Bertrand, 2010). En cambio, en teleósteos existen
datos contradictorios, ya que si bien algunos estudios describen elevadas concentraciones
de 5HT en las células endocrinas de la mucosa (Domeneghini et al., 2000), en otros se
demostró que esta puede ser liberada desde el tejido intestinal carente de células
enterocromafines (Anderson et al., 1991). En ciclóstomos y algunos teleósteos, además, se
ha descrito que estas células están ausentes (El-Salhy et al., 1985; Anderson y Cambell,
1988; Yui et al., 1988), lo que añade controversia a los resultados hallados en el presente
estudio. Estos datos sin embargo, concuerdan totalmente con los presentados recientemente
por Caamaño-Tubío et al. (2007), quienes asocian la elevada concentración de 5HT
intestinal a su extensa presencia en fibras nerviosas de la pared muscular.
Teniendo en cuenta los resultados discutidos previamente, uno de los objetivos que
se planteó en nuestro trabajo fue identificar los tipos celulares implicados en la síntesis de
melatonina gastrointestinal, así como su asociación con células serotoninérgicas. Para ello
se emplearon técnicas inmunohistoquímica con anticuerpos anti-5HT, anti-melatonina y
anti-AANAT. Con respecto a la localización de células 5HT-ir, éstas se observaron en
todas las zonas del TGI estudiadas (estómago, ciegos pilóricos, intestino medio e intestino
posterior), siendo su densidad mayor en la región del intestino medio. En base a su
morfología, los tipos celulares asociados a la 5HT-ir fueron clasificados como células
endocrinas, elementos fibrosos y células con morfología típicamente neuronal. Su
distribución varió de forma sustancial en las diferentes regiones y capas de la pared
digestiva. En el estómago, las células endocrinas se localizaron en las capas más internas
de la mucosa y a nivel de la submucosa (estrato compacto y glandular), mientras que en la
capa muscular solo se observaron elementos fibrosos 5HT positivos. En los ciegos los
elementos fibrosos (células y fibras nerviosas) se localizaron en la lámina propia, la
submucosa y la capa muscular, con casi nula presencia de inmunoreactividad en el epitelio
181
Discusión
de la mucosa. En el intestino se detectó presencia de 5HT en todas las zonas de la pared
digestiva (mucosa, submucosa y capa muscular). En la mucosa se observaron células
endocrinas positivas en el epitelio, así como células y elementos de morfología fibrosa en
la lámina propia. La presencia de elementos con morfología típicamente neuronal fue muy
evidente en la capa muscular del intestino medio y posterior, aunque este último contiene
menor densidad de células 5HT positivas tanto en la submucosa como en la capa muscular.
Por tanto, estos resultados confirman la presencia de 5HT-ir tanto en células
endocrinas como en fibras nerviosas de distribución diferente en la pared del tracto
intestinal. Las células endocrinas se localizan inmersas en la empalizada de la capa
epitelial de la mucosa y parecen corresponderse con células enterocromafines, en
concordancia con lo descrito previamente para esta misma especie (Caamaño-Tubio et al.,
2007). Por otro lado, se ha definido la presencia de elementos con morfología fibrosa y
neuronal que se corresponden con neuronas entéricas caracterizadas por una fuerte
proyección hacia la lamina propia (Watson, 1979; Anderson y Campbell, 1988; Beorlegui
et al., 1992) y, en algunos casos, con axones dirigidos hacia la capa muscular circular
(Anderson y Campbell, 1988). Estas características serían típicas de motoneuronas
implicadas en la regulación de la actividad de la musculatura circular y del epitelio
mucosal (Olsson y Holmgren 2001; Olsson, 2009). Además, se ha apreciado un cierto
gradiente decreciente en sentido anteroposterior en la inmunoractividad para la 5HT en el
TGI de la trucha arco iris, en concordancia con lo descrito para Oncorhynchus keta
(Balashov et al., 1992). Este resultado, sin embargo, es contrario al descrito en O. mykiss
por Caamaño-Tubio et al. (2007) quienes observan una mayor densidad de fibras
serotoninérgicas en la zona posterior del intestino. Estas diferencias podrían deberse al tipo
de disección realizada y/o condicionantes de las técnicas inmunohistoquímicas empleadas.
En nuestro estudio también se evaluó la presencia de células AANAT-ir, para lo
cual el anticuerpo utilizado (obtenido en conejo) fue validado previamente mediante
técnicas de western blot. Nuestro estudio se centró en la presencia de AANAT-ir en
intestino medio, evidenciándose una posible colocalización de AANAT-ir y 5HT-ir en
células de la capa de mucosa situadas en la base de las vellosidades intestinales. Ello pone
de manifiesto que las células endocrinas (posiblemente células enterocromafines) de la
mucosa del TGI de la trucha arco iris tienen potencial enzimático para llevar a cabo la
síntesis de melatonina. No existen antecedentes que describan la presencia de células
AANAT-ir a nivel intestinal de peces. Sin embargo los datos concuerdan con los obtenidos
de estudios histoquímicos utilizando anticuerpos anti-melatonina, que permitieron poner de
manifiesto la presencia de células inmunoreactivas a la melatonina en la mucosa de todos
los tejidos intestinales estudiados. Resultados similares para la 5HT han sido descritos en
ratones (Raikhlin y Kvetnoy, 1974; Raikhlin et al., 1978). Estos datos claramente apuntan
a las células enterocromafines de la mucosa intestinal como elementos implicados en la
síntesis local de melatonina. No obstante, teniendo en cuenta el carácter liposoluble de la
melatonina y su probable difusión en los tejidos circundantes a los que realizan su síntesis,
182
Discusión
el hecho de que apenas se observase inmunoreactividad a melatonina en las diferentes
capas submucosales, no permite excluir dicha posibilidad. Es más, los datos obtenidos con
los marcadores moleculares (expresión de genes de síntesis de melatonina) apuntan a que
dicha síntesis también tiene lugar en los plexos nerviosos submucoso y mientérico, así
como en las proyecciones de los mismos hacia la lámina propia y la capa de mucosa.
En definitiva, los resultados obtenidos apuntan hacia la colocalización de
inmunoreactividad para 5HT, AANAT y melatonina en las células enterocromafines de la
mucosa intestinal de la trucha arco iris, lo que refuerza a su vez la idea de una producción
local de melatonina en dichas células. Las discrepancias halladas entre la presencia de
expresión génica (mayoritaria en la capa de mucosa) y el contenido de melatonina
(ligeramente mayor en la pared intestinal) lleva a pensar que otros factores podrían estar
contribuyendo a la regulación de la producción, en términos cuantitativos, de la hormona.
El hecho de que el contenido de 5-HT sea también mucho mayor en la pared que en la
mucosa, permite especular con la posibilidad de que la disponibilidad de este sustrato
limite la cantidad de melatonina sintetizada. Esta hipótesis es apoyada también por la
existencia de elevados niveles del metabolito oxidativo de la 5-HT, el 5-HIAA, en la zona
de la pared, en contraste con niveles muy bajos del mismo en la mucosa. Ello indica que
existe una mayor tasa de utilización del neurotransmisor en las neuronas serotoninérgicas
que conforman los plexos nerviosos de la pared digestiva que en las células endocrinas y/o
elementos fibrosos ligados al epitelio de la mucosa.
El sistema hepato-bililiar y su contribución a la melatonina intestinal
El hígado y la vesícular biliar son órganos anexos al tracto digestivo que podrían
contribuir de una forma importante a la presencia de melatonina en el tejido y el lumen
intestinal. En mamíferos se ha mostrado que el nivel de melatonina encontrado en la
vesícula biliar es 10 a 40 veces superior al encontrado en la mucosa intestinal (Huether et
al., 1998; Messner et al., 2001; Tan et al., 1999). Teniendo en cuenta que el hígado es el
principal órgano de metabolización de la melatonina circulante, estos datos sugieren que
una parte importante de la melatonina que llega al hígado a través de la circulación enterohepática, escapa a la inactivación enzimática y pasa a formar parte de la bilis (Bubenik et
al., 2000b). En nuestro estudio en trucha arco iris, hemos observado que el contenido de
melatonina en la bilis fue muy elevado, en concreto unas 10 veces mayor que el respectivo
contenido en plasma sanguíneo durante el día y unas 3 veces mayor que el presente durante
la noche. También se hallaron valores elevados en el contenido de melatonina en el tejido
que conforma la pared de la vesícula biliar, lo que parece estar en relación con la difusión
de melatonina desde la bilis al tejido circundantes. Los valores hallados en bilis de trucha
son similares a los observados por Herrero et al. (2007) en la lubina.
Aunque no se han detectado diferencias dia-noche en el contenido de melatonina en
bilis, la cantidad de melatonina liberada al lumen intestinal con la secreción biliar supone
abrir la posibilidad a que una gran parte de esa melatonina entre en contacto con el epitelio
183
Discusión
de la mucosa y se internalice por todo el tejido que conforma la pared del TGI. Ese aporte
sería mayor en las zonas del intestino proximal y medial, regiones estas que reciben de
forma directa el vertido biliar, y estaría asociada principalmente a los momentos postingesta dado el papel activador que tiene esta actividad en la secreción biliar. De hecho, en
mamíferos se ha observado que la ingesta de alimento condiciona los niveles de
melatonina en bilis (Messner et al., 2001), asociándose la secreción de melatonina de
origen biliar con funciones protectoras del epitelio intestinal durante los procesos
digestivos (Tan et al., 1999). En la presente memoria se discutirán más adelante los
resultados obtenidos en el Trabajo experimental 4 en relación con el efecto de la ingesta
sobre el contenido biliar e intestinal de melatonina en la trucha arco iris.
Nuestros datos confirman también que puede existir una importante síntesis de
melatonina en el hígado, dado que en este órgano se han monitorizado la expresión de
genes (aanat1, aanat2 y hiomt) de enzimas implicados en la síntesis de la hormona, con
valores de expresión relativa incluso superiores a los observados en el tejido intestinal. En
cambio los niveles de melatonina detectados en hígado, expresados por unidad de peso
tisular, fueron más bajos que los hallados en intestino. Es evidente, también, que a la hora
de valorar la potencial contribución del hígado como tejido productor de melatonina hay
que tener en cuenta el gran tamaño de este órgano, así como su propia capacidad para
metabolizar parte de la melatonina sintetizada localmente. En todo caso, nuestros datos
claramente apuntan a que la elevada concentración de melatonina presente en la bilis de la
trucha arco iris es de origen hepático, lo que no excluye que además la melatonina
producida en el hígado pueda realizar funciones locales, como por ejemplo en la regulación
metabólica y/o en procesos de detoxificación.
En contraste con los valores de melatonina, las concentraciones de 5HT en la
vesícula biliar y en el hígado fueron los más bajos de todo el TGI. Estos resultados
responden a lo previsible, dado que se ha descrito que hasta un 80% de la 5HT producida
en las células enterocromafines es metabolizada por la enzima MAO en el hígado (Gilis,
1985), lo que implica el drástico descenso del contenido hepático de esta amina. Por tanto,
parece que en circunstancias normales el hígado podría controlar activamente la
concentración de 5HT liberada a la circulación portal desde los gránulos enterocromafines
intestinales (Verbeuren, 1989), siendo los productos metabólicos excretados en parte en la
bilis (Tyce y Owen, 1968).
Los estudios llevados a cabo en peces sobre el metabolismo enterohepático de 5HT
se han centrado principalmente en los enzimas relacionadas con el catabolismo aminérgico
(Yoshino et al., 1984; Chen et al., 1994; Nagai, 1995,1999). En este sentido, en la trucha
arco iris se ha descrito que la forma de la MAO presente en peces tiene una baja homología
con las dos isoformas conocidas en mamíferos (Chen et al., 1994), mostrando su mayor
actividad tanto en el intestino como en el hígado (Edwards et al., 1986). Ello justificaría los
bajos niveles de 5HT encontrados en el hígado de la trucha arco iris, en contraste con los
184
Discusión
niveles relativamente elevados de su metabolito oxidativo hallados tanto en el hígado como
en la vesícula biliar. De forma complementaria, también se observa un gradiente
decreciente en sentido antero-posterior en el contenido intestinal de 5HIAA, tal y como se
ha observado para la 5HT y la melatonina. Además, los niveles de 5HIAA fueron siempre
más elevados en las porciones de pared con respecto a las de mucosas en cada zona del
TGI, en fuerte relación con los niveles elevados de 5HT y de melatonina. Todo ello apoya,
una vez más, la posibilidad de que la dinámica celular de la 5HT pueda ser un factor
importante en la regulación de la producción de melatonina en sistema enterohepático.
Regulación de la producción diaria de melatonina intestinal por el fotoperiodo y el
alimento.
Variaciones diarias en el contenido intestinal de melatonina e influencia circadiana
En la mayoría de los vertebrados la melatonina es producida de forma rítmica en
órganos típicamente asociados a la formación de la hormona, tales como la glándula
pineal y la retina de los mamíferos. En los peces estas estructuras tienen características
fotorreceptoras, por lo que es la luz la que, actuando de forma directa sobre las células
fotorreceptores pineales y retinales, provoca una inhibición de la síntesis de la hormona y
modula sus ritmos diarios (Cahill et al., 1996; Falcón et al., 2007). El patrón rítmico
circulante de melatonina tiene un papel destacado en la organización circadiana de los
organismos, dado que permite el ajuste temporal de numerosos procesos rítmicos a nivel
diario y estacional (Pévet et al., 2006; Goldman, 2001; Falcón et al., 2010).
Es conocido que el sistema circadiano contribuye al mantenimiento del ritmo diario
de melatonina, dado que incluso en ausencia de cambios ambientales el ritmo de síntesis de
la hormona permanece en estructuras tales como el órgano pineal y la retina (Reiter, 1993;
Falcón, 1999). En el caso de los mamíferos, es el reloj circadiano principal localizado en el
NSQ del hipotálamo el que mantiene el ritmo endógeno de síntesis de melatonina en la
glándula pineal (Reiter, 1993), mientras que en los peces esa endogenia del ritmo de
melatonina se mantiene gracias a la existencia de osciladores intrapineales e intraretinales
(Falcón, 1999). En este sentido, los órganos fotorreceptores de algunos salmónidos, en
particular los de la trucha arco iris, parecen constituir una excepción dentro de los
teleósteos ya que carecen de mecanismos circadianos que regulen la síntesis de melatonina
(Gern y Greehouse, 1988; Falcón et al., 1992; Falcón, 1999). Trabajos recientes de nuestro
grupo han mostrado la presencia de oscilaciones en genes constitutivos del reloj circadiano
en el hipotálamo y la retina de la trucha arco iris (López-Patiño et al., 2011b), pero todavía
se desconoce su implicación en la síntesis rítmica de melatonina. En base a ello, uno de los
objetivos de la presente tesis doctoral ha sido explorar la existencia de variaciones rítmicas
diarias en la síntesis de melatonina en el intestino de la trucha arco iris, así como una
potencial implicación del sistema circadiano en su regulación.
185
Discusión
En el trabajo experimental 3 incluido en la presente memoria, se detallan las
variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino medio y posterior, tanto en
condiciones lumínicas normales (12L:12D) como bajo situación de oscuridad constante
(D:D). Además, se cuantificó la expresión génica de las enzimas aanat1, aanat2 y hiomt,
en estas mismas condiciones. Los resultados obtenidos apuntan a que no existen ritmos
significativos en los niveles intestinales de melatonina, si bien tanto en el intestino medio
como el posterior se observan incrementos puntuales durante la segunda mitad del día y la
segunda parte de la noche (máximos a ZT9 y ZT 18, tomando como ZT0 el momento de
encendido de las luces). Estos datos contrastan con el ritmo diario de los niveles de
melatonina observado en el plasma, con fuertes incrementos durante la fase nocturna
claramente dependientes de la síntesis de la hormona a nivel pineal (Ceinos et al., 2005).
Ello es prueba de la pobre correlación existente entre los perfiles rítmicos de melatonina
plasmática e intestinal, lo que apoya la independencia de ambos parámetros así como en
los mecanismos que permiten su regulación.
Por otra parte, se observó un perfil rítmico diario en el contenido de 5HT intestinal
que fue muy similar en ambos segmentos estudiados (medio y posterior). Este perfíl podría
definirse como contrario al descrito para la melatonina, dados los bajos niveles nocturnos
de 5HT en relación a los niveles relativamente elevados de la hormona en mitad del noche.
Para nuestro conocimiento no hay estudios que reflejen variaciones diarias del contenido
intestinal de 5HT, mientras que para la melatonina se ha descrito en base a procedimientos
inmunohistológicos la ausencia de cambios en el contenido intestinal de la rata (Bubenik,
1980), así como en la circulación periférica (venas y arterias de la circulación portal
hepática) en el cerdo (Bubenik et al., 2000b). No obstante, en este último estudio se detalla
la existencia de picos de melatonina en la circulación periférica tras los periodos de
ingesta, lo que pone de manifiesto una potencial regulación de la melatonina
enterohepática por el alimento (Bubenik et al., 2000b). En nuestro caso, los peces incluidos
en el experimento fueron alimentados con normalidad (a ZT 3), incluso en el propio día de
muestreo. Por tanto, es probable que el incremento diurno de los niveles de melatonina
fuese provocado (directa o indirectamente) por un efecto del alimento ingerido por los
peces, e incluso no es descartable que ello pudiese ser causa del fuerte incremento diurno
hallado en los niveles de 5HT intestinal.
Tal y como sería de esperar, bajo condiciones de oscuridad constante (D:D) los
niveles plasmáticos de melatonina se mantuvieron elevados de forma continua, aunque se
apreció un ligero aumento al comienzo de la noche subjetiva (CT12, CT18) en relación con
los periodos de día subjetivo. Estos datos están de acuerdo con la idea de que en la trucha
arco iris el ciclo L:O es el principal determinante de la producción rítmica de melatonina
pineal y de su secreción al plasma, mientras que en ausencia de cambios lumínicos no se
vislumbra un determinante circadiano de dichos procesos (Gern et al., 1992; Falcón, 1999).
186
Discusión
A nivel del intestino, en situación de D:D se midió el contenido de melatonina
únicamente en la región media, observándose un perfil diario diferente al observado en
condiciones normales (L:D). Así, no se halló el incremento diurno que sí estaba presente
en los animales bajo L:D, mientras que fue evidente un pico durante la noche subjetiva,
aunque con un máximo adelantado 3 horas (CT15) con respecto a lo observado en L:D
(ZT18). Dado que estos animales, a diferencia de los muestreados bajo el ciclo L:D, no
fueron alimentados en el día de muestreo, es posible que la ausencia de valores elevados
durante el día subjetivo obedezca a la falta de efecto del alimento o de los procesos
digestivos que siguen a la ingesta del mismo, incluyendo la liberación de bilis desde la
vesícula biliar. Por otra parte, la permanencia de un pico nocturno bajo situación de D:D y
su adelanto temporal en relación al detectado bajo L:D, nos lleva a hipotetizar la existencia
de un ritmo endógeno en el contenido de melatonina intestinal, cuyos valores máximos
están confinados al periodo de oscuridad del ciclo diario. En todo caso, se trataría de un
ritmo débil, dado, la reducida amplitud y duración del pico nocturno.
De forma complementaria, la expresión de aanat1, aanat2 y hiomt fue también
evaluada bajo situaciones de L:D y D:D. En situación de ciclo lumínico normal, tanto la
aanat1 como la hiomt mostraron variaciones rítmicas diarias en intestino medio y posterior
con un claro pico nocturno cuyos niveles máximos fueron detectados a ZT18, en
coincidencia con el máximo detectado para melatonina. En cambio, la aanat2 solo se
expresó de forma rítmica en intestino medio con características similares a las mostradas
por aanat1. La falta de variación rítmica de la expresión aanat2 en intestino posterior no
tiene una clara explicación fisiológica, al menos con los datos disponibles. Aunque es
posible que dicho resultado pueda derivar de un problema metodológico, cabe mencionar
que todas las muestras fueron extraídas en paralelo y ensayadas en las mismas placas en el
el análisis de qPCR, lo que en principio descarta un posible error técnico.
La expresión enzimática en condiciones de D:D solo fue evaluada en intestino
medio, observándose un perfil similar al encontrado en condiciones normales de luz, si
bien se detectó un ligero adelantamiento de 3 horas en el pico de expresión para cada uno
de los genes (aanat1, aanat2 y hiomt) analizados (D:D ZT15 vs L:D ZT18). En todo caso,
el momento temporal del pico hallado en la expresión de las enzimas coincidió con el
observado para los niveles de melatonina, lo que apoya la existencia de un ritmo circadiano
en la síntesis de melatonina en el intestino medio de trucha arco iris.
En vertebrados, incluidos los teleósteos, es conocido que las variaciones rítmicas
diarias de melatonina en retina y órgano pineal están determinadas principalmente por la
actividad rítmica de la enzima AANAT, de modo que una alta expresión de esta conlleva
incrementos de los niveles de la hormona (Iuvone et al., 2005; Klein, 2007). En cambio la
HIOMT no parece tener un papel limitante, aunque se han descrito variaciones diarias en
su actividad en codorniz (Fu et al., 2001) y algunas especies de roedores (Gauer et al.,
1999; Ribelayga et al., 1999). En tejidos periféricos, los datos existentes acerca del papel
187
Discusión
limitante de los enzimas implicados en la síntesis de melatonina son mucho más escasos,
sobre todo en los peces. En este sentido, estudios recientes de Velarde et al. (2010a)
demostraron la existencia de ritmos de expresión de aanat2 en el intestino posterior y el
hígado del carpín, así como de la hiomt en hígado e intestino anterior y posterior. Mientras
que la expresión aanat2 en el hígado presentó un pico durante la fase de luz, en el intestino
los máximos se localizaron durante la noche. En el caso de la hiomt, los valores máximos
del ritmo se correspondieron con la oscuridad en todos los tejidos periféricos estudiados.
Estos autores también aportaron evidencias de la persistencia del ritmo de aanat2 bajo
condiciones lumínicas constantes (D:D y L:L), con alteración de la acrofase en situación de
inversión del ambiente lumínico, lo que demuestra su independencia del fotoperiodo y su
naturaleza circadiana. Existen también algunos datos sobre la existencia de variaciones
rítmicas de la actividad AANAT1 en intestino e hígado del carpín (Velarde, 2010). Los
resultados de todos estos estudios coinciden básicamente con los obtenidos en nuestros
experimentos en trucha arco iris, que demuestran: i) la existencia de actividad rítmica
diaria en los genes que codifican para los principales enzimas de la síntesis de melatonina
en el tejido intestinal, con máximos localizados durante la noche en peces expuestos a un
ciclo L:D; ii) la persistencia de dichos ritmos en condiciones de D:D, lo que implica que
son independientes del fotoperiodo y que pueden estar generados por osciladores
circadianos.
En los peces la información disponible sobre los mecanismos circadianos a nivel
periférico es escasa. En el carpín se ha demostrado la existencia de ritmos de expresión de
algunos genes (cry, per) que forman parte de la maquinaria molecular del reloj circadiano
(Velarde et al., 2009a) y se ha hipotetizado que la síntesis de melatonina en tejidos
relacionados con la actividad digestiva (intestino, hígado) podría estar bajo el control de
relojes circadianos periféricos cuya oscilación sería independiente del fotoperiodo
ambiental. A la hora de definir factores no-fóticos que contribuyan al ajuste de los
osciladores localizados en el tracto digestivo, no cabe duda de que la ingesta de alimento
debe ser considerada como un parámetro primario. En este sentido, la existencia y
caracterización de osciladores encarrilados por el alimento (hora de alimentación,
composición de la ingesta) está recibiendo creciente atención no solo desde un punto de
vista descriptivo, sino fundamentalmente por lo que supone de sistema adaptativo que
permite al organismo anticipar cambios en los procesos digestivos y metabólicos
(Mistlberger, 2006; Mendoza, 2007; Zvonic et al., 2007). En nuestro estudio, la
alimentación de los peces durante la fase de luz en el día de muestreo claramente afectó a
los valores diurnos de melatonina, efecto que fue independiente de cambios en la expresión
génica. Con respecto al pico nocturno hallado tanto en los niveles de melatonina como en
la expresión de los diversos genes, no es posible definir si el adelanto del mismo bajo
situación de D:D se debió a la ausencia de alimento en el día de muestro o a la ausencia de
ciclo L:D per se. En este sentido harán falta estudios más precisos que definan la acción
del horario de alimentación sobre el ajuste de los ritmos de síntesis de melatonina
intestinal.
188
Discusión
Efecto del ayuno prolongado y de la realimentación sobre las variaciones diarias del
contenido de melatonina en el intestino de la trucha.
Estudios realizados en el cerdo han demostrado que la ingesta de alimento puede
provocar un aumento a corto plazo (entre 1 a 5 horas) en los niveles de melatonina
intestinal (Bubenik et al, 1996), efecto que fue similar al provocado por la privación de
alimento durante 48 horas en el ratón (Bubenik et al., 1992). En el caso de la trucha arco
iris, los datos discutidos anteriormente parecen indicar que la alimentación puede modular
el contenido intestinal de melatonina, con incrementos del mismo asociados a los
momentos posteriores a la ingesta. En un intento de comprender mejor el papel del
alimento sobre las variaciones diarias de la melatonina intestinal, hemos desarrollado un
experimento en el que se evaluó el efecto de la privación de alimento durante 7 días
consecutivos sobre las variaciones diarias del contenido de melatonina en el intestino
medio y posterior, así como en el plasma sanguíneo.
