MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS HUMANO Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS Directora: ADRIANA MATIZ VILLAMIL BACTERIOLOGA M. Sc. Codirectora: MARÍA MERCEDES MARTÍNEZ MICROBIÓLOGA M. Sc. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. DICIEMBRE DE 2007 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia”. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS Aprobado: ___________________________ _______________________ Dra. Adriana Matiz Villamil Directora Dra. María Mercedes Martínez Coodirectora __________________________ _______________________ Dra. Andrea Aguirre Jurado Dr. David Gómez Jurado PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL AISLAMIENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS Y DETERMINACIÓN DE PATÓGENOS HUMANOS Escherichia coli y Salmonella sp. A PARTIR DE RESIDUOS ORGÁNICOS DOMICILIARIOS EN COMPOSTAJE LEIDY ANDREA CEPEDA PATIÑO SANDRA PATRICIA VALENCIA CÁRDENAS Aprobado: _________________________________ ____________________________ Dra. ANGELA UMAÑA MUÑOZ.,M.Phil Decano Académico Facultad de Ciencias Dra. Janeth Arias Directora Carrera de Microbiología A Dios por brindarme apoyo para alcanzar todas mis metas…. A mi mama por ser compañera y amiga por su apoyo y compañía durante la elaboración de este trabajo de grado A mi papa por ser la inspiración de todo lo que hago A mis tios por la confianza y apoyo constante a pesar de la distancia A mis amigas por su amistad y por compartir conmigo esta gran experiencia Leidy Andrea Cepeda Patiño A Dios por haberme acompañado en el transcurso de mi carrera. A mi mami por darme apoyo en los momentos mas difíciles y por infundirme paciencia cuando creí que esto no sería posible. A mi papi por darme ejemplo de no desfallecer y luchar por lo que se quiere. A mis amigos que me brindaron una sonrisa y sus palabras en el momento justo. Por último a mis compañeros de laboratorio por su ayuda incondicional en los momentos de desesperación. Sandra Patricia Valencia Cãrdenas. AGRADECIMIENTOS A Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P., empresa de aseo de Villavicencio por la colaboración prestada durante el desarrollo de este proyecto. A la Dra. Adriana Matiz directora del presente proyecto, por su dedicación e infinita paciencia, aportando sus conocimientos para el desarrollo de este trabajo. A la Dra. Maria Mercedes Martínez codirectora del presente proyecto, por el aporte de sus conocimientos y su paciencia para concluir con éxito este trabajo. A todos aquellos que de una u otra forma colaboraron con nuestro trabajo e hicieron posible que este se llevara a cabo. DICIEMBRE DE 2007 TABLA DE CONTENIDO Pág. 1.-INTRODUCCIÓN 1 2.- MARCO TEÓRICO 2 COMPOSTAJE 2 2.1.1 Beneficios del Uso del Compost 2 2.1.2 Factores de Importancia 3 • Equilibrio carbono/nitrógeno 3 • Temperatura 4 • Humedad 5 • pH 6 • Aireación 6 • Tamaño de partícula 7 • Ambiente 7 • Porcentaje de líquido efectivo (% LE) 7 2.2 PROPIEDADES FÍSICO QUÍMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES 8 2.2.1 Propiedades Físicas. 8 2.2.2 Propiedades Químicas. 8 2.3 ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS 8 • Lípidos simples 9 • Lípidos complejos 9 2.4 LIPASAS 10 2.4.1 Métodos de Determinación de Lipasas 12 2.4.2 Enzimas Termoestables 12 2.4.3 Enzimas en el Tratamiento de Residuos 14 2.4.4 Importancia Industrial de las Enzimas Lipolíticas 14 2.4.5 Microorganismos reconocidos Biotecnológicamente como Productores de Lipasas 16 2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLÓGICOS. 17 2.6 19 MICROORGANISMOS PATÓGENOS 3.- JUSTIFICACIÓN 21 4.- OBJETIVOS 23 4.1 Objetivo General. 23 4.2 Objetivos Específicos. 23 5.- METODOLOGÍA 24 5.1 REACTIVACIÓN DE CEPAS 24 5.2 FASE DE LABORATORIO 24 5.2.1 MUESTREO 24 5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 25 5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica 25 5.2.2.2 Identificación microscópica y macroscópica de las colonias 26 5.3 BANCO DE CÉLULAS PRIMARIO (Conservación de Cepas) 26 5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 26 5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO 28 5.5.1 Producción del inóculo 28 5.5.2 Fermentación Discontinua 28 5.6 TÉCNICA COLORIMÉTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA 28 5.6.1 Curva Patrón de p-nitrofenol 28 5.6.1.1 Evaluación y estandarización cuantitativa de actividad lipolítica 29 5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimática 29 5.7 DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia coli y Salmonella sp 31 5.7.1 Determinación de microorganismos patógenos Salmonella sp 32 5.7.2 Determinación de Escherichia coli 33 5.8 FASE DE CAMPO 34 5.8.1 Determinación de pH y Temperatura 34 5.8.2 Análisis Físico Químico de las muestras 34 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 6.1. Procesamiento de las muestras 36 6.1.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica 36 6.1.2 Identificación macroscópica y microscópica de las cepas 38 6.1.3 Criopreservación de cepas 40 6.1.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO 40 6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO 42 6.3 CURVA DE CALIBRACIÓN 45 6.3.1 Actividad Lipolítica 45 6.3.1.1 Estandarización del tiempo de contacto entre sustrato y extracto crudo 45 6.3.1.2 Estandarización de diferentes concentraciones de sustrato 46 6.3.1.3 Estandarización con diferentes volúmenes de extracto crudo 20 ul, 500 ul y 700 ul 49 6.4 Toma de muestras 51 6.4.1 Determinación de pH y temperatura 52 6.5 ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia coli y Salmonella sp 55 6.5.1 NMP de Salmonella sp con medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado 56 6.5.2 NMP Escherichia coli 59 6.6 ANÁLISIS FÍSICO QUÍMICOS 61 7.- CONCLUSIONES 64 8.- RECOMENDACIONES 65 9.- REFERENCIAS 66 Anexos 75 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminación de patógenos comunes en materiales orgánicos. 5 Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas 17 Tabla 3.Tabla guía para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp 32 Tabla 4 Cepas presuntivas lipolíticas 37 Tabla 5. Identificación macroscópica y microscópica de las colonias 39 Tabla 6. Promedio de resultados de las pruebas antagónicas 41 Tabla 7 a,b,c Promedio de No de colonias características en medio XLT4 y BS 57 Tabla 8. Promedio de resultados de Escherichia coli materias primas 60 Tabla 9. Promedio de resultados de Escherichia coli muestras finales 60 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Mecanismos de acción de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). 11 Figura 2 a. Cepa aislada L1 38 Figura 2 b. Cepa aislada L2 38 Figura 2 c. Cepa aislada L3 38 Figura 3 a. Cepa L1 Bacilos Gram negativos 39 Figura 3 b. Cepa L2 Bacilos Gram negativos filamentosos 39 Figura 3 c. Cepa L3 Bacilos Gram negativos 40 Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolíticas sin halo de inhibición 41 Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolíticas con las cepas del inóculo 42 Figura 6. Curva de producción de biomasa en función del tiempo Cepa L3 43 Figura 7. Curva de crecimiento Cepa L2 44 Figura 8. Tiempo de Contacto 46 Figura 9. Evaluación de las diferentes concentraciones de sustrato 47 Figura 10. Curva de UL al 1 ٪ y producción de biomasa en función del tiempo 47 Figura 11. Segunda evaluación de diferentes concentraciones de sustrato 48 Figura 12 Curva UL al 1.5 ٪ y producción de biomasa en función del tiempo 48 Figura 13. Estandarización de los diferentes volumenes de extracto crudo 50 Figura 14. Estandarización de los diferentes volumenes de extracto crudo 50 Figura 15. Conformación de las pilas 52 Figura 16. Medición de temperatura 52 Figura 17. Resultados de pH y temperatura vs tiempo durante el proceso de compostaje de residuos orgánicos 53 Figura 18. Medio semisólido Rappaport V con halo de aclaramiento 56 Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas. 57 Figura 20. Medio BS con colonias presuntivas 57 Figura 21. Resultados de bioquímicas para identificación de Salmonella sp 58 Figura 22. Turbidez e indol positivo 59 Figura 23. Fluorescencia positiva 60 LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo 1. Medio Leche- Almidón al 1% 77 Medio Líquido TSB 77 Medio Rappaport Vassiliadis Modificado 77 Medio Lecitina 78 Anexo 2. Promedios de Temperatura y pH de las 3 réplicas 79 Anexo 3. Preparación de Buffer Fosfato Concentración 1 M 83 Anexo 4. Curva Patrón p-nitrofenol 84 Anexo 5. Promedio de absorbancias de actividad enzimática 85 Anexo 6. Recuentos de las cepas aisladas 89 Anexo 7. Resultados pruebas de antagonismo 90 Anexo 8. Pruebas Bioquímicas de las Colonias Positivas para Salmonellla sp 91 Anexo 9. Requisitos específicos de fertilizantes o abonos orgánicos minerales Y enmiendas orgánicas según NTC 5167 (Icontec 2004) 92 Anexo 10. Análisis estadístico 97 Anexo 11. Metodología 98 RESUMEN La Empresa “Bioagrícola del Llano S.A E.S.P” ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposición de residuos sólidos urbanos (RSU) generados en esta región, como residuos de plaza, industria pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de transformación de estos residuos mediante el compostaje aeróbico, produciendo un bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones según la norma NTC 5167. Esta empresa ha venido desarrollando un importante proyecto de aprovechamiento y transformación de residuos urbanos sólidos mediante el proceso de compostaje enriquecido con inoculantes microbianos termófilos, compuestos por 14 cepas amilolíticas y proteolíticas. Este proyecto de investigación se fundamenta en el aislamiento de microorganismos lipolíticos, a partir de 3 replicas de pilas de compostaje de residuos orgánicos (plaza 55%, poda, contenido ruminal y cascarilla de arroz). Igualmente se estandarizó la técnica que permitió la evaluación y determinación de la actividad lipolítica generada por la cepa 3, mediante el manejo de diferentes tiempos de contacto entre la enzima producida y el sustrato (p-nitrofenil), como fueron 30 minutos y 60 minutos, así como también fueron utilizados diferentes concentraciones de sustrato 0.08% (p/v), 0.5% (p/v), 1% (p/v), 1.5% (p/v) y 2%(p/v). Los resultados determinaron como tiempo óptimo de contacto 30 minutos pero en las diferentes concentraciones de sustrato y volumen demuestra, no se presentaron diferencias significativas. De la misma manera, la cepa 3 obtuvo UL del orden de 30.73UL corroborando una actividad muy baja relacionada con su biomasa que fue de 30*10 9 UFC/ml. Así mismo se llevó a cabo un análisis de microorganismos patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp al inicio y al final del proceso arrojando resultados positivos al inicio y al final y un NMP de Salmonella sp < a 0.006473 NMP/4g. Igualmente se hizo una caracterización fisicoquímica al producto obtenido (bioabono) en Agrilab, el cual arrojo resultados de relación C/N de 8 %, humedad de 42.03%, N 1.86%, P 1.32%, K 2.53%; N orgánico 1.59% y metales pesados como Cobre 28.6 ppm y Zinc 118.3 ppm valores cercanos a lo exigido a la norma Icontec. ABSTRACT "Bioagrícola del Llano SA ESP" located in Villavicencio (Meta) has been developing since 2003 a comprehensive plan regarding the provision of municipal solid waste (MSW) generated in this region, such as waste plaza, livestock industry, kitchens , among others. That is why, now being carried out processing of this waste through aerobic composting, producing a bioabono rich in nutrients and good conditions under the rule NTC 5176. The company has been carrying out a major project for the use and conversion of municipal solid waste through composting process enriched inoculators microbial thermophilic, composed of 14 strains amilolityc and proteolityc. This research project is based on the isolation of microorganisms lipollitycs, from the assembly of 3 replicas of bacteria composting of organic waste (plaza 55%, pruning, rumen contents and cascarilla). They also standardized technique that permitted the evaluation and determination of the activity lipolityc generated by the strain 3, through handling different times of contact between the enzyme and substrate produced (pnitrofenil), as were 30 minutes and 60 minutes, they were used as well as different concentrations of substrate 0.08% (w / v), 0.5% (w / v), 1% (w / v), 1.5% (w / v) and 2% (w / v). The results identified as optimum time to contact 30 minutes but in different concentrations of substrate and volume shows there was no significant difference. In the same way, the strain 3 obtained UL order 30.73 UL corroborating a very low related to biomass that was 30 * 109 CFU / ml. It also took out an analysis of human pathogens Escherichia coli and Salmonella sp at the beginning and end of the process yielding positive results at the beginning and end and an MPN Salmonella sp <a 0.006473 NMP/4g. They also made a physicochemical characterization on the product (bioabono) Agrilab, which results daring relationship C / N 8% moisture 42.03%, N 1.86%, P 1.32% K 2.53%, organic N 1.59% heavy metals such as copper 28.6 ppm and zinc 118.3 ppm values near what is required by Icontec. 1.-INTRODUCCIÓN La generación de residuos sólidos municipales, varía en función de diferentes factores asociados a los niveles de ingreso, hábitos de consumo, desarrollo tecnológico y calidad de vida de determinada población, es por esto, que en la actualidad se busca una eliminación segura de dichos residuos para evitar problemas de salud pública y ambiental. La Empresa “Bioagrícola del Llano S.A E.S.P.” ubicada en Villavicencio (Meta) ha venido desarrollando desde el 2003 un plan integral en cuanto a la disposición de residuos sólidos urbanos (RSU) generados en esta región, como residuos de plaza, industria pecuaria, cocinas, entre otros. Es por esto que, actualmente se llevan a cabo procesos de transformación de estos residuos mediante el compostaje aeróbico, produciendo un bioabono rico en nutrientes y de buenas condiciones según la norma NTC 5176 (Anexo 10). Este sistema ha sido optimizado, mediante el uso de un inoculante biológico acelerante, compuesto por 14 cepas nativas termofílicas con actividad proteolítica y amilolítica (Galindo et al., 2005). Este inoculante ha sido evaluado con diferentes porcentajes de materias primas utilizadas, en la búsqueda de la optimización del proceso y por ende, en la calidad del producto obtenido (bioabono), gracias a la actividad enzimática proteolítica y amilolítica de los microorganismos del inoculante. Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este proyecto de investigación, fue aislar microorganismos nativos con actividad lipolítica, con el fin de potencializar la eficiencia del inoculante utilizado en la “Empresa Bioagrícola del Llano”, identificando así mismo patógenos humanos, para que de esta manera se logre obtener un compost con mejores características fisicoquímicas, libre de patógenos, que pueda ser utilizado en cultivos propios de la región, contribuyendo de esta manera al desarrollo agroindustrial. 2.- MARCO TEÓRICO 2.1 COMPOSTAJE El compostaje es la descomposición biológica y la estabilización de sustratos orgánicos, bajo condiciones controladas que desarrollan temperaturas termófilas como un resultado del calor producido biológicamente, y genera un producto final que es estable, libre de patógenos y semillas de plantas y puede ser aplicado benéficamente al suelo (Stefan et al., 2006). En el compostaje la fase sólida del material orgánico sirve de soporte físico, matriz de intercambio de gases, fuente de nutrientes orgánicos e inorgánicos, vertederos para los productos residuales metabólicos y aislamiento térmico (Sylvia et al., 1998). Los principales objetivos del proceso son estabilizar materia orgánica putrescible, conservar la mayor cantidad de nutrientes y materia orgánica como sea posible, y generar un producto uniforme y relativamente seco conveniente para usar como acondicionador de suelo y suplemento para jardines o para disponer en tierra. 