GENÉTICA MOLECULAR Bajo la denominación de Genética

GENÉTICA MOLECULAR
GENÉTICA MOLECULAR
oLa genética molecular estudia todo lo
relacionado con la manipulación del ADN y
del ARN.
oUno de los objetivos de la técnica del ADN
recombinante es aislar segmentos de ADN
específicos e introducirlos en un genoma
más pequeño denominado vector.
Las herramientas más utilizadas en la
manipulación del ADN:
• Enzimas de restricción.
• ADN ligasas
• Vectores: plásmidos, virus (fagos) cósmidos,
vectores de clonación.
Enzimas de restricción
• Son endonucleasas
• Enzimas capaces de degradar el ADN extraño (1970 en
bacterias)
• Función: reconocer y cortar ADN extraño, en
secuencias específicas de nucleótidos llamadas
secuencias de reconocimiento.
• Estas secuencias de reconocimiento son palíndromes,
es decir que se leen de la misma manera en cada
cadena del ADN.
Ej: 5´ A C G T 3´
3´ T G C A 5
Enzimas de restricción
• Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual
ha sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción
identificada de Escherischia coli.
• Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se
conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia
específica a cada hebra de ADN.
• Pueden cortar: generando extremos romos o extremos cohesivos,
Enzimas de restricción
Enzima
extremo
Bacteria
Tipo de
• Eco RI
Escherichia coli
cohesivos
• Bam HI
Bacillus amyloquefaciens
cohesivos
• Hae III
Haemophilus aegyptius
romos
• Kpn I
Klebsiella pneumoniae
cohesivos
• Sma I
romos
Serratia marcenscens
La ADN ligasa es una enzima cuya función es regenerar las uniones de
las moléculas de ADN, generando el rADN
Enzimas de restricción
Vectores
• Vector: plásmidos, fagos, virus, cósmidos, capaces de mover
genes de un organismo a otro
• El uso de fragmentos de ADN como vectores cumple un rol
fundamental en la ingeniería genética, ya que sirven para
transferir material genético de un organismo a otro.
• Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble
cadena que contiene un sector con un origen de replicación del
ADN y un marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para
resistencia a un antibiótico. Los plásmidos vectores contienen
a menudo genes marcadores adicionales que identifican un
“inserto”.
Clonación del ADN
• El término clon proviene de la jardinería; desde hace
siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir
de gajos. Estas plantas son genéticamente idénticas
y constituyen un clon. Por lo que se define a un clon
como un grupo de células u organismos
genéticamente idénticas.
• La clonación molecular se hace utilizando células
hospedadoras, bacterias normalmente. Para realizar
la clonación se utilizan vectores.
Manipulación del ADN
• El ADN motivo de estudio, puede ser cualquier ADN
animal o vegetal o un genoma bacteriano completo, se
digiere con enzimas de restricción para obtener
pequeños fragmentos de ADN con extremos cohesivos.
• El plásmido vector se corta con enzimas de restricción
en un lugar de clonado específico y único.
• Se ponen en contacto el ADN extraño y el vector y se
agrega ADN ligasa que une los extremos pegajosos de
ambos. Esta nueva molécula es el rDNA.
Manipulación del ADN
• Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria
huésped y se multiplican independientemente del
cromosoma bacteriano.
• Esta técnica se denomina clonación.
• Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la
molécula de rDNA.
• Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a
antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo
las que hayan incorporado el plásmido (y con él la
resistencia) sobrevivirán.
• La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un
vegetal o a un callo.
• Por último, se debe detectar si se produjo o no la
recombinación.
CLONACIÓN
CLONACIÓN
Oveja Dolly
• Se tomó una célula de glándula mamaria de
una oveja Doeset (raza finlandesa) de seis
años y se colocó el material genético de esa
célula en un huevo vaciado (sin núcleo) de
una oveja escocesa Blackface. Aplicaron
una suave corriente eléctrica
• La nueva célula dio origen a un embrión que
fue implantado en el útero de la oveja.
Varios meses después, dio a luz a un animal
idéntico a sí misma.
• La clonación de esa oveja abrió un debate
sobre la ética de este tipo de experimentos,
sobre todo por el temor a que se pueda
utilizar en humanos.
• Lo realmente novedoso fue que se había
logrado clonar a un animal desde una célula
adulta ya diferenciada. Esta noticia sugería
que el núcleo de una célula ya diferenciada
era aún totipotente.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
• Método fue desarrollado por K. Mullis
en 1985, se extendió rápidamente tanto
en investigación básica como en diagnóstico clínico.
• Esta técnica permite multiplicar in vitro fragmentros de
ADN sin necesidad de recurrir a vectores y su
replicación en bacterias.
• Se puede amplificar pequeñas cantidades de ADN
miles de veces. El fragmento a multiplicar puede tener
desde 50 hasta más de 2000 nucleótidos de longitud.
Se basa, en su forma más simple, en reacciones
sucesivas a distinta temperatura, y estas reacciones
se repiten entre 20 y 40 veces.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
oSe calienta la muestra hasta lograr la
separación de las dos cadenas de ADN “desnaturalización” - 95°C.
oSe incorporan los primers, o iniciadores.
oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 °C
- apareamiento de la cadena de
oligenucleótidos con la hebra delADN
molde.
oLa ADN polimerasa extiende los primers, a
70°, sintetizan las secuencias
complementarias de hebra molde.
oSe agrega a la solución los nucléotidos –
dexosiribonucleósidos trifosfatos.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
o La temperatura está dada por la
temperatura en la cual trabaja la ADN
polimerasa. La más utilizada es la
bacteria Thermus aquaticus - Taq
polimerasa, actúa eficientemente
entre los 75 y 80°.
o El resultado de la amplificación de
numerosos ciclos da lugar a la
amplificación geométrica del
segmento del ADN.
o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil se
necesita 20 ciclos. Hoy día se hace de manera automática.
o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para
obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella
genética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs de
especies extinguidas o a punto de extinguirse.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
• Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser analizados
de diferente forma:
• Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa,
por electroforesis, proceso mediante el cual se produce la
separación por difusión bajo la acción de un campo eléctrico.