Los datos obtenidos indican que los animales ayunados presentaron un aumento de
los niveles de melatonina plasmática durante el día (18:00 h) y gran parte de la noche
(21:00 h y 00:00 h), en comparación con el grupo control alimentado con normalidad a las
11.00 horas. De forma paralela, a nivel intestinal la situación de ayuno produjo un fuerte
incremento de los niveles de melatonina en el periodo comprendido entre mediodía (14:00
h) y medianoche (00:00h), tanto en intestino medio como en el posterior. Dicho
incremento fue atenuado cuando los peces ayunados recibieron alimentos durante varios
días. Estos resultados concuerdan con lo descrito por Bubenik et al. (1996) en el ratón y
claramente ponen de manifiesto que el perfil diario de variación de los niveles de
melatonina intestinal puede estar condicionado, en gran medida, por la presencia de
alimento en momentos puntuales del ciclo diario y/o por el estado fisiológico del animal, el
cual varía sustancialmente en situación de ayuno.
La existencia de efectos similares de la ingesta de alimento y del ayuno prolongado
provocando aumentos en el contenido intestinal de melatonina, es un resultado cuanto
menos llamativo. Por un lado, parece que el alimento per se puede inducir un aumento de
la síntesis de melatonina, aspecto éste que será tratado posteriormente. Por otro lado, es
evidente que el ayuno podría condicionar las variaciones rítmicas de la producción
intestinal de melatonina y alterar los cambios diarios en su contenido. No obstante, y
teniendo en cuenta los datos de los experimentos anteriores, creemos que lo más probable
es que parte de la melatonina que se acumula a nivel intestinal en situación de ayuno
proceda de la bilis. En este sentido, es conocido que en las fases de ayuno existe un
proceso de concentración de la bilis en la vesícula biliar, con reabsorción y reciclado de
metabolitos, incluyendo la melatonina (Sewerynek et al., 1996; Tan et al., 1999; Reiter y
Tan, 2003). Asimismo, en periodos de ayuno prolongado se ha demostrado que la
secreción de bilis está influenciada por procesos ultradianos y/o circadianos (Camello et
al., 1991; Madrid, 2006) que permiten su liberación paulatina al lumen intestinal. Por tanto,
189
Discusión
parece probable que la secreción biliar proporcionase melatonina al lumen intestinal de las
truchas ayunadas, siendo ésta acumulada parcialmente en los tejidos intestinales.
En un experimento similar, nuestro grupo había observado que el ayuno prolongado
redunda en un descenso en la síntesis de melatonina en el órgano pineal de la trucha arco
iris, con fuertes caídas en el contenido de melatonina y en la actividad AANAT pineal
(Ceinos et al., 2008). Resultados similares fueron aportados por estudios llevados a cabo en
la glándula pineal (Holloway et al., 1985; Welker y Volrath, 1984) y a nivel del plasma
sanguíneo (Chick et al., 1985) en la rata. Si la síntesis de melatonina en la glándula pineal
de la trucha desciende en situación de ayuno, ¿cuál es entonces la causa del aumento de los
niveles de la hormona en el plasma sanguíneo? De los datos obtenidos en nuestros
experimentos en la trucha arco iris parece posible que la fuente que proporcione niveles
elevados de melatonina a la circulación sanguínea durante el ayuno sea el TGI. Esta
posibilidad había sido apuntada en los experimentos realizados con truchas
pinealectomizadas, en las cuales se siguió detectando una cierta concentración de
melatonina en plasma, aunque con valores menores que en los peces no pinealecomizados.
Dado que la pinealectomía no afectó al contenido intestinal de melatonina, es posible que
una parte de ésta contribuyese a los valores basales de melatonina plasmática. En la
situación actual, el incremento continuado en los niveles intestinales de melatonina durante
el ayuno podría desembocar en una mayor difusión de la hormona intestinal hacia los
capilares sanguíneos con elevación de sus niveles plasmáticos. Una explicación alternativa
sería que los peces ayunados presenten un descenso en el aclaramiento plasmático de la
melatonina debido a una reducción en la capacidad metabólica hepática, lo cual ha sido
también sugerido por otros autores en situaciones similares de ayuno (Bubenik et al, 1992).
Regulación de la síntesis de melatonina por la ingesta y el tránsito alimenticio en el tubo
digestivo.
A juzgar por los experimentos anteriores, la de alimentación de los peces induce un
aumento en los niveles de melatonina en el intestino. No obstante, no está claro si este
efecto se debe a un incremento en la síntesis de la hormona o bien responde a otros
factores como, por ejemplo, el aporte de melatonina procedente de la secreción biliar que
se activa en el periodo de ingesta. Para profundizar en estos aspectos, se procedió a evaluar
los cambios en los niveles de melatonina en diferentes regiones intestinales y el hígado, así
como en la bilis y en el contenido del lumen intestinal, asociados al momento de ingesta y
durante el tiempo de tránsito del alimento por el tubo digestivo (periodo post-ingesta).
También se estudió la existencia de alteraciones en la expresión de los enzimas implicados
en la síntesis de melatonina en intestino medio.
Tras la alimentación se produjo un aumento del contenido de melatonina en todos
los tramos intestinales, aunque el efecto fue más consistente, tanto en amplitud de cambio
como en su persistencia en el tiempo (desde 120 a 360 min post-ingesta), en las regiones
anterior y media del intestino. Estos resultados concuerdan con los descritos previamente
190
Discusión
para mamíferos (Rice et al., 1995; Bubenik et al., 1996). En el cerdo, Bubenik et al. (1996)
propone que el aumento en los niveles de melatonina se correlaciona con el
desplazamiento del alimento por el tracto digestivo. Esta respuesta sería diferencial a lo
largo del tracto, variando en relación al grado de desarrollo de la capa muscular. Así, tanto
el esófago como el estómago, con un mayor desarrollo de la capa muscular, responden en
menor medida, mientras que los mayores efectos se desencadenan en la región del íleon y
la zona distal del intestino, con menor desarrollo de la capa muscular (Bubenik et al.,
1996). En teleósteos, los estudios al respecto son casi inexistentes, aunque Herrero et al.
(2007) en la lubina muestra un ligero incremento en el contenido intestinal de melatonina a
los 180 minutos post-ingesta.
Del mismo modo que la presencia de alimento en el TGI provocó el incremento de
los niveles de melatonina, también indujo la expresión de las enzimas aanat1, aanat2 y
hiomt en intestino medio. Dicho efecto fue visible ya a los 20 minutos tras la ingesta y
disminuyó de manera muy rápida en el caso de la hiomt (ya no apareció a los 60 min),
mientras que fue más persistente para la aanat1 (visible hasta los 120 min) y aanat2
(visible hasta los 240 min). Tampoco estuvo presente en los animales que no recibieron
alimento, al igual que ocurrió con los cambios en los niveles de melatonina, por lo que
puede concluirse que la ingesta per se estimula la síntesis intestinal de melatonina debido,
al menos en parte, a un aumento en la disponibilidad de los enzimas necesarios para
transformar la 5HT en melatonina, en particular de las isoenzimas AANAT1 y AANAT2.
Estos resultados permiten concluir que existe una activación de la síntesis de
melatonina en el tejido intestinal en respuesta a la ingesta de alimento y al tránsito del
mismo por el tubo digestivo. Los mecanismos implicados en esta respuesta son todavía
desconocidos, pero el hecho de que la expresión de los enzimas de síntesis de melatonina
aumente de forma muy rápida (ya visible a los 20 min tras la ingesta) lleva a sospechar que
existe una estimulación del proceso de síntesis por mecanismos nerviosos y/o endocrinos,
los cuales podrían ser similares a los que regulan otros aspectos de la actividad digestiva y
que implican a una variedad de factores nerviosos y humorales (Hansen, 2003; Olsson,
2009; 2011). Por otro lado, es posible que el aporte de componentes metabólicos en la
ingesta necesarios para la síntesis de melatonina favorezca este proceso durante el periodo
post-ingesta. En este sentido, es conocido que la administración de L-Trp resulta en un
aumento del contenido de melatonina en el intestino de roedores (Huether et al., 1992;
Yaga et al., 1993). También en la trucha arco iris se ha descrito que la incubación de
fragmentos intestinales en un medio suplementado con L-Trp induce un aumento de la
liberación de melatonina al medio, indicando una mayor síntesis de la hormona en el tejido
(Lepage et al., 2005a). Todo ello, junto con los datos obtenidos en el presente trabajo
experimental nos han llevado a valorar el efecto de la administración de L-Trp sobre la
producción intestinal de melatonina (trabajos 5 y 6), lo que será discutido posteriormente.
191
Discusión
Como era de esperar, el volumen de bilis en la vesícula biliar descendió de forma
paulatina durante el periodo post-ingesta. Esta respuesta nos indica el grado de vaciado de
la vesícula biliar que, estimulada por la ingesta y el tránsito digestivo, proyecta su
contenido a la región inicial del intestino anterior.
De forma complementaria al vaciado biliar, el contenido de melatonina en el fluido
presente en el lumen intestinal se incrementó significativamente con el tiempo postingesta. La composición de este fluido es muy compleja ya que contiene la suma del
alimento ingerido y/o parcialmente digerido, jugos gástricos y enzimas digestivos.
Además, tras la ingesta contiene la bilis expulsada desde la vesícula biliar, lo que fue
evidente en función del color amarillo-verdoso que presentó el fluido luminal. Nuestros
datos midiendo los niveles de melatonina presentes en el fluido luminal revelan que tras la
ingesta se produce un incremento en los mismos (entre 120 y 240 min tras la ingesta) como
consecuencia del aporte de melatonina de origen biliar. Este efecto tuvo lugar sin apenas
cambios en la concentración de melatonina a nivel hepático ni en la bilis. Por lo tanto,
parece descartable un efecto de la ingesta estimulando la producción hepática de
melatonina y/o su concentración en la bilis, ya que los datos indican claramente que es el
volumen creciente de bilis secretada al intestino anterior tras la ingesta lo que induce un
aumento del nivel de melatonina en el contenido intestinal.
En definitiva, los resultados obtenidos en el trabajo 4 y precedentes demuestran que
el alimento estimula la síntesis local de melatonina en el tracto digestivo, pero además
estimula la liberación al tubo digestivo de bilis que contiene una elevada concentración de
melatonina. Es bien sabido que la liberación de bilis ocurre en respuesta a componentes
neurales (reflejos parasimpáticos activados por señales olfativas/gustativas del alimento,
estimulación de mecanorreceptores y quimiorreceptores de la pared digestiva,..) y por
hormonas gastrointestinales (CCK, gastrina, etc.), algunos de los cuales también podrían
participar en la estimulación del proceso de síntesis de melatonina en el tejido intestinal.
El incremento post-ingesta de la cantidad de melatonina tanto en el lumen como en el
tejido intestinal, también sugiere que esta hormona podría ser uno más de los mecanismos
que regulan la actividad digestiva. De hecho, en roedores se ha descrito que la inyección
i.p. de melatonina provoca un incremento de la secreción de amilasa al fluido intestinal y
en la producción de bicarbonato (Sjoblom y Flemstrom, 2003; Jaworek et al., 2004) y se ha
propuesto que puede modular el efecto regulador de la 5HT en la actividad digestiva
(Bubenik et al., 1994). En el carpín, la melatonina también parece modular la motilidad
intestinal (Velarde et al., 2010b), resultado que concuerda con lo hallado en la trucha arco
iris (Trabajo 7).
Efecto de la administración de L-triptófano sobre la síntesis de melatonina a nivel
gastrointestinal. Relación entre síntesis de serotonina y de melatonina.
192
Discusión
Estudios in vivo del efecto de L-Trp administrado por vía oral (alimento enriquecido) o
parenteral (i.p.)
Como ya se mencionó anteriormente, es posible que parte de los efectos
estimuladores de la ingesta sobre la síntesis de melatonina a nivel intestinal provengan de
una mayor disponibilidad del aminoácido L-Trp, precursor en dicho proceso de síntesis. En
concordancia con ello, los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral ponen de
manifiesto que la administración de L-Trp estimula la producción de melatonina en el TGI,
tanto in vivo como in vitro.
Tal y como se muestra en el Trabajo experimental 5, cuando se administraron dietas
suplementadas con L-Trp (0,5 y 2,5 g /100 g pienso) durante 7 días, se observó un
incremento en los niveles de melatonina en diferentes regiones del TGI: ciegos pilóricos,
intestino anterior, medio y posterior, así como en el hígado y la bilis. En general los efectos
fueron dependientes de la concentración de L-Trp y del tiempo post-ingesta, observándose
efectos mayores y más rápidos con la concentración más alta del aminoácido. Así, mientras
que a una hora tras la ingesta solo se hallaron efectos con la dosis mayor de L-Trp, a las
tres y cinco horas se observaron con las dos dosis estudiadas en la mayor parte de los
tejidos intestinales y en el hígado. A nivel de la bilis solo se observaron incrementos con la
dosis mayor de L-Trp, los cuales fueron independientes del tiempo post-ingesta.
Un dato interesante de este experimento fue que, en los grupos que recibieron dieta
sin suplementar con L-Trp, la presencia de alimento provocó un aumento de los niveles de
melatonina en todos tejidos estudiados, incluido el hígado. Este efecto fue evidente en los
peces muestreados a las 3 y/o 5 horas en comparación con los muestreados a 1 hora.
Comparativamente con estos grupos, aquellos que recibieron el L-Trp en el pienso
mostraron, en general, un incremento todavía mayor en el contenido en melatonina. Todo
ello claramente muestra la acción de dos factores complementarios: por un lado, el
alimento per se que induce la síntesis intestinal y hepática de melatonina, corroborando lo
descrito en el trabajo 4. Por otro lado, la presencia de concentraciones elevadas de L-Trp
en el alimento que potencian el efecto estimulador del alimento sobre la síntesis enterohepática de melatonina. Es posible que a estos efectos también contribuyese la melatonina
secretada en la bilis al tracto digestivo. De hecho, la concentración de hormona en la bilis
se incrementó tras la ingesta, en particular en los peces que recibieron dieta enriquecida en
L-Trp.
El incremento de melatonina intestinal tras la administración de L-Trp por vía oral
no tuvo reflejo en los niveles plasmáticos de la hormona, en contraste al incremento
descrito en estudios realizados en la trucha arco iris (Lepage et al., 2005a), aunque siendo
similar a lo observado en la lubina (Herrero e tal., 2007). Esta discrepancia de resultados
entre estudios podría estar relacionada con las diferentes concentración de L-Trp utilizadas
y/o los tiempos en los que se evaluaron los efectos. Incluso Lepage et al. (2005a) describe
que las dietas suplementadas con L-Trp incrementan los valores plasmaticos de melatonina
193
Discusión
durante el día, pero no los nocturnos. Aparentemente nuestros resultados descartan que en
esta situación de estimulación de la síntesis de melatonina intestinal pueda haber una
contribución significativa de dicha melatonina al plasma sanguíneo durante el periodo
diurno, en contraste a lo que se hemos descrito en situación de ayuno prolongado. Es
posible, por tanto, que la transferencia de melatonina desde el intestino al plasma, o bien su
permanencia en este compartimento (aclaramiento plasmático), estén influenciados por el
estado metabólico/nutricional del animal.
De forma complementaria, el enriquecimiento de las dietas con L-Trp también
provocó un incremento dosis-dependiente en la concentración de 5HT en la mayoría de los
tejidos intestinales analizados, especialmente evidente con la concentración mayor del
aminoácido. Además, el incremento en el contenido de 5HT dependió del tiempo postingesta, aunque no fue tan notorio como para la melatonina. En peces se conoce muy poco
sobre la regulación metabólica de la 5-HT intestinal, aunque estudios recientes en la lubina
demostraron un aumento progresivo de la 5-HT plasmática tras la ingesta de dietas
suplementadas con L-Trp, achacándose este efecto a una mayor liberación de 5HT desde el
intestino (Herrero et al., 2007). En los mamíferos, sin embargo, es conocido que tanto la
ingestión oral de triptófano, como su ausencia en la dieta alteran la actividad
serotoninérgica (Furness y Costa, 1977; Hansen y Witte, 2008), en concordancia con lo
mostrado en nuestro estudio.
Por otro lado, también presentamos evidencias de que el alimento per se (sin
suplemento con L-Trp, peces control) desencadena la presencia de una mayor
concentración de 5HT intestinal, lo que fue muy notorio en los ciegos pilóricos y el
intestino medio (valores a 3 y 6 horas post-ingesta fueron superiores a los de 1 hora). En
mamíferos se sabe que diversos nutrientes presentes en la dieta (ácidos grasos de cadena
larga, péptidos, glucosa) y estímulos químicos (ácidos gástricos) y sensoriales relacionados
con la acción digestiva actúan estimulando la actividad serotoninérgica intestinal (Gershon
y Tack, 2007, Bertrand y Bertrand, 2010). Nuestros datos sugieren que ello también parece
ocurrir en el TGI de la trucha arco iris, promoviendo una mayor disponibilidad celular de
5HT. La ingesta también influyó en los niveles del principal metabolito de la 5HT, el
5HIAA, observándose una disminución de sus niveles con las dietas ricas en L-Trp. Los
niveles de este metabolito en el tejido intestinal son más bajos que los de 5HT dado que es
retirado rápidamente hacia el fluido intestinal y la vasculatura portal (Legay et al., 1983).
Aparentemente, de nuestros datos se desprende que esa eliminación del 5HIAA podría ser
acelerada en situaciones en las que hay mayor concentración celular del neurotransmisor.
No obstante, tampoco es descartable que la caída de los niveles de 5HIAA con la
administración oral de L-Trp acontezca por el uso alternativo de una parte de la 5HT
intestinal para la formación de mayores niveles de melatonina.
Cuando el L-Trp fue administrado por vía parenteral (i.p.) no produjo, en general,
cambios significativos en el contenido de melatonina y 5HT en las distintas secciones del
194
Discusión
TGI de la trucha, aunque una tendencia al aumento se observó en intestino posterior. Esta
ausencia de efectos claros contrasta enormemente con los incrementos hallados tras la
administración oral (dieta enriquecida) de L-Trp. Efectos similares han sido descritos en
mamíferos, en los que el incremento en los niveles plasmáticos de melatonina es mayor
cuando el L-Trp es administrado por vía oral que por inyección parenteral (Huether et al.,
1992). Además, en nuestro caso hemos constatado que la administración i.p. de 5HTP sí
fue eficaz al estimular los niveles de melatonina en todas las secciones intestinales
estudiadas, así como en el hígado y el contenido biliar. Estos cambios inducidos por el
5HTP fueron acompañados de incrementos significativas en el contenido de 5HT y de su
metabolito, el 5HIAA. Sin embargo ni los niveles de la amina ni los de su metabolito
variaron tras la administración i.p. de L-Trp.
Los resultados derivados de la administración i.p. de L-Trp y de 5HTP nos llevan a
hipotetizar varios mecanismos posibles para explicar los efectos obtenidos. En primer
lugar, es posible que la captación celular y/o biodisponibilidad de L-Trp no sea tan eficaz
cuando se administra el aminoácido en la dieta como cuando se administra por vía
parenteral, lo que podría estar en relación con el transportador del aminoácido a las células
que sintetizan 5HT en el TGI de la trucha. En segundo lugar, es conocido el papel limitante
que realiza la enzima TPH en la formación de 5HT (Tyce, 1990). En mamíferos existen
dos isoformas de la TPH, habiéndose implicado la TPH1 en la conversión de L-Trp a
5HTP en las CE intestinales, mientras que la TPH2 ha sido localizada en neuronas
entéricas y en el cerebro (Yu et al., 1999; Walther et al,, 2003). La presencia de estas
isoformas y el probable papel limitante en los peces no han sido corroborados hasta la
fecha, existiendo únicamente datos a nivel cerebral en la trucha (Aldegunde et al., 1998).
En todo caso, nuestros resultados sugieren que la actividad de síntesis de 5HT intestinal
puede ser modulada por el alimento, de forma que se activaría tras la ingesta facilitando la
formación de 5HT y su accesibilidad para ser N-acetilada a melatonina. Se ha demostrado
que valores de L-Trp fisiológicos no saturan a la TPH (Tyce, 1990; Winberg et al., 2001),
pero si lo hacen concentraciones altas de L-Trp (Friedman et al., 1972). Por tanto, es
posible tras la administración parenteral de L-Trp los niveles de este aminoácido en
circulación fuesen muy elevados e impidiesen la adecuada función de la TPH, lo que no
llegó a ocurrir tras la administración de 5HTP.
Por último, nuestros resultados sugieren que, tanto la formación de 5HT como la
de melatonina en las células entero-hepáticas, podrían estar condicionados por las señales
sensoriales y humorales ligadas a la ingesta de alimento y a su paso por el tracto digestivo.
Estas señales nerviosas y hormonales podrían facilitar el propio transporte de L-Trp al
interior de las células serotoninérgicas, la síntesis de 5HT y su disponibilidad
citoplasmática para la conversión a melatonina.
En diversas especies de teleósteos la administración de L-Trp ha sido catalogada
por producir efectos de atenuación de la respuesta de estrés (Hoglund et al., 2007),
195
Discusión
incluyendo disminución de los niveles circulantes de cortisol (Lepage et al., 2002; Herrero
et al., 2007). Una respuesta característica ligada a la activación de la respuesta de estrés es
la disminución de la tasa de ingesta (Carr, 2002), efecto al que podrían contribuir los
elevados niveles de 5-HT (De Pedro et al., 1998; Winberg y Lepage, 1998). En nuestros
experimentos hemos constatado que en las truchas alimentadas con dieta enriquecida en LTrp se produjo un descenso significativo de los niveles plasmáticos de cortisol, aunque
solo en aquellos que recibieron la concentración más elevada del aminoácido. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos previamente en trucha arco iris (Lepage et al.,
2005a), lubina (Herrero et al., 2007) y trucha salmonada (Höglund et al., 2007). Aunque
los datos disponibles de nuestros experimentos solo abarcan a la 5HT periférica, se ha
demostrado que el L-Trp induce la síntesis de 5-HT en el cerebro de la trucha (Aldegunde
et al., 2000). Por tanto, estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que el efecto
anti-cortisol del L-Trp pueda estar asociado a una activación del sistema serotoninergico a
nivel cerebral y periférico. A pesar de ello, no hemos hallado alteraciones significativas de
la ingesta en los animales tratados con L-Trp. Ello puede ser motivado por el hecho de
nuestros experimentos fueron realizados en ausencia de estrés, en contraste con la mayoría
de estudios en los que la respuesta de la ingesta al L-Trp se valoró en peces sometidos a
algún tipo de estresante (Lepage et al., 2005b; Höglund et al., 2007).
Relaciones entre síntesis y disponibilidad celular de 5HT y síntesis de melatonina en el
intestino de trucha arco iris.
Los resultados derivados de la administración de L-Trp por vía oral e i.p., sugieren
que tanto la disponibilidad celular de L-Trp como la disponibilidad de la propia 5HT
formada, pueden modular la síntesis intestinal de melatonina en la trucha arco iris. A fin de
constatar la relación entre esos procesos, se realizaron una serie de estudios in vitro
utilizando segmentos de intestino medio en los que se valoró el efecto del L-Trp sobre los
niveles de 5-HT y melatonina. Se comprobó que la adición de L-Trp al medio de cultivo
provoca un incremento dosis-dependiente en el contenido tisular de melatonina tras 12
horas de cultivo, en concordancia con lo descrito previamente para el intestino en esta
misma especie (Lepage et al., 2005a). En general la magnitud de los efectos hallados fue
superior a la observada tras la administración de L-Trp in vivo, lo que sugiere que en este
último caso pueden existir otros condicionantes de la captación del aminoácido y/o de la
actividad celular intestinal.
A pesar de los cambios observados en la melatonina, no se apreciaron efectos de la
adición de L-Trp sobre el contenido de 5HT y de 5HIAA en el tejido intestinal, si bien se
apreció una tendencia dosis-dependiente al alza. Estos resultados se diferencian de los
descritos in vivo, donde a mayor concentración de L-Trp en la dieta, mayores fueron los
niveles de 5HT. La ausencia de efectos in vitro sobre la 5HT podría ser explicada por la
enorme diferencia entre las concentración de 5HT presente en las células intestinales
196
Discusión
(1000-4000 veces mayor que la de melatonina), la mayor parte de la cual permanece
internalizada en vesículas/gránulos citoplasmáticos (Bertrand y Bertrand, 2010). Se ha
indicado que la 5HT de nueva síntesis es rápidamente almacenada en estos gránulos
mediante un transportador vesicular tipo 1 (VMAT1) que, en mamíferos, es específico de
las CE (Rindi et al., 2004). Por tanto, en nuestro caso parece improbable que los pequeños
cambios inducidos en la síntesis de 5HT por el L-Trp pudiesen ser detectables, dada la gran
cantidad de 5HT residente en los almacenes citoplasmáticos de las células intestinales.
Por otro lado, nuestros resultados revelan la importancia que tiene el sistema de
transporte de aminoácidos neutros residente en las membranas de las células intestinales
para la síntesis de melatonina. En este sentido, se ha demostrado que la adición de Lalanina (1 mM) al medio de incubación del tejido intestinal bloquea de manera dependiente
de concentración el aumento promovido por el L-Trp en los niveles de melatonina en el
intestino. Este efecto concuerda con que ambos aminoácidos comparten el mismo
transportador de la membrana celular (Baumrucker et al., 1989), de forma que la
competencia entre ambos limita la cantidad de L-Trp que pasa al interior de la celular, tal y
como se ha descrito que ocurre en la barrera hematoencefálica de mamíferos (Fernstron y
Wurtman, 1972). Sin embargo, esta competición entre aminoácido neutros por el
transportador apenas tuvo consecuencias sobre los niveles de 5HT tisulares. Ello es
indicativo, una vez más, de que el aumento desencadenado de forma inmediata por el
aporte de L-Trp en la síntesis de 5HT, no siempre se traduce en cambios apreciables en el
contenido total de 5HT (5HT sintetizada de novo + 5HT almacenada en gránulos
citoplasmáticos). Estos datos claramente demuestran que el aumento de la 5HT libre (de
nueva síntesis) inducida por el L-Trp fue necesario y suficiente para incrementar los
niveles de melatonina, lo que avala un papel prioritario de la disponibilidad citoplasmática
de 5HT no vesicular en la síntesis de melatonina (figura 1).