2.1.1 Beneficios del Uso del Compost El compost se obtiene industrialmente por la transformación biológica de la materia orgánica. De esta transformación resulta un bioabono o acondicionador de suelos, apto según las características fisicoquímicas y microbiológicas, para la fertilización, tanto por la mejora del suelo como soporte fisicoquímico, como en relación con la capacidad de retención de agua, y presencia de agregados y microorganismos (MacGregor et al., 2001). Los ácidos resultantes de los procesos de degradación de la materia orgánica disuelven parte de los productos minerales del suelo y los hacen aprovechables para la nutrición de las plantas. Los organismos actúan como promotores de crecimiento, controladores biológicos y remediadores de suelo. El nitrógeno contenido en el compost se encuentra en forma asimilable por las raíces y puede ser retenido en el horizonte A - B (capa cultivable del suelo), evitando ser arrastrado por las aguas de lluvia o de riego a capas más profundas fuera del alcance del sistema radicular (Macgregor et al., 2001). Igualmente, la modificación de las características físico - químicas del terreno hace que se incremente el grado de disponibilidad del fósforo y potasio para la planta. El compost incorpora al terreno micro y oligo elementos (cobre, magnesio, zinc, manganeso, hierro, boro, etc.) que son muy necesarios para la actividad y desarrollo vegetativo de las plantas. Otra característica importante es que reduce la necesidad de pesticidas químicos al producir plantas saludables que son menos atacables por plagas de insectos, enfermedades y heladas (Trautmann y Olynciw, 1999). Físicamente, la aplicación de compost reduce la erosión y mejora la estructura del suelo, la retención de agua y el drenaje (Vásquez, 2003). 2.1.2 Factores de Importancia Hay varias condiciones críticas para la elaboración óptima de compost. Debe haber una humedad adecuada (50-60% de contenido de agua), evitando el exceso (70% o superior), puesto que interfiere con la aireación y reduce el autocalentamiento. La relación carbononitrógeno no debería ser mayor de 40:1(Atlas y Bartha, 2001). • Equilibrio carbono/nitrógeno En la composición elemental del sustrato, se encuentra la cantidad relativa de carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y otros nutrientes. Además de la composición, es necesario conocer la calidad de los sustratos para determinar el rango de descomposición (Silvya, et al 1998). Conviene mezclar materiales de origen vegetal y animal para procurar un contenido aceptable de todos los nutrientes esenciales. Es importante mantener un buen equilibrio entre los materiales ricos en carbono y los ricos en nitrógeno, para que la relación C/N se mantenga entre 25 y 35. Una relación elevada retrasa la velocidad de humificación y un exceso de N ocasiona fermentaciones no deseables. La mezcla debe ser rica en celulosa, lignina (restos de poda, pajas y hojas muertas) y en azúcares (hierba verde, restos de hortalizas y orujos de frutas). El nitrógeno será aportado por el estiércol, el purín, las leguminosas verdes y los restos de animales de mataderos. Todo se debe mezclar de manera tan homogénea como sea posible materiales pobres y ricos en nitrógeno, y materiales secos y húmedos (Vásquez, 2003). Un contenido menor de nitrógeno no permite la formación de biomasa microbiana suficiente. Una proporción excesiva de nitrógeno (C:N= 25:1 o menos) causa la volatilización del amonio, produce malos olores, y baja el valor fertilizante del compost resultante (Atlas y Bartha, 2001). • Temperatura Al inicio del proceso de desprende gran cantidad de calor, etapa termófila, la temperatura en el material a compostar puede subir hasta los 60 ó 70ºC, la actividad bacteriana aumenta rápidamente. Debido al aumento de temperaturas, una gran cantidad de agua del material se evapora. El oxígeno tiene que llegar a todo el material, por lo que el material requiere de una buena ventilación. En esta etapa los microorganismos atacan la materia más fácilmente biodegradable (Roder, 1998). La actividad metabólica de los microorganismos, al actuar sobre los sustratos orgánicos, libera energía. Parte de la energía generada al interior de la pila de compostaje es utilizada por los microorganismos, y otra parte es liberada al ambiente en forma de calor, es por esto que el incremento de la temperatura es reflejo de la actividad microbiana sobre la materia orgánica. Uno de los efectos de la temperatura sobre la pila de compostaje es la eliminación de microorganismos patógenos (Fundases, 2006). Es importante tener en cuenta que para determinado grupo de microorganismos existen rangos de temperatura y tiempos de exposición (tabla 1). Tabla 1. Tiempo y temperatura de eliminación de patógenos comunes en materiales orgánicos. Microorganismo Salmonella sp. Escherichia coli Brucela Abortus Corynebacterium diphtheriae Tiempo 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora Temperatura 55ºC 55ºC 55ºC 55ºC Fuente: EPA, 1992 El diseño de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destrucción de patógenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura. Estos organismos prefieren temperaturas por debajo de los 42ºC, ya que normalmente viven a la temperatura corporal del hombre y animales, o a la temperatura ambiental de las plantas. En la fase termofílica del compostaje se busca eliminar patógenos con el fin de minimizar focos de contaminación y establecer un bioabono óptimo para ser aplicado a cultivos de consumo directo. Las técnicas para la preparación de compost se les señalan como muy efectivas para el control de microorganismos patógenos y la tasa de mortalidad de estos microorganismos esta en función del tiempo y de la temperatura. Cuando el proceso de compostaje funciona correctamente se pone de manifiesto que la mayoría de los organismos patógenos mueren cuando se exponen todas las partes de la pila a temperaturas de 55 ºC (Luque, 1997). • Humedad El agua es requerida por los microorganismos para desarrollar sus funciones metabólicas, además, es utilizada como vehículo de trasporte de nutrientes y productos de desecho. En la pila de compostaje, el balance de la humedad es importante, ya que bajos valores afectan el metabolismo microbiano, mientras que altos valores de humedad, conllevan a la acumulación de agua en las cavidades intersticiales, dificultando la difusión de O2 y favoreciendo las condiciones de anaerobiosis. Así pues, la humedad de la pila de compostaje debe oscilar entre el 60 al 70% (Fundases, 2006). • pH El valor del pH no sólo determina la existencia de una ecología microbiana particular sino que su nivel y sus variaciones pueden inhibir fuertemente la actividad de las bacterias. Un pH entre 5.5 y 8.5 es óptimo a los microorganismos del compost. En las fases tempranas del proceso los ácidos orgánicos excretados por los hongos y bacterias aumentan, hay un crecimiento fúngico y se empieza la degradación de lignina y celulosa. Si el sistema se vuelve anaeróbico la acumulación ácida puede bajar el pH hasta 4.5 y limitar la actividad microbiana; en estos casos la aireación es importante para volver el pH hasta sus rangos óptimos (Trautmann y Olynciw, 1999). Así mismo es importante resaltar como se menciona en estudios recientes que la actividad enzimática lipolítica se ve afectada por factores como el pH, la temperatura, la composición del medio y la aireación, mostrando mayor afinidad por pHs alcalinos debido a que se presenta una mejor solubilización de los productos de hidrólisis formados (Chahinian et al., 2005). • Aireación Se trata de un proceso aerobio (requiere oxígeno) por lo que es importante mantener una aireación adecuada. Para ello, se han de mezclar materiales pastosos (lodos de depuradora, estiércol) con otros que aumenten la porosidad (paja, virutas, etc). Los materiales de excesivo tamaño (restos de poda), es conveniente triturarlos previamente para que descompongan más fácilmente. Una forma de mantener una adecuada aireación durante el compostaje es mediante volteos periódicos o con aireación forzada. El material de los materiales a compostar debe variar entre los 35 y los 75 mm (Trautmann y Olynciw, 1999). Otra forma de oxigenar las pilas de compost son los métodos de aireación directa, ya sea por succión o por presión (Roder, 1998). • Tamaño de partícula La actividad microbiana generalmente ocurre en la superficie de las partículas orgánicas. Por consiguiente, el tamaño de la partícula menor, con mayor área de superficie, aumentará la actividad y sucesivamente la proporción de descomposición. Por otro lado cuando la partícula es demasiado pequeña se unen inhibiendo la circulación de aire en el compost, y por ende el oxígeno disponible para los microorganismos, minimizando su actividad (Trautmann y Olynciw, 1999). Es importante tener en cuenta el tamaño de las partículas, todos los tipos de residuos verdes con excepción del pasto deben ser triturados para optimizar el proceso de degradación ya que ésta otorga propiedades como agrandar la superficie para que el microorganismo pueda actuar, reduciendo el material original a un volumen del 30 % (Stock, 2002). • Ambiente En climas fríos y húmedos conviene situarlo al sol y al abrigo del viento, protegiéndolo de la lluvia con una lámina de plástico o similar que permita la oxigenación. En zonas más calurosas es mejor situarlo en un lugar sombreado para evitar la desecación (Vásquez, 2003). • Porcentaje de líquido efectivo (% LE) Este parámetro se utiliza cuando hay presencia de lípidos (grasas y aceites) en los materiales a compostar debido a que ellos son líquidos a las temperaturas de tratamiento y causan interferencia en la medición de humedad. Se ha encontrado que el porcentaje LE debe estar entre el 68% y el 70 % de acuerdo con diversos estudios (Pérez, 1999). 2.2 PROPIEDADES FÍSICO QUÍMICAS DE LOS RESIDUOS COMPOSTABLES 2.2.1 Propiedades Físicas. La descomposición es llevada a cabo esencialmente en un ambiente acuoso. Los componentes solubles de los sustratos sólidos y residuos del metabolismo microbiano se difunden a través de una película de humedad sobre el compost sólido, el contenido de humedad óptimo para el compostaje, está generalmente entre 40 y 60%, es decir, se sitúa en el orden del 15 al 35% (Sztem y Pravia, 1999). Además es importante para mejorar la estructura y estabilidad del suelo, la textura y su permeabilidad ya que regula el balance hídrico del suelo y reduce el riesgo de erosión porque los suelos compactos se sueltan y los arenosos se compactan por la acción de la materia orgánica (Vásquez, 2003). 2.2.2 Propiedades Químicas. La aplicación de residuos orgánicos y desechos de una amplia variedad de actividades humanas a suelos arables ha recibido atención alrededor del mundo por una potencial mejora en la fertilidad del suelo e incremento en el contenido de materia orgánica. Los residuos orgánicos son raramente aplicados al suelo en estado fresco o crudo. Generalmente, ellos son procesados para obtener materia orgánica estabilizada, madura, con producción de sustancias húmicas (Gigliotti et al., 2002). En la materia orgánica procesada, una parte de las sustancias orgánicas es soluble en agua, por esta razón, un impacto inmediato de la aplicación de materiales orgánicos sobre los suelos agrícolas es la liberación de materia orgánica dentro de la solución del suelo (Gigliotti et al., 2002). 2.3 ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y GENERALIDADES DE LAS LIPASAS Los lípidos (del griego, lipos, grasa) se encuentran en todos los organismos vivos y desempeñan un papel indispensable en el mantenimiento de la vida. Sin embargo a diferencia de las proteínas y los carbohidratos, los lípidos son en extremo polimórficos y difíciles de definir estructuralmente (Horton, 2003). Aunque las estructuras de los lípidos son con frecuencia complejas, comparten en su estructura partes similares. Los lípidos más sencillos son los ácidos grasos, ácidos monocarboxílicos de la fórmula general R-COOH, en donde R representa una cola de hidrocarburo. Los lípidos se pueden clasificar de diferentes maneras, aunque en general se dividen en: ● Lípidos simples: son los que contienen uno o dos tipos de moléculas diferentes, e incluyen, entre otros, a los hidrocarburos, los alcoholes, aldehídos y ácidos grasos, los eicosanoides, los polihidroxialcanoatos, las cutinas, las suberinas, los cianolípidos, los acilgliceroles (o acilglicéridos), las ceras, las ceramidas, los lipoaminoácidos y lipopéptidos, los lípidos fenólicos, los terpenos, los alcaloides isoprenicos, las quinonas lipidicas y los esteroides (Rivera y García, 2007). ● Lípidos complejos: son aquellos que contienen glúcidos en su estructura, y los que están formados por tres o más tipos de moléculas diferentes. Incluyen a los gliceroglicolípidos, los glicerofosfolípidos, las esfingomielinas, los gangliósidos, los cerebrósidos, los lipoaminoácidos glicosídicos, los acilglicósidos, los lipopolisacáridos y los proteolípidos, entre otros (Rivera y García, 2007). De los lípidos mencionados, los ácidos grasos y los acilglicéridos son de especial interés. Los ácidos grasos están formados por cadenas hidrocarbonadas saturadas o insaturadas que contienen al menos un grupo carboxílico en uno de sus extremos. Estas moléculas intervienen en múltiples funciones biológicas, y están en la base de la biosíntesis del resto de lípidos (Rivera y García, 2007). Una variedad de lípidos anfipáticos, que incluyen los glicerofosfolípidos y los esfingolípidos, son componentes de importantes de todas las membranas biológicas (Horton, 2003). Los acilglicéridos están formados por uno, dos o tres ácidos grasos esterificados a una molécula de glicerol (mono, di y triacilglicéridos, respectivamente), y están, implicados en varias funciones biológicas: reserva energética, aislamiento, señalización intra e intercelular, etc. Estos compuestos pueden ser hidrolizados mediante soluciones alcalinas (saponificación), o mediante la actividad de unas enzimas llamadas lipasas que liberan un ácido graso (Cheetham, 2005). Por otra parte, los lípidos están envueltos en diferentes procesos biológicos. La estructura de la membrana celular depende de la combinación de ciertas proteínas y lípidos específicos. Las enzimas lipolíticas juegan un rol importante en la movilización de lípidos entre células individuales de los organismos como también en la transferencia de los lípidos de un organismo a otro (Beisson et al., 2000). Los microorganismos han sido la principal fuente de extracción de diversas enzimas. Las lipasas son parte de la familia de las hidrolasas, catalizan la hidrólisis de triacilglicéridos en la interfase lípido-agua. Además de su rol fisiológico en la hidrólisis de grasas neutras, las lipasas catalizan la hidrólisis o síntesis enantio- y regio-selectiva de una amplia variedad de sustratos naturales tales como soya, aceite de pescado, ricino y frutas cítricas (Björkling et al., 1991), así mismo pueden llevar a cabo la esterificación, interesterificación y transesterificación en medios no acuosos (Houde et al., 2004). Estas enzimas presentan su pH óptimo entre 8 y 9, también se han reportado lipasas con pH óptimo ácido. En cuanto a la temperatura, la mayoría trabaja apropiadamente en el rango de 30-40ºC, algunas son activas a temperaturas bajas como 29ºC. El calcio parece estimular la actividad de la mayoría de las lipasas, mientras que los agentes quelantes y los iones de metales pesados las inhibe (López, 1999). 