• Hibridación con una sonda marcada radioactivamente, cuya
secuencia de bases complementarias está contenida en el
fragmento de interés.
• Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas
manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la
sonda. La localización de la sonda radioactiva se logra
mediante autoradiografías.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Utilidad en general y en medicina veterinaria:
• Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de
parentesco o en pruebas de paternidad.
• También sirve en el diagnóstico de enfermedades
• En el desarrollo de vacunas
• En el estudio de especies extinguidas
• En la determinación del sexo en embriones, identificación
de embriones potencialmente transgénicos,
• Investigación de mutaciones en embriones
• Clonación de genes de secuencia desconocida,
• Variaciones génicas en poblaciones.
transgénicos
Organismos transgénicos.
• Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia de
genes, es decir que posee genes extraños integrados en su
patrimonio genético.
• Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la
técnica del rADN en la obtención de mejores variedades.
Animales transgénicos
• El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en
EEUU obtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo
normal. Habían transferido por microinyección el gen de la
hormona de crecimiento a células huevo de ratón y luego
implantaron estas células en oviductos de hembras capaces de
llevar a cabo la gestación.
• Para la obtención de los animales transgénicos, los principales
procedimientos son: la microinyección y la utilización de virus como
vectores.
Microinyección
• Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleos
procedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así,
se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embriones
manipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valor
disminuye en mamíferos.
• Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda
transgénica que produce una proteína humana de interés
terapeútico.
• La leche de “Genie” produce la proteína C que controla la
coagulación de la sangre.
• Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobó
que la cerda producía la proteína humana en su leche.
oSe construyó un fragmento de ADN con
una copia del gen humano de interés y
una secuencia promotora.
oEl promotor procedía del gen que
codifica la proteína de la leche del ratón.
oSe recogieron los embriones de una
cerda donante y se seleccionaron los
huevos fecundados, estos se inyectaron
con el ADN extraño usando una
micropipeta de cristal. El ADN se inyectó
en la región del pro núcleo macho y el
ADN extraño se incorporó en uno de los
cromosomas del cerdo.
oLas células fecundadas se implantaron
en una cerda madre “de alquiler” y se
obtuvo la lechona portadora del ADN
extraño en todas sus células.
MICROINYECCIÓN
Genie
Utilidad de los anímales transgénicos
 Sirven para suministrar información sobre la función del gen y
la regulación de su expresión, es decir su traducción en
proteína.
 El gen insertado puede determinar la síntesis de una sustancia
útil que se puede extraer, en especial de la leche (proteínas),
cuando se trata de un mamífero.
 Mejora en la producción animal.
 Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se intenta
conseguir que los órganos de este animal se pueden utilizar
para ser transplantados al hombre.
 Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes que sería
interesante transferir para alcanzar estos objetivos.
Utilidad de los animales transgénicos
Científicos de INTA Balcarce y de la univ. de
San Martín produjeron la primera vaca
transgénica capaz de producir leche
maternizada.
Es decir, su leche puede expresar dos proteínas
importantes para los humanos, la lisozima y la
lactoferrina.
La lisozima: propiedades antibacterianas que
los bebés necesitan y normalmente absorben al
mamar de pecho de su mamá
Lactoferrina: involucrada en la incorporación del
hierro a los glóbulos rojos.
La leche de vaca la lleva pero no es igual a la
humana y por ende no funciona de la misma
forma. Rosita en cambio en su leche expresa
lactoferrina humana y por ende se podrá
alimentar a bebés con este tipo de leche.
Otro ej.: Pampita
Rosita
Otras aplicaciones
• Gato modificado genéticamente con la inserción de un gen que codifica una proteína:
PROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP: Green fluorescent proteín – origen medusas).
• Esta GFP fue el descubrimiento por el otorgara a 3 científicos el premio nobel de
química en 2008. Se usa para evaluar si un gen insertado se está expresando o para
evaluar la extensión de tejidos tumorales, entre otras aplicaciones.
• Los gatos son susceptibles al virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), un pariente
cercano del VIH, la causa del SIDA.
• Se sabe que los gatos son una de las pocas especies animales que normalmente son
susceptibles a estos virus, y de hecho están sujetas a una pandemia, con
síntomas tan devastadores en los gatos como los que
ya que son para los humanos.
• Se aclara que esto no produce nada en la salud del gatito!
Fuente: http://www.guardian.co.uk/science/2011/sep/11
Bibliografía
 Genética. Conceptos esenciales. César Benito. Fco. Javier Espino. Ed. Méd. Panamericana. 2012,
 Introducción a la Genética Veterinaria. Nicholas, F. W. Ed. Acribia. Zaragoza. 1998.
 Johanson y Rendel. 1972.Genética y mejora animal.
 PIERCE, B. A. Genética Un enfoque conceptual. 2da. Edición. Ed. Panamericana. 2005.
 SRB, A. M.; R. Q. Owen y R. S. EdgarR. Genética General. Omega. 1968.
2016, Algunas fotografías fueron extraídas de textos de genética y de
internet