De forma complementaria, el tratamiento con pargilina del medio de incubación
intestinal, provocó un aumento dosis-dependiente del contenido intestinal de melatonina.
La aplicación de este fármaco, definido como un inhibidor de la actividad enzimática
MAO (Fowler et al., 1981), también provocó un aumento de los niveles de 5HT
conjuntamente con un descenso de los de 5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT.
Dado que la MAO es un enzima mitocondrial, solo puede actuar sobre la 5HT que está en
forma libre en el citoplasma (Aldegunde et al., 1998), lo que permite concluir que la
pargilina indujo una mayor presencia de 5HT no vesicular/granular en el interior celular.
Ello favoreció la acción de las enzimas de síntesis de melatonina que actúan sobre la 5HT
libre del citoplasma, incrementando su transformación en melatonina (figura1).
Contrariamente, la administración de fenfluramina provocó una disminución en la
producción de melatonina in vitro, de manera similar a lo observado para la 5HT, aunque
este efecto fue mucho menor que el obtenido con la pargilina. Además, la fenfluramina
resultó en un incremento de los niveles de 5HIAA, así como en la relación 5HIAA/5HT,
197
Discusión
siendo esta última interpretada como un indicador de la tasa de liberación funcional del
neurotransmisor (verli et al., 2001). Estos datos concuerdan totalmente con los descritos
por Caamaño-Tubío et al. (2006) tras inyección i.p. de fenfluramina en la trucha arco iris.
Se ha postulado que la fenfluramina actúa de forma dual en las neuronas serotoninérgicas,
provocando la liberación de la 5HT y bloqueando su recaptación (Garattini, 1987). A nivel
intestinal, el mecanismo de recaptación de 5HT es muy activo, al igual que lo es la
inactivación celular de la amina por la MAO (Edwards et al. 1986; Senatori et al., 2003).
Por ello, es probable que la fenfluramina no llegue a bloquear totalmente la recaptación de
la amina, permitiendo que una parte entre en el citoplasma y sea degradada de forma
inmediata a 5HIAA. Por tanto, los datos concuerdan fielmente con la idea de que
fenfluramina produce una reducción de la 5HT presente en el medio intracelular, lo que se
traduce en menor síntesis de melatonina debido a la baja disponibilidad de 5HT libre en el
citoplasma de las células intestinales(figura 1). Un mecanismo similar de regulación de la
síntesis de melatonina por los niveles celulares de 5HT ha sido propuesto en la glándula
pineal de mamíferos (Míguez et al., 1997).
Figura 1. Esquema de la formación de 5HT a partir de aminoácidos neutros en una célula
EC y de los mecanismos de acción de los fármacos que alteran la disponibilidad de 5HT celular
(fenfluramina, pargilina) y su efecto sobre la síntesis de melatonina.
198
Discusión
Estudio de la función de la melatonina en la contractibilidad intestinal
En los vertebrados se ha propuesto que la melatonina podría estar implicada en la
regulación de diversas funciones en el TGI, incluyendo un papel potencial como protector
de la mucosa digestiva y en la regulación de las secreciones y de la motilidad intestinal
(Bubenik, 2002; Kvetnoy et al., 2002). Sin embargo, la mayor parte de los estudios se han
llevado a cabo en mamíferos y en el humano, existiendo datos muy escasos en peces. En
este sentido, trabajos recientes de Velarde et al. (2009b) en el carpín dorado han
demostrado que la melatonina podría ejerce un efecto de atenuación de la actividad
contráctil intestinal, en parte actuando sobre receptores específicos de la hormona. Dado el
interés que tiene este aspecto funcional de la melatonina, así como el poder disponer de
datos a nivel comparativo entre las distintas especies de teleósteos, una parte final de
nuestro trabajo dedicó su atención a estudiar la acción de la melatonina sobre la
contractilidad intestinal en la trucha arco iris, utilizando para ello la metodología del baño
de órganos.
Nuestros resultados han puesto de manifiesto que, a diferencia de otras especies de
teleósteos tales como el carpín (Velarde et al., 2009b), el pez cebra (Holmberg et al., 2007)
o el salmón Chinook (Forgan y Forster, 2007), en los que existen patrones típicos de
actividad muscular basal caracterizados por una actividad miogénica espontánea con
contracciones periódicas de amplitud y frecuencia relativamente constantes, en la trucha
arco iris existen serias dificultades para monitorizar este patrón rítmico contráctil en
situación basal dada su escasa permanencia en el tiempo. Este dato concuerda con lo
demostrado previamente en esta especie (Johansson y Holmgren, 2003), lo que se ha
asociado a que el músculo intestinal de la trucha arco iris carece de ritmo de ondas lentas
(Manera et al., 2008) que genere la motilidad espontánea. Metodológicamente, ello supone
una seria limitación la hora estudiar la acción reguladora de la motilidad intestinal de
sustancias con potencial acción fisiológica. Por ello, los estudios realizados en nuestro caso
se centraron en la evaluación de la fuerza contráctil del intestino (tensión muscular) en
situación basal y/o en presencia de melatonina y otros fármacos.
La Ach ha sido descrita como el principal neurotransmisor implicado en la
regulación de la contracción de la musculatura lisa intestinal de los vertebrados. Este
neurotransmisor es liberado por neuronas del sistema parasimpático y del sistema entérico
y su acción esta mediada por receptores muscarínicos (Mandl y Kiss, 2007). Nuestros
resultados muestran una respuesta estimuladora de la contractilidad intestinal en la trucha
con concentraciones de 10nM y superiores de ACh, en concordancia con estudios pioneros
realizados en esta misma especie (Burnstock, 1958) y más recientemente en el carpín
(Velarde et al., 2009b). Tal y como cabía esperar, los experimentos de competición
realizados en presencia de atropina, un inhibidor de receptores muscarínicos, demostraron
la especificidad del efecto contráctil de la ACh y su mediación por receptores
muscarínicos. En teleósteos, concretamente en tilapia, se ha descrito la existencia de 5
199
Discusión
subtipos de receptores muscarínicos en distintas regiones del TGI, aunque de todos ellos
parece que los M1 y M3 son los más firmes candidatos a mediar respuesta contráctil
colinérgica (Seo et al., 2009). En la trucha arco iris se ha descrito inicialmente la presencia
del receptor muscarínico M2 (Burka et al., 1989) y más recientemente del receptor M3
(Ulrika y Holmgren, 2000). En consecuencia, a partir de los resultados obtenidos
sugerimos la implicación de receptores muscarínicos de los subtipos M2 y M3 en la
respuesta contráctil generada por ACh en el intestino de la trucha arco iris.
La motilidad intestinal permite el tránsito de alimento y su absorción de una manera
organizada a lo largo del tracto digestivo. En su regulación participan una variedad de
neurotransmisores ligados a la inervación extrínseca e intrínseca del TGI, así como
moduladores paracrinos (Olsson y Holmgren, 2001). Los modelos de intestino aislado
permiten evaluar con relativa facilidad los cambios en la tensión muscular derivados de
diversos fármacos y sustancias moduladoras. En nuestro caso, hemos demostrado que la
5HT también ejerce un efecto estimulador dosis-dependiente de la contracción muscular
intestinal, el cual fue evidente con un amplio rango de concentraciones del neurotransmisor
(desde 10nM a 10M). Dicho efecto de la 5HT responde a lo esperado, ya que confirma su
papel estimulador de la contracción intestinal observado en una variedad de teleósteos tales
como el carpín (Kiliaan et al., 1989; Velarde et al., 2010b), la carpa (Kitazawa et al.,
1990), así como en estudios pioneros realizados en la trucha arco iris (Burnstok, 1958). No
obstante, en la tilapia se ha descrito un efecto relajante de la 5-HT sobre de la motilidad
intestinal (Kilian et al., 1989), lo que podría indicar que existen diferencias interespecíficas
en la acción de este neurotransmisor. Es posible también que los efectos de la 5HT puedan
ser diferentes entre las regiones digestivas, lo que ha sido propuesto para otros modelos de
vertebrados (Baxter et al., 1991; Martin et al, 1993; Tonini, 2005; Kitazawa et al., 2006).
Dado que a lo largo de esta tesis doctoral hemos demostrado la presencia en el intestino de
la trucha arco iris de 5HT tanto en las CE de la mucosa, como en elementos nerviosos
asociados a los plexos nerviosos y mientéricos, así como en proyecciones neuronales de
estos plexos hacia la mucosa, los datos aportados en el presente trabajo indican que la
liberación de neurotransmisor desde estas poblaciones celulares puede ejercer un papel
importante estimulador del tono contráctil basal en el intestino de la trucha arco iris.
En el carpín se ha indicado que el efecto contráctil inducido por la 5HT puede
implicar una interacción directa sobre el músculo liso y/o una acción indirecta modulando
la contracción inducida por ACh (Velarde et al., 2009b). En nuestro caso hemos
comprobado que, en presencia de atropina en el medio de incubación, el efecto de la 5HT
sobre la tensión muscular es considerablemente menor que si se aplica 5HT sola. Este
resultado coincide con lo descrito también en otras especies de peces, como la carpa
(Kitazawa et al., 1990), el bacalao (Karila et al., 1998) y la trucha (Burnstock, 1958). Por
otro lado, nuestros resultados demuestran que el efecto de 5HT es en gran medida
dependiente de la presencia de Ca2+ extracelular. Al incubar los fragmentos de intestino en
un medio con total ausencia de ión se observó un efecto muy atenuado de la 5HT sobre la
200
Discusión
fuerza de contracción muscular, requiriéndose concentraciones mayores del
neurotransmisor para provocar efectos que normalmente se obtendrían con concentraciones
más bajas. Ello concuerda con lo descrito previamente para esta especie (Burka et al.,
1990), mientras que en el carpín se ha encontrado que la 5HT no provoca contracción
alguna en un medio libre de calcio (Velarde et al., 2010b). Por tanto, nuestros datos indican
que el efecto contráctil de la 5HT puede estar mediado por una estimulación de la
liberación neuronal de ACh, siendo la acción postsináptica de este neurotransmisor la que
explicaría gran parte de los efectos estimuladores de la 5HT en la musculatura intestinal.
De forma complementaria a un efecto indirecto (liberación de ACh) ejercido por la
5HT, los datos obtenidos invitan a sugerir que este neurotransmisor también ejerce una
acción directa sobre la musculatura intestinal, lo que explicaría que incluso en presencia de
atropina y/o en ausencia de calcio (ión necesario para la liberación de ACh), la 5HT sigue
ejerciendo un efecto de estimulación contráctil. En vertebrados se conoce la presencia de
diversos receptores de 5HT en intestino, con potencial implicación en la regulación de la
contracción de la musculatura lisa. Tal es el caso de los subtipos 5HT1b, 5HT1d, 5HT2,
5HT3 y 5HT4 o los recientemente identificados como el 5HT7 (Hoyer et al., 2002; Gershon
y Tack, 2007). En peces el conocimiento de receptores serotoninérgicos es más bien
escaso, aunque en la trucha se ha apuntado al subtipo 5HT2 como el responsable de la
contracción muscular intestinal inducida por 5HT (Burka et al., 1989), mientras que en el
carpín existirían al menos dos subtipos de receptores mediando la acción de la 5HT,
concretamente los subtipos 5HT4-like y 5HT7-like (Velarde et al., 2010b). En nuestro caso,
se ha evaluado el efecto de metisergida, un fármaco que en mamíferos se ha descrito como
antagonista de receptores 5HT1 y 5HT2 y 5HT7, sobre la respuesta contráctil basal inducida
por 5HT. Los resultados mostraron un claro efecto inhibitorio de metisergida sobre la
fuerza contráctil basal, lo que dificultó técnicamente su seguimiento en el tiempo. Además,
la metisergida bloqueó de manera concentración-dependiente la respuesta contráctil
inducida por 5HT, la cual se anuló completamente con concentraciones elevadas del
antagonista. En consecuencia, estos resultados sugieren que ciertos receptores de 5HT,
concretamente los subtipos 5HT2-like y/o 5HT7-like, podrían ser esenciales para el
mantenimiento de la contractilidad basal en el intestino de la trucha arco iris. El bloqueo de
estos subtipos de receptores provoca la pérdida casi total del tono contráctil e impide la
acción de agentes estimuladores de la contracción.
Conocidos algunos de los mecanismos mediadores de la contractilidad intestinal en
nuestro modelo de teleósteo, hemos tratado de averiguar la influencia que podría ejercer la
melatonina sobre este proceso fisiológico. Los resultados obtenidos tras la incubación del
tejido intestinal con concentraciones crecientes de melatonina muestran una respuesta
estimuladora de la tensión muscular, aunque los efectos significativos se alcanzaron a
partir de 0.1 M de melatonina. El efecto máximo se obtuvo con la concentración de 10
M y a partir de ésta el efecto estimulador de la melatonina decayó progresivamente. Esta
acción diferencial de la melatonina concuerda con la variedad de efectos descritos en la
201
Discusión
bibliografía para esta hormona. Así, en preparaciones de intestino de rata se ha descrito un
efecto inhibitorio de la melatonina sobre la frecuencia contráctil, sin alterar la amplitud de
las contracciones (Bubenik, 1986; Harlow y Weekly, 1986), mientras que en otro estudio
en que se registró actividad mioeléctica en intestino de rata in vivo, se observaron efectos
estimuladores con dosis bajas de melatonina administradas a los animales e inhibidores con
dosis elevadas (Drago et al., 2002). También en la rata se ha observado que la melatonina
produce efectos farmacológicos sobre la motilidad intestinal, diferentes según el estado
prandial y la fase diaria (día: noche) (Merle et al., 2000). Por otra parte, en el colon del
cerdo la melatonina estimula la contracción intestinal, si bien solo se alcanza una respuesta
estable con concentraciones elevadas de la hormona (Lucchelli et al., 1997). En cuanto al
efecto de la melatonina en la contractilidad intestinal en peces, éste solo fue evaluado en el
carpín, demostrándose que la melatonina no altera el ritmo miogénico espontáneo pero
atenúa la respuesta contráctil inducida por ACh (Velarde et al., 2009b).
Una vez determinado el efecto de la melatonina sobre la contractilidad intestinal de
la trucha, se ha procedido a estudiar la especificidad del mismo en base a la acción de la
hormona sobre potenciales receptores de membrana presentes en la musculatura intestinal.
En los vertebrados se ha establecido la localización de lugares de unión de la melatonina
en diferentes tejidos asociados al TGI, particularmente en aves y mamíferos (Lee y Pang,
1993; Pontoire et al., 1993; Poon et al., 1997; Sallinen et al., 2005). En el colon del cerdo
se ha sugerido que la acción contráctil de la melatonina se produciría sobre receptores
intracelulares de baja afinidad, denominados como MT3 (Lucchelli et al., 1997). Más
recientemente se ha descrito la presencia de receptores de alta afinidad del tipo MT2 en la
capa muscular de la rata, los cuales podrían estar relacionados con la modulación de la
motilidad intestinal (Stebelová et al., 2010). Por su parte, en peces los estudios son mucho
menos precisos, describiéndose la presencia de lugares de unión de melatonina en intestino
de lubina, platija y trucha arco iris (Kulczykowska et al., 2006). Recientemente también se
ha señalado la presencia de receptores del subtipo MT1 en el intestino y diversas regiones
periféricas del lenguado, Solea senegalensis (Confente et al., 2010).
En nuestro caso, se evaluó el efecto de la melatonina en presencia de luzindol, un
conocido antagonista competitivo de los receptores de melatonina. Los resultados
mostraron que el luzindol bloqueó hasta un 60% el efecto estimulador inducido por
melatonina a la concentración de 10-6M sobre la actividad contráctil basal del intestino.
Aunque el luzindol se ha definido como un antagonista de receptores de melatonina
MT1/MT2, en humanos parece mostrar mayor selectividad por el subtipo MT2
(Dubocovich y Markowska, 2005). De acuerdo con ello, estos resultados sugieren que los
posibles candidatos para mediar la acción reguladora de la contractibilidad intestinal por la
melatonina en la trucha podría ser el receptor MT2. No obstante, el escaso conocimiento de
la farmacología de receptores serotoninérgicos en los peces en general y en particular, en la
trucha, no permite concluir con rotundidad tal posibilidad. Incluso en el carpín estudios
similares al actual, pero utilizando una farmacología más completa, han sugerido que
202
Discusión
podrían existir más de un tipo de receptores melatoninérgicos implicados en la respuesta
contráctil (Velarde et al., 2009b). Es evidente, por tanto, que se requieren estudios más
extensos a fín de pormenorizar el mecanismo receptor sobre el que la melatonina ejerce su
efecto en la musculatura intestinal en la trucha arco iris, así como su papel en los efectos
diferenciales relativos a la concentración de la hormona.
Nuestros resultados muestran claramente que la estimulación de la contracción
muscular inducida por melatonina es un proceso dependiente del calcio extracelular, de
forma similar a lo descrito para el efecto de ACh y de 5HT. Es sabido que la contracción
de la musculatura lisa intestinal depende del aumento de calcio intracelular, proporcionado
por la entrada del ión través de canales específicos de la membrana, y/o liberado desde
depósitos intracelulares (Aronsson y Holmgren, 2000). En el conejo se ha demostrado que
la melatonina inhibe la contracción de la musculatura aórtica inducida por 5HT,
provocando una inhibición en la entrada de calcio (Satake et al., 1986), mientras que en la
rata inhibió la contracción aórtica inducida por KCl, pero solo con concentraciones de
melatonina de rango suprafisiológico (10 mM a 1 mM) (Monroe and Watts, 1998). Estos
efectos de la melatonina parecen ser indicativos de acciones no específicas, dado que no
responden a luzindole y requieren concentraciones muy elevadas de la hormona. En
nuestro caso, la melatonina en el rango de 0,1µM-10M potenció la contractilidad
muscular estimulada por ACh (10 nM), indicando que, en parte, el efecto de la melatonina
podría ser independiente de la estimulación colinérgica.
Dado que el rango de concentraciones en el que la melatonina produjo efectos en
presencia de ACh fue similar al que alteró la contracción intestinal en situación basal, es
lógico sugerir que esta acción potenciadora de la melatonina podría ser mediada por
receptores postsinápticos localizados sobre las propias fibras musculares. Esta posibilidad
estaría de acuerdo con lo descrito por Lucchelli et al. (1997) en el conejo de Indias, quienes
sugieren que la acción estimuladora de la melatonina sobre la contractilidad del colon
proximal se lleva a través receptores postsinápticos de melatonina del subtipo MT2. No
obstante, existe la posibilidad de que la melatonina actúe indirectamente sobre las
terminales colinérgicas activando mecanismos exocitóticos dependientes de calcio, lo que
también redundaría en una potenciación de la acción estimuladora inducida por la ACh.
Incluso en el conejo de Indias se ha mostrado que la melatonina modula el potencial
postsinátpico inducido por la activación de receptores nicotínicos a nivel del plexo
submucoso (Barajas-López et al., 1996). Por tanto, en nuestro caso no podemos descartar
una acción similar de la hormona sobre los receptores muscarínicos que median el efecto
de ACh a nivel intestinal. En este sentido, el hecho de que la atropina bloquease
eficazmente (y de manera similar a la ausencia de calcio) el efecto de la melatonina sobre
la contracción intestinal, nos lleva a decantarnos por una posible acción de la melatonina
ejercida, en gran parte, a través de mecanismos colinérgicos pre- y/o post-sinápticos
(Figura 2).
203
Discusión
Al margen de los posibles efectos directos y/o mediados por la actividad
colinérgica, nuestros resultados indican una interacción de la melatonina con la regulación
serotoninérgica de la contractilidad intestinal, de forma similar a lo propuesto en el
intestino de rata (Bubenik, 1986) y del carpín (Velarde et al., 2010b). Así, en la trucha la
melatonina (10 M) inhibió significativamente la contracción muscular inducida por
concentraciones bajas (10 nM) de 5HT. Asimismo, la presencia del antagonista
serotoninérgico metisergida en el medio de incubación intestinal inhibió la respuesta
contráctil inducida por la melatonina. Este bloqueo de la metisergida sobre el efecto de la
melatonina fue incluso más evidente (desde un punto de vista del rango farmacológico)
que el que ejerció sobre la contractilidad inducida por 5HT. Todo ello nos lleva a proponer
una acción de la melatonina sobre mecanismos serotoninérgicos que regulan la
contractilidad intestinal en la trucha arco iris. En el mismo sentido, Velarde et al. (2010b)
proponen un efecto modulador de la melatonina sobre la contracción intestinal evocada por
5HT. A diferencia de nuestro estudio, en el carpín el efecto de la melatonina tuvo lugar en
el rango pM y fue totalmente bloqueado por luzindole, sugiriéndose una mediación por
receptores específicos localizados en terminales colinérgicas y/o en las células musculares
lisas. En nuestro caso, el efecto modulador de la melatonina sobre la estimulación
serotoninérgica solo fue visible con concentraciones elevadas de la hormona (10M), lo
que os lleva a catalogar dicha respuesta como de orden suprafisiológico. Esta acción
inhibidora con elevadas concentraciones de melatonina podría explicar el menor efecto que
sobre la contractilidad intestinal basal provocan las concentraciones elevadas de
melatonina (rango mM), en relación con aquellas más próximas al rango fisiológico (MnM). Dada la similitud estructural de la melatonina con la 5HT (así como con algunos
agonistas 5HTérgicos), es posible una acción directa de la melatonina a elevadas
concentraciones sobre los receptores serotoninérgicos. Sin embargo, dicha posibilidad ha
sido descartada en estudios llevados a cabo en el colón del conejo de Indias (Lucchelli et
al. 1997). Por tanto, en el presente trabajo proponemos que la acción moduladora de la
melatonina sobre la actividad contráctil inducida por 5HT en intestino de trucha podría ser
mediada por un efecto inhibitorio de la melatonina actuando de forma directa sobre las
terminales serotoninérgicas que forman parte de los plexos nerviosos entéricos (Figura 2).
204
Discusión
Figura 2. Esquema de la posible acción de la melatonina intestinal sobre neuronas
colinérgicas y/o a través de mecanismos serotoninérgicos para modular su efecto sobre la
musculatura lisa.
Los resultados de este último trabajo nos llevan a proponer a la melatonina como un
posible modulador fisiológico de la actividad motora intestinal en la trucha arco iris. Las
consecuencias fisiológicas de dicha modulación no son del todo evidentes, pero podrían
estar encaminadas a la facilitación de la actividad digestiva y absortiva, adaptando la
velocidad de desplazamiento del alimento por el tracto digestivo. En este sentido, nuestros
datos concuerdan con aquellos obtenidos en el ratón que muestran que las inyecciones
intraperiotoneales de melatonina reducen el tiempo de tránsito del alimento (Bubenik y
Dhanvantari, 1989), aunque en ratas se han señalado respuestas variables dependiendo de
la dosis de melatonina. Por otro lado, diversos trabajos muestran que la melatonina actúa
como un agente anoréctico en algunas especies de teleósteos, tales como el carpín (Pinillos
et al., 2001) y la lubina (López-Olmeda et al., 2006a), con posibles efectos reguladores del
peso corporal (De Pedro et al., 2008). Los experimentos realizados en nuestro laboratorio
en la trucha nos han permitido definir un efecto inhibitorio de débil magnitud de la
melatonina sobre la ingesta de alimento (datos no publicados), menor que el observado
para otras especies. También el efecto modulador (estimulador) de la melatonina sobre la
contractilidad intestinal descrito en nuestro trabajo es diferente al descrito para la
melatonina en el carpín (inhibidor), lo que claramente indica la existencia de diferencias
entre especies en la acción fisiológica de la hormona y/o de los mecanismos que integran
su respuesta. En todo caso, el hecho de que la melatonina altere la actividad contráctil y el
tiempo de tránsito de alimento en el tracto digestivo apoya la posibilidad de que participe
en la generación de las señales periféricas (hambre, saciedad) que orientan al organismo en
la ingesta de alimento.
205
Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones
1.- Se ha desarrollado un método analítico de HPLC con detección fluorimétrica para
cuantificar melatonina en muestras de diferentes fluidos corporales y tejidos digestivos. La
sencillez del método basado en un tratamiento extractivo de la muestra con cloroformo y
un mayor rendimiento de las condiciones cromatográficas, reduce el coste analítico sin
detrimento de la sensibilidad y de la versatilidad de las técnicas de HPLC.
2.- El tracto gastrointestinal de los peces, de forma similar a mamíferos, contiene
importantes cantidades de melatonina y expresa toda la maquinaria enzimática que justifica
la síntesis local de la hormona. Además, los datos señalan que existe una gran
independencia entre los niveles de melatonina presentes en el TGI y aquellos presentes en
la circulación sanguínea. La bilis, un fluido asociado a la actividad digestiva, también
contiene una cantidad muy elevada de melatonina, presumiblemente de origen hepático.
3.- La síntesis de melatonina, al igual que la de 5HT, parece ser ubicua a lo largo del TGI,
aunque muestra diferencias territoriales. Además, el contenido de ambos indoles no está
uniformemente distribuido en la pared digestiva, concentrándose sobre todo en la capa
muscular en relación al epitelio de la mucosa. Sin embargo, la expresión génica de las
enzimas que sintetizan melatonina es mayor en la zona en la mucosa que en la pared,
indicando que la facilidad de la hormona para difundir en los tejidos puede enmascarar una
localización más específica de la síntesis de melatonina en la mucosa.