2.4 LIPASAS Son usadas para hidrolizar lípidos produciendo ácidos grasos y glicerol, las reacciones más importantes en las cuales las lipasas están implicadas son reacciones quirales debido a la posibilidad de resolver mezclas racémicas (Sánchez, 1999). El mecanismo de acción de las lipasas consiste en la hidrólisis de un ácido graso en presencia de alcohol obteniendo un éster y liberando agua (Figura 1). Así mismo el mecanismo catalítico de las lipasas se basa en un sistema de intercambio de cargas que consta de 4 etapas. Tras la unión del sustrato, se produce el ataque nucleofílico por parte del grupo hidroxilo de la serina catalítica sobre enlace éster del lípido, lo que lleva a la rotura del enlace y a la formación de un intermediario entre el ácido graso y la serina nucleofílica. Posteriormente se libera el alcohol y se produce un segundo ataque nucleofílico por parte de una molécula de agua que ataca el enlace éster del intermediario transitorio, lo que produce la liberación del ácido graso y la regeneración del centro catalítico (Bornscheuer, 2002). En algunos organismos, las grasas y los aceites (triacilgliceroles) funcionan como depósitos de reserva de energía metabólica. En algunos casos, los lípidos llevan a cabo funciones biológicas como moléculas individuales; en otros interactúan con otras biomoléculas para realizar una función como parte de un complejo o a un agregado. Los complejos lipídicos comprenden las lipoproteínas (partículas compuestas de lípidos y proteína), y los agregados lipídicos incluyen las membranas biológicas (capas delgadas compuestos de lípidos, proteínas y algunas veces carbohidratos) (Horton, 2003). Las lipasas son una clase de enzimas de rápida producción, poseen actualmente nuevas aplicaciones en la industria de hidrocarburos en síntesis orgánica y han expandido su penetración en la producción farmacéutica. El primer objetivo son las lipasas bacterianas y fúngicas porque éstas son más fáciles de producir, modificar por tecnología de DNA recombinante (Snellman y Cowell, 2004). Ambientalmente las lipasas son utilizadas en inoculantes como depurador de tratamientos cloacales y como tratamiento para hidrolizar grasa en residuos sólidos y líquidos como una alternativa de sustitución de productos de origen químico (Sánchez, 1999). O O R1C------ OR 2 + H2O----------------- R1C-------OH----R2OH Figura 1. Mecanismos de acción de las lipasas (Arpigny y Jaeger, 2000). 2.4.1 Métodos de determinación de lipasas Las dificultades que conlleva el hecho de que las lipasas sean enzimas solubles en medio acuoso que actúan sobre sustratos hidrofóbicos ha llevado al desarrollo de una gran cantidad de métodos para determinar la actividad de estas enzimas y su inhibición, como ensayos en placas con triacilglicéridos, ensayos espectrofotométricos con sustratos naturales, derivados del p-nitrofenol o ésteres de resorufina, ensayos espectrofluorimétricos con análogos de acilglicéridos que contienen fluoróforos como la 4metilumbeliferona (MUF) o la resorufina, ensayos cromatográficos para la detección de moléculas como los ácidos grasos, el β-naftol o el p-nitrofenol liberados por las lipasas al hidrolizar los acilglicéridos o sus correspondientes análogos, métodos, basados en la neutralización de la acidez generada por los ácidos grasos libres, métodos tensiométricos que miden cambios en la tensión superficial de las monocapas lipídicas, métodos radiométricos que utilizan sustratos marcados radiactivamente, y otros métodos para la detección de la actividad lipolítica o de las propiedades fisicoquímicas de estas enzimas tales como ensayos conductimétricos, turbidimétricos, resonancia magnética nuclear, microscopia de fuerzas atómicas, cristalografía, etc. (Beisson et al., 2000). Por otro lado, estas enzimas son caracterizadas por tener una amplia actividad ya que catalizan un gran rango de reacciones, usando así para ser evaluadas la técnica de pnitrofenil laurato (sustrato), la cual en estudios recientes ha demostrado que dichas enzimas lipolíticas tienen en su mayoría un alto contenido de ácidos hidrofóbicos (60.2%) (Neerupmaa y Jagdeep, 2006). Así mismo, la mayoría de las enzimas lipolíticas han sido estudiadas según sus propiedades químicas. Entre estas se encuentran la dependencia a la actividad de los iones Ca2+, pH y temperatura (Arpigny y Jaeger, 2000). 2.4.2 Enzimas Termoestables Las enzimas son los catalizadores de las reacciones de los sistemas biológicos cuyas dos principales características son la extrema especificidad y la óptima velocidad de reacción. La estructura de la membrana celular depende de la combinación de ciertas proteínas y lípidos específicos (Rivera y García, 2007). Las enzimas estables se encuentran generalmente en organismos adaptados a vivir en condiciones hostiles. Actualmente, hay un gran interés en las enzimas de organismos ya que se han realizado gran cantidad de estudios sobre la relación estructura-estabilidad de las enzimas provenientes de dichos microorganismos (Hubble, 1990). En cuanto al crecimiento microbiano a temperaturas elevadas se pueden destacar las adaptaciones que estas han venido desarrollando a lo largo de la evolución. Estos microorganismos para sobrevivir a temperaturas elevadas comprenden, entre otras, una gran proporción de lípidos saturados en las membranas, lo cual impide la fusión a esas temperaturas (Atlas y Bartha, 2001). Muchos microorganismos termófilos producen enzimas que no se desnaturalizan a altas temperaturas. A veces, las proteínas de los termófilos presentan secuencias de aminoácidos poco frecuentes que estabilizan dichas proteínas a temperaturas elevadas. Cuando se sobrepasa el máximo de temperatura de crecimiento, los ribosomas se funden y cesa la síntesis de proteínas. Muchos termófilos tienen proporciones muy altas de guanina y citosina en su ADN, que eleva el punto de fusión y añade estabilidad a la molécula de ácido nucléico del organismo (Atlas y Bartha, 2001). Las termoenzimas son aquellas que se producen a temperaturas aproximadas de 60ºC y 80ºC (hipertermófilos). Son resistentes a la denaturación irreversible y óptimamente activas a altas temperaturas (60-120ºC), por lo cual son usadas en muchos procesos industriales (Zeikus et al., 1998). Estas formas termófilas de vida son de interés, no solo desde el punto de vista biológico sino porque poseen ventajas industriales y biotecnológicas. Las enzimas de termófilos son capaces de catalizar reacciones bioquímicas a altas temperaturas y son generalmente más estables; esto se debe a la presencia de los puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, intercambio iónico, unión a metales y puentes disulfuro; lo que prolonga la vida útil de las enzimas (Páez et al., 2000). De la misma manera, los microorganismos extremófilos han despertado un gran interés durante los últimos años, debido a la elevada estabilidad térmica, resistencia a desnaturalizantes químicos y pHs extremos de sus enzimas, que las hacen especialmente adecuadas para su uso en procesos de biotransformación en condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura. Los microorganismos termófilos crecen a temperaturas superiores a 45ºC, y en algunos casos (hipertermófilos) incluso por encima de 90ºC. La disponibilidad de lipasas termofílicas permitiría operar a altas temperaturas, con el lógico incremento de la velocidad de reacción y una más fácil solubilización de los sustratos, aspecto que constituye con frecuencia un factor limitante en algunas aplicaciones de este tipo de enzimas, por ejemplo reacciones de síntesis en medios con bajo contenido en agua ( Rivera y García, 2007). 2.4.3 Enzimas en el tratamiento de residuos La aplicabilidad de grupos enzimáticos depende de la capacidad de hidrolizar polímeros complejos para incrementar su posterior degradación microbiana. Dentro de éstas se incluyen empleo de lipasas asociados a cultivos bacterianos para eliminar depósitos de grasa procedentes de diversas industrias, como embutidos o láctea, entre otras. Así mismo en estudios recientes se ha demostrado que combinando microorganismos aislados del agua residual de una industria de alimentos con microorganismos lipolíticos termófilos se acelera el proceso de compostaje al ser utilizados éstos, mezclados en un inoculante (Tsai et al., 2006). Otras enzimas degradadoras de polímeros utilizadas en forma similar son las celulasas, amilasas y proteasas. Además de esta hidrólisis de materiales poliméricos existen también aplicaciones de enzimas capaces de degradar compuestos tóxicos que podrían ocasionar la inhibición de procesos fundamentados en el desempeño microbiológico. 2.4.4 Importancia industrial de las enzimas lipolíticas Pocas enzimas lipolíticas son las que han sido aisladas en forma pura y cristalizada, y poco se conoce acerca de su estructura y función. Las enzimas lipolíticas han cobrado gran atención por su potencial aplicación en biotecnología (Benjamín y Pandey,1998). Muchas son las aplicaciones que se han encontrado para las lipasas, en la industria del aceite, la producción de farmacéuticos, agroquímicos y componentes aromáticos (Jaeger, 1999). Las lipasas son usadas en dos distintos ámbitos. Ellas son usadas en la catálisis para la manufactura de otros productos (como ingredientes alimentarios) y por sus aplicaciones (producción de químicos). Todas ellas presentan una gran eficiencia cuando son empleadas en la industria (Cheetham, 2005). Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos químicos tradicionales en la manufactura alimentaria y, las lipasas, se usan actualmente en la producción de una variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Ashok et al., 1999) En la mayor parte de los casos la producción de enzimas debe ser inducida por la adición de aceites y grasas. Aunque se reconocen casos en que las grasas no tienen efecto sobre la producción de estas. Las lipasas están generalmente unidas a las células por tanto inhiben la superproducción pero mediante la adición de un catión como magnesio; las lipasas se liberan y esto conduce a un título mayor de enzimas en el proceso de producción (Sánchez, 1999). Entre otras aplicaciones, estas enzimas se utilizan en la industria alimentaria (producción de aromas, emulgentes, etc.), en química orgánica (síntesis de antibióticos, pesticidas, producción de compuestos enantiopuros, etc.), en detergencia (aditivos en detergentes, producción de surfactantes para jabones y productos de limpieza, etc.), en la industria papelera (eliminación del “pitch”, de tintas, etc.), así como en el tratamiento de productos residuales o tóxicos, en biosensores, en la producción de biodiesel, etc (Bornscheuer, 2002). La importancia de estas aplicaciones ha llevado a la optimización de las reacciones catalizadas por las lipasas, a mejoras en la producción y purificación de estas enzimas, así como a la obtención de lipasas con nuevas propiedades catalíticas o una mayor estabilidad, lo que se ha conseguido mediante la modificación de enzimas ya existentes, o mediante el aislamiento de nuevas lipasas (Wiseman, 1995). 2.4.5 Microorganismos reconocidos biotecnológicamente como productores de lipasas Las lipasas han sido aisladas de una gran variedad de microorganismos pero una de las primeras fuentes ha sido la especie Bacillus, la cual además de la producción de lipasas, produce otras enzimas de interés industrial como son las celulasas, amilasas, elastasas, etc. Las lipasas difieren en varias de sus propiedades, éstas dependen de su origen (el cual puede ser fúngico, bacteriano, de mamíferos, etc.), ellas catalizan la hidrólisis o síntesis de una gran variedad de esteres carboxílicos y liberan ácidos orgánicos y glicerol. Todas ellas muestran una alta especificidad sobre los sustratos (Rivera y García, 2007). En años recientes, más de 30 lipasas fueron asiladas de cepas de Rhizopus y muchas de ellas han sido caracterizadas (Rivera y García, 2007). Las lipasas de Rhizopus están relacionadas con las lipasas de Rhizomucor miehei (existe una homología >55%), éstas tienen una alta especificidad en la posición 1,3 de triglicéridos, las cuales las hacen muy versátiles en la modificación de lípidos. En estudios recientes en la ciudad de Suiza se determinó en la fase termofílica del compost el gen Thermus perteneciente a Bacillus stearothermophillus, aislado de un proceso de compostaje con residuos de cocina y de poda. Este compost alcanzó una temperatura máxima reportada de 80°C la cual es óptima para el crecimiento de este microorganismo (Beffa et al., 2006). Las enzimas termoestables pueden ser obtenidas de organismo mesofílicos y termofílicos; se han obtenido algunas enzimas termofílicas a partir de organismos psicrófilos (Imamura y Kitaura, 2000). Los principales organismos de los cuales se han extraído enzimas de interés industrial son hipertermófilos Pyrococcus furiosus y Thermotoga sp (Adams et al., 1995). Otros organismos como hongos son productores de lipasas termoestables (Tabla 2). Tabla 2. Microorganismos productores de lipasas Organismo Candida Antarctica Candida curvata Mucor miehei Temperatura óptima ºC 70 50-60 40 pH Óptimo 6.5 6.5 7.0 Fuente: (Rivera y García, 2007). Así mismo, las lipasas son producidas por muchos microorganismos, siendo las fuentes tradicionales para la producción comercial: Pseudomonas sp, Serratia sp, Rhizopus sp, Mucor sp, Aspergillus spp y Candida. Algunos de los microorganismos producen varias lipasas cuya especificidad varía con respecto a los ácidos grasos y a la posición en el triglicérido (López 1999). Entre los microorganismos reportados como mayores productores de enzimas lipasas termofílicas se encuentra el género de Bacillus sp, siendo la especie mas destacada B. thermocatenolatus, éstos producen dos lipasas extracelulares termoestables las cuales dependen de la edad del cultivo (Nerupmaa y Jagdeep, 2006). Se han encontrado estudios recientes de levaduras productoras de lipasas como: Candida rugosa la cual produce lipasa extracelularmente y es ampliamente utilizada para propósitos industriales. Una preparación comercial de lipasa de esta levadura puede separase en varias izoenzimas, con varios mecanismos como: diferente contenido de carbohidratos, punto isoeléctrico, substrato específico y secuencia primaria (Neerupma, 2006). 2.5 IMPORTANCIA DE LOS INOCULANTES BIOLÓGICOS. Los inoculantes biológicos están clasificados como: biofertilizantes, biocontroladores y acelerantes. Los biofertilizantes o abonos biológicos tienen como principio activo microorganismos vivos (bacterias y hongos) que promueven y benefician la nutrición y el crecimiento de las plantas. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, el uso de biofertilizantes representa una importante alternativa para limitar el uso de abonos químicos, reduciendo su negativo impacto ambiental y económico, y mejorando la productividad de los cultivos enfocado al óptimo crecimiento vegetal permitiendo así un mejor aprovechamiento de los recursos naturales del suelo, por estas razones la producción de bio-insumos agrícolas ha cobrado importancia (Cuevas et al., 2000). Es evidente que un desarrollo exitoso de esta tecnología debe ir ligado a la generación de conocimiento básico que conduzca a una mayor comprensión de los fenómenos asociados al proceso de nutrición vegetal promovidos por los inoculantes (Lozano, 2005). En la actualidad la implementación de inoculantes termofílicos es una alternativa viable en el tratamiento de residuos sólidos orgánicos. La gran estabilidad que presentan las enzimas de estos microorganismos, frente a temperaturas extremas, garantiza una capacidad de degradación mayor que la obtenida por géneros microbianos mesofílicos. La utilización de inoculantes biológicos a partir de microorganismos mesófilo - termófilos ha traído grandes beneficios en compostación de residuos domésticos, industriales y hospitalarios. En estudios recientes en una industria láctea, se realizó una prueba de compostaje de campo, comparando un inoculante comercial con un inoculante que tenía cepas nativas, observando al final del proceso, la eficiencia de las bacterias nativas y la óptima utilización de estas en la degradación de diversos desechos producidos por la industria en estudio (Moreno et al.,2001). De la misma forma, otro proyecto de investigación fue el realizado en la ciudad de Sogamoso (Boyacá), donde se evaluó la acción de un inóculo termofílico con actividad enzimática proteolítica, amilolítica, lipolítica y celulolítica, acelerador del proceso de compostaje en residuos sólidos municipales. En la prueba de campo se verificó la eficiencia del inoculante aplicado sobre la pila experimental, se evidenció la reducción del tiempo de degradación a ocho semanas, ya que el tiempo del proceso de compostaje era de 16 semanas. Por otra parte, este proceso garantizó el mejoramiento de las características fisicoquímicas y la eliminación de patógenos en el producto final (Palomino et al., 2002). En diversos proyectos se ha obtenido un rendimiento óptimo a partir de inoculantes correspondiente a la tasa de degradación de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar de modo alguno la calidad del producto final; por el contrario se ha logrado la producción de un compost con alto contenido de elementos como nitrógeno, fósforo y potasio, que ayudan a aumentar la viabilidad de los suelos (Moreno et al., 2001). 2.6 MICROORGANISMOS PATÓGENOS El control sanitario del compost es de vital importancia, éste debe ser tratado de manera adecuada debido a que será utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en agricultura orgánica o inorgánica, dando lugar a la contaminación de los productos y/o de las fuentes de aguas, por lo que su aplicación descontrolada constituye un peligro para la salud pública y una amenaza para el medio ambiente por la exposición a microorganismos patógenos que esto representa (Fundases, 2006). Los patógenos son causantes de enfermedades y pueden pertenecer a cualquiera de las clases de microorganismos, bacterias, hongos, virus, ricketsias y protozoos. El diseño de un proceso de compostaje debe tener en cuenta la destrucción de patógenos, ya que la presencia de ellos afecta los cambios normales de temperatura (Islam et al., 2004). A lo largo del proceso de compostaje, se espera una reducción total de los agentes patógenos por acción de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibióticas, entre otros. Salmonella sp. es una bacteria Gram negativa, predominantemente móvil, anaerobia facultativa, que al ser un microorganismo patogénico de tipo entérico causa salmonellosis en animales y humanos (EPA Método 1682, 2006). De igual manera Salmonella sp. puede causar una deshidratación crónica y muerte en los niños mientras que en el ganado puede causar abortos. Una vez la vaca es infectada con Salmonella su erradicación es difícil ya que hay cepas resistentes a antibióticos. Además, puede transmitirse por contacto directo de animales (Islam et al., 2004) Así mismo, Salmonella sp, es uno de los patógenos entéricos más estudiados encontrados en el compost. Es conocido que la temperatura de 55°C por 15 días es letal para los miembros de este grupo (EPA, 1682). Por otra parte Escherichia coli, es una bacteria Gram negativa, que causa infecciones de tipo intestinal, es por esto que la presencia de este microorganismo patógeno en el compost y su diseminación en el medio ambiente (suelo, agua, superficie de las plantas) merece especial atención por las severas consecuencias que puede traer un mal manejo de este producto para la salud y la higiene ambiental, por lo que es necesario que los productores apliquen buenas prácticas agrícolas para manipular estos fertilizantes naturales con el fin de reducir al mínimo los peligros microbiológicos ( Islam et al., 2004). 3.- JUSTIFICACIÓN. Bioagrícola del Llano S. A. E.S.P ubicada en el Departamento del Meta (Villavicencio); es una empresa creada a través del Acuerdo 004 de 1995 del Concejo Municipal y constituida el 17 de agosto de 1995, a fin de atender a la necesidad surgida de la Ley 142 de 1994, que aplica a aquellas entidades que realizan actividades prestadoras de servicios públicos domiciliarios, alcantarillado, aseo, entre otros. De ésta manera la empresa se ha orientado en una gestión que promueve el mejoramiento continuo de los procesos y la satisfacción de los usuarios. Por esta razón, se han obtenido reconocimientos por los avances efectuados en materia de disposición final y compensación ambiental efectuada en el relleno sanitario “Don Juanito”, el cual en la actualidad es el Parque Ecológico Reciclante en esta ciudad. Así mismo, esta empresa es la encargada de realizar la recolección y transporte de residuos sólidos domiciliarios y comerciales. En la actualidad se reciben 308 toneladas/día de residuos de la cuales aproximadamente 285 toneladas corresponden a la disposición de Villavicencio y 23 toneladas corresponden a la disposición de otros municipios. En cuanto a los residuos orgánicos generados se utilizarán como recurso para eliminar focos de contaminación y optimizar la higiene pública. Actualmente, se ha venido desarrollando un inoculante biológico acelerante compuesto por 14 cepas nativas termofílicas con actividad proteolítica y amilolítica (Galindo et al., 2005) el cual ha contribuido a la reducción del tiempo de producción y a la obtención de un compost de buena calidad. Por lo anterior, se buscará potencializar la eficiencia del inóculo ya existente compuesto por cepas termofílicas amilolíticas y proteolíticas, aislando microorganismos nativos con actividad lipolítica que serán adicionados al inoculante microbiano termofílico con el fin de optimizar su acción en el proceso de degradación de residuos orgánicos. Así mismo, debido a la importancia que ha alcanzado este compost producido (bioabono) se plantea el análisis de patógenos humanos E.coli y Salmonella sp. al inicio y al final del proceso para garantizar su calidad. Por ultimo, la finalidad de este proyecto es poder obtener resultados favorables mediante el aislamiento de las bacterias anteriormente mencionadas, para mejorar la eficiencia del inóculo con el que se ha venido trabajando en la Empresa Bioagrícola del Llano, el cual aportará óptimos resultados al momento de obtener el bioabono producido. 4.- OBJETIVOS 4.1 Objetivo General. Aislar bacterias lipolíticas y determinar patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. a partir de residuos orgánicos domiciliarios en compostaje. 4.2 Objetivos Específicos. • Aislar bacterias con actividad lipolítica a partir de los residuos orgánicos a compostar. • Evaluar la capacidad antagónica de las cepas en estudio. • Evaluar cualitativamente y cuantitativamente actividad enzimática lipolítica de las cepas seleccionadas. • Estandarizar la técnica de p-nitrofenol para la evaluación cuantitativa de las cepas. • Determinar patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. en compost, al inicio y final del proceso de compostaje. 5.- METODOLOGÍA Este proyecto fue realizado en el relleno sanitario “Don Juanito” en la ciudad de Villavicencio manejado por la empresa Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P, en donde se llevó a cabo el montaje de tres replicas de compostaje, utilizando 55% de residuos de plaza, contenido ruminal, poda y cascarilla de arroz, para el aislamiento de bacterias lipolíticas y para llevar a cabo la determinación de patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. Las muestras fueron procesadas y analizadas en los laboratorios de Microbiología Ambiental y Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. La determinación de los parámetros fisicoquímicos del producto inicial y final se realizó en AGRILAB, laboratorio certificado por el ICA (Anexo 12). 5.1 REACTIVACIÓN DE CEPAS Se llevó a cabo la reactivación de 14 cepas nativas termofilicas, con actividad proteolítica y amilolítica provenientes de residuos orgánicos domiciliarios del relleno sanitario “Don Juanito” de la ciudad de Villavicencio, las cuales fueron conservadas en glicerol al 25%(v/v), en el banco de células del laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana (Galindo et al; 2005). El proceso de reactivación de las 14 cepas se llevó a cabo en medio líquido leche-almidón al 1%(p/v) (Anexo1) hasta obtener una concentración de 1020 UFC/mL a una temperatura de 55°C. A partir de estas, se produjo la cantidad de inoculante necesaria para aplicar a las pilas de compostaje. Para comprobar la producción de biomasa de las cepas reactivadas se determinó mediante técnicas cualitativas (formación de halos de hidrólisis) en agares específicos (leche-almidón al 1%), se realizaron recuentos en placa para determinar biomasa, fueron incubadas a 55°C por 24 horas. La cantidad de inoculante a preparar se calculó de acuerdo a los metros cúbicos de residuos orgánicos que se compostaron y a la concentración final deseada de 1020 UFC/mL, siendo 2.5 litros por metro cúbico la cantidad destinada para cada tonelada (Galindo et al., 2005). 5.2 FASE DE LABORATORIO 5.2.1 MUESTREO A partir de las 3 réplicas de compostaje, se tomaron de las materias primas y del compost final 5 muestras de 100 g cada una para completar 500 g, utilizando un tubo de PVC de 70 cm de largo por 3 de diámetro, para esto se retiró el material de tal forma que la materia quedó al descubierto, de dicha pared se tomaron las 5 muestras de diferentes alturas y distancias (Universidad de los Andes, 2003). Posteriormente, se trasladaron en bolsas plásticas de cierre hermético dentro de una nevera plástica al laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. El análisis realizado a estas muestras primero fueron análisis físico químico y segundo “screening” de bacterias lipolíticas y patógenos. 5.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 5.2.2.1 Aislamiento de bacterias con actividad lipolítica A partir de 500g de muestra homogenizada se tomaron 10 gramos y se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada al 1% (p/v) de 10-1 a 10-8. Luego se sembró en superficie y por duplicado 0.1 mL de las diluciones, en medio lecitina (Ramírez et al., 2004) (Anexo 1) se utilizó como control medio de cultivo tributirina. Algunos de los microorganismos aislados hidrolizaron el ácido graso presente en el medio, generando una zona de hidrólisis o aclaramiento alrededor de las colonias que se evidenció después del tiempo de incubación a 55°C por 24 horas. Se tuvo como parámetro de selección, las cepas con halos ≥ 1mm de diámetro (Jaeger et al., 1999, citado por Moreno et al., 2001) Las siembras realizadas fueron sucesivas, mediante la técnica de parcheo para purificar cada colonia, en donde se observó la actividad enzimática, la cual se determinó de forma cualitativa en mm de diámetro con la siguiente ecuación (1): C = A – B (ecuación 1) En donde: A: Diámetro de la colonia más el halo de hidrólisis en mm. B: Diámetro de la colonia en mm. C: Diámetro del halo de hidrólisis (Rodríguez et al., 2002) 5.2.2.2 Identificación microscópica y macroscópica de las colonias Para llevar a cabo la identificación microscópica se realizaron montajes en láminas de cada una de las colonias seleccionadas y se realizaron tinciones de Gram para evidenciar morfología celular (Madigan, 1997). En la identificación macroscópica se tuvieron en cuenta características de las colonias como halos de hidrólisis, color, textura, tamaño y elevación de las colonias bacterianas. 5.3 BANCO DE CÉLULAS PRIMARIO (Conservación De Cepas). La conservación de las cepas seleccionadas se realizó mediante la técnica de criopreservación con glicerol al 30% (v/v). Para alcanzar la concentración óptima de 108 UFC/mL del banco fue necesario realizar recuentos en placa en medio lecitina para confirmar la concentración inicial. Cada cepa fue cultivada en 25 mL de caldo lecitina por 12 horas a 55ºC. Posteriormente se añadieron 25 mL de caldo lecitina más glicerol al 60% (v/v). Finalmente se tomó 1 mL de dicha suspensión y se almacenó en tubos eppendorf a -70°C (Poutou et al., 1994). Este procedimiento se llevó a cabo con cada una de las cepas aisladas. 5.4 PRUEBAS DE ANTAGONISMO Las 14 cepas existentes correspondientes al inóculo utilizado en La Empresa “Bioagrícola del Llano S.A E.S.P.” se llevaron a cultivar de 48 horas a 55°C en el medio correspondiente a cada cepa, para determinar el tiempo óptimo de crecimiento del microorganismo. (Galindo et al., 2005). Se realizó un inóculo con una concentración de 108UFC/mL en un erlenmeyer relación 1/5 en caldo Almidón-leche al 1% (p/v) y lecitina bajo las siguientes condiciones 55ºC por 12 horas, después de este tiempo se realizaron las pruebas de antagonismo para cada una de las cepas. Para la prueba se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos en medio almidón-leche al 1%(p/v) y lecitina. A partir de la suspensión anterior se tomaron 20µl y se dispusieron en pozos, como control se tomó el microorganismo que se sembró masivamente, esta técnica se realizó por triplicado enfrentando las 14 cepas existentes con las cepas lipolíticas aisladas. Este antagonismo se evaluó con el fin de evidenciar si las cepas lipolíticas pueden ser adicionadas al inóculo ya existente .Las 14 cepas ya existentes no presentan antagonismo entre ellas comprobado en estudios anteriores. (Galindo et al.,2005) El efecto antagónico se evaluó midiendo el diámetro de los halos de inhibición, tomando como antagonismo positivo a las cepas que enfrentándose entre sí, inhibieron el crecimiento de las otras en ≥ 5mm de diámetro (Gauze, 1967). Adicionalmente, se realizaron pruebas antagónicas de las cepas lipolíticas enfrentadas entre si obtenidas del screening, sembrando masivamente cada cepa lipolitica. De igual manera al iniciar las pruebas fue necesario que los microorganismos alcanzaran la misma concentración (108UFC/mL) para evitar falsos positivos. Para esto se llevaron a cabo nuevamente recuentos en placa en medio lecitina, lo cual permitió determinar la concentración inicial de cada microorganismo, posteriormente se realizó la metodología anteriormente mencionada. 5.5 CURVAS DE CRECIMIENTO Esta prueba se realizó con el fin de determinar el tiempo de la fase de crecimiento de cada una de las cepas aisladas y de esta manera saber, el tiempo óptimo para la producción del inóculo nativo termofílico, en el cual se genera mayor actividad enzimática. 5.5.1 Producción del inóculo Se preparó un inóculo de 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial obtenido del banco primario de cada una de las cepas en un erlenmeyer de 500 mL (1/5), el cual duró en incubación un tiempo aproximado de 24 horas. Transcurrido este tiempo para la fermentación se transfirió a un erlenmeyer de 1000mL con 500 mL de medio lecitina, relación (1/2) adicionalmente se realizó coloración de Gram para corroborar pureza (Moreno et al., 2001). 5.5.2 Fermentación Discontinua Se tomó del inóculo preparado en el numeral anterior la cantidad correspondiente a 0.5 mL para realizar diluciones de 10-1 a 10-10 para luego determinar biomasa mediante la técnica de recuento en placa (UFC/mL) por triplicado, por un periodo de incubación de 18 horas a 55ºC. Para la determinación de biomasa de los diferentes tiempos de muestreo se leyó absorbancia utilizando la técnica de lavado con buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4 + KH2 PO4) y adición de Triton X-100 al 1%, debido a la turbidez del medio. Esta técnica se leyó a 540 nm (Otálora et al., 2003) la metodología anterior se uso para bacterias, para actinomycetes utilizó únicamente la técnica de recuento en placa. 