4.- Mediante estudios inmunohistoquímicos se ha localizado la inmunoreactividad a 5HT,
AANAT y melatonina en el TGI de la trucha. Tanto las células que contienen 5HT, como
aquellas que expresan AANAT y melatonina, se localizan preferentemente en la zona de la
base del epitelio mucosal, sugiriendo que podrían ser similares a las enterocromafines.
5.- No se han encontrado cambios rítmicos diarios en el contenido de melatonina en
intestino de trucha, pero si en la expresión génica de las enzimas aanat1, aanat2 y hiomt
que aumenta durante el periodo de oscuridad. Estos ritmos de expresión parecen ser
endógenos ya que se mantienen en condiciones de ambiente lumínico constante. No
obstante, la ingesta del alimento también tiene efectos moduladores de la síntesis de
melatonina y debe ser un factor a considerar a la hora del ajuste rítmico.
6.- La actividad de ingesta induce un aumento en la producción intestinal de melatonina
que parece ser en gran parte desencadenado por reflejos neuroendocrinos ligados al paso
de alimento a lo largo del tubo digestivo, lo que condiciona la expresión de los genes
implicados en la síntesis de la hormona. Otro factor que contribuye al incremento de los
niveles de melatonina en el tracto digestivo es la secreción de bilis al lumen intestinal,
activada por reflejos relacionados con la ingesta y el transito del contenido digestivo.
7.- En condiciones prolongadas de ayuno, los niveles intestinales de melatonina se
incrementan durante la fase diaria en la que normalmente tiene lugar la ingesta. Aunque es
209
Conclusiones
posible que en estas condiciones aumente la tasa de síntesis de melatonina en el tejido
intestinal, el aumento de los niveles de la hormona también podría provenir de la bilis
liberada de forma paulatina al lumen digestivo, incluso en situación de ayuno. Teniendo en
cuenta las propiedades antioxidantes y protectoras celulares de la melatonina, su presencia
en el tubo digestivo de animales ayunados podría contribuir al buen mantenimiento del
epitelio intestinal.
8.- Mientras que la administración del aminoácido L-Trp por vía oral (suplemento
alimenticio) induce un aumento de la síntesis de melatonina en el intestino, la
administración parenteral no tiene efectos. Este dato, conjuntamente con el efecto
estimulador del 5HTP, indica que no es suficiente la mayor presencia del aminoácido en
las células productoras de melatonina (y de serotonina) para activar su síntesis, sino que
existe una compleja relación entre disponibilidad celular de 5HT y síntesis de la hormona.
Los reflejos neuroendocrinos desencadenados por el tránsito del alimento a lo largo del
tubo digestivo podrían regular esta relación, incrementando la disponibilidad de 5HT
accesible para la acción de los enzimas implicados en la síntesis de melatonina.
9.- La melatonina afecta significativamente la contractilidad intestinal de la trucha arco
iris, generando un incremento en la fuerza de contracción basal. Este efecto, diferente al
observado en el carpín, muestra características de dependencia de la concentración y de la
entrada de calcio extracelular, y es bloqueado por atropina. En parte, el efecto de la
melatonina es mediado por receptores específicos de membrana presentes en el tejido
intestinal.
10.- Los efectos de la melatonina sobre la contractilidad son mucho menores que los que
ejercen dos de los principales neurotransmisores que regulan la motilidad digestiva, la
acetilcolina y la serotonina. Es probable que la melatonina intestinal, de forma específica o
inespecífica, también ejerza un efecto modulador de la motilidad a través de estos
neurotransmisores y/o de los mecanismos celulares que median la acción de estos
neurotransmisores.
11. A modo de conclusión general, los resultados nos muestran al TGI de la trucha arco iris
como un tejido productor de melatonina, con una regulación potencial por mecanismos
circadianos pero sobre todo asociada a la ingesta y al tránsito de alimento en el tubo
digestivo. La melatonina intestinal también podría contribuir a modular el tránsito
intestinal, facilitando con ello la coordinación temporal y funcional de la actividad
digestiva y absortiva.
210
Bibliografía
Bibliografía
Abrams, P., Andersson, K.E., Buccafusco, J.J., Chapple, C., De Groat, W.C., Fryer, A.D., Kay, G.,
Laties, A., Nathanson, N.M., P.J., Pasricha (2006) Muscarinic receptors: their distribution and
function in body systems, and the implications for treating overactive bladder. Br. J. Pharmacol.
148:565–578.
Ahearn, G.A., Gerencser, G.A., Thamotharan, M., Behnke, R.D. y T.H., Lemme (1992) Invertebrate
gut diverticula are nutrient absorptive organs. Am. J. Physiol. 263: 472-481.
Ahlman, H., y A., Dahlstrom (1982) Storage and release of 5-hydroxytryptamine in enterochromaffin
cells of the small intestine. En: 5-Hydroxytryptamine in Peripheral Reactions. Editado por F. De
Clerk y P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 1-21.
Akbulut, H., Akbulut, K.G., B., Gonul (1997) Malodialdehyde and glu-athione in rat gastric mucosa
and effects of exogenous melatonin. Dig. Dis. Sci. 42: 1381-1388
Aldegunde, M., J. Garcia, J. L. Soengas, G., Rozas (1998) Uptake of tryptophan into brain of rainbow
trout. J. Exp. Zool., 282: 285-289.
Aldegunde, M., Soengas, J.L., G., Rozas (2000) Acute effects of L-tryptophan on tryptophan
hydroxylation rate in brain regions (hypothalamus and medulla) of rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss). J. Exp. Zool. 286: 131–135.
Aldman, G., y S., Holmgren (1995) Intraduodenal fat and amino acids activate gallbladder motility in
the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol.100(1):27–32.
Amin, A. H., Crawford, T. B. B., J. H., Gaddum (1954) The distribution of substance P and 5hydroxytryptamine in the central nervous system of the dog. J. Physiol., 126: 596-618.
Anderson, C. (1983) Evidence for 5-HT-containing intrinsic neurons in the teleost intestine. Cell
Tissue Res., 230: 377-386.
Anderson, C., y G., Campbell (1988) Immunohistochemical study of 5-HT-containing neurons in the
teleost intestine: relation to the presence of enterochromaffin cells. Cell Tissue Res. 254:553-559.
Anderson, C. R., Campbell, G., O‘Shea, F., M., Payne (1991) The release of neuronal 5-HT from the
intestine of a teleost fish, Platycephalus bassensis. J. Auton. Nerv. Syst. 33: 239-246.
Andersen, D., Reid, S., Moon, T., S., Perry (1991) Metabolic effects associated with chronically
elevated cortisol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Can. J. Fish Aquat. Sci., 48: 1811-1817.
Antolin, I., Mayo, J.C., Sainz, R.M., del Brio Mde, I., Herrera, F., Martin, V., y C., Rodriguez
(2002) Protective effect of melatonin in a experimental model of Parkinson's disease, Brain Res. :
943: 163–173.
Appelbaum, L., Vallone, D., Anzulovich, A., Ziv, L., Tom, M., Foulkes, N.S., Y., Gothilf (2006)
Zebrafish arylalkylamine-N-acetyltranferase genes–targets for regulation of the circadian clock. J.
Mol. Endocrinol. 36:337-347.
213
Bibliografía
Aranda, A., Madrid, J.A., Zamora, S., y F.J., Sánchez-Vázquez (1999) Synchronizing effect of
photoperiod on the dual phasin of demand-feeding rhythms in sea bass. Biol. Rhythm Res. 30:
392-406.
Aronsson, U., y S., Holmgren (2000) Muscarinic M·-like receptors, cyclic AMP and L-tuype
calcium channels are involved in the contractile response to cholinergic agents in gut smooth
muscle of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Fish Phyisiol. Biochem. 23: 353-361.
Aswad, D.W. (1984) Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by high
performance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of ophthaldialdehyde. Anal. Biochem. 137: 405- 407.
Auerbach, S.B., Minzenberg, M.J., L.O., Wilkinson (1989) Extracellular serotonin and 5hydroxyindoleacetic acid in hypothalamus of the unanesthetized rat measured by in vivo
dialysis coupled to high-performance liquid chromatography with electrochemical detection.
Brain Res. 499:281–290.
Aust, S., Thalhammer, T., Humpeler, S., Jäger, W., Klimpfinger, M., Tucek, G., Obrist, P.,
Marktl, W., Penner, E., C. Ekmekcioglu (2004) The melatonin receptor subtype MT1 is
expressed in human gallbladder epithelia. J. Pineal Res. 36: 43–48.
Azpeleta, C., Martínez-Álvarez, R.M., Delgado, M.J., Isorna, E., De Pedro, N. (2010). Melatonin
reduces locomotor activity and circulating control in goldfish. Horm. Behav. 57:323-329.
Balashov, I.V., Nozdrachev A.D., V.G., Skopichev (1992) The localization and functional status
of serotonin-producing structures in the gastrointestinal tract of chum salmon fry. Fiziol. Zh.
SSSR Im. I. M. Sechenova. 78: 95-104.
Baldisserotto, B., Mimura, O.M., y L.C., Salomão (1990) Gallbladder bile and plasma ionic
content of some freshwater teleosts. Bol. Fisiol. Anim. (São Paulo). 14: 7–11.
Barrington, E.J.W. (1957) The alimentary canal and digestion. In ―The physiology of fishes”, Vol.
1, Metabolism, ed. M.E. Brown, pp. 106-161. New York: Academic Press.
Barajas-Lopez, C., Peres, A. L., y R., Espinosa-Luna (1996) Cellular mechanisms underlying
adenosine actions on cholinergic transmission in enteric neurons Am. J. Physiol. Cell Physiol.
271:(1) C264-C275
Bartness T.J., Powers J.B., Hastings M.H., Bittman E.L. y B.D., Goldman (1993) The time
infusion paradigm for melatonin delivery: what has it taught us about the melatonin signal, its
reception, and the photoperiodic control of seasonal responses. J. Pineal Res. 15: 161-190.
Baumgarten, H. G. y Z., Grozdanovic (1997) Serotonergic neurons and 5-HT receptors in the
CNS. En: Handbook of Experimental Pharmacology. Vol. 129. Editado por H. G. Baumgarten
y M. Gothert. Springer-Verlag (Berlin, Alemania), pp.: 41-88.
Baumrucker, C. R., Guerino, F., y G. B., Huntington (1989) In ―Absorption and Utilization of
Amino Acids‖ (M. Friedman, ed.), p. 189. CRC Press, Boca Raton, FL.
214
Bibliografía
Baxter, G.S., Craig, D.A., D.E., Clarke (1991) 5-hydroxytryptamine4 receptors mediate relaxation
of the rat oesophageal túnica muscularis mucosae. Naunyn- Schmiedebergs Arch. Pharmacol.
343: 439-446.
Bayarri, M.J., Rol De Lama, M.A., Madrid, J.A., F.J., Sánchez-Vázquez (2003) Both pineal and
lateral eyes are hended to sustain daily circulating melatonin rhythms in the sea bass. Brain
Res. 969:175-182.
Beattie, D.T., y J.A.M., Smith (2008) Serotonin pharmacology in the gastrointestinal tract: a
review. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 377:181-203.
Bechgaard, E., Lindhardt, K., L., Martinsen (1998) High-performance liquid chromatographic
analysis of melatonin in human plasma and rabbit serum with on-line column enrichment. J.
Chromatogr. B. 712: 177-181.
Bégay, V., Falcón, J., Cahill, G.M., Klein, D.C., S.L., Coon (1998) Transcripts encoding two
melatonin synthesis enzymes in the teleost pineal organ: circadian regulation in pike and
zebrafish, but not in trout. Endocrinology 139:905-912.
Beorlegui, C, Martinez, A., P. Sesma (1992) Endocrine cells and nerves in the pyloric ceca and the
intestine of Oncorhynchus mykiss (Teleostei): an immunocytochemical study. Gen. Comp.
Endocrinol. 86: 483-495.
Benyassi, A., Schwartz, C., Coon, S.L., Klein, D.C., J., Falcón (2000) Melatonin synthesis:
arylalkylamine N-acetyltransferases in trout retina and pineal organ are different. Neuroreport.
11:255-258.
Bernard, M., Klein, D.C., M., Zatz (1997) Chick pineal clock regulates serotonin
Nacetyltransferase mRNA rhythm in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:304-309.
Bertrand P., R.L., Bertrand (2010) Serotonin release and uptake in the gastrointestinal tract. Auton
Neurosci.: Bas. Clin. 153: 47–57.
Besancon, R., Simonneaux, V., Jouvet, A., Belin, M.F. y M., Fevre-Montange (1996)
Nycthemeral expression of tryptophan hydroxylase mRNAs in the rat pineal gland. Brain Res.
Mol. Brain Res. 40:136-138.
Besseau, L., Benyassi, A., Møller, M., Coon, S.L., Weller, J.L., Boeuf, G., Klein, D.C., Falcón, J.
(2006). Melatonin pathway:breaking the ―high-at-night‖ rule in trout retina. Exp. Eye Res.
82:620-627.
Binkley, S.A., Riebman, J.B. y K.B., Reilly (1978) The pineal gland : a biolgical clock in vitro.
Science 202, 1198-1200.
Binkley, S. (1988) The pineal: endocrine and neuroendocrine function. In: Hadley, M.E. (Ed.),
Endocrinology Series. Prentice Hall, Englewood CliVs, pp. 175–184.
Binkley, S. (1993) Structures and molecules involved in generation and regulation of biological
rhythms in vertebrates and invertebrates. Experientia. 49: 648-53.
215
Bibliografía
Birks E.K., y R.D., Ewing (1981) Photoperiod effects on hydroxyindole-O-methyltransferase
activity in the pineal gland of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Gen. Comp.
Endocrinol. 43: 277-283.
Boadle-Biber, M. C. (1993) Regulation of serotonin synthesis. Prog. Biophys. Mol. Biol. 60: 1-15.
Bogdanski, D.F., Bonomi, L., y B.B., Brodie (1963) Occurrence of serotonin and catecholamines
in brain and peripheral organs of various vertebrate classes, Life Sci. 2: 1–84.
Bogoeva M., Mileva M.S., K.S., Tsanova (1993) Effect of exogenous melatonin on the twentyfour-hour mitotic activity of some normal mouse tissues. C. R. Acad. Bulgare Sci. 46:107–
110.
Bolliet, V., Ali, M.A., Lapointe, F.J., J., Falcón (1996) Rhythmic melatonin secretion in different
teleost species: an in vitro study. J. Comp. Physiol. B 165: 677-683.
Bolliet, V., Azzaydi, M., y T., Boujard (2001) Effects of feeding time on feed intake. In: D.
Houlihan, T. Boujard and M. Jobling, Editors, Food Intake in Fish, Blackwell Science,
Oxford, pp. 233–249.
Bortoff, A. (1976) Myogenic control of intestinal motility. Physiol. Rev. 56: 416-434.
Bromage, N.R., Randall, C.F., Porter, M. J. R. y B. Davies (1995) How do photoperiod, the pineal
gland, melatonin, and circannual rhythms interact to co-ordinate seasonal reproduction in
salmonid fish? En: Proc. Fifth Int. Symp. Reprod. Biol. Fish. Austin, TX. 95, pp.164-166.
Bradford, T.K., ZJ, P.M., Iuvone (1990) Arylalkylamine (serotonin) Nacetyltransferase assay
using high-performance liquid chromatography with fluorescence or electrochemical detection
of N- acetyltryptamine. Anal Biochem 184:228-234.
Briejer, M.R., Akkermans, L.M.A., Lefebvre, R.A., y J.A.J., Schuurkes (1995) Novel 5-HT2-like
receptor mediates neurogenic relaxation of the guinea-pig proximal colon. Eur. J. Pharmacol.
279 , p. 123.
Bubenik, G.A. (1980) Localization of melatonin in the digestive tract of the rat. Effect of
maturation, diurnal variation, melatonin treatment and pinealectomy. Hormone Res. 12:313–
323.
Bubenik, G.A. (1986) The effect of serotonin, N-acetylserotonin and melatonin on spontaneous
contractions of isolated rat intestine. J. Pineal Res. 3:41-54.
Bubenik G.A. (2001) Localization, physiological significance and possible clinical implication of
gastrointestinal melatonin. Biol. Signals Recept. 10:350–366.
Bubenik, G.A. (2002) Gastrointestinal melatonin localization, function, and clinical relevance.
Digest. Diseases and Sci. 47: 2336-2348.
Bubenik, G.A. (2006) Gastrointestinal melatonin- 30years of research. J. Exp. Zool. 305A: 114114.
216
Bibliografía
Bubenik, G.A. (2008) Thirty four years since the discovery of gastrointestinal melatonin. J.
Physiol. Pharmacol. 59:33-51.
Bubenik, G.A., y S., Dhanvantari (1989) The influence of serotonin and melatonin on some
parameters of gastrointestinal activity. J. Pineal Res. 7: 333-344.
Bubenik, G. A. y G. M., Brown (1997) Pinealectomy reduces melatonin levels in the serum but
not in the gastrointestinal tract of rats. Biol. Signals 6: 40-44.
Bubenik, G.A., y S.F. Pang (1994) The role of serotonin and melatonin in gastrointestinal
physiology: ontogeny, regulation of food intake and mutual serotonin-melatonin feedback. J.
Pineal Res. 16: 91-99
Bubenik, G.A., y S.F., Pang (1997) Melatonin levels in the gastrointestinal tissues of fish,
amphibians, and a reptile. Gen. Comp. Endocrinol. 106:415-419.
Bubenik, G. A., Brown, G. M. y L. J., Grota (1977) Inmunohistological localization of melatonin
in the digestive system of the rat. Experientia 33: 662-663.
Bubenik, G.A., Ball, R.O., S.F., Pang (1992) The effect of food deprivation on brian and
gastrointestinal tissue of tryptophan, serotonin, 5-hydroxyindolacetic acid, and melatonin. J.
Pineal Res. 7-16.
Bubenik, G.A., Niles L.O., Pang, S.F. y P.J., Pentney (1993) Diurnal variations and binding
characteristics of melatonin in the mouse brain and gastrointestinal tissues. Comp. Biochem.
Physiol. 104A:377–380.
Bubenik, G. A., Pang, S. F., Hacker, R. R. y P. S., Smith (1996) melatonin concentrations in
serum and tissues of porcine gastrointestinal tract and their relationship to the intake and
passage of food. J. Pineal Res. 21: 251-256.
Bubenik, G.A., Ayles, H.L., Friendship, R.M., Brown, G.M., R.O., Ball (1998) Relationship
between melatonin levels in plasma and gastrointestinaltissues and the incidence and severity
of gastric ulcers in pigs. J. Pineal Res. 24: 62–66.
Bubenik, G.A., Hacker, R.R., Brown, G.M., L., Baros (1999). Melatonin concentrations in the
luminal fluid, mucosa and muscularis of the bovine and porcine gastrointestinal tract. J. Pineal
Res. 26:56-63.
Bubenik, G.A., Brown, G.M., Hacker, R.R., L., Bartos (2000a) Melatonin concentration in the
gastrointestinal tissues of bovine fetuses. Acta Vet. Brno. 69:177–182.
Bubenik, G.A., Pang, S.F., Cockshut, J.R., Smith, P.S., Grovum, L.W., Friendship, R.M., R.R.,
Hacker (2000b) Circadian variation of portal, arterial and venous blood levels of melatonin in
pigs and its relationship to food intake and sleep. J. Pineal Res. 28:9–15.
Buddington, R.K., y J.M., Diamond (1987) Pyloric ceca of fish: a new absorptive organ. Am. J.
Physiol. 252: G65-G76.
217
Bibliografía
Burnstock, G. (1958) The effect of drugs on spontaneous motility and on response to stimulation
of the extrinsic nerves of the gut of a teleostean fish. Brit. J. Pharmacol. 13:216-226.
Burka, J. F., Blair, R. M., Hogan, J. E. (1989) Characterization of the muscarinic and
serotoninergic receptors of the intestine of the rainbow trout (Salmo gairdneri). Can. J.
Physiol. Pharmacol., 67: 477-482.
Burka J.F., Blair, R.M.J., Chong C. y J.E., Hogan (1990) Effects of calcium channel blockers on
pharmacologically induced contractions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish
Physiol. Biochem. 8: 251–527.
Burkhardt-Holm, P. y Holmgren, S. (1989) A comparative study of neuropeptides in the intestine
of two stomachless teleost (Poecilia reticulata, Leuciscus idus melanotus) under conditions of
feeding and starvation. Cell Tissue Res., 255: 245-254.
Byrne, J.E., (1970) Locomotor activity responses in juvenile sockeye salmon, Oncorhynchus
nerka, to melatonin and serotonin. Can J. Zool. 48: 1425-1427.
Caamaño-Tubío, R.I., Pérez, J., Ferreiro, S., M., Aldegunde (2007) Peripheral serotonin dynamics
in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem. Physiol. Part C 145:245-255.
Cabeza, J., Motilva, V., Martin, M. J. y C. A., De La Lastra (2001) Mechanism involved in gastric
protection of melatonin against oxidant stress by ischemia-reperfusion in rats. Life Sci. 68:
1405-1415.
Cahill G.M., (1996) Circadian regulation of melatonin production in cultures zabrafish pineal and
retina. Brain Res. 708: 177-181.
Callaghan, B.D. (1991) The effect of pinealectomy and autonomic denervation on crypt cell
proliferation in the rat small intestine. J. Pineal Res. 10:180–185.
Callaghan, B.D. (1995) The long-term effect of pinealectomy on the crypts of the rat
gastrointestinal tract. J. Pineal Res. 18:191– 196.
Camello, P.J., Pozo, M.J., Salido, G.M., et al. (1991) Ultradian rhythms in canine gallblader bile
composition. J. Interdiscipli. Cycle Res. 22 (3): 281-291.
Carr, J.A. (2002) Stress, Neuropeptides, and Feeding Behavior: A Comparative Perspective.
Integr. Comp. Biol. 42 (3): 582-590.
Carrillo-Vico, A., Calvo, J.R., Abreu, P., Lardone, P.J., García-Maurino, S., Reiter, R.J., J.M.,
Guerrero (2004) Evidence of melatonin synthesis by human lymphocites and its physiological
significance: possible role as intracrine, autocrine, and/or paracrine substance. FASEB J.
18:537-539.
Carrillo-Vico, A., Reiter, R.J., Lardone, P.J., Herrera, J.L., Fernández-Montesino, R., Guerrero,
J.M., D., Pozo (2006) The modulatory role of melatonin on immune responsiveness. Curr.
Opin. Investig. Drugs 7:423-431.
218
Bibliografía
Ceinos, R.M., Chansard, M., Revel, F., Calgari, C., Míguez, J.M. y V., Simonneaux (2004)
Analysis of andrenergic regulations of mela-tonin synthesis in Siberian hamster pineal
emphasizes the role of HIOMT. Neurosignals 13: 308-317.
Ceinos, R.M., Rabade, S., Soengas, J.L. y J.M., Miguez (2005) Indoleamines and 5methoxyindoles in trout pineal organ in vivo: daily changes and influence of photoperiod.
Gen. Comp. Endocrinol. 144: 67-77.
Ceinos, R.M., Polakof, S., Rodriguez, A., Soengas, J.L. y J. M., Míguez (2008) Food deprivation
and refeeding effects on pineal índoles metabolism and melatonin synthesis in the rainbow
trout Oncorrhynchus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 156: 410-417.
Cervantes, C.R.C., Barbosa, R.D., Faro, L.R., Adan, L.V., Gago-Martínez, A., M.A. Pallares
(2009) Differential changes of neuroactive amino acids in simples obtained from discrete rat
brain regions alter systemic administration of saxitoxin. Neurochem Int.54: 308-313.
Challet, E., Pévet P., Vivien-Roels, B., y A., Malan (1997) Phase-advanced daily rhythms of
melatonin, body temperature, and locomotor activity in food-restricted rats fed during
daytime. J. Biol. Rhythms 12: 65–79.
Chanut, E., Nguyen-Legros, J., Versaux-Botteri, C., Trouvin, J.H., J.M., Launay (1998)
Determination of melatonin in rat pineal, plasma and retina by high-performance liquid
chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. B 709: 11-18.
Chen, K.H., Wu, F., Grimsby, J., J.C., Shih (1994) Cloning of a novel monoamine oxidase cDNA
from trout liver. Mol. Pharmacol. 46: 1226-1233.
Chik, C., Ho A.K., G.M., Brown (1987) Effect of food restriction on 24-h serum and pineal
melatonin content in male rats. Acta Endocrinol. 115:507–513.
Choich, J.A., El-Nabawi A., y E.K., Silbergeld (2004) Evidence of histamine receptors in fish
brain using an in vivo [14C]2-deoxyglucose autoradiographic method and an in vitro receptorbinding autoradiographic method. Environ. Res.94: 86–93.
Chomczynsky, P., y N., Sacchi (1987) Single-step method of RNA isolation by guanidinium
thiocyanate–phenol–chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–169.
Chow, P.H., Lee, P.P.N., Poon, A.M.S., Shiu, S.Y.W., S.F., Pang (1996) The gastrointestinal
system: A site of melatonin paracrine action. 21:123–132.
Clemens, J.W., Jarzynka, M.J., y P.A., Witt-Enderby (2001) Down-regulation of mt1 melatonin
receptors in rat ovary following estrogen exposure. Life Sci. 69: 27–35.
Clements, K. D., y D., Raubenheimer (2005) Feeding and nutrition. In D. H. Evans, editor. The
physiology of fishes. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 616 p.
Coates, M.D., Mahoney, C.R., Linden, D.R., Sampson, J.E., Chen, J., Blaszyk, H., Crowell,
M.D., Sharkey, K.A., Gershon, M.D., Mawe, G.M., G.M., Moses (2004) Molecular defects in
219
Bibliografía
mucosal serotonin content and decreased serotonin reuptake transporter in ulcerative colitis
and irritable bowel syndrome. Gastroenterology 126: 1657–1664
Confente, F., Rendón, M.C., Besseau, L., Falcón J., y J.A., Muñoz-Cueto (2010) Melatonin
receptors in a pleuronectiform species, Solea senegalensis: Cloning, tissue expression, day–
night and seasonal variations. Gen. Comp. Endocrinol. 167: 202-214.
Conti, A., Conconi, S., Hertens, E., Skwarlo-SontA, K., Markowska, M., J.M., Maestroni, (2000)
Evidence for melatonin synthesis in mouse and human bone marrow cells. J. Pineal Res.
28:193-202.
Coon, S.L., D.C., Klein (2006) Evolution of arylalkylamine N-acetyltransferase: emergence and
divergence. Mol. Cell Endocrinol. 252:2-10.
Coon, S.L., Roseboom, P.H., Boler, R., Weller, J.L., Namboodiri, M.A., Koonin, E.V., D.C.,
Klein (1995) Pineal serotonin N-acetyltransferase: expression, cloning and molecular analysis.
Science 270:1681-1683.
Coon, S.L., Bégay, V., Falcón, J., D.C., Klein (1998) Expression of melatonin synthesis genes is
controlled by a circadian clock in the pike pineal organ but not in trout. Biol. Cell. 90:399-405.
Coon, S.L., Bégay, V., Deurloo, D., Falcón, J., D.C., Klein (1999) Two arylalkylamine
Nacetyltranseferase genes mediate melatonin synthesis in fish. J. Biol. Chem. 274:9076-9082.
Costa, M., Furness, J. B., Cuello, A. C., Verhofstad, A. A. J., Steinbusch, H. W. J., R. P., Elde
(1982) Neurons with 5-hydroxytryptamine-like immunoreactivity in the enteric nervous
system: their visualization and reactions to drug treatment. Neuroscience 7: 351-364.
Côte, F., Thevenot, E., Fligny, C., Fromes, Y., Darmon, M., Ripoche, M. A., Bayard, E., Hanoun,
N., Saurini, F., Lechat, P., Dandolo, L., Hamon, M., Mallet, J., G. Vodjdani (2003) Disruption
of the nonneuronal tph1 gene demonstrates the importance of peripheral serotonin in cardiac
function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 13525-13530.
Cote, F., Fligny, C., Fromes, Y., Mallet, J., G., Vodjdani (2004) Recent advances in understanding
serotonin regulation of cardiovascular function. Trends Mol. Med., 10: 232-238.
Craig, S. R., Neill, W. H. y D. M., III, Gatlin (1995) Effects of dietary lipid and environmental
salinity on growth, body composition, and cold tolerance of juvenile red drum (Sciaenops
ocellatus). Fish Physiol. Biochem. 14:49-61.
Cuesta, A., Rodríguez, A., Calderón, M.V., Meseguer, J., y M.A., Esteban (2007) Effect of the
Pineal Hormone Melatonin on Teleost Fish Phagocyte Innate Immune Responses After in
vitro Treatment. J. Exp. Zool. 307A:509–515.
Cymborowski, I. (2010) Introduction to Circadian Rhythms. En: Biological clock in fish.
Editores: Kulczykowska, E., Popek, W., Kapoor, B.G. Enfield (NH) : Science Publishers,
264p.
220
Bibliografía
Damiola, F., Le Minh, N., Preitner, N., Kornmann, B., Fleury-Olela, F., U., Schibler (2000)
Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central
pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes Dev. 14:2950-2961.
Darmon, M.C., Grima, B., Cash, C.D., Maitre, M., J., Mallet (1986) Isolation of a rat pineal gland
cDNA clone homologous to tyrosine and phenylalanine hydroxylases. FEBS Lett. 206: 43-46.
Datla, K.P., y G., Curzon (1996) Effect of p-chlorophenylalanine at moderate dosage on 5-HT and
5-HIAA concentrations in brain regions of control and p-chloroamphetamine treated rats.
Neuropharmacology 35: 315–320.
De Lastra, C.A., Cabeza, J., Motilva, V., M.J., Martin (1997) Melatonin protects against gastric
ischemia reperfusion injury in rats. J. Pineal Res. 23: 47–52.
De Pedro, N., Pinillos, M.L., Valenciano, A.I., Alonso-Bedate, M. y M.J., Delgado (1998)
Inhibitory effect of serotonin on feeding behaviour in goldfish: involvement of CRF. Peptides
19:505–511.
De Pedro, N., Martínez-Álvarez, R., M.J., Delgado (2008) Melatonin reduces body weight in
goldfish (Carassius auratus): effects on metabolic resources and some feeding regulators. J.
Pineal Res. 45:32-39.
De Vlaming, V.L. (1980) Effects of pinealectomy and melatonin treatment on growth in the
goldfish, Carassius auratus. Gen. Comp. Endocrinol. 40: 245-250.
De Vry, J. y R., Schreiber. (2000) Effects of selected serotonin 5-HT(1) and 5-HT(2) receptor
agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24:
341-353.
DeBoer, H. (1988) The influence of photoperiod and melatonin on hormone levels and operand
light demand in the pig. PhD thesis. University of Guelph, Ontario, Canada.
Deguchi, T. (1992) Physiology and molecular biology of arylamine Nacetyltransferases.
Biomedical Res. 13:231-242.
Delgado, M.J., Alonso-Gomez, A.L., Gancedo, B., De Pedro, N., Valenciano, A.I., M. AlonsoBedate (1993) Serotonin N-acetyltransferase (NAT) activity and melatonin levels in the frog
retina are not correlated during the seasonal cycle. Gen. Comp. Endocrinol. 92:143–150.
Drago, F., Macauda, S., S., Salehi (2002) Small doses of melatonin increase intestinal motility in
rats. Dig. Dis. Sci. 47:1969-1974.
Domeneghini, C., Radaelli, G., Arrighi, S., Mascarello, F. y A., Veggetti (2000) Neurotransmitters
and putative neuromodulators in the gut of Anguilla anguilla (L.). Localizations in the enteric
nervous and endocrine systems. Eur. J. Histochem. 44: 295-306.
Dubocovich, M.L., M., Markowska (2005). Functional MT1 and MT2 receptors in mammals.
Endocrine 27:101-110
221
Bibliografía
Dubocovich, M.L., Yun, K., Al-Ghoul, W.M., Benloucif, S., M.I., Masana (1998) Selective M2
melatonin receptor antagonists block melantonin- mediated phase advances of circadian
rhythms. FASEB J 12:1211–1220.
Ezeasor D.N., y W.M., Stokoe (1981) Light and electron microscopic studies on the absorptive
cells of the intestine, caeca and rectum of the adult rainbow trout, Salmo gairdneri, Rich., J.
Fish Biol. 18: 527–554.
Edwards, D., Hall, R. T., J. A., Brown (1986) The characteristics and distribution of monoamine
oxidase (MAO) activity in different tissues of the rainbow trout Salmo gairdneri. Comp.
Biochem. Physiol. C, 84: 73-77.
Ehret, M., Cash, C.D., Hamon, M., y M., Maitre (1989) Formal demonstration of the
phosphorylation of rat brain tryptophan hydroxylase by calcium/calmodulin-dependent protein
kinase, J. Neurochem. 52: 1886–1891
Ehret, M., Pévet, P. y M., Maitre (1991) Tryptophan hydroxylase synthesis is induced by 3',5'cyclic adenosine monophosphate during circadian rhythm in the rat pineal gland. J.
Neurochem. 57: 1516-21.
Einarsson S., y P.S., Davies (1996) On the localisation and ultrastructure of pepsinogen,
trypsinogen, and chymotrypsinogen secreting cells in the Atlantic salmon, Salmo salar L.
Comp. Biochem. Physiol. 114B: 295–301
Einarsson, S., P.S., Davies (1997) A multiductal system conveys digestive enzymes from the
pancreas into the intestine in the Atlantic salmon. J Fish Biol 50: 1120–1123.
Ekmekcioglu, C., Haslmayer, P., Philipp, C., Mehrabi, M.R., Glogar, H.D., Grimm, M.,
Leibetseder, V.J., Thalhammer, T., W., Marktl (2001) Expression of the MT1 melatonin
receptor subtype in human coronary arteries. J. Recept. Signal Transduct Res. 21:85-91.
Ekmekcioglu, C. (2006) Melatonin receptors in humans: biological role and clinical relevance.
Biomed. Pharmacother 60:97-108.
Ekström, P., H., Meissl (1997) The pineal organ of teleost fishes. Rev. Fish Biol. Fish. 7:199-284.
El-Salhy, M., Winder, E., M., Lundqvist (1985) Comparative studies of serotonin-like
immunoreactive cells in the digestive tract of vertebrates. Biomed. Res. 6: 371–375.
Ercan, F., Cetinel, S., Contuk, G., Cikler, E. y G., Sener (2004) Role of melatonin in reducing
wáter avoidance stress-induced degeneration of the gastrointestinal mucosa. J. Pineal Res. 37:
113-121.
Eriksson, L.O. (1978) Nocturnalism versus diurnalism – dualism within fish individuals. En: J.E.
Thorpe, Editor, Rhythmic Activity of Fishes, Academic Press, New York, pp. 69–89.
Erspamer, V. (1954) Il sistema cellulare enterocromaffine ae l‘enteramina (5-idrossitriptamina).
Rend. Sci. Farmitalia, 1: 1-193.
222
Bibliografía
Essman, W. B. (1978) Serotonin Distribution in Tissues and Fluids. En: Serotonin in Health and
Disease. Volume I: Availability, Locatization and Disposition. Editado por W. B. Essman,
M.D., Ph.D. Spectrum Publications, Inc. (New York, USA), pp.: 15-179.
Evans, D.H., y J.B., Claiborne (2006) The physiology of fishes, 3rd Edicion, Taylo & Francis
group, Boca Raton, Florida. 601p.
Falcón, J. (1999) Cellular circadian clocks in the pineal. Prog. Neurobiol. 58:121-162.
Falcón, J. y J. P., Collin (1989) Photoreceptors in the pineal of lower vertebrates: functional
aspects. Experientia 45: 909-913.
Falcón, J., Guerlotté, J., Voisin, P. y J.P., Collin (1987) Rhythmic melatonin biosynthesis in a
photoreceptive pineal organ: a study in the pike. Neuroendocrinology 45: 479-486.
Falcón, J., Thibault, C., Bégay V., Zackmann A., y J.P. Collin, (1992) Regulation of the rhythmic
melatonin secretion by the fish pineal photoreceptor cells. In: M.A. Ali, Editor, Rhythms in
fishes, NATO ASI Series A: Life Sciences vol. 236, Plenum Press, New York, pp. 167–198.
Falcón, J., Bolliet, V., Ravault, J.P., Chesneau, D., Ali, M.A. y J.P., Collin (1994) Rhythmic
secretion of melatonin by the superfused pike pineal organ: thermo- and photoperiod
interaction. Neuroendocrinology 60: 535-543.
Falcón, J., Boilliet, V., J.P., Collin (1996) Partial characterization of serotonin Nacetiltransferases
from northern pike (Esox lucius, L.) pineal organ and retina. Pflugers Arch. 432:386-393.
Falcón, J., Besseau, L., Fazzari, D., Attia, J., Gaildrat, P., Beauchaud, M., G., Boeuf (2003)
Melatonin modulates secretion of growth hormone and prolactin by trout pituitary glands and
cells in culture. Endocrinology. 104: 4648-4658.
Falcón, J., Besseau, L., Sauzet, S., G., Boeuf (2007) Melatonin effects on the hypothalmo-pituitary
axis in fish. Trends Endocrinol. Metab. 18:81-88.
Falcón, J., Besseau, L., Fuentès, M., Sauzet, S., Magnanou, E., G., Boeuf (2009) Structural and
functional evolution of the pineal melatonin system in vertebrates. Ann. N. Y. Acad. Sci.
1163:101-111.
Falcón, J., Migaud, H., Muñoz-Cueto, J.A., M., Carrillo (2010) Current knowledge on the
melatonin system in teleost fish. Gen. Comp. Endocrinol. 165:469-482.
Feliciano, A., Vivas, Y., De Pedro, N., Delgado, M.J., Velarde, E., E., Isorna (2011) Feeding time
synchronizes clock gene rhythmic expression in brain and liver of goldfish (Carassius
auratus) J. Biol. Rhythms. 26: 24-33
Fernández-Durán, B., Ruibal, C., Polakof, S., Ceinos, R.M., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2007)
Evidence for arylalkylamine N-acetyltransferase (AANAT2) expression in rainbow trout
peripheral tissues with emphasis in the gastrointestinal tract. Gen. Comp. Endocrinol.
152:289-294.
223
Bibliografía
Fernstrom, J. D. y R. J., Wurtman (1972) Brain serotonin content: regulation by plasma neutral
amino acids. Science, 178: 414-416.
Fernstrom, J.D. (1983) Role of precursor availability in the control of monoamine biosynthesis in
brain. Physiol Rev. 63:484–546.
Ferretti, C., Blengio, M., Ghi, P., y E., Genazzani (1990) Differential effects of indolepyruvic acid
and 5-hydroxytryptophan on indole metabolism in the pineal gland of the rat during the lightdark cycle. Eur. J. Pharmacol. 187:345-356.
Field, M. (1993) Intestinal electrolyte secretion: history of a paradigm. Arch. Surg. 128: 273-278
Fioretti, M.C., Menconi, E., C., Ricardi (1974) Mechanism of the in vitro 5-hydroxytryptamine (5HT) antagonism exerted by pineal indole derivatives. Riv. Farmacol. Ter. 5: 43-49.
Forgan, L.G., M.E., Forster (2007) Effects of potential mediators of an intestinal brake mechanism
on gut motility in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Comp. Biochem. Physiol.
Part C 146:343-347.
Forsberg, E. J., y R.J., Miller (1982) Cholinergic agonists induce vectorial release of serotonin
from duodenal enterochromaffin cells. Science, 217: 355-356.
Forsberg, E. J., y R.J., Miller (1983) Regulation of serotonin release from rabbit intestinal
enterochromaffin cells. J. Pharmacol. Exp. Ther., 227: 755-766.
Fowler, C. J., Oreland, L., B. A., Callingham (1981) The acetylenic monoamine oxidase inhibitors
clorgyline, deprenyl, pargyline and J-508: their properties and applications. J. Pharm.
Pharmacol. 33: 341–347.
Friedman, P. A., Kappelman, A. H., S., Kaufman (1972) Partial purification and characterization
of tryptophan hydroxylase from rabbit hindbrain. J. Biol. Chem., 247: 4165-4173.
Frungieri, M., Mayerhofer, A., Zitta, Z., Pignataro, O.P., Calandra, R.S., y S. I., Gonzalez-Calvar
(2005) Direct effect of melatonin on syrian hamster testes: melatonin subtype 1a receptors,
inhibition of androgen production, and interaction with the local corticotropin-releasing
hormone system. Endocrinology 146(3):1541–1552.
Fu, Z., Kato, H., Kotera, N., Noguchi, T., Sugahara, K., T., Kubo (2001) Regulation of
hydroxyindole-O-methyltranferase gene expression in Japanese quail (Coturnix coturnix
japonica) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:2504-2511.
Furness, J. B., y M., Costa (1987) Studies of neuronal circuitry of the enteric nervous system. En:
The Enteric Nervous System. Churchill Livingstone, Edinburgh pp. 164-169.
Gaildrat, P. y J., Falcón (1999) Expression of melatonin recptor and 2-[125I]-iodomelatonin
binding sites in the pituitary of a teleost fish. Adv. Exp. Med. Biol. 460: 61-72.
224
Bibliografía
Gaildrat, P., y J. Falcón (2000). Melatonin receptors in the pituitary of a teleost fish: mRNA
expression 2-[125I]-iodomelatonin binding and cyclic AMP response. Neuro-endocrinology.
72: 57-66.
Gaildrat, P., Becq, F., J. Falcón (2002) First cloning and functional characterization of a melatonin
receptor in fish brain: a novel one? J. Pineal Res. 32:74-84.
Ganguly, S., Weller, J.L., Ho, A., Chemineau, P., Malpaux,B., Klein, D.C. (2005) Melatonin
synthesis: 14-3-3-dependent activation and inhibition of arylalkylamine N-acetyltransferase
mediated by phosphoserine-205. Proc Natl Acad Sci USA 102:1222–1227.
Garcia-Pergañeda, A., Pozo, D., Guerrero, J.M. y J.R., Calvo (1997) Signal transduction for
melatonin in human lymphocytes: involvement of a pertussis toxin-sensitive G protein. J.
Immunol. 159: 3774-3781.
Garattini, S. (1987) Mechanisms of anoretic activity of dextrofenfluramine. In: Body Weight
Control. Editado por A. E. Bender y L. J. Brookes. Churchill Livingstone (Edinburgh,
Scotland), pp.: 261-270.
Gauer, F., Poirel, V.J., Garidou, M.L., Simonneaux, V., P., Pévet (1999) Molecular cloning of the
arylalkylamine-N-acetyltransferase and daily variations of its mRNA expression in the Syrian
hamster pineal gland. Mol. Brain Res. 71:87-95.
Gern, W.A. y C.L., Ralph (1979) Melatonin synthesis by retina. Science 204: 183-184
Gern, W.A., Duvall, D., y J.M., Nervina (1986) Melatonin: A discussion of its evolution and
actions in vertebrates. Am. Zool. 26: 985–996.
Gern, W. A., y S. S., Greenhouse (1988) Examination of in vitro melatonin secretion from
superfused trout (salmo gaisdneri) pineal organs maintained under diel illumination or
continous darkness. Gen. comp. Endocrinol. 71: 163-174.
Gern, W.A., Owens, D.W., C.L., Ralph (1978) Plasma melatonin in the trout: Day-night change
demonstrated by radioimmunoassay. Gen. Comp. Endocrinol. 34: 453-458.
Gern W.A., Greenhouse, S.S., Nervina, J.M., y J.P., Gasser (1992) The rainbow trout pineal
organ: an endocrine photometer. En: Rhythms in fishes. Ali, M.A. (ed.). Plenum Press, New
York. pp. 199-1218
Gershon, M. D. (1982) Serotonergic neurotransmission in the gut. Scand. J. Gastroenterol. 17: 2641.
Gershon, M.D. (2003) Plasticity in serotonin control mechanisms in the gut. Curr Opin
Pharmacol. 3(6):600–607.
Gershon, M.D., (2004) Review article: serotonin receptors and transporters—roles in normal and
abnormal gastrointestinal motility. Aliment. Pharmacol. Ther. 20: 3–14.
225
Bibliografía
Gershon, M.D., y J., Tack (2007) The serotonin signalling system: from basic understanding to
drug development for functional GI disorders. Gastroenterology 132:397-414
Gershon, M. D., Dreyfus, C. F., Pickel, V. M., Joh, T. H., D. J., Reis (1977) Serotoninergic
neurons in the peripheral nervous system: identification in gut by inmunohistochemical
localization of tryptophan hydroxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3086-3089.
Gershon, M. D., Sherman, D. L., y J. E., Pintar (1990) Type-specific localization of monoamine
oxidase in the enteric nervous system: relatonship to 5-hydroxytryptamine, neuropeptides, and
sympathetic nerves. J. Comp. Neurol. 301: 191-213.
Gesto, M., Tintos A., Soengas J.L., J.M., Míguez (2006) Effects of acute and prolonged
naphthalene exposure on brain monoaminergic neurotransmitters in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Comp. Biochem. Physiol. C 144:173–183.
Gesto, M. (2008) Efectos a nivel neuroendocrino de la exposicion a hidrocarburos aromaticos
policíclicos en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Tesis doctoral. Universidad de Vigo,
Vigo, España 155p.
Gesto, M., Tintos, A., Álvarez, R., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2009) Alterations in the brain
monoaminergic neurotransmitters of rainbow trout related to naphthalene exposure at the
beginning of vitellogenesis. Fish Physiol Biochem 35: 453-465.
Gibbs, F.P. y J., Vriend (1981) The half-life of melatonin elimination from rat plasma.
Endocrinology 109:1796-1798.
Gibson, G.E. (1985). Hypoxia. In: Cerebral Energy Metabolism and Metabolic
Encephalopathy(ed. D. W. McCandless),. New York, London: Plenum Press. pp. 43-78.
Gillis, C. N. (1985) Peripheral metabolism of serotonin. En: Serotonin and the Cardiovascular
System. Editado por P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 27-36.
Gingerich, W. H., y L. J., Weber (1979) ―Assessment of Clinical Procedures to Evaluate Liver
Intoxication in Fish,‖ Ecol. Res. Ser. EPA, Duluth, MN.
Goldman, B.D. (2001) Mammalian photoperiodic system: formal properties and neuroendocrine
mechanism of photoperiodic time measurement. J. Biol. Rhythms. 16: 283-301.
Green, K., y G., Campbell (1994) Nitric oxide formation is involved in vagal inhibition of the
stomach of the trout (Salmo gairdneri). J. Auton. Nerv. Syst. 50: 221–229.
Grewe, P.H., Billington, N.E. y P.D.N., Herbert (1990) Phylogenetic relationships among
members Salvelinus inferred from mitochondrial DNA divergence. Can. J. Fish Aquat. Sci.
47: 984-991.
Grove, D.J., y C., Campell (1979) The role of extrinsic and intrinsic nerves in the coordination of
gut motility in the stomachless flatfish Rhombosolea tapirina and Ammotretis rostrata
Guenther. Comp. Biochem. Physiol. 63C: 143–159.
226
Bibliografía
Grove, D.J., y S., Holmgren (1992) Mechanisms controlling stomach volume of the Atlantic cod
(Gadus morhua) following gastric distension. J. Exp. Biol. 163: 49–63.
Grübe, D. (1976) The endocrine cells of the gastrointestinal epithelium and the metabolism of
biogenic amines in the gastrointestinal tract. Prog. Histochem. Cytochem., 8: 1-128.
Guerrero, J.M., Pozo, D., García-Maurino, S., Osuna, C., Molinero, P., y J.R., Calvo (2000)
Involvement of nuclear receptors in the enhanced IL-2 production by melatonin in Jurkat cells.
Ann. N.Y. Acad. Sci. 917: 397-403.
Gustafsson, B.I., Bakke, I., Tommeras, K. y H.L., Waldum (2006). A new method for
visualization of gut mucosal cells, describing the enterochromaffin cell in the rat
gastrointestinal tract. Scand J Gastroenterol 41: 390–395.
Gwak, W.S., Seikai, T. y M., Tanaka (1999) Evaluation of starvation status of laboratory-reared
Japanese flounder Paralichthys olivaceus larvae and juveniles based on morphological and
histological characteristics. Fisheries Sci. 65: 339–346.
Hafeez, M.A., y W.B., Quay (1970) Pineal acetylserotonin methyltransferase activity in the teleost
fishes, Herperoleucus symmetricus and salmo gairdneri, with evidence for lack of effect of
constant light and darkness. Comp. Gen. Pharmacol. 1: 257-262.
Halver, J. (1989) Fish nutrition, pp. 798. Academic Press, San Diego, California.
Halver, J. y R., Hardy (2002) Fish nutrition, pp. 824. Third edition, Academic Press, San Diego,
California.
Hamase, L., Hirano, J., Kosai, Y., Tomita, T., K., Zaitsu (2004) A sensitive internal standard
method for the determination of melatonin in mammals using precolumn oxidation reversedphase high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B 811: 237-241.
Hansen, M.B. (2003) Neurohumoral control of gastrointestinal motility. Physiol. Res. 52: 1-30.
Hansen, M.B., y E., Skadhauge (1997) Signal transduction pathways for serotonin as an intestinal
secretagogue. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 118: 283–290.
Hansen, H.B., y A.B., Witte (2008) The role of serotonin in intestinal luminal sensing and
secretion. Acta Physiol. 193:311-323.
Hara, R., Wan, K., Wakamatsu, H., Aida, R., Moriya, T., Akiyama, M. y S., Shibata (2001).
Restricted feeding entrains liver clock without participation of the suprachiasmatic nucleus.
Genes Cells. 6: 269-278.
Harumi, T., y S., Matsushima (2000) Separation and assay methods for melatonin and its
precursors. J. Chromatogr. B 747: 95-110.
Hardeland, R., B., Poeggeler (2003) Non-vertebrate melatonin. J. Pineal. Res. 34:233- 241.
227
Bibliografía
Harder, W. (1975) Anatomy of fishes, part I, Stuttgart: E. Schweizerbart‘sche Verlagsbuchhandlung. 612pp.
Harlow, H.J., B.L., Weekly (1986) Effect of melatonin on the force of spontaneous contractions
of in vitro rat small and large intestine. J. Pineal Res. 3:277-284.
Hernández, J. (2011) Efecto protector de la melatonina frente a las alteraciones del sistema
circadiano intestinal del pez cebra (danio rerio) durante el envejecimiento. Proyecto fin de
Master, Universidad de Vigo, España. 22p.
Herrero, M.J., Martínez, F.J., Míguez, J.M., J.A., Madrid (2007) Response of plasma and
gastrointestinal melatonin, plasma cortisol and activity rhythms of European sea bass
(Dicentrarchus labrax) to dietary supplementation with tryptophan and melatonin. J. Comp.
Physiol. B 177: 319-326.
Hirata, F., Hayaishi, O., Tokuyama, O., Senoh, S. (1974). In vitro and in vivo formation of two
new metabolites of melatonin. J. Biol. Chem. 249:1311-1313.