5.6 TÉCNICA COLORIMÉTRICA P-NITROFENIL PALMITATO PARA ACTIVIDAD LIPOLÍTICA 5.6.1 Curva patrón de p-nitrofenol La curva de p-nitrofenol se realizó en tubos 13 x 100mm, utilizando una solución buffer fosfato 1M (Anexo 3), el cual fue utilizado como blanco y como solución buffer del pnitrofenil (Otálora et al., 2003). Para realizar la curva patrón (Anexo 4), se preparó una solución stock de p-nitrofenil de 1umol/mL en buffer fosfato pH 7.0, a partir de esta solución se determinaron las diferentes concentraciones para la construcción de la curva de p-nitrofenol, las cuales fueron leídas por duplicado en un espectrofotómetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrán et al., 2006). Las concentraciones de p-nitrofenol que arrojaron valores de absorbancias entre 0.1 y 0.9 fueron escogidos para realizar el trabajo de acuerdo con la Ley de Beer-Bouguer-Lambert (Otálora et al., 2003). 5.6.1.1 Evaluación y estandarización cuantitativa de actividad lipolítica Para determinar la actividad lipolítica se preparó una solución buffer fosfato 1M a pH 7 + o – 2 (Na2HPO4 + NaH2PO4) con diferentes concentraciones de p-nitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v), 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)) + 1% de TRITON X-100 (Shuen et al., 1996). A partir de esta solución se tomó 900µl en tubos 16*150 y se le adicionó diferentes volúmenes de extracto crudo (20µl, 500µl y 700µl). La solución se incubó por 30 y 60 minutos a 55 °C. Transcurrido este tiempo se frenó la reacción con NaOH. Posteriormente cada una de las mezclas fue llevada a centrifugación a 10000 rpm por 10 minutos, a partir del sobrenadante se tomó 1mL y fue depositado en las celdas de cuarzo, para luego realizar la lectura usando como blanco la solución buffer sin extracto crudo de la enzima en espectrofotómetro Spectronic 21D Milton Roy a 450nm (Beltrán et al., 2006). Las unidades lipolíticas fueron determinadas a través de la curva patrón de calibración donde una unidad de p-nitrofenol liberada corresponde a una unidad lipolítica por minuto (UL). (Kampen, 1999). 5.6.1.2 Prueba preliminar de actividad enzimática Se realizaron pruebas preliminares de actividad enzimática de las cepas escogidas, llevando a cabo una fermentación discontinua, para lo cual se llevó a cabo la producción de un inóculo en 100mL de caldo lecitina, inoculando un vial de cada cepa obtenido del banco primario en un erlemmeyer de 500mL para alcanzar una relación (1/5) con un pH inicial 7.5 y un tiempo de incubación de 24h a 55°C. Pasado el tiempo de incubación se trasladaron 100mL del inóculo a un erlenmeyer de 1000mL que contenía 400 mL de caldo lecitina relación (1/2) con pH 7.5 inicial, éstos se cultivaron durante 12 horas, a 55°C, posteriormente se retiró el erlenmeyer, iniciando el muestreo en la hora 0, luego se realizaron muestreos cada media hora hasta llegar a la hora y media, a partir de aquí se realizaron muestreos cada 2 horas de fermentación hasta la hora 18, para corroborar pureza del cultivo se realizaron coloraciones de Gram en cada hora de muestreo (Otálora et al.,2003). En cada muestreo se tomaron del erlenmeyer 5mL de muestra, esta se centrifugó a 150 rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante, es decir, el extracto crudo que contiene la enzima lipolítica como se mencionó el numeral anterior. Por otro lado, se preparó una solución de Buffer Fosfato 1 M a pH 7 (K 2HPO 4 + KH2 PO4), el cual fue mezclado con el p-nitrofenil palmitato mas Triton X – 100 a una concentración del 1% (Beltrán et al.,2006). A partir de esta solución se tomaron las cantidades especificadas anteriormente de p-nitrofenil palmitato y extracto crudo en tubos 13*100. La solución se incubó por 30 y 60 minutos a 55ºC transcurrido este tiempo se frenó la reacción con 1575 ul de NaOH (Otálora et al., 2003). Luego se realizó la lectura usando como blanco la solución de Buffer sin el extracto crudo de la enzima (Beltrán et al., 2006). Para realizar la técnica de cuantificación de la actividad enzimática, se formula que una unidad lipolítica se define como la cantidad de enzima capaz de liberar una micromol de p- nitrofenol por minuto por litro (Moreno et al., 2001). 5.7 DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS. Escherichia.coli y Salmonella sp. 5.7.1 Determinación de microorganismos patógenos. Salmonella sp. Las muestras iniciales fueron tomadas de la primera y última semana de residuos del proceso de compostaje, éstas fueron recolectadas en bolsas plásticas de cierre hermético y llevadas a refrigeración a 4°C hasta el momento de su análisis. Para la presencia de Salmonella sp se usó el método de NMP (número más probable). A partir de 500g de muestra se tomaron 25g para diluirlo en 225mL de agua peptonada al 0.1%(p/v), enseguida se homogenizo por inmersión (EPA, 1682, 2005). Seguido a esto se realizaron tres diluciones: el primer juego se realizó con frascos de vidrio, con 10mL de medio líquido TSB (Anexo 1) mas 20mL de muestra homogenizada, el segundo juego se realizó en tubos tapa rosca (16x150mm) con 5mL de medio líquido TSB más 5mL de muestra homogenizada y finalmente el tercer juego con tubos tapa rosca (16x150mm) con 10mL de medio liquido TSB mas 1mL de muestra homogenizada. Cada juego correspondió a las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 respectivamente. Se incubó 24h a 36°C (EPA, 1682-2006), para cada una de las diluciones (10-1, 10-2 y 10-3) se preparó el medio Rappaport Vassiliadis (semisólido) (Anexo 1). Sobre cada caja se distribuyeron cinco puntos equidistantes y se depositaron 30µl de cada juego de diluciones. Esto se llevó a incubar a 42°C por 24h. De cada una de las gotas depositadas (5) en el medio semisólido Rappaport Vassiliadis correspondiente a cada dilución, se repicaron a medios selectivos XLD y Sulfito Bismuto (EPA, 1682-2006). De los aislamientos se escogieron colonias características de Salmonella sp y de estas se hicieron pases a: TSI, LIA y UREA (Tabla 3), seguido de esto se escogieron las colonias que presentaron reacción metabólica positiva, y se realizó la prueba serológica con solución salina y antisuero polivalente ´´o``, esta prueba consiste en obtener una muestra de la superficie inclinada del tubo de cada una de las bioquímicas, emulsionando sobre una lámina con suero fisiológico estéril, evidenciando aglutinación en caso de un resultado positivo (EPA, 1682-2006). Tabla 3.Tabla guía para la lectura indicadores de Presencia de Salmonella sp Medio Resultados Salmonella Método 1682 Reacción Positiva Tripticasa soya Medio Rappaport Vassialiadis modificado Positivo Positivo XLT4 Positivo Turbidez Células que migran en el medio alrededor del halo donde se realizó la inoculación de color blanco grisáceo rosado a rojo con colonias que presentan centro negro TSI Positivo Viraje de rojo a Método 1682 Reacción Negativa No turbidez Medio de color igual al inicial sin halo Otro color con centro negro ejm: E.coli: colonias amarillas con el centro negro Otro tipo de color amarillo con o sin producción de H2S Columna vertical y superficie inclinada color violeta, formación de H2S LIA Positivo ÚREA Negativo Color Rosado Polivalente “O” Positivo Aglutinación Otra combinación de colores ejm: E.coli presenta color rojo o variación entre rojo y morado sin producción de H2S No hay cambio de color ( Salmonella es ureasa negativo) No Aglutinación Fuente: EPA 2006 United States Enviromental Protection Agency Method 1682: Salmonella in Sewage Sludge (Biosolids) by Modified Semisolid Rappaport-Vassiliadis (MSRV) Medium La determinación de NMP se realizó a partir de los tubos originales de TSB con resultados positivos para Salmonella sp en MSRV, XLD, Hecktoen, Sulfito Bismuto, TSI, LIA, urea negativo y antisuero polivalente positivo, se leyeron en la tabla de NMP. Para la determinación de sólidos totales se tomaron 15g de la muestra a 100°C por 24 horas. El porcentaje de peso seco se calculó utilizando la siguiente ecuación (1) g de la muestra seca (1) % peso seco = * 100% g de la muestra Para la determinación de Salmonella sp como NMP/15g peso seco se utilizó la siguiente ecuación (2): NMP/ ml (peso húmedo) * 15 (2) NMP/15g (peso seco) = Porcentaje de sólidos totales 5.7.2 Determinación de Escherichia coli. Las muestras para el análisis fueron tomadas de la primera y última semana de la mezcla del compost, éstas fueron recolectadas en bolsas plásticas de cierre hermético y llevadas a refrigeración a 4°C hasta el momento de su análisis. Para la presencia de Escherichia coli se usó el método de NMP (número más probable). A partir de 500g de muestra se tomaron 10g para diluirlo en 90ml de agua peptonada al 0.1%(p/v), enseguida se homogenizó por inmersión (EPA, 1680, 2006). Seguido a esto se realizan tres diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Alternamente se preparan 9 tubos, cada uno con 9ml de caldo LMX ,los cuales cada serie de tres serán inoculados con 1ml de las diluciones ya preparadas, que corresponderán la primera serie de tres a la dilución 10 -1, la segunda serie de tres ala dilución 10-2, y la ultima serie de tres a la dilución 10-3. Se tomó como resultados positivos para Escherichia coli aquellos tubos que presentaran tres reacciones positivas como lo son: Indol positivo, fluorescencia y presencia de glucoronidasa (EPA, 1680, 2006). Para la determinación de NMP/4g se revisó en la tabla establecida por la EPA, 1680, 2006. 5.8 FASE DE CAMPO 5.8.1 Determinación de pH y Temperatura La temperatura fue analizada mediante un termómetro de punzón de 70 cm de largo con receptor digital, las mediciones se realizaron diariamente. Estas temperaturas se registraron de las 3 replicas de compostaje para luego ser promediadas y encontrar el valor medio. Este procedimiento se realizó diariamente los resultados fueron registrados para su posterior análisis. El pH se determinó semanalmente en el laboratorio de Biotecnología Aplicada por medio del método de pasta de saturación, que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila hasta completar 500g y agregar 500mL de agua destilada; se debe mezclar y pasados de 5 a 10 minutos, se toma el valor del pH sobre el extracto liquido superficial (Galindo et al., 2005). Finalmente se calibra el potenciómetro con las soluciones reguladoras de pH 7.0 y 4.0 (soluciones buffer) y se introduce el electrodo de vidrio en la pasta saturada y se registra la lectura (ICONTEC, 2004). 5.8.2 Análisis Fisicoquímico De Las Muestras Se tomaron 500 g del compost final y fueron destinadas para el análisis de los parámetros fisicoquímicos realizados por AGRILAB, laboratorio registrado ante el ICA, con el fin de establecer parámetros fisicoquímicos: Relación C/N Humedad, Cenizas. Carbobo orgánico oxidable, Capacidad de Intercambio Catiónico, Nitrógeno orgánico, Fósforo total, Potasio total, Calcio total, Magnesio Total, Azufre total, Hierro total, Manganeso total, Cobre total, Zinc total. 5.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO De acuerdo a los registros de actividad enzimática se que se obtendrán, con las diferentes cantidades de sustrato y de extracto crudo, se llevara a cabo un análisis de ANOVA, para el posterior análisis en el programa JUMP. Planteamiento de Hipótesis. Ho: No existen diferencias entre la actividad lipolítica obtenida a partir de microorganismos nativos de compost en los tiempos de contacto, los volúmenes de extracto y las diferentes concentraciones de sustrato. Ho: H1 = H2 = H3 Hi: Al menos una de las variables analizadas presenta diferencias significativas. Hi: H1 ≠ H2≠ H3 Por otra parte, según los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo se realizó un estudio de tipo descriptivo en el que se plantearon las siguientes hipótesis Ho: Las cepas enfrentadas presentan antagonismo Hi: Las cepas enfrentadas no presentan antagonismo 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Bioagrícola del Llano S.A. E.S.P, ubicada en Villavicencio (Meta) se ha convertido en un puente entre la civilización y la biodiversidad, debido al Parque Ecológico Reciclante, en el que se encuentra ubicado el Relleno Sanitario “Don Juanito”. Este parque a través del tiempo ha dado respuesta a la necesidad de brindar una nueva imagen a la comunidad demostrando una excelente gestión ya que brinda un adecuado manejo de los residuos sólidos logrando así un ecosistema benéfico ( Galindo et al., 2005). Por lo anterior, se demuestra la importancia de la obtención de estos resultados ya que se le proporcionará a Bioagrícola del Llano avances en cuanto a las posibilidades del inoculante acelerante ya desarrollado con cepas amilolíticas y proteolíticas con una actividad de 114.5 UA y 98.5 UP respectivamente (Rodríguez et al., 2005) las cuales permitirán un mejoramiento continuo para optimizar la calidad del bioabono que se comercializa en cultivos de la región. 6.1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 6.1.1 Aislamiento de Bacterias con Actividad Lipolítica Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza, contenido ruminal y cascarilla de arroz. A partir del “screening” inicial en medio lecitina después de realizar las respectivas diluciones, siembras en superficie e incubación a 55ºC por 48 horas, se obtuvo un total de 9 cepas presuntivas (Tabla 4) debido a la presencia de un halo de hidrólisis, como consecuencia de la utilización de la fuente de carbono del medio (ácidos grasos contenidos en la lecitina) estas se les realizo técnicas de agotamiento para obtener cepas purificadas. Luego de las siembras sucesivas se obtuvieron 3 cepas denominadas: L1, L2 y L3 (Figura 2a, b y c). Se debe tener en cuenta que la lecitina es el nombre común para un determinado tipo de fosfolípidos, estos son componentes importantes que se encuentran en la estructura de todas las membranas celulares. De la misma manera la lecitina, es una importante fuente de fosfolípidos, la cual es necesaria para todas las células vivas. Las membranas de las células que regulan los nutrientes que pueden penetrar o no en la célula, están compuestas en gran medida de lecitina (Rivera y García, 2007). Tabla 4. Cepas presuntivas lipolíticas Halo de hidrólisis en mm Cepa Lipolítica de diámetro 1L 1,5 2L 1,3 3L 1,2 4L 1,0 5L 1,0 6L 1,1 7L 1,0 8L 0,5 9L 0,8 Fuente: Autores, 2007 Cabe anotar que de las cepas aisladas únicamente tres presentaron un halo > de 1 mm de diámetro se seleccionaron aquellas cepas que tenían un halo de hidrólisis entre 1.2mm y 1.5 mm ya que estos fueron los mayores diámetros. Sin embargo, en los mismos procesos algunas lipasas son reportadas con una alta especificidad por ácidos grasos. El más amplio ejemplo es la lipasa extracelular aislada de la cepa Geotrichum candidum, la cual es reportada por poseer una alta especificidad por los ácidos grasos insaturados (Stránský et al., 2006). En la preparación del inóculo para Geotrichum se utilizaron medios de cultivo que tenían al igual que el lecitina MgSO 4 y KCL lo que otorga al microorganismo un sustrato favorable para su desarrollo, diferenciándose únicamente en la fuente de carbono (Aceite de Oliva), utilizado como inductor de lipasas (Stránský et al., 2006). Figura 2a. Cepa aislada L1. Medio lecitina Figura 2b. Cepa aislada L2. Medio lecitina Figura 2c. Cepa aislada L3. Medio lecitina Fuente: Autores, 2007 Figuras 2. a,b,c Cepas Purificada con un tiempo de incubación de 48 horas a 55ºC. En estudios recientes se ha encontrado que la mayoría de microorganismos lipolíticos y sus enzimas se obtienen del suelo, donde se encuentran bacterias muy activas en el reciclaje de nutrientes como las pertenecientes al género Bacillus y otros géneros relacionados. Estos géneros están considerados como una de las mayores fuentes de enzimas con aplicación industrial debido a que, en general, son microorganismos no patógenos, bien estudiados y fáciles de manipular, que producen y secretan grandes cantidades de enzimas como lipasas, celulasas, entre otros ( Snellman, 2004). 