Hirschowitz, B.I. (1957) Pepsinogen, its origins, secretion and excretion. Physiol. Rev. 37: 475511.
Hibiya, T. (1982) ―An Atlas of Fish Histology: Normal and Pathological Features.‖ Kodansha,
Tokyo. 213 pp.
Hilton, J.W. y D.G., Dixon (1982) Effect of increased liver glycogen and liver weight on liver
function in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson: recovery from anaesthesia and plasma
35
S-sulphobromophthalein clearance. J. Fish Dis. 5: 185–195.
Hoegg, S., Brinkmann, H., Taylor, J.S., A., Meyer (2004) Phylogenetic timing of the fishspecific
genome duplication correlates with the diversification of teleost fish. J. Mol. Evol. 59:190203.
Höglund, E., Sørensen, C., Bakke, M. J., Nilsson G. E., y Ø., Øverli (2007) Attenuation of stressinduced anorexia in brown trout (Salmo trutta) by pre-treatment with dietary L-tryptophan. Br.
J. Nutr. 97:786–789.
Hollands, T.R. (1974). Constant temperature tissue bath for the in vitro measurement of muscle
tension. Lab. Pract. 23:253-254.
Holloway, W. R., Grota, L. J. y G. M., Brown (1985) Immunohistochemical Assessment of
Melatonin Binding in the Pineal Gland. J. Pineal Res. 2,3: 235–251.
Holloway, W. R., Grota, L. J. y G. M., Brown (1980) Determination of immunoreactive melatonin
in the colon of teh rat by immunocytochemistry. J. Histochem. 28: 255-262.
Holmgren, S., Grove, D. J. y S., Nilsson (1985). Substance P acts by releasing 5hydroxytryptamine from enteric neurons in the stomach of the rainbow trout, Salmo gairdneri.
Neuroscience 14: 683–693.
228
Bibliografía
Holmberg, A., Olsson, C., S., Holmgren (2006) The effects of endogenous and exogenous nitric
oxide on gut motility in zebrafish, Danio rerio, embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207: 923935.
Holmberg, A., Olsson, C., G.W., Hennig (2007) TTX-sensitive and TTX-insensitive control of
spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol.
210:1084-1091.
Holmgren, S., C., Olsson (2009) The neuronal and endocrine regulation of gut function. En: Fish
neuroendocrinology. (Eds. N.J. Bernier, G. Van Der Kraak, A.P. Farrell, C.J. Brauner).
Academic Press, Oxford. pp 467-512.
Hong, G.X. y S.F., Pang (1995) N-acetyltransferase activity in the quail (Coturnix coturnix jap)
duodenum. Comp. Biochem. Physiol. 112B: 251-262.
Horn, M.H. (1998) Feeding and digestion. En: The physiology of fishes. (Ed.: D.H. Evans). CRC
Press, New York. pp 43-63.
Hoyer, D., Hannon, J.P., Martin, G.R., (2002) Molecular, pharmacological and functional
diversity of 5-HT receptors. Pharmacol. Biochem. Behav. 71:533– 554.
Hseu, J.R., Lu F.I., Su, H.M., Wang, L.S., Tsai, C.L., P.P., Hwang (2003) Effect of exogenous
tryptophan on cannibalism, survival and growth in juvenile grouper, Epinephelus coioides.
Aquaculture 218: 251–263.
Hubel, K.A. (1985) Intestinal nerves and ion transport: stimuli, reflexes, and responses. Am. J.
Physiol. 248:G261-G271.
Huether, G. (1993) The contribution of extrapineal sites of melatonin synthesis to circulating
melatonin levels in higher vertebrates. Experientia 49:665–670.
Huether, G., (1994) Melatonin synthesis in the gastrointestinal tract and the impact of nutritional
factors on circulating melatonin. Ann. N. Y. Acad. Sci. The Aging Clock 719: 146–158.
Huether, G., Poegeller, B., Reimer, R., A., George (1992) Effect of tryptophan administration on
circulating melatonin levels in chicks and rats: evidence for stimulation of melatonin synthesis
and release in the gastrointestinal tract. Life Sci. 51:945-53.
Huether, G., Messner, M., Rodenback, A., R., Hardeland (1998) Effects of continuous infusion on
steady state plasma melatonin levels under near physiological conditions. J. Pineal Res.
24:146–15.
Ianas, O., Olnescu, R., y I., Badescu (1991) Melatonin involvement in oxidative stress, Rom. J.
Endocrinol. 29 (1991), pp. 147–153.
Iigo, M., Kezuka, H., Aida, K. y I., Hanuy (1991) Circadian rhythms of melatonin secretion from
superfused goldfish (Carassius auratus) pineal glands in vitro. Gen. Comp. Endocrinol. 83:
152-158.
229
Bibliografía
Iigo, M., y K., Aaida (1995) Effects of season, temperaure, and photoperiod on plasma melatonin
rhythms in the golfish, Carassius auratus. J. Pineal Res. 18, 62-68.
Iigo, M., Furukawa, K., Tabata, M., K., Aida (2003) Circadian variations of melatonin binding
sites in the goldfish brain. Neurosci. Lett. 347:49-52.
Iigo, M., Abe T., Kambayashi, S., Oikawa, K., Masuda, T., Mizusawa, K., Kitamura, S., Azuma,
T. Takagi, Y., Aida, K., y T., Yanagisawa (2007) Lack of circadian regulation of in vitro
melatonin release from the pineal organ of salmonid teleosts. Gen. Comp. Endocrinol. 154:
91-97.
Iinuma, F., Hamase, K., Matsubayashi, S., Takahashi, M., Watanabe, M., K., Zaitsu (1999)
Sensitive determination of melatonin by precolumn derivatization and reversed-phase highperformance liquid chromatography. J. Chromatogra. A 835:67-72.
Ikegami, T., Azuma, K., Nakamura, M., Suzuki, N., Hattori, A., H., Ando (2009a) Diurnal
expressions of four subtypes of melatonin receptor genes in the optic tectum and retina of
goldfish. Comp. Biochem. Physiol. A 152:219-224.
Ikegami, T., Motohashi, E., Doi, H., Hattori, A., H., Ando (2009b) Synchronized diurnal and
circadian expression of four subtypes of melatonin receptor genes in the diencephalon of a
puffer fish with lunar-related spawning cycles. Neurosci. Lett. 469:58-63.
Isorna, E., Besseau, L., Boeuf, G., Desdevises, Y., Vuilleumier, R., Alonso-Gómez, A.L.,
Delgado, M.J., J., Falcón (2006) Retinal, pineal and diencephalic expression of frog
arylalkylamine N-acetyltransferase-1. Mol. Cell. Endocrinol. 252:11-18.
Isorna, E., El M' rabet, A., Confente, F., Falcón, J., J.A., Muñoz-Cueto (2009) Cloning and
expression of arylalkylamine N-acetyltranferase-2 during early development and
metamorphosis in the sole Solea senegalensis. Gen. Comp. Endocrinol. 161:97-102.
Ito, Y., H., Kuriyama (1971) Nervous control of the motility of the alimentary canal of the silver
carp. J. Exp. Biol. 55:469-487.
Itoh, M.T., Ishizuka, B., Kudo, Y., Fusama, S., Amemiya, A., Y., Sumi (1997) Detection of
melatonin and serotonin N-acetyltransferase and hydroxindole-O-metyltransferase activities in
rat ovary. Mol.Cell.Endocrinol. 136:7-13.
Itoh, M.T., Shinozawa, T., y Y., Sumi (1999) Circadian rhythms of melatonin-synthetizing
enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Res. 830: 165–173
Iuvone, P.M., Tosini, G., Pozdeyev, N., Haque, R., Klein, D.C., S.S., Chaurasia (2005) Circadian
clocks, clock networks, arylalkylamine N-acetyltransferase, and melatonin in the retina. Prog.
Retinal Eye Res. 24:433-456.
Jaworek, J., Nawrot, K., Konturek, S.J., Leja-Szpak, A., Thor, P. y W.W., Pawlik (2004)
Melatonin an its precursor, L-tryptophan: influence on pancreatic amylase secretion in vivo
and in vitro. J. Pineal Res. 36: 155-164.
230
Bibliografía
Jensen, J. (1997) Co-release of substance P and neurokinin A from the Atlantic cod stomach.
Peptides 18:717-722.
Jensen, J., y S., Holmgren (1991) Tachykinins and intestinal motility in different fish groups. Gen.
Comp. Endocrinol. 83:388-396.
Jensen, J., y S., Holmgren (1994) The gastrointestinal canal. In: Nilsson S, Holmgren S, editors. J
Chur, Switzerland:Harwood Academic Publisher; 199: 119–67.
John, T.M.; Beamish, F.W.H. y J.C., George (1983) Diurnal impact of locomotory activity and
melatonin and N-acetylserotonin treatment on blood metabolite levels in the rainbow trout.
Arch. Int. Physiol. Biochim. 91: 115-120.
Johnels, A. G., y E., Östlund (1958) Anatomical and physiological studies on the enteron of
Lampetra fluviatilis (L.). Acta Zool. (Stockh.) 39: 9–12.
Johansson, A., S., Holmgren (2003) Ca2+-recruitment in tachykinin inducedcontractions of gut
smooth muscle from African clawed frog, Xenopus laevis, and rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 113:185-191.
Johnston, W. L., y N.T., Glanville (1992) Effect of feeding and fasting on plasma tryptophan and
tryptophan to large neutral amino acid ratio, and on brain serotonin turnover in rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss. Fish Physiol. Biochem. 10: 11-22.
Kachi, T., M., Kurushima (2000) Pineal-digestive organ relations: Physiological and
pathophysiological significance of melatonin in the digestive system. Hirosaki Med. J. 51:93–
108.
Kachi, T., Suzuki, T., Yanagisawa, M., Kimura, N., T., Irie (1999) Pinealgut relations. Hirosaki
Med J 51: 209–S213.
Kaneko, M., Hernandez-Borsetti, N., G.M., Cahill (2006) Diversity of zebrafish peripheral
oscillators revealed by luciferase reporting. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:14614-14619.
Kapoor, B.G., Smit, H., I.A., Verighina (1975) The alimentary canal and digestion in teleost. Adv.
Mar. Biol. 13:109-230.
Kapoor, B. G. y B., Khawna (1993) The potencial spectrum of the gut in teleost fishes. J. Fish
Biol. 1: 221-226.
Karila, P., S., Holmgren (1995) Enteric reflexes and nitric oxide in the fish intestine. J. Exp. Biol.
198:2405-2411.
Karila, P., Shahbazi, F., Jensen, J., S., Holmgren (1998) Projections and actions of tachykinergic,
cholinergic, and serotonergic neurons in the intestine of the Atlantic cod. Cell. Tissue Res.
291:403-413.
Kasimay, Ö., Çakir, B., Devseren, E., B.Ç., Yegen (2005) Exogenous melatonin delays gastric
emptying rate in rats: role of CCK2 and 5-HT3 receptors. J. Physiol. Pharmacol. 56:543-553.
231
Bibliografía
Kezuka, H., Kobayashi, M., Aida, K., y I., Hanyu (1989) Effects of photoperiod and pinealectomy
on the gonadotropin surge and ovulation in goldfish Carassius auratus. Nippon Suisan
Gakkaishi 55: 2099-2103
Kezuka, H., Iigo, M., Furukawa, K., Aida, K., I., Hanyu (1992) Effects of photoperiod,
pinealectomy and ophthalmectomy on circulating melatonin rhythms in the goldfish,
Carassius auratus. Zool. Sci. 9:1047-1053.
Kiliaan, A.J., Joosten, H.W., Bakker, R., Dekker, K., J.A., Groot (1989) Serotonergic neurons in
the intestine of two teleosts, Carassius auratus and Oreochromis mossambicus, and the effect
of serotonin on transepithelial ion-seletivity and muscle tension. Neuroscience 31:817-824.
Kiliaan, A.J., Scholten, G. J. A., Groot (1997) Exocytotic release of vasoative intestinal
polypeptide and serotonin from mucosal nerve fibres and endocrine cells of the intestine of the
goldfish (Carassius auratus) and the tilapia (Oreochromis mossambicus): an ultrastructural
study. Histochem. J. 29: 45-51
King, T.S. y S., Steinlechner (1985) Pineal indolalkylamine synthesis and metabolism: kinetic
considerations. Pineal Res. Rev. 3: 69-113.
Kitazawa, T., Hoshi, T., A., Chugun (1990) Effects of some autonomic drugs and neuropeptides
on the mechanical activity of longitudinal and circular muscle strips isolated from the carp
intestinal bulb (Cyprinus carpio). Comp. Biochem. Physiol. C 97:13-24.
Kitazawa, T., Ukai, H., Komori, S., T., Taneike (2006) Pharmacological characterization of 5hydroxytryptamine-induced contraction in the chicken gastrointestinal tract. Auton. Autacoid.
Pharmacol. 26: 157-168.
Klein, D.C. (1985). Photoneural regulation of the mammalian pineal gland. In: Everet, D., Clark,
E. (Eds.), Photoperiodism, Melatonin and The Pineal. Ciba Foundation Symposium 117.
Pittman Press, London, pp. 38–56.
Klein, D.C. (2006) Evolution of the vertebrate pineal gland: the AANAT hypothesis. Chronobiol.
Int. 23:5-20.
Klein, D.C. (2007) Arylalkylamine N-acetyltransferase: the ―timezyme‖. J. Biol. Chem. 282:42334237.
Klein, D.C. y J.L., Weller (1970) Indole metabolism in the pineal gland: a circadian rhythm in Nacetyltransferase. Science. 169:1093-5.
Klein, D. C., Sugden, D. & Weller, J. L. (1983). Postsynaptic a-adrenergic receptors potentiate the
,-adrenergic stimulation of pineal serotonin N-acetyltransferase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA.,
80: 599-603.
Klein, D.C., Roseboom, P.H., S.L., Coon (1996) New light is shining on the melatonin rhythm
enzyme the first postcloning view. Trends Endocrinol. Metab. 7: 106-112.
232
Bibliografía
Klein, D.C., Coon, S.L., Roseboom, P.H., Weller, J.L., Bernard, M., Gastel, J.A., Zatz, M., Iuvone,
P.M., Rodriguez, I.R., Bégay, V., Falcón, J., Cahill, G.M., Cassone, V.M. y R., Baler (1997)
The melatonin rhythm-generating enzyme: molecular regulation of serotonin Nacetyltransferase in the pineal gland. Recent Prog. Horm. Res. 52: 307-357.
Kleszczynska, A., Vargas-Chacoff, L., Gozdowska, M., Kalamarz, H., Martinez-Rodriguez, G.,
Mancera, J. M. y E., Kulczykowska (2006) Arginine vasotocin, isotocin and melatonin
responses following acclimatation of gilthead sea bream (Sparus aurata) to different
environmental salinities. Comp. Biochem. Physiol. 145: 268-273.
Kotler, M., Rodriquez, C., Sainz, R.M., Antolín, I., y A., Menéndez-Peláez (1998) Melatonin
increases gene expression for antioxidant enzymes in rat brain cortex. J. Pineal Res. 24:83-89.
Kobayashi, H., Kromminga, A., Dunlop, T.W., Tychsen, B., Conrad, F., Suzuki, N., Memezawa,
A., Bettermann, A., Aiba, S., Calberg, C., R., Paus (2005) A role of melatonin in
neuroectodermal-mesodermal interactions: the hair follicle synthesizes melatonin and
expresses functional melatonin receptors. FASEB J. 19:1710-1712.
Konturek, S.J., Konturek, P.C., Brzozowski, T., G.A. Bubenik (2007) Role of melatonin in upper
gastrointestinal tract. J. Physiol. Pharmacol. 58: 23-52.
Kruk, Z. L. y C. J., Pycock (1991) 5-hydroxytryptamine. En: Neurotransmitters and Drugs. 3a
edicion. Editado por Z. L. Kruk y C. J. Pycock. Chapman & Hall (London, UK), pp.: 116-132.
Kuhn, D. M., Wolf, W.A., W., Lovenberg (1980) Review of the role of the central serotonergic
neuronal system in blood pressure regulation. Hypertension, 2: 243-255.
Kurian, S.S., Ferri, G.L., De Mey, J. y J.M., Polak (1983) Immunocytochemistry of serotonincontaining nerves in the human gut. Histochemistry 78: 523–529.
Kulczykowska, E. (2001) Responses of circulating arginine vasotocin, isotocin, and melatonin to
osmotic and disturbance stress in rainbow trout (O. mykiss). Fish. Physiol. Biochem. 24: 201206.
Kulczykowska, E. (2002) A review of the multifunctional hormone melatonin and a new
hypothesis involving osmoregulation. Rev. Fish Biol. Fisheries 11: 321-330.
Kulczykowska, E., y P.M., Iouvone (1998) Highly Sensitive and Specific Assay of Plasma
Melatonin Using High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection
Preceded by Solid-Phase Extraction. J. Chromatrogr. Sci. 36: 175-178.
Kulczykowska, E., Kalamarz, H., Warme, J.M., R.J., Balment (2006) Day-night specific binding
of 2-[125I]Iodomelatonin and melatonin content in gill, small intestine and kidney of three
fish species. J. Comp. Physiol. B 176: 277-285.
Kunze, W.A.A., J.B., Furness (1999) The enteric nervous system and regulation of intestinal
motility. Annu. Rev. Physiol. 61:117-142.
233
Bibliografía
Kvetnoy, I.M., Ingel, I.E., Kvetnaia, T.V., Malinovskaya, N.K., Rapaport, S.I., Raikhlin, N.T.,
Trofimov, A.V., y V.V., Yuzhakov (2002) Gastrointestinal melatonin: cellular identification
and biological role, Neuro Endocrinol. Lett. 23: 121–132.
Lagler, K.F., Bardach, J.E., Miller R.R., y D.R.M., Passino (1977) En: (2nd Edn. ed.),Ichthyology,
John Wiley and Sons, New York, pp. 251–267.
Lang, U., Aubert, M. L., Conne, B. S., Bradtke, J. C. y Sizonenko, P. C., (1983) Influence of
exogenous melatonin on melatonin secretion and on the neuroendocrine reproductive axis of
intact male rats during sexual maturation. Endocrinology, 112: 1578-1584.
Larson, E.T., Winberg, S., Mayer, I., Lepage, O., Summers, C.H., y Ø., Øverli (2004) Social
stress affects circulating melatonin levels in rainbow trout, Gen. Comp. Endocrinol. 136: 322–
327.
Lee, P.P.N., S.F., Pang (1993) Melatonin and its receptors in the gastrointestinal tract. Biol.
Signals 12:181-193.
Lee, P. P. N., Hong, G.X. y Pang, S.F. (1991). Melatonin in the gastrointestinal tract. En:
Faschini, F. y Reiter, R. J. (eds) Role of the melatonin and Pineal Peptides in
Neuroimmunomodulation. Plenum Press, New York. pp. 127-136
Lee, J.H., Ku, S.K., Park, K.D., H.S., Lee (2004) Immunohistochemical study of the
gastrointestinal endocrine cells in the Korean aucha Perch. J. Fish Biol., 65, 170–181.
Legay, C., Faudon, M., Hery, F., J. P., Ternaux (1983) 5-HT metabolism in the intestinal wall of
the rat. I. The mucosa. Neurochem. Int., 5: 721-727.
Lepage, O., Tottmar, O. y S., Winberg, (2002). Elevated dietary Ltryptophan counteracts the
stress-induced elevation of plasma cortisol in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). J. Exp.
Biol. 205: 3679-3687.
Lepage, O., Vilchez, I. M., Pottinger, T. G., y S., Winberg (2003) Timecourse of the effect of
dietary L-tryptophan on plasma cortisol levels in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. J. Exp.
Biol. 206: 3589-3599.
Lepage, O., Larson, E.T., Mayer, I., y S., Winberg (2005a) Tryptophan affects both
gastrointestinal melatonin production and interrenal activity in stressed and nonstressed
rainbow trout. J. Pineal Res. 38: 264-271.
Lepage, O., Larson, E.T., Mayer, I. y S., Winberg (2005b) Serotonin but not melatonin, plays a
role in shaping dominant-subordinate relationships and aggression in rainbow trout..
Hormones and Behavior 48: 233-242.
Lerner, A.B., Case, J.D., Takahashi, Y. (1958). Isolation of melatonin, a pineal factor that lightens
melanocytes. J. Am. Chem. Soc. 80:2057-2058.
Levi, G., y M., Raiteri (1993) Carrier-mediated release of neurotransmitters.Trends Neurosci. 16:
415-419.
234
Bibliografía
Liu, C., Weaver, D.R., Strogatz, S.H., S.M., Reppert (1997) Cellular construction of a circadian
clock: period determination in the suprachiasmatic nuclei. Cell, 91: 855-860.
López-Patiño, M.A., Guijarro, A.I., Isorna, E., Delgado, M.J., A.L., Alonso-Gómez (2007)
Regulación por la temperatura de la ritmicidad de los receptores de melatonina en la tenca
(Tinca tinca, L.). En: Avanços em Endocrinologia Comparativa Vol III. (Eds.: A.V.M.
Canário y D.M. Power) CCMAR, Universidade do Algarve. pp. 149-153.
López-Patiño, M.A., Alonso-Gómez, A.L., Guijarro, A.I., Isorna, E., M.J., Delgado (2008)
Melatonin receptors in brain areas and ocular tissues of the teleost Tinca tinca.
Characterization and effect of temperature. Gen. Comp. Endocrinol. 155: 847-856.
López-Patiño, M.A., Rodríguez-Illamola, A., Gesto, M., Soengas, J.L., J.M., Míguez (2011a)
Changes in plasma melatonin levels and pineal organ melatonin synthesis following
acclimation of rainbow trout (oncorhynchus mykiss) to different water salinities J. Exp. Biolo.
214: 928-936.
Lopez-Patiño M.A., Rodriguez-Illamola, A., Conde-Sieira, M., Soengas, J.L., J.M., Miguez
(2011b) Daily rhythmic expression patterns of clock1a, Bmal1, and Per1 genes in retina and
hypothalamus of the rainbow trout, Oncorhynchus Mykiss. Chronobiol. Intern. DOI:
10.3109/07420528.2011.566398
López-Olmeda, J.F., Madrid, J.A., F.J., Sánchez-Vázquez (2006). Melatonin effects on food
intake and activity rhythms in two fish species with different activity patterns: Diurnal
(goldfish) and nocturnal (tench). Comp. Biochem. Physiol. A 144:180-187.
López-Olmeda, J.F., Bayarri, M.J., Rol De Lama, M.A., Madrid, J.A., Sánchez-Vázquez, F.J.
(2006b). Effects of melatonin administration on oxidative stress and daily locomotor activity
patterns in goldfish. J. Physiol. Biochem. 62:17-25..
López-Olmeda, J.F., Oliveira, C., Kalamarz, H., Kulczykowska, E., Delgado, M.J., F.J., SánchezVázquez (2009) Effects of water salinity on melatonin levels in plasma and peripheral tissues
and on melatonin binding sites in European sea bass (Dicentrarchus labrax). Comp. Biochem.
Physiol. A 152: 486-490.
Lovenberg, W., Jequier, E., A., Sjoerdsma (1967) Tryptophan hydroxylation in pineal gland,
brainstem and carcinoid tumor. Science, 155: 217-219.
Lucchelli, A., Santagostino-Barbone, M.G., M., Tonini (1997) Investigation into the contractile
response of melatonin in the guineapig isolated proximal colon: the role of 5-HT4 and
melatonin receptors. Br. J. Pharmacol. 121:1775–1781.
Madrid, J.A. (2006) Cronobiología básica y clínica (Eds.: J.A. Madrid y M.A. Rol de Lama).
Editec@Red, Madrid, España. 864p.
Malinovskaja, N., Komarov, F., Rapoport, S., Voznesenskaya, Sharov, A., L., Wetterberg (2001)
Melatonin production in patients with duodenal ulcer. Neuroendocrinol. Lett. 22:109 117.
235
Bibliografía
Mailliet, F., Ferry, G., Vella, F., Berger, S., Coge, F., Chomarat, P., Mallet, C., Guenin, S.P.,
Guillaumet, G., Viaud-Massuard, M.C., Yous, S., Delagrange, P., Boutin, J.A. (2005).
Characterization of the melatoninergic MT3 binding site on the NRH: quinone oxidoreductase
2 enzyme. Biochem. Pharmacol. 71:74-88.
Mandl, P., J.P., Kiss (2007) Role of presynaptic nicotinic acetylcholine receptors in the regulation
of gastrointestinal motility. Brain Res. Bull. 72:194–200.
Manera, M., y B.S., Dezfuli (2004) Rodlet cells in teleosts: a new insight into their nature and
functions, J. Fish Biol. 65: 597–619.
Manera, M., Giammarino, A., Perugini, M., M., Amorena (2008) In vitro evaluation of gut
contractile response to histamine in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792).
Res. Vet. Sci. 84: 126-131.
Matheus, N., Mendoza C., Iceta, R., Mesonero, J.E., A.I., Alcalde (2010) Melatonin inhibits
serotonin transporter activity in intestinal epithelial cells. J. Pineal Res. 48: 332-339.
Matsuda, K., Kashimoto, K., Higuchi, T., Yoshida, T., Uchiyama, T., Uchiyama, M., Shioda, S.,
Arimura, A., T., Okamura (2000) Presence of pituitary adenylate cyclaseactivating
polypeptide (PACAP) and its relaxant activity in the rectum of a teleost, the stargazer,
Uranoscopus japonicus. Peptides 21:821-827.
Matveev, V., Nishihara, H. y N., Okada (2007) Novel SINE families from salmons validate
Parahucho (Salmonidae) as a distinct genus and give evidence that SINEs can incorporate
LINE-related 3'-tails of other SINEs, Mol. Biol. Evol. 24: 1656–1666.