6.1.2 Identificación macro y microscópica de las cepas De acuerdo al aislamiento, se identificaron morfologías macro y microscópicas de las 3 cepas, siendo 1 actinomycete y 2 bacterias (Tabla 5). Al realizar coloraciones de Gram, se determino la presencia de bacilos gram positivos filamentosos para el actinomycete y bacilos Gram negativos para las dos bacterias (Figura 3 a,b y c) Tabla 5. Identificación Macro y Microscópica de las colonias Cepa Origen Morfología Microscópica Morfología Macroscópica Cepa L1 Pila No 3 Cepa L2 Pila No 3 Bacilos Gram negativos Bacilos Gram negativos Colonias cremosas de color amarillo Colonias rugosas de color blanco Cepa L3 Pila No 3 filamentosos Bacilos Gram negativos Colonias cremosas de color amarillo Fuente: Autores 2007. Cepa L1. Bacilos Gram negativos Cepa L2. Bacilos Gram negativos filamentosos Cepa L3. Bacilos Gram negativos Fuente: Autores, 2007. Figura 3 a,b,c . Coloraciones de Gram 6.1.3 Criopreservación Cepas de En total fueron criopreservadas 3 cepas con glicerol al 30 %(v/v). Cada cepa fue almacenada en 35 viales a -70ºC para un total de 105 viales. 6.1.4 Pruebas de Antagonismo Esta prueba se realizó con las 3 cepas seleccionadas como lipolíticas, con el fin de evaluar la posible inhibición en el crecimiento. Se llevo acabo enfrentando las tres cepas entre sí. Los resultados no evidencian antagonismo entre las cepas seleccionadas (Figura 4), lo que favorecería su actividad en el inoculante, ya que estas pruebas tienen como propósito evaluar la ausencia de inhibición de crecimiento entre las cepas. El hecho de no presentar inhibición de crecimiento entre los microorganismos puede atribuirse a que probablemente no liberan sustancias que impida el crecimiento de la cepa enfrentada o las liberan en cantidades que no alcanzan a afectar su desarrollo. También puede deberse a que la producción de sustancias inhibitorias se vea estimulada por condiciones de estrés, como falta de nutrientes y en este caso el medio en el cual se desarrollaron (agar lecitina) contenía los nutrientes en cantidades necesarias para su crecimiento. (Duran, 1996). Así mismo cabe destacar que estas cepas posiblemente no presentan antagonismo al ser aisladas de la misma fuente (residuos orgánicos) donde conviven sin presentar ningún tipo de competencia por sustrato debido a que esta fuente muy posiblemente cuenta con todos los requerimientos óptimos para su desarrollo. Las pruebas se realizaron en agar lecitina, por triplicado; los resultados reflejan un posible efecto de sinergismo que podría acelerar la degradación de los residuos sólidos presentes en el compost, constituidos por lípidos, disminuyendo el tiempo del compostaje. (Tabla 6). Tabla 6. Promedio de Resultados de las pruebas antagónicas. (Diámetro de Halos en mm) Cepa No L1(R1) L2(R1) L3(R1) L1 0 0 L2 0 0 Fuente: Autores, 2007. L3 0 0 - Figura 4. Enfrentamiento de cepas lipolíticas sin halo de inhibición Fuente: Autores, 2007 Las pruebas antagónicas también se realizaron enfrentando las cepas aisladas lipolíticas con las cepas del inóculo, para evaluar si las cepas seleccionadas como lipolíticas, tienen efecto antagónico frente a las cepas del inóculo. La cepa L1 (Figura 5) presentó efectos antagónicos con las cepas 3P (Proteolítica), 4 A (Amilolítica), 5AP ( Actividad compartida: Amilolítica y Proteolítica), 8AP ( Actividad compartida: Amilolítica y Proteolítica) y 14AP (Actividad compartida: Amilolítica y Proteolítica) . Se tomo como diámetro de halo representativo o inhibitorio (> 5mm). Los resultados reflejan que la cepa L1 tiene efecto antagónico. Las pruebas antagónicas fueron realizadas en un medio que contenía tres fuentes de carbono para cumplir con las exigencias nutricionales de los microorganismos evaluados. El medio contenía 1%(p/v) leche, 1%(p/v) almidón y lecitina (Anexo1). La pequeña inhibición presentada por la cepa 1 (Anexo 7) muy seguramente se presentó debido a que en este caso si hubo una competencia por sustrato, ó también se puede deber a que esta bacteria Gram negativa secreta sustancias que inhiben el crecimiento de las cepas 3 P, 5AP, 8 AP y 14P es por esto necesario que en futuros estudios se realice una identificación bioquímica de dicho microorganismo para descartar una cepa patógena, ya que sería perjudicial si se tuviera en cuenta al momento de ser adicionado en el inóculo debido a que este compost como ya se ha mencionado anteriormente es utilizado en cultivos propios de la región. Figura 5. Enfrentamiento de cepas lipolíticas con cepas de inóculo Fuente: Autores, 2007 6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO Cabe resaltar que se hizo un estudio preliminar realizando una curva de 12 horas, y al observar que el microorganismo, correspondiente a la cepa L3 no llegó a su fase de muerte, se decidió realizar una curva de 18 horas. Así mismo, en la curva de 12 horas se tomó como medio control el medio tributirina, para realizar los respectivos recuentos (Anexo 6), arrojando resultados de ausencia de crecimiento en las primeras horas de la 0 a la 1 y ½ , demostrando que el medio óptimo para su crecimiento es el medio lecitina. Este medio contiene ácidos grasos simples los cuales son de fácil asimilación por los microorganismos. De la misma manera se debe tener en cuenta que estos microorganismos se encontraban en caldo lecitina, y es probable que al momento de realizar la siembra a medio tributirina este pudo haber presentado estrés. Para esto se determinó un recuento inicial el cual reportó un recuento inicial de 10*10 5 UFC/ml en caldo lecitina y se evaluó su crecimiento, producción de biomasa en función del tiempo (Figura 6). Es importante resaltar que el microorganismo no presenta una fase de adaptación debido a lo mencionado anteriormente, presentando la fase exponencial desde la hora 0 a la 5 aproximadamente, observando luego su fase estacionaria hasta la hora 13, descendiendo así hasta su fase de muerte en la hora 18. 12 Log UFC/mL 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 Tiempo (Horas) Figura 6. Curva Producción de biomasa en función del tiempo Cepa L3. La cepa L3 no presentó fase de adaptación, sino que el microorganismo comienza la fase exponencial aproximadamente a la hora 0 de fermentación debido al pre inóculo realizado, alcanzando su máximo punto en la hora 8, evidenciándose una pequeña fase estacionaria, para luego comenzar a descender hasta llegar a fase de muerte en la hora 18. Según microscopia se observaron bacilos Gram negativos, este tipo de morfología se evidencia en gran parte de las bacterias aisladas del suelo ya que están involucradas en el reciclaje de nutrientes, es por esto que en el presente proyecto se obtuvieron dos cepas con estas características. Posteriormente se realizó una curva de crecimiento en caldo lecitina en donde se determinó la formación de biomasa (Anexo 6) por un tiempo de 18 horas del actinomycete aislado, para este al igual que la bacteria se realizó un inóculo en 100 ml de caldo lecitina bajo las siguientes condiciones 55ºC, 12 horas a 150 rpm, para esto se determinó un recuento inicial que reportó un valor de 25*107 UFC/ml. 14 12 Log UFC/mL 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 Tiempo (Horas) Figura 7. Curva de crecimiento cepa L2. Actinomycete Fuente: Autores: 2007. Como se observa en la figura 7 de la hora 0 a la 8 se observa la fase de crecimiento denominada trofofase que es donde se producen metabolitos secundarios, en este caso lipasas. La ideofase se evidencia desde la hora 10 hasta la muerte que se da a la hora 18. Por ultimo, la producción de biomasa de los dos microorganismos evaluados presentó un comportamiento ascendente en la producción de biomasa. El descenso durante las curvas de crecimiento puede deberse al agotamiento gradual de nutrientes presentes en el medio lecitina (Ramírez et al., 2004). De la misma manera se debe tener en cuenta que en procesos de fermentación el crecimiento de los microorganismos se ve relacionado con el tipo del medio, la temperatura, el pH, la composición del medio, el volumen de inoculación, la aireación entre otros ( Snellman, 2004). 6.3 CURVA DE CALIBRACIÓN La curva de calibración (Anexo 4) reporto un factor de correlación (r2) de 0,996 indicando la estrecha relación entre los valores del eje X y los de Y, que finalmente se ve representada en la distribución lineal de la curva y por ende el comportamiento normal de los datos. Sabiendo que el valor de r2, en los casos de la curva de calibración, debe estar cercano a 1 (Otálora et al., 2003). 6.3.1 ACTIVIDAD LIPOLÍTICA La fermentación de la cepa 3 tuvo un período inicial de 12 horas, bajo las siguientes condiciones 150rpm a 55ºC, luego al observarse que el microorganismo no llegó a su fase total de muerte se realizaron pruebas de 18 horas, en total se tomaron14 muestras, las cuales fueron puestas a evaluación enzimática lipolítica por la técnica de p-nitrofenol, reportando los valores en el Anexo 5. 6.3.1.1 Estandarización del tiempo de contacto entre el sustrato y el extracto crudo La primera evaluación realizada fue la evaluación del tiempo de contacto, en el cual se cuantificaran más unidades lipolíticas, esto se hizo evaluando 30 y 60 minutos. En los datos arrojados en la figura 14 si existen diferencias significativas entre estos dos tiempos de contacto con un p<0,05 aceptando la hipótesis nula. Sugiriendo que el mejor tiempo de contacto es el de 30 minutos pues es en este donde se ve mas la cuantificación de la actividad lipolítica (Figura 8). Así mismo cabe resaltar que según estudios reportados por Gessesse et al., 2003, se tomó un tiempo de contacto de 10 minutos, porque es en este tiempo donde se presenta una mayor actividad enzimática. Aunque, Neerupma y Jagdeep, 2006 reportan un tiempo óptimo de 45 minutos. 30 25 UL 20 15 10 5 0 30 60 T. contacto Figura 8. Tiempo de contacto 6.3.1.2 Estandarización de diferentes concentraciones de sustrato La estandarización de la técnica, se realizó probando diferentes concentraciones de pnitrofenil palmitato (0,08%(p/v), 0,5%(p/v) ,1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v)). Transcurrido el tiempo de fermentación 24h/55°C/150 rpm de las cepas seleccionadas, la enzima se obtuvo por centrifugación, para la evaluación cuantitativa de la actividad enzimática de cada una de las cepas, utilizando las diferentes concentraciones de sustrato anteriormente mencionadas con el fin de determinar la concentración óptima en relación con la máxima actividad lipolítica. Para llegar a encontrar la concentración en la cual se obtienen más unidades lipolíticas, primero se hizo un ensayo con las siguientes concentraciones 0,08%(p/v),0.5%(p/v),1%(p/v) y de este primer ensayo se obtuvo que no hay diferencias significativas (Anexo 10) entre las concentraciones de sustrato utilizadas, rechazando la hipótesis nula con un p > 0,05.(Figura 9). Sin embargo la concentración del 1% se acerca más al valor de la media por lo tanto, se decidió probar concentraciones más altas para observar si así se logra encontrar la concentración de sustrato en la cual cuantifique mas la actividad enzimática. Así mismo durante estas evaluaciones se realizó la evaluación de la producción de biomasa en función del tiempo (Figura 10). 18 16 14 UL 12 10 8 6 4 2 0 0,08 0,5 1 C. sustrato Figura 9. Evaluación de las diferentes concentraciones de sustrato. 14 14 12 12 10 10 8 8 6 6 4 4 2 2 0 UL Log 10 UFC/ml Biomasa L3 vs UL al 1% Log 10 UFC/ml UL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) Figura 10. Curva de UL al 1% y producción de biomasa en función del tiempo. La producción de enzima se lleva a cabo desde la hora 0 hasta la hora 8, se observa de la misma manera un aumento en la producción de biomasa, lo cual indica que esta se encuentra asociada con la producción de enzima, como ya se ha reportado (Rúa et al., 1997). De la misma manera la alta producción de lipasa fue observada en la fase logarítmica en estudios presentados por Stránsky, 2006. Por otra parte, en estudios realizados por Moreno et al., 2001 se evidencia una alta producción enzimática asociada a la fase de crecimiento de los microorganismos. Observando que este crecimiento es directamente proporcional a la producción enzimatica, según los estudios realizados por Janny en el 2001. En el segundo ensayo se evaluaron las concentraciones de 1%(p/v), 1,5%(p/v) y 2%(p/v), y en esta segunda evaluación tampoco se encontraron diferencias significativas entre estas concentraciones con un p>0,05 rechazando la hipótesis nula (Figura 11). De la misma manera se evaluó la producción de biomasa en función del tiempo (Figura 12). 30 25 UL 20 15 10 5 0 1 1,5 2 C.Sustrato Figura 11. Segunda evaluación de diferentes concentraciones de sustrato al 1%, 1.5% y 2%. > 14 35 12 30 10 25 8 20 6 15 4 10 2 5 0 UL Log 10 UFC/ml Biomasa L3 vs UL al 1,5% Log 10 UFC/ml UL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tiempo (horas) Figura 12. Curva de UL al 1.5% y producción de biomasa en función del tiempo Según lo observado, al igual que en la figura 14 hay un incremento en la producción enzimática conforme aumenta su biomasa, observando la óptima producción en la hora 10 aproximadamente. Es importante tener en cuenta que en estudios recientes se ha demostrado que la producción de las lipasas es afectada por el tipo del medio, la temperatura, el pH, la composición del medio, el volumen de inoculación, la aireación entre otros. La composición del medio de cultivo en particular la incorporación de diferentes sustancias lipídicas, pueden resultar de diferentes fuentes de producción de isoenzimas. Reportando en otros estudios que las lipasas y la especificidad por la estereasa pueden ser modificadas variando las condiciones operacionales durante el crecimiento (Arpigny y Jaeger, 2000). 6.3.1.3 Estandarización con diferentes volúmenes de extracto crudo 20µl, 500µl y 700µl Además de probar diferentes concentraciones de sustrato también se probaron diferentes volúmenes de extracto crudo para ver cual volumen cuantificaba más enzima. Transcurrido el tiempo de fermentación 24h/55°C/150 rpm de la cepa seleccionada, la enzima se obtuvo por centrifugación, para la cuantificación de la actividad enzimática, así mismo en otros estudios para la extracción de la enzima se manejaron parámetros similares al de este estudio; se centrifuga a 5000 g por 10 minutos a 4°C , de aquí se obtiene el sobrenadante que es la fuente de la enzima, para determinar la actividad lipolítica utilizaron al igual que p-nitrofenil palmitato como sustrato y una solución stock de p- nitrofenil a 20 mM fue preparada usando isopropanol. Trabajando con la solución de sustrato la cual fue preparada diluyendo el p-nitrofenil con la solución stock 1:20 utilizando 20 mM Tris HCL buffer (Gessese, 2003). Se utilizaron diferentes volúmenes de extracto crudo (20µl, 500µl y 700µl) con el fin de determinar el volumen óptimo en relación con la máxima actividad lipolítica, encontrando que existen evidencias significativas (Anexo 10) entre los tres volúmenes evaluados aceptando la hipótesis nula con un valor de p < 0,05 (Figura 13). Con este resultado los siguientes experimentos fueron realizados sin el volumen de 20 µl. Ésta diferencia estadísticamente significativa demuestra que la cantidad de extracto es demasiado pequeña para llevar a cabo la hidrólisis del éster p- nitrofenilo de propionato (sustrato) (Jenny, 2001). 30 25 UL 20 15 10 5 0 20 500 700 V. de extracto Figura 13. Estandarización de los diferentes volúmenes de extracto crudo. Luego de descartar el volumen de 20µl, se realizó otro análisis para ver si existían diferencias significativas entre las concentraciones de 500µl y 700µl, encontrando, que entre estos dos volúmenes no existe diferencia significativa, rechazando la hipótesis nula con un valor de p >0,05 (Figura 14). Es así que con estos resultados para trabajos futuros se aconsejaría utilizar el volumen de extracto crudo de 500µl, ya que arroja resultados confiables y se disminuiría volumen de extracto. 