Martin, F. J., y M., Aldegunde (1995) Peripheral serotonin and experimental Diabetes mellitus
(type I). A review. Biogenic Amines, 11: 453-467.
Martín, M.T., Fernández, A.G., Fernández, E., Goñalons, E. (1993) Receptors implicated in the
actions of serotonin on chicken ileum longitudinal smooth muscle. Life Sci. 52: 1361-1369.
Martin, M.T., Azpiroz, F., J.R., Malagelada (1998) Melatonin in the gastrointestinal tract.
Thérapie 53: 453-458.
Masson-Pévet, M., y P., Pévet (1989) Cytochemicallocalization of type-A and –B monoamine
oxidase in the rati pineal gland. Cell Tissue Res. 255: 299-303.
Mattison, A. y B., Holstein (1980) The ultrastructure of the gastric and its relation to induced
secretory activity of cod. Gadus morhua. Acta Physiol. Scand. 109: 51-60.
Max, M., y M., Menaker (1992) Regulation of melatonin production by light, darkness and
temperature in the trout pineal. J. Comp. Physiol., 170: 479-489.
Mayo, J.C., Sainz, R.M., Antolin, I., Herrera, F., Martin, V., C., Rodriquez (2002) Melatonin
regulation of antioxidant enzyme gene expression. Cell Mol Life Sci. 59: 1706–13.
236
Bibliografía
McCord, C.P., Allen, F.P. (1917) Evidences associating pineal gland function with alterations in
pigmentation. J. Exp. Zool. 23:207-224.
McKay, L. y B., Gjerde (1985) The effect of salinity on growth of rainbow trout. Aquaculture. 49:
325-331.
Melchiorri, D.E., Sewerynek, E., Reiter, R.J., Ortiz, G.G., Poegeller, B., G., Nistico (1997)
Suppressive effect of melatonin administration on ethanol-induced gastroduodenal injury in
rats in vivo. Br. J. Pharmacol. 121:264–270.
Menaker, M., Moreira, L.F., G., Tosini (1997). Evolution of cicadian organization in vertebrates.
Brazilian J. Med. Biological Res. 30:305-313.
Mendoza, J. (2007). Circadian clocks: setting time by food. J. Neuroendocrinol. 19:127-137.
Menendez-Pelaez, A., Poeggeler, B., Reiter, R.J., Barlow-Walden, L., Pablos, M.I., D-X., Tan
(1993) Nuclear localization of melationin in the different mammalian tissues:
Immunocytochemical and radioimmunoassay evidence. J. Cell Biol. 53:373–382.
Merle A., Delagrange P.H., Renard P., Lesieur D., Cuber J.C., Roche M., S., Pellissier (2000)
Effect of melatonin on motility pattern of small intestine in rats and its inhibition by melatonin
receptor antagonist S 221152. J. Pineal Res. 29:116–124.
Messner, M., Hardeland, R., Rodenbeck A., y G., Huether (1998) Tissue retention and subcellular
distribution of continuously infused melatonin in rats under near physiological conditions, J.
Pineal Res. 25: 251–259.
Messner, M., Huether, G., Lorf, T., Ramadori, G., C., Schwörer (2001) Presence of melatonin in
the human hepatobiliary-gastrointestinal tract. Life Sci. 69:543-551.
Míguez, J.M., Simonneaux, V., y P., Pévet (1997) The role of the intracellular and extracellular
serotonin in the regulacion of melatonin production in rat pinealocytes. J. Pineal Res. 23: 6371
Mistlberger, R.E. (2006) Circadian rhythms: perturbing a food-entrained clock Current Biol.
16(22): 968-969.
Molina-Borja M., Falcón, J. Urquiola, E. y J.P. Ravault (1996) Production of melatonin by the
gilthead sea bream pineal: in vivo and in vitro study, Fish Physiol. Biochem. 15: 413–419.
Monroe, K.K., Watts, S.W. (1998) The vascular reactivity of melatonin. Gen. Pharmacol. 30:31–
35.
Morton D.J. y H.J., Forbes (1989) Probable mechanism of catalysis of pineal gland
hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT) from rainbow trout (Salmo gairdneri). J.
Neural Transm. 75: 65-71.
237
Bibliografía
Morton, D.J., y H.J., Forbes (1988). Pineal gland N-acetyltransferase and hydroxyindole-Omethyltransferase activity in the rainbow trout (Salmo gairdneri): seasonal variation linked to
photoperiod. Neurosci. Lett. 94: 333-337.
Mourre, C., Calas, A., J., Gonella (1981) Radioautographic study of uptake and storage of
indoleamines in the rabbit enterochromaffin cells. Neurosci. Lett. 23: 251-256.
Moyes, C. D. y P. M., Schulte (2007) Principios de fisiología animal. Pearson Educaci´on, S:A.,
Madrid, España., pp.767
Munro, A.D. (1986) Effects of Melatonin, Serotonin, and Naloxone on Aggression in Isolated
Cichlid Fish (Aequidens pulcher) J. Pineal Res. 3: 257–262.
Muñoz, J.L.P., Ceinos, R.M., Soengas, J.L., Míguez, J.M. (2009) A simple and sensitive method
for determination of melatonin in plasma, bile and intestinal tissues by high performance
liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatography B 877:2173-2177.
Muñoz, J.L.P., López Patiño, M.A., Hermosilla, C., Conde-Sieira, M., Soengas, J.L., Rocha, F.,
J.M., Míguez (2011) Melatonin in nervous system and hemolymph of the octopus (Octopus
vulgaris): tissue distribution and daily changes. J. Comp.Physio.A, (DOI 10.1007/s00359-0110641-x)
Murakami, N., Kawano, T., Nakahara, K. Nasu, T. y K., Shiota (2001) Effect of melatonin on
circadian rhythm, locomotor activity and bosy temperatura in the intact house sparrpw,
Japanese quail and owl. Brain Res. 889: 220-224.
Mush, M. W., O´Grady, S. M. y M., Field (1990) Ion transport of marine teleost intestine. En:
Guthrie, C: y Fink, G.R. (eds.) methods in Enzymology, Vol. 194. Academic Press, San Diego.
pp. 746-753.
Nagai, T. (1995) Purification and properties of aromatic L-amino acid decarboxylase from liver of
skipjack tuna (Katsuwonus pelamis, Teleostei: Scombridae). Comp. Biochem. Physiol. B 112:
265-270.
Nagai, T. (1999) Studies on the serotonin metabolic enzymes in the liver of skipjack Katsuwonus
pelamis. J. Natl. Fish Univ. Japan 48: 81-195.
Nagai, T., Hamada, M., Kai, N., Tanoue, Y., F., Nagayama (1997) Characterization of yellowfin
tuna (Thunnus albacares, Scombroidei) tryptophan hydroxylase. Comp. Biochem. Physiol. B,
116: 161-165.
Naji, L., Carrillo-Vico, A., Guerrero, J.M., y J.R. Calvo (2004). Expression of membrane and
nuclear melatonin receptors in mouse peripheral organs. Life Sci. 74: 2227–2236.
Naranjo, M.C., Guerrero, J.M., Rubio, A., Lardone, P.J., Carrillo-Vico, A., Carrascosasalmoral,
M.P., Jiménez-Jorge, S., Arellano, M.V., Leal-Noval, S.R., Leal, M., Lissen, E., P., Molinero
(2007) Melatonin biosynthesis in the thymus of humans and rats. Cell.Mol.Life Sci. 64:781790.
238
Bibliografía
Nash, J., Kime, D.E., Holtz, W. y H., Steinberg (1995) Has melatonin a role in reproductive
seasonality in the female rainbow trout, Oncorhynchus mykiss?. En: Proc. Gifth Int. Symp.
Goetz F.W. and Thomas P. (eds.) Reprod. Biol. Fish. Austin, TX: Fish symposium 95, p. 93.
Navarro, I., Gutierrez, J., J., Planas (1992). Changes in plasma glucagon, insulin and tissue
metabolites associated with prolonged fasting in brown trout (Salmo trutta fario) during two
different seasons of the year. Comp.Biochem. Physiol. A, 102: 401-407.
Nelson, L.E., y M.A., Sheridan (2006) Gastroenteropancreatic hormones and metabolism in fish.
Gen. Comp. Endocrinol. 148:116-124.
Nemoto, N., Kawaoi, A., T., Shikata (1982) Immunohistochemical demonstration of serotonin (5HT)-containing cells in the human and rat intestines. Biomed. Res. 3: 181-187.
Nikaido, Y., Aluru, N., McGuire, A., Park, Y. Mathilakath, M. Vijayan, M., y A., Takemura
(2010) Effect of cortisol on melatonin production by the pineal organ of tilapia, Oreochromis
mossambicus.Comp.Biochem.Physiol.A. 155: 84-90.
Nilsson, G. E. y O., Tottmar (1987) Effects of biogenic aldehydes and aldehyde dehydrogenase
inhibitors on rat brain tryptophan hydroxylase activity. Brain Res. 409: 374-379.
Nilsson, G. E. (1990) Turnover of serotonin in brain of an anoxia-tolerant vertebrate, the crucian
carp. Am. J. Physiol., 258: R1308-R1312.
Nilsson, S. (1983) The Autonomic Nerve Function in Vertebrates. En: Zoophysiology. Vol. XIII.
Editado por D. S. Famer. Springer-Verlag (Berlin, Alemania), pp.: 100-111.
Nilsson, S., y S., Holmgren (1994) Comparative Physiology and Evolution of Autonomic Nervous
System. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland. 376pp.
Nosjean, O., Ferro, M., Coge, F., Beauverger, P., Henlin, J.M., Lefoulon, F., Fauchere, J.L.,
Delagrange, P., Canet, E., J.A., Boutin (2000) Identification of the melatonin binding site
MT3 as the quinone reductase 2. J. Biol. Chem. 275:31311-31317.
Øverli, O., Pall, M., Borg, B., Jobling, M., S., Winberg (2001) Effects of Schistocephalus solidus
infection on brain monoaminergic activity in female three-spined sticklebacks, Gasterosteus
aculeatus. Proc. Roy. Soc. Lond, Ser. B. 268: 1411-1415.
Olsson, C. (2009) Autonomic innervation of the fish gut. Acta Histochem. 111:185- 195.
Olsson, C. (2011) The Enteric nervous system. En: The multifunctional gut of fish. Editors:
Grosell M., Farrell A. P., Brauner C.J., Academic Press, London, 444pp.
Olsson, C., P., Karila (1995) Coexistence of NADPH-diaphorase and vasoactive intestinal
polypeptide in the enteric nervous system of the Atlantic cod (Gadus morhua) and the spiny
dogfish (Squalus acanthias). Cell. Tissue Res. 280:297- 305.
Olsson, C., y S., Holmgren (2001) The control of gut motility. Comp. Biochem. Physiol. A
128:481-503.
239
Bibliografía
Olsson, C., Holmberg, A., S., Holmgren (2008) Development of enteric and vagal innervation of
the zebrafish (Danio rerio) gut. J. Comp. Neurol. 508:756-770.
Otsuka, M., Kato, K., Murai, I., Asai, S., Iwasaki, A., Y., Arakawa (2001) Roles of nocturnal
melatonin and the pineal gland in modulation of water-immersion restraint stress-induced
gastric mucosal lesions in rats. J. Pineal Res. 30:82–86.
Ouichou, A., y P., Pévet (1992) Implication of tryptophan in the stimulatory effect of delta-sleep
inducing peptide on indole seretion from perifused rat pineal glands Bio. Signals 1: 78-87.
Ouyang, M. y H. J., Vogel (1998) Melatonin and serotonin interactions with calmodulin: NMR,
spectroscopic and biochemical studies. Biochem. Biophys. Acta 1383: 37-47.
Okamura, H., Yamaguchi, S., K., Yaguita (2002) Molecular machinery of the cricadian clock in
mammals. Cell Tissue Res. 309: 47-56.
Oakley, T.H. y R.B., Phillips (1999) Phylogeny of salmonine fishes based on growth hormone
introns: Atlantic (Salmo) and Pacific (Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Mol. Phyl.
Evol. 11: 381–393.
Pan, X., y M., Hussain (2009) Clock is important for food and circadian regulation of
macronutrient absorption in mice. J. Lipid Res. 50(9): 1800–1813.
Pando, M.P., y P., Sassone-Corsi (2002) Unraveling the mechanisms of the vertebrate circadian
clock: zebrafish may light the way. Bioessays. 24(5):419-426.
Pardridge, W. M. (1977) Kinetics of competitive inhibition of neutral amino acid transport across
the blood brain barrier. J. Neurochem., 28: 103-108.
Pardridge, W. M. y L. J., Mietus (1980) Transport of albumin bound of seawater in flounder: role
of active sodium transport. Am. J. Physiol. 245: 1761-1763
Park, Y.J., Park, J.G., Kim, S.J., Lee, Y.D., Saydur Rahman, M., A., Takemura (2006) Melatonin
receptor of a reef fish with lunar-related rhythmicity: cloning and daily variations. J. Pineal
Res. 41:166-174.
Park, Y-J., Park, J.G., Hiyakawa, N., Lee, Y.D., Kim, S.J., A., Takemura (2007a) Diurnal and
circadian regulation of a melatonin receptor, MT1, in the golden rabbitfish, Siganus guttatus.
Gen. Comp. Endocrinol., 150: 253-262.
Park. Y-J., Park, J-G., Jeong, H-B., Takeuchi, Y., Kim, S-J., Lee, Y-D. y A., Takemura (2007b)
Expression of the melatonin receptor Mel1c in neural tissues of the reef fish Siganus guttatus.
Comp. Biochem. and Physiol. 147: 103-111.
Paz-Valiñas, L. (2009) Estudio de las relaciones metabólicas y funcionales entre serotonina y
melatonina en la glándula pineal de mamíferos. aplicación de técnicas de microdiálisis in vivo.
Tesis, Doctoral Universidad Santiago de Compostela. 252 pp.
240
Bibliografía
Parmelee, J.T. y J.L., Renfro (1983) Esophageal desalination of seawater in flounder: role of
active sodium transport. Am. J. Physiol. 245: R888-R893.
Peitsaro, N., Anichtchik, O. V., y P., Panula (2000) Identification of a histamine H(3)-like
receptor in the zebrafish (Danio rerio) brain. J. Neurochem. 75: 718–724.
Pentney, P. T. y G. A., Bubenik (1995) Melatonin reduce the severity of dextran-induced colitis in
mice. J. Pineal Res. 19: 31-39.
Petterson, G., Ahlman, H., Bhargava, H. N., Dahlstrom, A., Kewenter, J., Larsson, I., J. K.,
Siepler (1979) The effect of propranolol on the serotonin concentration in the portal plasma
after vagal nerve stimulation in the cat. Acta Physiol. Scand., 107: 327-331.
Pévet, P. (1998) Melatonin and biological rhythms. Therapie 53:411-420.
Pévet, P. (2003) Melatonin: from seasonal to circadian signal. J. Neuroendocrinol. 15:422-426.
Pévet, P., Agez, L., Bothorel, B., Saboureau, M., Gauer, F., Laurent, V., y M. Masson-Pévet
(2006) Melatonin in the multi-oscillatory mammalian circadian world, Chronobiol. Int. 23:
39–51.
Phillips, R.B., Pleyte, K.A.E. y M.B., Brown (1992) Salmonid restriction maps. Can. J. Fish
Aquat. Sci. 9: 2345-2353.
Pickard, G.E., y F.W., Turek (1983) The suprachiasmatic nuclei: two circadian clocks?. Brain Res.
268: 201-210.
Pinillos, M.L., De Pedro, N., Alonso-Gómez, A.L., Alonso-Bedate, M., M.J., Delgado (2001)
Food intake inhibition by melatonin in goldfish (Carassius auratus). Physiol. Behav. 72:629634.
Plaza, M.A. (2001) 5-Hydroxytryptamine and the gastrointestinal migrating motor complex. Curr.
Opin. Investig. Drugs 2: 539–544
Polak, J. M., Heitz, P., A. G. E., Pearse (1976) Differential localization of substance P and
motilina. Scand. J. Gastroenterol., Suppl. 39: 39-42.
Pontoire, C., Bernard, M., Silvain, C., Collin, J.P., P., Voisin (1993) Characterization of melatonin
binding sites in chicken and human intestines. Eur. J. Pharmacol. 247:11-18.
Poon, A.M.S., Mak, A.S.Y., H.T., Luk (1996) Melatonin and 2[125I]iodomelatonin binding sites
in the human colon. Endocrine Res. 22:77–94.
Poon, A.M.S., Chow, P.H., Mak, A.S.Y., S.F., Pang (1997) Autoradiographic localization of
2[125I]iodomelatonin binding sites in the gastrointestinal tract of mammals including humans
and birds. J. Pineal Res. 23:5-14.
241
Bibliografía
Popek, W., Breton, B., Piotrwski, W., Bieniarz, K., y P., Epler (1994) The role of the pineal gland
in the control of a circadian pituitary gonadotropin release rhythmicity in mature female carp.
Neuroendocrinology. 16: 183-193.
Porter, M.J.R., Randall, C.F., Bromage, N.R. y J.E., Thorpe (1998) The role of melatonin and the
pineal gland on development and smoltification of Atlantic salmon (Salmo salar) parr.
Aquaculture. 168: 139-155.
Poston,H.G., y G.L., Rumsey (1983) Factors affecting dietary requirement and deficiency signs of
L-tryptophan in rainbow trout. J.Nutr. 113:2568–2577
Pozo, M.J., Camello, P.J., y G.M., Mawe (2004) Chemical mediators of gallbladder dysmotility.
Curr Med Chem 11:1801–1812.
Quastel, M.R., R., Rahamimoff (1965) Effect of melatonin on spontaneous contractions and
response to 5-hidroxytryptamine of rat isolated duodenum. Br. J. Pharmacol. 24:455-461.
Quay, W.B. (1967) Lack of day-night rhythm and effects of darkness in rat pineal content of Nacetyltransferase. Physiologist 10: 286.
Quay, W.B., Y.H., Ma (1976) Demonstration of gastrointestinal
Omethyltransferase.. IRCS. Med Sci. : Libr. Compend. 4:563-569.
hydroxyindole-
Racke, K., Schworer, H., H., Kilbinger (1988) Adrenergic stimulation of the release of 5hydroxytryptamine from the vascularly perfused ileum of the guinea-pig. Br. J. Pharmacol.,
95: 923-931.
Radaelli, G., Domeneghini, C., Arrighi, S., Castaldo, L., Lucini, C. y F., Mascarello (2001)
Neurotransmitters, neuromodulators, and neurotrophin receptors in the gut of pantex, a hybrid
sparid fish (Pagrus major x Dentex dentex). Localization in the enteric nervous and endocrine
systems. Histol. Histopathol. 16: 845-853.
Raikhlin, N. T. y I. M., Kvetnoy (1974) Lightening effect of the extract of human appendix
mucosa on frog skin melanophores. Bull. Exp. Biol. Med. 8: 114-116.
Raikhlin, N. T. y I. M., Kvetnoy (1976) melatonin and entorochromaffines cells. Acta Histochem.
55: 19-25.
Raikhlin, N.T., Kvetnoy, I.M., Tolkachev, V.N. (1975) Melatonin may be synthesized in
enterochromaffin cells. Nature 255:344-345.
Raikhlin, N.T., Kvetnoy, I.M., Kadagidze, Z.G., y Sokolov, V. (1978) Immunomorphological
studies on synthesis of melatonin in enterochromaffin cells, Acta Histochem. Cytochem. 11:
75–77.
Ram, P.T., Dai, J., Yuan, L., Dong, C., Kiefer, T.L., Lai, L. y S.M., Hill (2002) Involvement of the
mt1 melatonin receptor in human breast cancer. Cancer Letters 179: 141–150.
242
Bibliografía
Randall, C.F., Porter, M.J.R., Bromage, N.R. y B., Davies (1995) Preliminary observations on the
effects of melatonin implants and pinealectomy on the timing of reproduction in rainbow trout.
En: Goetz, F. W. and Thomas, P. eds.. Proc. Fifth Int. Symp. Reprod. Biol. Fish. Austin, TX.
pp. 196.
Randall, D., Burggren, W., K., French (2002) Eckert: Animal Physiology (mechanisms and
adaptations). 5ª Ed. W. H. Freeman, New York. Cap. 15 pp 683-724.
Rapport, M. M., Green, A. A., I. H., Page (1948a) Partial purification of the vasoconstrictor in
beef serum. J. Biol. Chem., 174: 735-741.
Rapport, M. M., Green, A. A., I. H., Page (1948b) Serum vasoconstrictor (serotonin). IV. Isolation
and characterization. J. Biol. Chem., 176: 1243-1251.
Read, J. B. y G., Burnstock (1968) Fluorescent histochemical studies on the mucosa of the
vertebrate gastrointestinal tract. Histochemie, 16: 324-332.
Reed, B.L. (1968) The control of circadian pigment changes in the pencil fish: a proposed role of
melatonin. Life Sci. 7: 961-973.
Reite, O.B. (2005) The rodlet cells of teleostean fish: their potential role in host defence in relation
to the role of mast cells/eosinophilic granule cells, Fish Shellfish Immunol. 19: 253–267.
Reiter, R.J. (1991) Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological
interactions. Endocr. Rev. 12: 151-180.
Reiter, R.J. (1993) The melatonin rhythm: both a clock and a calendar. Experientia 49: 654-664.
Reiter, R.J. (2003) Melatonin: clinical relevance. Best Practice & Research Clinical &
Endocrinology & Metabolism, 17(2): 273–285.
Reiter, R.J., Tan, D.X. (2003) Melatonin: A novel protective agent against oxidative injury of the
ischemic/reperfused heart. Cardiovasc Res. 58: 10–9.
Reiter, R.J., King, T.S., Steinlechner, S., Steger, R.W. y B.A., Richardson (1990) Tryptophan
administration inhibits nocturnal N-acetyltrans-ferase activity and melatonin content in the rat
pineal gland. Neuroendocrinology. 52: 291-296.
Reiter, R.J., Tan, D-X., Mayo, J.C., Sainz, R.M., Leon J., Z., Czarnocki (2003) Melatonin as an
antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans. Acta
Biochim. Pol. 50:1129-1146.
Reppert, S.M. (1997) Melatonin receptors: molecular biology of a new family of G proteincoupled receptors. J. Biol. Rhythms 12: 528-531.
Reppert, S.M., Weaver, D.R., Cassone, V.M., Godson, C., L.F. JR., Kolakowski (1995) Melatonin
receptors are for the birds: molecular analysis of two receptor subtypes differentially
expressed in chick brain. Neuron 15:1003-1015.
243
Bibliografía
Reyes-Vázquez, C., Naranjo-Rodríguez, E.B., García-Segoviano, J.A., Trujillo-Santana, J.T., B.
Prieto-Gómez (1997) Apamin blocks the direct relaxant effect of melatonin on rat ileal smooth
muscle. J. Pineal Res. 22:1-8.
Ribelayga, C., Gauer, F., Pévet, P., y V., Simonneaux (1999) Photoneural regulation of rat pineal
hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT) messenger ribonucleic acid expression: an
analysis of its complex relationship with HIOMT activity. Endocrinology 140: 1375-1384.
Ribelayga, C., Pévet, P., y V., Simonneaux (2000) HIOMT drives the photoperiodic changes in
the amplitude of the melatonin peak of the Siberian hamster. Am .J Physiol. Regul. Integr.
Comp. Physiol. 278: 1339-1345.
Rice J., Mayor, J., Tucker H.A., R.J., Bielski (1995) Effect of light therapy on salivary melatonin
in seasonal affective disorder. Psychiatry Res. 56:221–226.
Rich, A. (2009) A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the
zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21:225-228.
Rich, A., Leddon, S.A., Hess, S.L., Gibbons, S.J., Miller, S., Xu, X., G., Farrugai (2007) Kit-like
immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative ICC. Devel. Dyn.
236:903-911.
Richardson, N.E., y J.D., McCleave (1974) Locomotor activity rhythms of juvenile Atlantic
salmon (Salmo salar) in various light conditions, Biol. Bull. mar. Biol. Lab., Woods Hole 147:
422–432.
Rindi, G, Leiter, A.B., Kopin, A.S., Bordi, C., E., Solcia (2004) The "normal" endocrine cell of
the gut: changing concepts and new evidences. Ann. N Y. Acad. Sci. 1014:1–12.
Rizzo, V., Porta, C., Moroni, M., Scoglio, E., R., Moratu (2002) Determination of free and total
(free plus protein-bound) melatonin in plasma and cerebrospinal fluid by high-performance
liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatogr. B 774: 17-24.
Rodríguez-Illamola, A., López Patiño, M.A., Soengas, J.L., Ceinos, R.M., J.M., Míguez (2011)
Diurnal rhythms in hypothalamic/pituitary AVT synthesis and secretion in rainbow trout:
Evidence for a circadian regulation. Gen. Comp. Endocrinol.170: 541-549
Roseboom, P.H., Coon, S.L., Baler, R., McCune, S.K., Weller, J.L. y D.C., Klein (1996)
Melatonin synthesis: analysis of the more than 150-fold nocturnal increase in serotonin Nacetyltransferase mRNA in the rat pineal gland. Endocrinology 137: 3033-3044.
Rozas, G., Rey, P., Andres, M. D., Rebolledo, E., M., Aldegunde (1990) Distribution of 5hydroxytryptamine and related compounds in various brain regions of rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Fish Physiol. Biochem., 8: 501-506.
Russo, S., Kema, I.P., Haavik, J., J., Korf (2004) Tryptophan dependency of brain serotonin is
evolutionary conserved and of functional significance. En: The tryptophan link to
psychopathology. Tesis dirigida por J. Korf, E. G. E. de Vries, J. A. den Boer. Hospital
Universitario de Groninger (Paises Bajos), pp.: 111-132.