30 25 UL 20 15 10 5 0 500 700 V. de extracto Figura 14. Estandarización de los diferentes volúmenes de extracto crudo. Como se observa en la figura 16, no existen diferencias significativas entre los volúmenes evaluados. Confirmando los estudios de Neerupmaa Nawani y Jagdeep Kaur, 2006, que usaron un volumen de trabajo entre 500µl y 700µl para sus estudios de cuantificación de lipasas extracelulares de Bacillus sp. La adición de Triton-x100 al buffer y al nitrofenil palmitato, hace que en el momento de la cuantificación de la actividad enzimática, permita que la molécula de la enzima se disperse cuando entra en contacto con esta solución, lo que facilita la degradación de los lípidos (Shuen et al., 1996). Según un estudio de Moreno et al., 2001 la producción de unidades lipolíticas en microorganismos aislados de una industria láctea arrojan valores entre 86,91-91,35 UL, comparando con los resultados del presente estudio las unidades lipolíticas obtenidas oscilaron entre los valores de 28 y 31 UL, observando un nivel bajo de producción de enzima. Puede deberse a que el sitio de aislamiento de microorganismos lipolíticos del presente estudio no contiene niveles altos de grasa. Por otra parte en estudios realizados por Janny et al., 2001 se observan valores enzimáticos mucho mas bajos (0.26 UL y 0.21UL) que los obtenidos en el presente estudio, debido a que su fuente de aislamiento fue la caña de azúcar. Según lo anterior, se corrobora que hay una relación directa entre las características del halo de hidrólisis y la actividad enzimática, ya que los halos obtenidos por Moreno et al., 2001 fueron de 9 mm de diámetro, a diferencia de este estudio que fueron de 1.5 mm. 6.4 Toma de muestras Las materias primas utilizadas para el aislamiento fueron: poda, residuos de plaza, contenido ruminal y cascarilla de arroz (Figura 15). Así mismo, se llevo a cabo la toma de muestras, correspondiente para el análisis de patógenos humanos Escherichia coli y Salmonella sp. Sin reportes de temperatura al momento del montaje, debido a que estos se comenzaron a evaluar desde el día 3. Figura 15. Conformación de las pilas. Fuente: Autores 2007. 6.4.1 Determinación de pH y Temperatura Durante las 8 semanas que duró el proceso de compostaje, se determinó pH y temperatura a las 3 replicas (Figura 16). La temperatura se determinó diariamente y el pH semanalmente. El proceso de compostaje, se describe comúnmente como un proceso aeróbico de degradación de materia orgánica, donde el calor esta relacionado con el consumo de oxígeno debido al metabolismo microbiano, dando como resultado un incremento en la temperatura (MacGregor et al., 2001). Figura 16. Medición de Temperatura. Fuente: Autores 2007. Un sistema de compostaje es dinámico cuando hay una intensa actividad biológica, debido a los cambios en el sistema y a las condiciones del medio ambiente, en especial el incremento en la temperatura (Sundberg, 2005). De la misma manera el valor de pH varía en el compost con el tiempo durante el proceso, en este el pH inicial de la fracción orgánica de los residuos sólidos urbanos se encuentran en valores de 5 y 7. Se debe tener en cuenta que durante el proceso de compostaje se presentan tres fases de acuerdo a la temperatura y a su efecto sobre los microorganismos; la primera mesofílica o fase de temperatura moderada; hace que la temperatura se eleve rápidamente hasta los 40ºC; segunda, la termofílica, donde se alcanzan temperaturas de 65ºC, la cual puede durar pocos días o semanas y finalmente la fase de maduración y de enfriamiento que tiene una duración de semanas, obteniendo valores de temperatura de 40ºC hasta alcanzar la temperatura ambiente que indica que alcanzó la fase de maduración. Por lo anterior, fue importante llevar a cabo un monitoreo de la temperatura, cabe anotar que los resultados obtenidos son de los promedios alcanzados por las tres 70 60 50 40 30 20 10 0 10 8 6 4 pH Temperatura ºC pilas, ya que estas corresponden a un solo tratamiento (Anexo 2) (Figura 17). Temperatura (°C) pH 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Semanas Figura 17. Resultados de pH y Temperatura vs. Tiempo durante el proceso de compostaje de residuos orgánicos, Fuente: Autores, 2007 De la misma manera, la energía liberada al inicio del proceso se emplea para elevar la temperatura de la masa en el proceso secando el material por evaporación (Gómez, 1998), lo que permite el paso a la degradación de diversos compuestos ya que a medida que aumenta la temperatura se transformaron en moléculas más sencillas para que microorganismos presentes en bajas temperaturas sinteticen completamente hasta obtener compost. Teniendo en cuenta los resultados observados en la figura 4, se puede decir que las pilas comienzan a salir de la etapa mesofílica al tercer día, ya que se registra un valor de 50.21 ºC. En cuanto al pH, se observa un valor neutro lo cual indica que va en aumento para alcanzar la etapa termofílica. A partir de la segunda semana se evidencia igualmente un aumento de ambas variables, observando que el punto máximo se obtiene en la semana 6 cuando alcanza la etapa termofílica, encontrando una temperatura de 65.2ºC y un pH entre 8 y 9 debido a que se presenta un consumo de ácidos orgánicos por parte de los microorganismos, además en esta fase forman esporas a manera de resistencia (Trautmann et al., 1999). Por otro lado, el pH sufre cambios durante el proceso de compostaje, debido a los cambios en la composición química. En general el pH cae por debajo de la neutralidad en el comienzo, durante la formación de ácidos orgánicos y mas adelante sube alrededor de la neutralidad porque los ácidos orgánicos son consumidos y hay producción de amonio, es por esto que durante el monitoreo se observó un aumento a medida que pasaban las semanas, hasta que se alcanzó un pH cercano a la neutralidad. Sin embargo, mientras ocurre este cambio de acidez a neutralidad, se presentan alrededor de la semana 4 valores cercanos a la alcalinidad, esto debido a la adición de cal (10 Kg/T de residuos) que corrigió la acidificación (Galindo et al., 2005); esto a su vez evita presencia de vectores así como malos olores. De la misma manera se sabe que al adicionar cal o hidróxido de calcio se aumenta la velocidad de degradación de materiales orgánicos, debido a la activación de enzimas termófilas, que actúan principalmente en pHs comprendidos entre 7 y 9; este uso a su vez tiene una desventaja ya que se presentan pérdidas de nitrógeno en forma de amoniaco, debido al pH ligeramente básico que favorece su formación (Gómez, 1998). Finalmente en la semana 9 los resultados arrojados denotan una caída poco notoria tanto del pH como de la temperatura, alcanzando valores de 6,5 y 52.45ºC respectivamente. Lo anterior puede atribuirse a que probablemente hubo un largo período de termofilia (5 semanas) debido a que quizá ocurrieron desigualdades en la homogenización de los residuos en el momento del volteo (Galindo et al., 2005) ó se presentó un alto porcentaje en la fuente de carbono, en este caso Residuos de Plaza (55%) (Sylvia et al., 1999). De la misma manera cabe resaltar que el pH en el proceso de compostaje es influenciado por el CO2, el cual se forma durante el proceso de descomposición, el cual puede evaporarse como gas o disolverse en forma líquida como ácido carbónico (H2CO3), bicarbonato (HCO3) y carbonato (CO3 -2). Este sistema tiene dos constantes de disociación (pKa) 6.35 y 10.33 a 25°C, las cuales tienden a neutralizar el pH en el compost, aumentando un pH bajo y reduciendo un pH alto (Sundberg, 2005). El amonio es formado cuando hay una descomposición de las proteínas durante la fase inicial del compostaje gran parte del nitrógeno es metabolizado y retenido por microorganismos que se encuentran en etapa de crecimiento (Sundberg, 2003). El amoniaco tiene un pKa de 9.24 a 25°C, lo que hace que haya un incremento en los valores de pH. Así mismo, como ya se mencionó anteriormente, otro de los factores que afectan dichos valores son los ácidos orgánicos, donde predominan el acido acético y el láctico, estos se han demostrado en estudios recientes que pueden disminuir el pH hasta valores de 4.14 (Sundberg, 2005). 6.5 ANÁLISIS DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS Escherichia.coli y Salmonella sp. El control sanitario del compost es de vital importancia, éste debe ser tratado de manera adecuada debido a que será utilizado como biofertilizante o nutriente del suelo, ya sea en agricultura orgánica o inorgánica, dando lugar a la contaminación de los productos y/o de las fuentes de aguas, por lo que su aplicación descontrolada constituye un peligro para la salud pública y una amenaza para el medio ambiente por la exposición a microorganismos patógenos que esto representa (Fundases, 2006). 6.5.1 NMP de Salmonella con medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado A lo largo del proceso se espera una reducción de los agentes patógenos por acción de diferentes condiciones como pH, temperatura, humedad, sustancias antibióticas, entre otras (Turner, 2001). En cuanto a la técnica después del tiempo de incubación de cada juego se tomaron los tubos con medio TSB que presentaron turbidez para llevar a cabo una siembra en microgota (30ul), en medio Rappaport Vassiliadis semisólido modificado (Figura 18), el cual busca aislar cepas móviles de Salmonella sp.,detectando alrededor de la zona de inoculación un halo de crecimiento. Después del tiempo de incubación, únicamente para las muestras iniciales, se repicaron en medios selectivos XLT4 y Sulfito Bismuto (Figuras 19 y 20) (EPA, 1682). Figura 18. Medio semisólido Rappaport modificado con halo Fuente: Autores, 2007 Figura 19. Medio XLT4 con colonias presuntivas Fuente: Autores, 2007 Figura 20. Medio BS. Con colonias presuntivas Fuente: Autores, 2007 Teniendo en cuenta el fundamento del medio, para XLT4 se seleccionaron aquellas cajas que presentaron colonias rosadas o rojas con centro negro y para Sulfito Bismuto, colonias del color del medio con centro negro (Tabla 7), para posteriormente llevar a cabo la realización de las respectivas bioquímicas TSI, LIA y Úrea (Anexo 8) (EPA Método 1682, 1996). Tabla 7 a, b,c Medios XLT4 y Sulfito Bismuto (Muestras Iniciales) Pila No 1 Promedio del No de Colonias Características Medio XLT4 Medio B.S 2 2 1 1 1 1 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos Fuente: Autores, 2007 Pila No 2 Promedio del No de Colonias Características Medio XLT4 Medio B.S 2 2 2 1 1 1 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos Fuente: Autores, 2007 Pila 3 Promedio del No de Colonias Características Medio XLT4 Medio B.S 1 2 1 1 1 1 1. Juego serie de cinco tubos 2. Juego serie de cinco tubos 3. Juego serie de cinco tubos Fuente: Autores, 2007 Luego de realizar las bioquímicas (Figura 21) estas tres arrojaron para algunos resultados negativos y para otros positivos para Salmonella sp, es por esto que se debe tener en cuenta que estas tres bioquímicas deben ser positivas (Anexo 9), informando tanto para muestras iniciales como finales: < 0,006473 NMP/4g, resultado óptimo y adecuado al comparar con el reportado por la NTC 5167 (< 1 NMP/4g). Figura 21. Resultados de Bioquímicas para identificación de Salmonella sp. (TSI, LIA y Úrea positiva) Fuente: Autores, 2007 Considerando los resultados anteriores, es importante tener en cuenta la relación de los microorganismos patógenos con la temperatura de exposición a la cual se presentará su respectiva destrucción. Debido a esto importante enlazar los resultados de temperatura obtenidos en las pilas para poder analizar la eliminación de éste patógeno. Para llevar a cabo la destrucción de Salmonella sp. es necesario exponerla a temperaturas entre 55ºC y 60ºC temperaturas que se evidenciaron entre las semanas 2 y 4 del proceso de compostaje. Así mismo, en algunos estudios se ha demostrado que organismos fecales son destruidos en el propio proceso, si las temperaturas en el rango termofílico se mantienen por un tiempo suficiente y todo el material es sujeto a dichas temperaturas. Las bacterias patógenas se destruyen rápidamente cuando todas las partes de la pila de compost están sujetas a temperaturas de 60°C durante 30 a 60 minutos (Islam et al., 2004). Cabe resaltar que este microoranismo a diferencia de Escherichia coli es termosensible, es por esto que probablemente se obtuvo una total eliminación del patógeno (Turner, 2001). La norma ICONTEC 5167, 2004, especifica la ausencia de Salmonella sp., y de acuerdo a los resultados se indica que los materiales con los que se elaboraron las pilas en ningún momento presentaron este indicador, por lo que el producto cumple con la norma colombiana en materia de patógenos humanos (Anexo 9). 6.5.2 NMP Escherichia coli Posterior a la incubación a 37°C por 24 horas, se tomaron como positivos (Tabla 8 y 9) aquellos tubos que presentaron turbidez, fluorescencia con Luz UV a 365 nm y prueba de indol positiva al adicionar reactivo de Kovac’s (Figuras 22 y 23). Figura 22. Turbidez e indol positivo Figura 23. Fluorescencia Positivo Tabla 8. Promedios Resultados Materias Primas MATERIA PRIMA Rumen Poda RESULTADO NMP/ 4 g >2400 1100 Cascarilla 1100 Residuos de plaza 4 Fuente: Autores, 2007. Tabla 9. Promedios Muestras Finales RESULTADO Réplica NMP/ 4 g Pila 1 4 Pila 2 180 Pila 3 8 Fuente: Autores, 2007. Los resultados finales evidencian en la pila 2 que hubo una diferencia en el muestreo, ya que se observa un valor alto a diferencia de las otras dos pilas. De la misma manera los resultados arrojados muestran una disminución al relacionar las muestras iniciales con respecto a las finales, aunque es importante resaltar que en estudios se ha demostrado que el tratamiento térmico provoca la reducción de los indicadores fecales a niveles comparables a muchos patógenos, particularmente bacterias patógenas, pero la concentración inicial de los indicadores es normalmente mayor en factores de 10 que la de los patógenos, por lo que aunque su número disminuya siempre sobrevivirá una cantidad apreciable de estos microorganismos (EPA, 1992). Esto se debe a diferentes factores como el origen de los materiales de elaboración de las pilas, el comportamiento, el tiempo de duración de las fases, el pH, la humedad, la temperatura y la frecuencia de los volteos, entre otros. De igual forma, se puede considerar que la adición inicial de cal en grandes proporciones durante la conformación de las pilas, generó alcalinidad en el medio facilitando el crecimiento microbiano y estimulando su actividad enzimática (Turner, 2001). Así pues, se ha demostrado que en algunos casos se puede inducir la proliferación de agentes patógenos, los cuales pueden emerger y causar infecciones por el manejo del material orgánico de uso agrícola. De igual forma, se ha encontrado resistencia y supervivencia de Escherichia coli a temperaturas termofílicas de 60ºC de 2 a 21 meses, debido a que este microorganismo se mantiene en fase de latencia y al final se expresa nuevamente ( Lemunier et al., 2005). En la degradación llevada a cabo en termofilia 60-70ºC se estimula el crecimiento de hongos y bacterias, los cuales sintetizan compuestos complejos, en este transcurso de degradación se generan mezclas de antibióticos y sustancias tóxicas (Ciemat, 2000). De esta manera, la acidificación del pH durante el proceso de compostaje depende de la producción de sustancias antibióticas, ácidos o fitotoxinas, que pueden llegar a destruir una gran parte de la población patógena. 