244
Bibliografía
Rust, M. B. (2002) Nutritional physiology, in fish Nutrition, 3rd Edicion, Halver, J. E. y Hardy,
R.W., (eds.), Academic Press, Amsterdam, pp.367-452.
Rubio, V.C., Sánchez-Vázquez, J., J.A., Madrid (2004) Oral administration of melatonin reduces
food intake and modifies macronutrient selection in European sea bass (Dicentrarchus labrax
L.). J. Pineal Res. 37:42-47.
Ruibal, C., Soengas, J. L., M., Aldegunde (2002) Brain serotonin and the control of food intake in
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): effects of changes in plasma glucose levels. J. Comp.
Physiol. A 188: 479-484.
Saito, D., Shi, Q., Ando, H. y A., Urano (2004) Attenuation of diurnal rhythms in plasma levels of
melatonin and cortisol, and hypothalamic contents of vasotocin and isotocin mRNAs in prespawning chum salmon. Gen Comp Endocrinol. 15,137(1): 62-68.
Sallinen, P., Saarela, S., Ilves, M., Vakkuri, O., J., Leppaluoto (2005) The expression of MT1 and
MT2 melatonin receptor mRNA in several rat tissues. Life Sci. 76: 1123-1134.
Sánchez-Vázquez ,F.J., Madrid, J.A. y S., Zamora (1995) Circadian rhythms of feeding activity in
sea bass, Dicentrarchus labrax L.: dual phasing capacity of diel demand-feeding pattern. J.
Biol. Rhythms 10: 256-66.
Sánchez-Vázquez, F.J., Madrid, J.A., Zamora, S., Iigo, M., M., Tabata (1996) Demand feeding
and locomotor circadian rhythms in the goldfish, Carassius auratus: dual and independent
phasing. Physiol. Behav. 60:665-674.
Sánchez-Vázquez, F. J., Iigo, M., Madrid, J. A. y M., Tabata (2000) Pinealectomy does not affect
the entrainment to light nor the generation of the circadian demand-feeding rhythms of
rainbow trout. Physiol. Behav. 69: 455-461.
Sanders, K.M., Koh, S.D., S.M., Ward (2006) Interstitial cells of Cajal as pacemakers in the
gastrointestinal tract. Annu. Rev. Physiol. 68:307-343.
Sanger, G.J. (2008) 5-Hydroxytryptamine and the gastrointestinal tract: Where next? Trends
Pharmacol Res 29: 465–471.
Sarr, M.G., Cullen, J.J., Otterson, M.F. (2001) Gastrointestinal motility. En: Surgical research.
(Ed.: W.W. Souba, D.W. Wilmore). Academic Press, London. Cap. 40 pp 507-569.
Sastre-Toraño, J., Rijn-Bikker, Van, Merkus, P., H.J., Guchelaar (2000) Quantitative
determination of melatonin in human plasma and cerebrospinal fluid with high-performance
liquid chromatography and fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. :14 306-310.
Satake, N., Shibata, S., Takagi, T. (1986) The inhibitory action of melatonin on the contractile
response to 5-hydroxytryptamine in various isolated vascular smooth muscles. Gen.
Pharmacol. 17:553–558.
245
Bibliografía
Sauzet, S., Besseau, L., Herrera Pérez, P., Covès, D., Chatain, B., Peyric, E., Boeuf, G., MuñozCueto, J.A., J., Falcón (2008) Cloning and retinal expression of melatonin receptors in the
European sea bass, Dicentrarchus labrax. Gen. Comp. Endocrinol. 157:186-195.
Scher, J., Wankiewicz, E., Brown, G.M., H., Fujieda (2002) MT1 Melatonin receptor in the
human retina: expression and localization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43:889-897.
Schworer, H., Racke, K., H., Kilbinger (1987) Spontaneous release of endogenous 5hydroxytryptamine and 5-hydroxyindoleacetic acid from the isolated vascularly perfused
ileum of the guinea-pig. Neuroscience, 21: 297-303.
Schworer, H., Racke, K., H., Kilbinger (1989) GABA receptors are involved in the modulation of
the release of 5-hydroxytryptamine from the vascularly perfused small intestine of the guineapig. Eur. J. Pharmacol., 165:29-37.
Seo, J.S., Kim, M.S., Park, E.M., Ahn, S.J., Kim, N.Y., Jung, S.H., Kim, J.W., Lee, H.H., J.K.,
Chung (2009) Cloning and characterization of muscarinic receptor genes from the nile tilapia
(Oreochromis niloticus). Mol. Cells 27:383-390.
Senatori, O., Pierucci, F., Parvez, S. H., Scopelliti, R., A., Nicotra (2003) Monoamine oxidase in
teleosts. Biogenic Amines 17: 199-213.
Sewerynek, E., Reiter, R.J., Melchiorri, D., Ortiz, G.G. y A., Lewinski (1996) Oxidative damage
in the liver induced by ischemia-reperfusion: protection by melatonin. HepatoGastroenterology 43: 898–905
Sharp, T., Bramwell, S.R., D.G., Grahame-Smith (1992) Effect of acute administration of Ltryptophan on the release of 5-HT in rat hip-pocampus in relation to serotoninergic neuronal
activity: an in vivo microdialysis study. Life Sci. 50:1215–1223.
Simon, C. y J.P., Ternaux (1990) Regulation of serotonin release from the enterochromaffin cells
of rat cecum mucosa. J. Pharmacol. Exp. Ther. 253: 825-832.
Sjoblom, M., Flemstrom, G. (2001) Central nervous stimuli increase duodenal bicarbonate
secretion by release of mucosal melatonin. J. Clin. Invest. 108: 625-633.
Sjoblom, M., Flemstrom, G. (2003) Melatonin in the duodenal lumen is a potent stimulant of
mucosal bicarbonate secretion. J. Pineal Res. 34:288-293.
Slominski, A., Tobin, D.J., Zmijewski, M.A., Wortsman, J., R., Paus (2008) Melatonin in the skin:
synthesis, metabolism and functions. Trends Endocrinol. Metab. 19:17- 24.
Smit, H. (1968) Gastric secretion in the lower vertebrates and birds. In: C.F. Code, Editor,
Handbook of Physiology, sect 6: Alimentary canal, volume V: Bile, digestion, ruminal
physiology. Am. Physiol. Soc. 2791–2805.
Smith, L.S. (1980) Digestion in teleost fishes. En: Fish feed technologies Ed. FAO/UNDP
www.fao.org Cap. 1 pp 2-20.
246
Bibliografía
Smith, L. S. (1989) En ―Fish Nutrition,‖ 2nd ed. (J. H. Halver, ed.), p. 332. Academic Press, San
Diego, CA.
Smith, G.R. y R. F., Stearley (1989) The classification and scientific names of rainbow and
cutthroat trouts. Fisheries 14: 4-10.
Smith, N.F., Eddy, F.B., Struthers, A.D. y C., Talbot (1991) Renin, atrial natriuretic peptide and
blood plasma ions in parr and smolts of Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in fresh water and after short-term exposure to sea water. J.
Exp. Biol. 157: 63-74.
Smith, B.M., Thomsen, W.J., y A.J., Grottick (2006) The potential use of selective 5-HT2C
agonists in treating obesity. Expert Opin Investig Drugs 15:257–266.
Snyder, S. H. y J., Axelrod (1965) Circadian rhythm in pineal serotonin: Effect of monoamine
oxidase inhibition and reserpine. Sciencie 149: 542-544.
Soengas, J. L., Strong, E. F. y M. D., Andrés (1998) Glucose, lactate, and β-hydroxybutyrate
utilization by rainbow trout brain: changes during food deprivation. Physiol. Zool. 71: 285293.
Spieler, R.E. (1992) Feeding-entrained circadian rhythms in fishes. En: Rhythms in Fishes. M.A.
Ali, (ed.). Plenum New York. pp. 137-147.
Stankov, B. y F., Fraschini (1993) High-affinity melatonin binding-sites in the vertebrate brain.
Neuro Endocrinology Lett. 15: 149-164.
Stebelová, K., Zeman, M., Cornélissen, G., Bubenik, G., Jozsa, R., Hardeland, R., Poeggeler, B.,
Huether, G., Olah, A., Nagy, G., Csernus, V., Kazsaki, J., Pan, W., Otsuka, K., Bakken, E.E.,
y F., Halberg (2005) Chronomics reveal and quantify circadian rhythmic melatonin in
duodenum of rats. Biomed. Pharmacother. 59: 209–212.
Stebelová, K., Anttila, K., Mänttäri, S., Saarela, S., M., Zeman (2010) Immunohistochemical
definition of MT2 receptors and melatonin in the gastrointestinal tissues of rat. Acta
Histochem. 112:26-33.
Stenfors C. y S.B., Ross (2002) Evidence for involvement of protein kinases in the regulation of
serotonin synthesis and turnover in the mouse brain in vivo, J. Neural Transm. 109: 1353–
1363.
Stefulj, J., Hörtner, M., Ghosh, M., Schauenstein, K., Rinner, I., Wölfler, A., Semmler, J., P.M.,
Liebmann (2001) Gene expression of the key enzymes of melatonin synthesis in extrapineal
tissues of the rat. J. Pineal Res. 30: 243-247.
Stevens, C. E. y I. D., Hume (1995) Comparative physiology of the vertebrate digestive system.
2nd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, united Kingdom. 400p.
Stokkan, K.A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., M., Menaker (2001) Entrainment of the
circadian clock in the liver by feeding. Science 291:490-493.
247
Bibliografía
Storch, K.F., Weitz, C.J. (2009) Daily rhythms of food-anticipatory behavioural activity do not
require the known circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:6808-6813.
Storr, M., Schusdziarra, V., , H.D., Allescher (2000) Inhibition of small conductance K+-channels
attenuated melatonin-induced relaxation of serotonin-contracted rat gastric fundus. Can. J.
Physiol. Pharmacol. 78:799-806.
Sugden, D. (1979) Circadian change in rat pineal tryptophan content: lack of correlation with
serum tryptophan. J. Neurochem. 40: 1647-1653.
Sugden, D. y D.C., Klein (1983) Adrenergic stimulation of rat pineal hydroxyindole-Omethyltransferase. Brain Res. 265: 348-351.
Tabata, M. y H., Meissl (1993) Effect of temperature on ganglion cell activity in the
photoreceptive pineal organ of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Comp. Biochem. Physiol.
105: 449-452.
Takeda, M., y K., Takii (1992) In ―Fish Chemoreception‖ (T. J. Hara, ed.). Chapman & Hall,
London. p. 271
Tan, D.X., Chen, L.D., Poeggeler, B., Manchester, L.C. y R.J., Reiter (1993) Melatonin: a potent
endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocrine J. 1: 57–60.
Tan, D.X., Manchester, L.C., Reiter, R.J., Qi, W., Hanes, M., N.J., Farley (1999) High
physiological levels of melatonin in the bile of mammals. Life Sci. 65:2523-2529.
Taylor, J.F., Migaud, H., Porter, M.J.R., N.R., Bromage (2005) Photoperiod influences growth
rate and plasma insulin-like growth factor-I levels in juvenile rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 142:169–185
Ternaux, J. P., Gonella, J., Legay, C., Faudon, M., Barrit, M. C., F., Mery (1981) 5-HT
metabolism in the intestinal wall of the rabit. J. Physiol. (Paris), 77: 319-326.
Teshima, S. I., Ishikawa, M., Koshio, S., Yunoki, M., Kanazawa, A., y S., Hayashida (1999)
Metabolism of ursodeoxycholic acid in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) and the
yellowtail (Seriola quinqueradiata) Aquaculture 179: 365.
Thorré, K., Sarre, S., Twahirwa, E., Meeusen, R., Ebinger, G., Haemers, A. y Y., Michotte (1996)
Effect of L-tryptophan, L-5-hydroxytryptophan and L-tryptophan prodrugs on the extracellular
levels of 5-HT and 5-HIAA in the hippocampus of the rat using microdialysis. Eur. J. Pharm.
Sci. 4: 247-256
Tijmes, M., Pedraza, R., L., Valladares (1996) Melatonin in the rat testis: evidence for local
synthesis. Steroids 61:65-68.
Tison, F., Normand, E., Jaber, M., Aubert, I., B., Bloch (1991) Aromatic L-aminoacid
decarboxylase (DOPA decarboxylase) gene expression in dopaminergic and serotonergic cells
of the rat brain stem. Neurosci. Lett. 127: 203-206.
248
Bibliografía
Tonini, M. (2005) 5-hydroxytryptamine effects in the gut: the 3, 4, and 7 receptors.
Neurogastroenterol. Motil. 17:637-642.
Tucker, J. W., Jr., Lellis, W. A., Vermeer, G. K., Roberts, D. E., Jr., y P. N., Woodward (1997)
The effects of experimental starter diets with different levels of soybean or menhaden oil on
red drum (Sciaenops ocellatus) Aquaculture 149: 323.
Twarog, B. M. y I. H. Page (1953) Serotonin content of some mammalian tissues and urine and a
method for its determination. Am. J. Physiol., 175: 157-161.
Tyce, G. M. (1985) Biochemistry of serotonin. En: Serotonin and the cardiovascular sytem.
Editado por P. M. Vanhoutte. Raven Press (New York, USA), pp.: 1-14.
Tyce, G. M. (1990) Origin and metabolism of serotonin. J. Cardio. Pharmacol. 16 (Suppl. 3): S1S7.
Tyce, G.M., Flock, E.V., y C.A. Jr., Owen (1968) Uptake and metabolism of 5-hydroxytryptamine
by the isolated perfused rat liver. Am J Physiol 215:611–619.
Uchiyama, T., R., Chess-Williams (2004) Muscarinic receptor subtypes of the bladder and
gastrointestinal tract. J. Smooth Muscle Res. 40:237-247.
Underhay, J.R. y J.F., Burka (1997) Effects of pH on contractility of rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) intestinal muscle in vitro. Fish Physiol. Biochem. 16: 233-246.
Vakkuri, O., Rintamaki, H., J., Leppaluoto (1985) Plasma and tissue concentrations of melatonin
after midnight light exposure and pinealectomy in the pigeon. J. Endocrinol. 105:263-268.
Vakkuri, O., Rintamaki, H., J., Leppaluoto (1985) Presence of immunoreactive melatonin in
different tissues of the pigeon. Gen. Comp. Endocrinol 58:69–75.
Valenciano, A.I., Alonso-Gómez, A.L., Alonso-Bedate, M. y M.J., Delgado (1997) Effect of
constant and fluctuating temperature on daily melatonin production by eyecups from Rana
perezi. J. Comp. Physiol. B 167: 221-228.
Vandermaelen, C. P. (1985) Serotonin. En: Neurotransmitter Actions in the Vertebrate Nervous
System. Editado por M. A. Rogawski y J. L. Barker. Plenum Publishing Corporation (New
York, USA), pp.: 201-239.
Van`t Hof , T. J. y E., Gwinner (1999) Influence of pinealectomy and pineal stalk deflection on
circadian gastrointestinal trac melatonin rhythms in Zebra fish (Taenioppygia guttata). J. Biol.
Rhythms 14: 185-189.
Van Nieuwenhoven, M.A., Valks, S.D., Sobczak, S., Riedel, W.J. y R.J., Brummer (2004) Acute
tryptophan depletion slows gastric emptying in females. Br. J. Nutr. 91: 351–355.
Vanecek, J. (1998) Cellular mechanism of the melatonin action. Physiol. Rev. 78: 687-721.
249
Bibliografía
Vaughan, G.M. y R.J., Reiter (1986) Pineal dependence of the Syrian hamster‘s nocturnal serum
melatonin surge. J. Pineal Res. 3: 9-14.
Velarde, E. (2010) Tesis doctoral: Relojes periféricos en el tracto digestivo del carpin (Carassius
auratus): síntesis circadiana de melatonina y su función en la motilidad intestinal. Universidad
Complutense de Madrid, Madrid, 253pp.
Velarde, E. , Haque, R. , Iuvone, P.M. , Azpeleta, C. , Alonso-Gomez, A.L. , M.J., Delgado
(2009a) Circadian clock genes of goldfish, carassius auratus: CDNA cloning and rhythmic
expression of period and cryptochrome transcripts in retina, liver, and gut. J. Biol. Rhythms .
24: 104-113
Velarde, E., Alonso-Gómez, A.L., Azpeleta, C., Isorna, E., M.J., Delgado (2009b) Melatonin
attenuates the acetylcholine-induced contraction in isolated intestine of a teleost fish. J.
Comp.Physio. B. 179: 951-959
Velarde, E. , Cerdá-Reverter, J.M. , Alonso-Gómez, A.L. , Sánchez, E. , Isorna, E. , M.J., Delgado
(2010a) Melatonin-synthesizing enzymes in pineal, retina, liver, and gut of the goldfish
(Carassius): MRNA expression pattern and regulation of daily rhythms by lighting conditions
Chronobiology International. 27:1178-1201
Velarde, E., Delgado, M.J., A.L., Alonso-Gómez (2010b) Serotonin-induced contraction in
isolated intestine from a teleost fish (Carassius auratus): Characterization and interactions with
melatonin. Neurogastroenterology Motility. 22: 364-373
Velarde, E., Alonso-Gómez, A.L., Azpeleta, C., Isorna, E., De Pedro, N., Delgado, M.J. (2011)
Melatonin effects on gut motility are independent of the relaxation mediated by the nitrergic
system in the goldfish. Comp. Biochem. Physiol.A doi: 10.1016/j.cbpa.2011.01.024.
Velasco Martín, A. (2001) Técnicas instrumentales in vitro. En: Compendio de farmacología
general. Díaz de Santos, Madrid. Cap. 13 pp 287-297.
Verbeuren, T. J. (1989) Synthesis, storage, release, and metabolism of 5-hydroxytryptamine in
peripheral tissues. En: The Peripheral Actions of 5-Hydroxytryptamine. Editado por J. R.
Fozard. Oxford Medical Publications, Oxford University Press (Oxford, UK), pp.: 1-25.
Vieira, R., Míguez, J.M., Lema, M., M. Aldegunde (1992) Pineal and plasma melatonin as
determined by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection Anal.
Biochem. 205: 300-305.
Vivien-Röels, B., Arendt, J. y J., Bradtke (1979) Circadian and circannual fluctuations of pineal
indoleamines (serotonin and melatonin) in Testudo hermanni Gmelin (Reptilia, Chelonia). I.
Under natural conditions of photoperiod and temperature. Gen. Comp. Endocrinol. 37: 197210.
Von Bohlen und Halbach, O., y R., Dermietzel (2002) Neurotransmitters and Neuromodulators.
Handbook of Receptors and Biological Effects, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 402p.
250
Bibliografía
Vuilleumier, R., Boeuf, G., Fuentes, M., Gehring, W.J., J., Falcón (2007) Cloning and early
expression pattern of two melatonin biosynthesis enzymes in the turbot (Scophthalmus
maximus). Eur. J. Neurosci. 25:3047-3057.
Walther, D. J., J. U., Peter, S., Bashammakh, H., Hortnagl, M., Voits, H., Fink, M., Bader (2003)
Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform. Science. 299: 76.
Walton, M. J., Coloso, R. M., Cowey, C. B., J.W., Adron (1984a) The effects of dietary
tryptophan levels on growth and metabolism of rainbow trout (Salmo gairdneri). Br. J. Nutr.
51: 279-287.
Walton, M. J., Cowey, C.B., J.W., Adron (1984b) Effect of biotin deficiency in rainbow trout
(Salmo gairdneri) fed diets of different lipid and carbohydrate content. Aquaculture. 37: 2138.
Watson, A. H. D. (1979) Fluorescence histochemistry of the teleost gut: evidence for the presence
of serotoninergic neurones. Cell Tissue Res. 197: 155-164.
Wang, Y., S.C., Mangel (1996) A circadian clock regulates rod and cone input to fish retinal cone
horizontal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4655-4660.
Wang, Y., Takai, R., Yoshioka, H., K., Shirabe (2006) Characterization and expression of
serotonin transporter genes in zebrafish. Tohoku J. Exp. Med. 208:267-274
Weissbach, H., Redfield, B. G. y Axelrod, J. (1960) Biosynthesis of melatonin: enzymatic
conversion. En: McNeil, W.J. y Himsworth, D. C. (eds) Salmonid ecosystems of the North
Pacific,. Corvallis: Oregon State University Press. pp. 313-320.
Welker, H.A. y L., Vollrath (1984) The effects of a number of short-term exogenous stimuli on
pineal serotonin N-acetyltransferase activity in rats, J. Neural Transm. 59: 69–80.
Wiechmann, A.F., Vrieze, M.J. y Dighe, R., Y., Hu (2003) Direct modulation of rod photoreceptor
responsiveness through a Mel(1c) melatonin receptor in transgenic Xenopus laevis retina.
Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 44: 4522-4531.
Wikstrom, M.V. (1996) Melatonin, the pineal gland and circadian rhythms; an introduction. En:
Melatonin on-line. Development of trans-pineal microdialysis and its application in
pharmacological and chronobiological studies. pp. 3-52.
Wilson, J.M., L.F.C., Castro (2011). Morphological diversity of the gastrointestinal tract in fishes.
(2-55) En: The multifunctional gut of fish. Editors: Grosell M., Farrell A. P., Brauner C.J.,
Academic Press, London, 444pp.
Winberg, S. y O., Lepage (1998) Elevation of brain 5-HT activity, POMC mRNA expression, and
plasma cortisol in socially subordinate rainbow trout. Am. J. Physiol. 274: R645-R654.
Winberg, S., Overli, O., O., Lepage (2001) Suppression of aggression in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss) by dietary L-tryptophan. J. Exp. Biol. 204: 3867-3876.
251
Bibliografía
Wingate, D.L. (1981) Backwards and forwards with the migrating complex. Dig. Dis. Sci. 26:641666.
Whitmore, D., Foulkes, N.S., Strahle, U., P., Sassone-Corsi (1998) Zebrafish Clock rhythmic
expression reveals independent peripheral circadian oscillators. Nat Neurosci. 1:701-707.
Woollard, D. J., Bornstein, J. C., y J. B., Furness (1994) Characterization of 5-HT receptors
mediating contraction and relaxation of the longitudinal muscle of guinea-pig distal colon in
vitro. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 349: 455–462.
Wood, J.D., Alpers, D.H., P.L., Andrews (1999) Fundamentals of neurogastroenterology. Gut
45:6-16.
Yaga, H., Reiter, R. J. y B. A., Richardson (1993) Tryptophan loading increase day time serum
melatonin in intac and pinealectomized rats. Life Sci. 52: 1231-1238.
Yamamoto, T. (1966) An electron microscope study of the columnar epithelial cell in the intestine
of freshwater teleosts: goldfish (Carassius auratus) and rainbow trout (Salmo irideus), Z.
Zellforsch. Mikrosk. Anat. 72: 66–87.
Yasutake, W. T. y J. H., Wales (1983) Microscopic anatomy of salmonids: an atlas.U.S. Fish and
Wildlife Service Resource Publication 150, 190p. USFWS, Washington, DC.
Young, J. Z. (1980) Nervous control of gut movements in Lophius. J. Mar. Biol. Assoc. UK. 60:
19–30.
Young, S.N. y G.M., Anderson (1982) Factors influencing melatonin, 5-hydroxytryptophol, 5hydroxytryptamine and tryptophan in rat pineal gland. Neuroendocrinology 35: 464-468.
Yoshino, M., Obata, T., Sho, S., H., Kinemuchi (1984) Enzymic and molecular characteristics of a
new form of monoamine oxidase, distinct from form-A and form-B. Jpn. J. Pharmacol. 35:
105-115.
Yu, P.L., Fujimura, M., Okumiya, K., Kinoshita, M., Hasegawa, H., y M., Fujimiya (1999)
Immunohistochemical localization of tryptophan hydroxylase in the human and rat
gastrointestinal tracts. J. Comp. Neurol. 411: 654–665.
Yui, R., Nagata, Y., T., Fujita (1988) Immunocytochemical studies on the islet and the gut of the
arctic lamprey, Lampetra japonica. Arch. Histol. Cytol. 51: 109-119.
Zachmann, A., Knijff, S.C.M., Bolliet, V. y M.A., Ali (1991) Effects of temperature cycles and
photoperiod in rhythmic melatonin secretion from the pineal organ of a teleost (Catostomus
commersoni) in vitro. Neuroendocrinol. Lett. 13: 325-330.
Zachmann, A., Knijff, S.C.M., Ali, M.A. y M., Anctil (1992) Effects of photoperiod and different
intensities of light exposure on melatonin levels in the blood, pineal organ and retina of the
brook trout (Salvelinus frontinalis Mitchill). Can. J. Zool. 70: 25-29.
252
Bibliografía
Zilberman-Peled, B., Benhar, I., Coon, S.L., Ron, B., Y., Gothilf (2004) Duality of serotonin-Nacetyltransferase in the gilthead seabream (Sparus aurata): molecular cloning and
characterization of recombinant enzymes. Gen. Comp. Endocrinol. 138:139-147.
Zilberman-Peled, B., Ron, B., Gross, A., Finberg, J.P.M., Y., Gothilf (2006) A possible new role
for fish retinal serotonin-N-acetyltransferase-1 (AANAT1): dopamine metabolism. Brain Res.
1073:220-228.
Zvonic, S., Ptitsyn, A.A., Kilroy, G., Wu, X., Conrad, S.A., Scott, L.K., Guilak, F., Pelled, G.,
Gazit, D. y Gimble, J.M. (2007) Circadian oscillation of gene expression in murine calvarial
bone. J. Bone. Miner. Res. 22:357–365.
253
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