6.6 ANALISIS FISICOQUÍMICOS A partir de estos resultados se determinó la calidad del bioabono obtenido. Los resultados fueron determinados por el laboratorio de referencia AGRILAB expresados en base seca (Tabla 10). ANÁLISIS DE MATERIALES ORGÁNICOS -Composición nutricional IDENTIFICACIÓN ANÁLISIS Humedad DE MATERIALES ORGÁNICOS – CARACTERIZACIÓN Nitrógeno (Norg) IDENTIFICACIÓN Fósroro total Humedad (%) Potasio total Cenizas (%) Calcio total Perdidas por volatilización (%) Magnesio total Carbono Orgánico Oxidable (%) Azufre total Ph Hierro total Densidad (g/c.c) Manganeso total Conductividad Eléctrica (Ds/m) Cobre total Capacidad Retención Humedad (%) Zinc total Capacidad Intercambio Catiónico Boro total (Norg) (%) Nitrógeno Sodio C/N total Residuo insoluble en ácido (Promedio de tres replicas de pilas de compostaje) (Promedio de tres de pilas de RESULTADOS ENreplicas BASE SECA compostaje) RESULTADOS EN BASE SECA Fuente: AGRILAB, 2007 INICIAL 66,9 1,86 INICIAL 1,126 66,9 2,1 38,9 3,37 61,1 1,01 25,36 0,3 8,13 0,77 0,45 43,13 7,16 30 231 127 55,9 30,33 1,86 4350 13,6 29,26 FINAL 42,03 1,62 FINAL 1,03 42,06 2,01 56,86 3,31 43,13 1,04 13,2 0,28 7,57 0,84 0,67 431 11,9 28,6 103 118,3 49,1 31 1,62 4516,6 8 48,76 La humedad es uno de los factores más importantes en el proceso de compostaje. Si su contenido es muy bajo, se detiene la actividad microbiológica del proceso; y si es muy alto se dan condiciones anóxicas porque el agua desplaza al aire de los espacios libres existentes (Soto, 2003). Para que un proceso de compostaje sea exitoso es necesario que la humedad de la materia orgánica inicial se encuentre entre el 40 y 60%(Sylvia et al.,1999) , sin embargo este parámetro comparado con la humedad inicial de las replicas de pilas de compostaje se acerca poco a la norma, observándose que durante el transcurso del proceso este disminuyó considerablemente. El porcentaje de humedad al finalizar el proceso fué alto (42,3%) de acuerdo al límite establecido en la NTC 5167, 2004 reportando que el límite máximo de humedad es 35% este hecho evidencia la necesidad de alargar el tiempo de la etapa de maduración. Según otros reportes para que un compost sea comercialmente aceptable debe tener una humedad < 40%. (Paúl et al., 1996). Esto hace pensar que la humedad se pudo ver influenciada por las materias primas empleadas, sabiendo que los residuos de plaza y el contenido ruminal son los que presentan cantidades altas de humedad. Por otra parte la densidad (g/c.c) se encuentra asociado a la porosidad, el cual se define como el espacio del material orgánico que no es ocupado por la matriz sólida, que permitirá el flujo de aire y de agua. Según los resultados obtenidos (0.67%), este valor se acerca considerablemente a la norma ICONTEC (0.6%). Las altas porosidades (mas del 50 %) se consideran favorables para el adecuado desarrollo de las especies vegetales (Gómez, 1998). El carbono orgánico oxidable determina el contenido de materia orgánica, y la materia orgánica da ciertas propiedades al suelo, este valor debe aumentar mínimo al 15% para cumplir con lo establecido en la norma ICONTEC 5167 del 2004. El valor obtenido en este estudio cumple con lo que se establece en la norma puesto que se obtuvo un valor final de 13,2%. La capacidad de intercambio catiónico (C.I.C) es la capacidad que tiene la materia orgánica de extraer cationes del suelo como K+, Ca++, Mg++ aportándole nutrientes a la planta. Para abonos orgánicos esta debe ser mínimo de 30% .Se encontró un valor final de 49,1% obteniendo un resultado óptimo para lo que establece la norma ICONTEC 5167 del 2004. Este valor obtenido indica una alta capacidad de atraer cationes de la solución de suelo, evitando su lixiviación o pérdida y manteniéndolos para que la planta pueda tomarlos (Galindo et al., 2005) Por otra parte están los parámetros que están directamente influenciados por elementos como el carbono y el nitrógeno. La relación C/N, obtuvo un resultado final de 8 .Este resultado, comparado con otros estudios realizados en un compost producido a partir de residuos urbanos sólidos en la cuidad de Sogamoso de 4,26 es bajo , determinando que el origen de las materias primas usadas está directamente relacionado con la fuente de nitrógeno que es este caso es elevada, permitiendole a las bacterias que lo agoten rapidamente dejando el nitrógeno no utilizado en forma de amonio. De igual forma, se expresó el porcentaje de nitrógeno total, dentro del cual se encuentra el nitrógeno mineral y orgánico. El orgánico es el elemento que forma parte considerable del suelo ya que supera el 98%. Por esta razón un abono de buena calidad debe estar reportado entre el 2% y 3% (Gómez, 2000). Es por esto que según los resultados obtenidos (1.63%) se observa un valor relativamente bajo lo cual puede deberse como un consumo excesivo de la fuente de nitrógeno para la síntesis de compuestos de carbono. También se tuvo en cuenta el análisis inicial y final de dos metales pesados cobre y zinc, la evaluación de estos metales pesados en el compost es importante puesto que estos pueden aumentar su concentración en las cosechas y ser tóxicos para los seres humanos. Estos dos metales no están contemplados en NTC 5167, 2004. Sin embargo según Labrador, 2001 el límite permisible de estos metales son para cobre 450 ppm y zinc 1.100 ppm. Se observó que en los resultados obtenidos por el laboratorio de referencia se obtuvieron valores que están en los rangos permisibles para estos metales en el tratamiento evaluado. En cuanto al contenido de macro y micronutrientes estos deberían aumentar al finalizar el proceso. Se espera que estos lleguen a valores superiores del 1% según lo establecido en la norma ICONTEC 5167, muchos de estos nutrientes cumplieron este parámetro. El compost obtenido se clasifica según la NTC 5167, 2004 en abono orgánico que es un producto solido obtenido a partir de la estabilización de residuos animales o vegetales. 7.- CONCLUSIONES • Se aislaron 3 cepas L1, L2 y L3, de las cuales L1 presentó antagonismo. • A partir de la cepa L3 con actividad enzimática lipolítica se logró estandarizar una técnica cuantitativa para detectar lipasas utilizando como sustrato principal el pnitrofenil palmitato utilizando concentraciones de sustrato desde 0.08% y un volumen de extracto crudo desde 500ul. • La cepa lipolítica L3 presentó una actividad máxima entre 29 y 30 UL definiendo una UL como la cantidad necesaria para liberar una una umol/min/L. • El compost obtenido resultó con N orgánico1.59%, P 1.32%, K 2.53% y respecto a Escherichia coli y Salmonella sp presentaron una disminución en la cantidad probablemente porque las replicas alcanzaron una temperatura máxima de 65.2 en la semana 6. de 8.- RECOMENDACIONES • Producir un inoculante biológico con las 14 cepas que se han manejado en la empresa Bioagrícola del Llano adicionando las dos cepas lipolíticas aisladas, con el fin de evaluar su actividad llevando a cabo un nuevo montaje de pilas. • Realizar curvas de actividad enzimática manejando volúmenes de extracto crudo entre 20 ul y 500 ul y tiempo de contacto entre 10 y 30 minutos. • Caracterizar bioquímicamente las cepas aisladas y evaluar otras características como promoción de crecimiento vegetal y actividad enzimática. • Realizar estudios alternos para el aislamiento de microorganismos pectinolíticos para potencializar la efectividad del inóculo. 9.- REFERENCIAS • Adams M, Perler F, Kelly R 1995 Extremozymes: expanding the limits of biocatalyst. 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Anexo 2 Temperatura y pH de las 3 réplicas REPLICA 1 DIAS T °C 3 47.3 1 4 48.5 2 N.R 5 50.1 3 55.6 6 51.3 4 50.3 7 51.8 5 52.8 8 52.4 6 54.5 57.3 N.R 9 53.6 7 10 N.R 8 N.R 11 N.R 9 61.7 12 54.6 10 64.2 13 55.4 11 63.1 14 56.2 12 60.7 15 57.5 13 58.5 16 58.4 14 58.6 17 N.R 15 N.R 18 N.R 16 60.2 19 60.9 17 59.3 20 59.2 18 60.5 21 54.8 19 61.2 22 50.9 20 N.R 23 52.3 21 60.7 24 N.R 22 N.R 25 52.8 23 N.R 26 53.1 24 58.9 27 53.4 25 58.0 28 53.9 26 57.1 29 54.7 27 N.R 30 54.9 28 54.3 29 N.R 30 N.R 31 51.2 1 50.7 FUENTE: BIOAGRICOLA, 2007 REPLICA 2 DIAS 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 T°C 46.4 47.1 47.9 48.3 49.2 50.6 51.2 N.R N.R 53.8 54.5 55.9 56.7 58.7 N.R N.R 60.2 59.3 55.1 50.4 52.6 N.R 52.8 53.5 53.7 54.6 55.8 56.1 31 N.R N.R 57.9 56.6 57.3 58.1 58.5 N.R 59.5 60.2 58.7 58.4 58.2 N.R N.R 58.7 60.3 60.3 60.7 60.5 60.2 N.R N.R 60.1 58.2 56.1 N.R N.R N.R N.R 52.1 1 50.3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 FUENTE:BIOAGRICOLA, 2007 REPLICA 3 DIAS T°C 3 49.2 49.7 50.3 50.8 51.7 52.4 N.R N.R 54.8 55.9 60.8 61.9 63.2 N.R N.R 67.8 67.3 64.1 62.4 67.2 N.R 65.2 65.8 64.2 63.4 63.0 62.3 N.R 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 N.R 59.7 48.0 51.4 54.7 56.3 N.R 58.1 58.1 58.4 58.6 58.8 N.R N.R 60.3 61.5 62.4 62.0 60.1 60.1 N.R N.R 59.3 57.8 57.1 56.0 55.6 N.R 50.9 50.8 50.6 1 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 FUENTE: BIOAGRICOLA, 2007 Semana Junio 3 Junio 27 Julio 4 Julio 11 Julio 18 Julio 25 Agosto 9 Pila 1 7.3 8.06 8.17 8.16 8.4 8.32 6.8 Valores de pH Pila 2 7.2 8.07 8.35 8.41 8.4 8.1 7.04 Pila 3 7.5 8.0 8.0 8.25 8.17 7.75 6.96 Anexo 3 Preparación de Buffer Fosfato Concentración 1 M 1. Preparar 57.7 ml de Na2HPO4 concentración 1M 2. Preparar 42.3 ml de NaH2PO4 concentración 1M 3. Mezclar lentamente las dos soluciones 4. Ajustar pH a +- 7 Anexo 4 Curva Patrón p-nitrofenol Fueron elaboradas dos réplicas de la misma solución stock de p-nitrofenil, con el fin de obtener datos significativos Concentración (u mol/ ml) 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Promedio de Absorbancias 0.175 0.267 0.346 0.486 0.577 0.717 0.829 0.918 Ecuación: Y: mx+b X: y-b/m m: 1.09 b:-0.06 r:0.99 Curva de calibración p-nitrofenol. Fuente: Autores, 2007 Anexo 5 TABLAS DE DATOS DE LAS PRUEBAS REALIZADAS Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 12 horas de la cepa 3 con P-nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio lecitina .Con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos y Unidades Lipoliticas (umol/min/l) Hora Absorbancia 0.08% UL (umol/m in/l) Absorbancia 0.5% UL (umol/mi n/l) Absorbancia 1% UL (umol/mi n/l) 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 0.037 0.138 0.180 0.196 0.251 0.272 0.342 0.305 0.292 0.281 2.9 6 7.3 7.8 9.53 10.16 12.3 11.16 10.66 10.43 0.044 0.128 0.222 0.313 0.354 0.364 0.388 0.378 0.364 0.351 3.2 5.8 8.6 11.33 12.66 12.96 13.7 13.4 12.96 12.56 0.052 0.082 0.122 0.151 0.261 0.276 0.373 0.473 0.452 0.425 3.4 4.4 5.6 6.5 9.83 10.2 13.23 16.26 15.58 14.8 Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 12 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 0.08%, 0.5% y 1%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos Hora Absorbancia 0.08% 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 0.112 0.167 0.246 0.255 0.275 0.304 0.320 0.313 0.282 0.271 UL (umol/ min/l) 5.3 5.3 9.6 9.6 10.26 11.2 11.63 11.4 10.46 10.13 Absorbancia 0.5% 0.261 0.304 0.305 0.321 0.352 0.364 0.355 0.343 0.343 0.333 UL (umol/m in/l) 9.8 10 11.16 11.93 12.6 12.96 12.7 12.33 12.33 12 Absorbancia 1% 0.124 0.138 0.146 0.159 0.191 0.275 0.375 0.361 0.324 0.305 UL (umol/mi n/l) 5.6 6 6.2 6.73 7.7 10.26 13.3 12.86 11.73 11.16 Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos Hora Absorbancia 1% 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.213 0.409 0.490 0.498 0.515 0.558 0.701 0.725 0.700 0.658 0.639 0.498 0.215 UL (umol/m in/l) 8,3 14.33 16.83 17.06 17.6 18.9 23.26 24 23.23 21.96 21.36 17.06 8.4 Absorbancia 1.5% 0.493 0.539 0.685 0.702 0.724 0.757 1.151 0.945 0.902 0.896 0.723 0.501 0.325 UL (umol/m in/l) 16.9 18.33 22.76 23.3 23.96 26.83 30.5 30.73 29.43 25.26 22 17.16 11.76 Absorbancia 2% 0.524 0.560 0.639 0.679 0.698 0.712 0.951 0.930 0.885 0.802 0.793 0.413 0.301 UL (umol/mi n/l) 17.86 18.96 21.36 22.6 23.16 23.6 30.93 29.43 28.9 26.36 26.1 14.46 11.3 Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 30 minutos Hora Absorbancia 1% 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.513 0.654 0.702 0.785 0.801 0.823 0.898 0.900 0.855 0.705 0.527 0.462 0.102 UL (umol/ min/l) 17.53 21.83 23.3 25.83 26.33 27 29.3 29.36 27.96 23.4 17.96 14.13 14.4 Absorbanci a 1.5% 0.637 0.750 0.778 0.785 0.793 0.824 1.155 0.906 0.899 0.878 0.756 0.585 0.398 UL (umol/min/ l) 21.3 23.16 25.63 26.13 26.93 28.26 29.33 29.53 29.33 28.7 23.13 19.73 11.76 Absorbancia 2% 0.542 0.650 0.679 0.702 0.750 0.785 0.998 0.899 0.795 0.755 0.746 0.520 0.415 UL (umol/mi n/l) 18.4 21.7 22.6 23.3 24.76 25.83 32.36 29.33 27.43 2.93 24.63 17.73 14.53 Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 500 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos Hora Absorban cia 1% 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.541 0.560 0.585 0.602 0.689 0.791 0.802 0.850 0.799 0.658 0.499 0.205 0.125 UL (umol/min/ l) 9.18 9.48 9.86 10.11 11.45 13.01 13.18 13.91 13.13 10.98 8.55 4.05 2.83 Absorbancia 1.5% 0.610 0.650 0.692 0.701 0.710 0.761 0.787 0.859 0.865 0.899 0.823 0.639 0.539 UL (umol/mi n/l) 10.23 10.35 11.51 12.5 12.93 14.63 16.16 17.18 17.31 16.1 11.93 10.68 8.86 Absorbancia 2% UL (umol/mi n/l) 10.78 11.2 10.11 11.61 11.75 12.38 16.23 16.2 14.11 13.06 11.96 10.28 7.61 0.646 0.673 0.676 0.700 0.708 0.750 1.002 0.999 0.863 0.795 0.723 0.612 0.438 Promedio de absorbancias de actividad enzimática en curva de 18 horas de la cepa 3 con P- nitrofenil a concentraciones de sustrato 1%, 1.5% y 2%, en medio lecitina con 700 ul de extracto crudo con tiempo de contacto 60 minutos Hora 0 ½ 1 1½ 2 4 6 8 10 12 14 16 18 UL (umol/mi n/l) 10.08 10.85 11.45 11.6 12.43 13.18 14.05 14.66 13.15 11.65 7.26 5.51 3.98 Absorbancia 1% 0.600 0.650 0.689 0.699 0.753 0.802 0.859 0.899 0.900 0.702 0.415 0.301 0.201 UL (umol/mi n/l) 11.15 12.68 12.95 13.21 13.4 15.7 18.33 17.83 16.33 14.33 11.55 9.85 5.88 Absorbancia 1.5% 0.670 0.770 0.787 0.805 0.817 0.867 0.878 0.889 0.893 0.895 0.855 0.620 0.598 UL (umol/ min/l) 10.78 12.01 10.93 11.85 13.18 13.58 17.78 16.38 14.7 14.63 13.38 10.38 8.41 Absorbancia 2% 0.605 0.726 0.655 0.782 0.802 0.827 1.103 1.012 0.901 0.897 0.815 0.619 0.490 Anexo 6 Recuentos de las cepas aisladas CEPA L3 B HORA 0 30 1 1 y 30 2 4 6 8 10 12 14 16 18 RECUENTO UFC/ml 8,0E+05 3,00E+06 1,50E+07 2,00E+07 9,00E+08 1,20E+10 4,00E+10 1,80E+10 3,00E+10 2,10E+09 2,30E+08 8,00E+07 5,00E+05 CEPA L2 HORA 0 30 1 1 y 30 2 4 6 8 10 12 14 16 18 RECUENTO UFC/ml 3,0E+07 8,00E+07 5,00E+08 1,30E+09 2,80E+09 1,50E+10 2,30E+10 1,80E+12 1,50E+10 3,00E+09 1,00E+08 5,00E+06 2,00E+06 Anexo 7 Resultados pruebas de antagonismo en mm Fuente: Autores, 2007 Cepa No L1(R1) L1 (R2) L1(R3) L2(R1) L2(R2) L2(R3) L3(R1) L3(R2) L3(R3) 2P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3P 1,0 0 1,6 0 0 0 0 0 0 4A 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 5AP 1,3 1,5 1,0 0 0 0 0 0 0 6P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7ª 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8AP 1,5 1,3 1,0 0 0 0 0 0 0 9AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 11P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12AP 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Anexo 8 Pruebas Bioquímicas de las Colonias Positivas Pila 1 Colonias presutivas Sulfito Bismuto y XLT4 Bioquímica 1 Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Replica Negativo Positivo Positivo 13P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14P 1,4 1,2 1,5 0 0 0 0 0 0 2 3 4 5 Pila 2 1 2 3 4 Pila 3 1 2 3 4 5 6 Fuente: Autores, 2007 Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea: Negativo TSI: Negativo LIA: Negativo Urea: Negativo TSI: Negativo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI:Positivo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA:Positivo Urea: Negativo TSI:Negativo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI:Negativo LIA:Negativo Urea:Negativo TSI:Negativo LIA:Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA: Positivo Urea:Negativo TSI: Posititivo LIA:Negativo Urea: Negativo TSI: Posititivo LIA:Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo
