Detección y validación de marcadores de diagnóstico

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Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología
Área de Bioquímica y Biología Molecular
DETECCIÓN Y VALIDACIÓN DE MARCADORES DE
DIAGNÓSTICO DEL DERRAME PLEURAL MALIGNO
Memoria presentada por
Nuria Sánchez Otero
Para optar al grado de Doctora por la Universidad de Vigo
Vigo, Junio de 2012
Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología
Área de Bioquímica y Biología Molecular
Los DRES. MARÍA PÁEZ DE LA CADENA TORTOSA y FRANCISCO
JAVIER RODRÍGUEZ BERROCAL, Catedráticos del Área de Bioquímica y
Biología Molecular de la Universidad de Vigo,
HACEN CONSTAR que la presente Tesis Doctoral titulada “Detección y
validación de marcadores de diagnóstico del derrame pleural maligno”, ha sido
realizada bajo su dirección por la Licenciada en Biología Dña. Nuria Sánchez
Otero. Dicho trabajo se considera concluido, por lo que autorizan su presentación
al Tribunal calificador.
Y para que así conste a los efectos oportunos, firman en Vigo, a 18 de Junio de
2012.
Dra. María Páez de la Cadena Tortosa
Dr. Francisco Javier Rodríguez Berrocal
VBº. Francisco Javier Rodríguez Berrocal.
Director del Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología.
A mi familia y esposo
Porque lo han dado todo por mí, sin esperar nada a cambio

Este trabajo de investigación ha sido parcialmente financiado
mediante los siguientes Proyectos de investigación:
-
Título:
“Desarrollo
de
un
kit
de
detección
múltiple
de
biomarcadores séricos para el diagnóstico del cáncer de pulmón no
microcítico”, concedido por el Instituto de Salud Carlos III
(Ministerio de Sanidad) (PS09-00405, 2009-2012).
- Título: “Contribución a un mellor coñecemento das patoloxías
dende unha perspectiva multidisciplinar (Agrupación estratégica
INBIOMED)”, concedido por la Xunta de Galicia (DOGA_23jul2009.
Proyecto 2009/63).

Los resultados del trabajo han dado lugar a las siguientes
publicaciones en revistas científicas:
- Sánchez-Otero, N.; Rodríguez-Piñeiro, A.M.; Fernández-Villar, A.;
Botana-Rial, M.I. y Páez de la Cadena, M. (2009). Análisis
proteómico del derrame pleural para la obtención de nuevos
marcadores del cáncer de pulmón. Investigación, Vol.1, Nº2.
- Rodríguez-Piñeiro, A.M.; Blanco-Prieto, S.; Sánchez-Otero, N.;
Rodríguez-Berrocal, F.J. y Páez de la Cadena, M. (2010). On the
identification of biomarkers for non-small cell lung cancer in serum
and pleural effusion. Journal of Proteomics, 73: 1511-1522.
- Sánchez-Otero, N.; Blanco-Prieto, S.; Páez de la Cadena, M.;
Vázquez-Iglesias,
L.;
Fernández-Villar,
A.;
Botana-Rial,
M.I.;
Rodríguez-Berrocal, F.J. (2012). Calprotectin: A novel biomarker for
diagnosis of pleural effusion. British Journal of Cancer. En revisión.
- Sánchez-Otero, N.; Blanco-Prieto, S.; Páez de la Cadena, M.;
Vázquez-Iglesias,
L.;
Fernández-Villar,
A.;
Botana-Rial,
M.I.;
Rodríguez-Berrocal, F.J (2012). Levels of PEDF in pleural effusions
from lung adenocarcinoma and benign disease patients. En
preparación.

Parte de los resultados del trabajo han dado lugar a la
siguiente patente:
- Rodríguez-Berrocal, F.J.; Sánchez-Otero, N.; Blanco-Prieto, S;
Vázquez-Iglesias, L.; Páez de la Cadena, M.; Fernández-Villar, A;
Botana-Rial,
M.I.;
Leiro-Fernández,
V;
Represas-Represas,
C.
(2011). Procedimiento para el diagnóstico del derrame pleural
maligno
mediante
la
determinación
de
la
concentración
de
calprotectina en líquido pleural. Registrada P201101131.

Los resultados del trabajo han dado lugar a las siguientes
comunicaciones en congresos:
- Nuria Sánchez-Otero, Sonia Blanco-Prieto, María Páez de la
Cadena, Paula Álvarez-Chaver, María I. Botana-Rial, Alberto
Fernández-Villar,
Francisco
J.
Rodríguez-Berrocal.
Proteomic
approach to improve the diagnosis of malignant pleural effusions.
Comunicación escrita al 3º Congreso de la Sociedad Española de
Proteómica (SEPROT) y de la Latinoamerican Human Proteome
Organisation (LAHUPO). Pamplona (España) 10- 13 de febrero de
2009.
- Sonia Blanco-Prieto, Ana Mª Rodríguez-Piñeiro, Paula ÁlvarezChaver, Nuria Sánchez-Otero, Virginia Leiro, Vicenta S. Martínez
Zorzano, Fco. Javier Rodríguez-Berrocal, María Páez de la Cadena.
In the search of early stages biomarkers for non small cell lung
cancer. Comunicación escrita al 3º Congreso de la Sociedad
Española de Proteómica (SEPROT) y de la Latinoamerican Human
Proteome Organisation (LAHUPO). Pamplona (España) 10- 13 de
febrero de 2009.
- Nuria Sánchez-Otero, Sonia Blanco-Prieto, Ana Mª RodríguezPiñeiro, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, Vicenta S. MartínezZorzano, María I. Botana-Rial, Alberto Fernández-Villar, María Páez
de la Cadena. Identification of biomarker candidates for non smallcell lung cancer in pleural effusions. Comunicación escrita al 3º
Congreso de la European Proteomic Asociation (EuPA). Stockholm
(Suecia) 14- 17 de junio de 2009.
- Ana Mª Rodríguez-Piñeiro, Sonia Blanco-Prieto, Nuria SánchezOtero, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, Vicenta S. MartínezZorzano, Virginia Leiro, María I. Botana-Rial, Alberto FernándezVillar, María Páez de la Cadena. 2D-DIGE como estrategia para la
identificación de proteínas marcadoras en cáncer de pulmón no
microcítico.
Comunicación
oral
corta
a
las
2º
Xornada
de
Investigación Biomédica de Vigo. 10 de junio de 2009.
- Ana Mª Rodríguez-Piñeiro, Sonia Blanco-Prieto, Nuria SánchezOtero, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, Vicenta S. MartínezZorzano, María I. Botana-Rial, María Páez de la Cadena. On the
identification of biomarkers for non-small cell lung cancer: DIGE
approach. Comunicación escrita al 5º Congreso de la Portuguese
Proteomic Network (ProCura) y 1º International Congress on
Analytical Proteomics (ICAP). Costa da Caparica (Portugal) 30 de
septiembre al 03 de octubre de 2009.
- Sonia Blanco-Prieto, Nuria Sánchez-Otero, Ana Mª RodríguezPiñeiro, María I. Botana-Rial, Francisco J. Rodríguez-Berrocal,
María Páez de la Cadena. Validation of PEDF as a potential
biomarker for NSCLC. Comunicación escrita a las 2º Jornadas de
Jóvenes investigadores (SEProt). Córdoba (España) 11 y 12 de
febrero de 2010.
- Nuria Sánchez-Otero, Ana Mª Rodríguez-Piñeiro, Francisco J.
Rodríguez-Berrocal, María I. Botana-Rial, María Páez de la Cadena.
Calprotectin as a novel biomarker for the diagnosis of pleural
effusions. Comunicación escrita al 4º Congreso de la European
Proteomic Asociation (EuPA) y 6º Congreso de la Portuguese
Proteomic Network (ProCura). Estoril (Portugal) 23 y 27 de octubre
de 2010.

Durante la realización de este trabajo Nuria Sánchez Otero
ha disfrutado de la siguiente ayuda:
- Beca de Tercer Ciclo de la Universidad de Vigo (31/12/200831/12/2010).
Agradecimientos
Agradecimientos
Agradecimientos
Parece mentira que ya haya llegado este momento. Espero ser
capaz de reflejar con palabras la gratitud que siento por todo lo que he
compartido durante estos años en el laboratorio.
Empezaré agradeciendo este trabajo a todos los pacientes que han
participado en este estudio, puesto que sin ellos nunca se hubiese
podido realizar nada de lo aquí escrito. También me gustaría destacar la
gran importancia de los profesionales que han recogido día a día las
muestras y datos clínicos, gracias por haber depositado en el grupo de
investigación vuestra confianza y apoyo. En la parte del CHUVI, quisiera
agradecer al Dr. Alberto Fernández Villar, a María I. Botana Rial, y a su
equipo, el haber confiado en mí durante el tiempo que trabajamos juntos.
Y en cuanto a la parte del Meixoeiro y POVISA, gracias al Dr. Manuel
Núñez Delgado y a la Dra. Dolores Corbacho Abelairas por haberme
ofrecido su colaboración durante el verano de 2010, cediéndome
semanalmente muestras de pacientes, lo que me permitió ampliar el
estudio.
Y cómo no, seguiré con mis tutores, gracias a los Drs. María Páez
de la Cadena y Fco. Javier Rodríguez Berrocal, por haberme acogido en el
laboratorio y haber confiado en mí para haber hecho el proyecto que hoy
está recogido en estas líneas, gracias por vuestro apoyo y vuestro
consejo. María, gracias por los momentos compartidos en el despacho,
por tus consejos, y por toda la ayuda que me has dado durante todo este
tiempo, porque has sido la “madre” del laboratorio, que me ha guiado en
todo momento. Javier, gracias no solo por haber sido mi “padre” durante
mis años de investigador en formación, sino también por haberme
mostrado el mundo interno de la universidad a través de las diferentes
comisiones y órganos.
Agradecimientos
Me gustaría también de un modo especial dar las gracias a la Dra.
Vicenta S. Martínez Zorzano, gracias por las palabras de ánimo y
consuelo, y tu apoyo incondicional día a día. También deseo agradecer el
apoyo prestado por los demás profesores del Área de Bioquímica,
especialmente a las Dras. Diana Valverde y Almudena Fernández, y al
Dr. Emilio Gil, por estar dispuestos a resolver cualquier duda, siempre
con un carismático sentido del humor, y empleando el apoyo de las
“reuniones científico-gastronómicas”. Y no quería dejar de agradecerle
también al Dr. Óscar Cordero la ayuda prestada estos últimos meses,
gracias por tus consejos desde la lejanía.
Y gracias como no a Mary, nuestra eterna consejera con el
papeleo, las facturas, etc. Gracias por ser como eres.
Y no quisiera olvidarme de darle las gracias a África y a su grupo
de “inmunólogos” por la cantidad de veces que me han permitido usar el
“perkin” (o lector de placas), y porque siempre que lo he necesitado han
estado ahí para ayudarme.
Pero quizás lo más importante durante este tiempo ha sido la
convivencia mantenida en el laboratorio con los compañeros, puesto que
hemos podido compartir muchos acontecimientos, hemos visto crecer a
muchas personas a nuestro lado y hemos podido compartir muchas
experiencias personales juntos.
Con Sonia y Tere he compartido muchos momentos de mi vida en
el laboratorio en los que juntas hemos podido aclarar dudas (sobre todo
en mis inicios como novata), y siempre han estado ahí cuando lo he
necesitado. Pero también he podido compartir con ellas momentos
especiales de mi vida personal, que nunca se me borrarán de la mente.
Espero que la relación que tenemos no se termine cuando nos
marchemos del laboratorio. Para mí siempre habéis sido un gran ejemplo
a seguir.
Agradecimientos
Con Susi he compartido muchas experiencias en los primeros
años en el lab, gracias por esas comidas tan entretenidas, y por hacer
que la vida en el laboratorio fuese tan amena. Gracias por esos consejos
que hacen que cada día nuestra piel te lo agradezca. Espero que pueda
pedirte consejo siempre que lo necesite, que lo máximo que nos pueda
separar la vida sea un mensaje de correo electrónico.
Paula, Loretta y Lorena, aunque siempre han sido las “mayores”,
desde que llegué me acogieron como una integrante más del grupo,
apoyándome cuando más lo necesitaba y aconsejándome cuando se lo
pedía. Gracias por todo, por vuestra ayuda y vuestros consejos.
Guille, qué decir de ti, si te conozco desde que estábamos en la
carrera!! Espero que todo te vaya genial junto a Diana, y que cuando
tengas alguna duda me llenes el correo con mensajitos. Que la relación
que tenemos desde hace años se mantenga mucho más tiempo. Gracias
por estar siempre a mi lado, y por apoyarme y escucharme.
Y al resto de compañeros del grupo Andrés, Olalla, Leti, Óscar,
Sheila y María, no hemos podido compartir muchos cafés juntos, pero a
pesar de eso sí que he pasado el suficiente tiempo para darme cuenta del
potencial que tenéis, tanto investigador como personal, muchas gracias
por los ánimos y los consejos que siempre me habéis ofrecido (no os
cabreéis por no haberos dedicado algo especial a cada uno, pero es que
se me hacía esto larguísimo).
Y a toda la gente que en algún momento ha estado en el grupo,
Tamara, Cigdem, Lucía, Noelia, Carlos,… Gracias por los momentos
divertidos que juntos hemos podido compartir.
Y gracias también a Marisol, Bea y Ángel, porque ellos son los tres
confidentes que tengo en la facultad, los que me asesoran, los que me
guían y los que me hacen empezar cada día con una sonrisa en la cara.
Agradecimientos
Pero no quería terminar esta parte de agradecimientos sin hacer
mención a Ana, gracias por estar ahí cuando más lo necesitaba, por
haberme apoyado de manera incondicional desde hace años, por
haberme demostrado que si quiero, soy capaz de hacer las cosas, y por
ser mi directora desde la lejanía siempre que lo he necesitado. GRACIAS,
porque sin tu fuerza quizás hoy no estaría aquí.
Mi familia y mi marido merecen sin duda el agradecimiento más
especial porque siempre me han apoyado en todo lo que he hecho,
aconsejándome cuando lo he necesitado, y sintiéndose orgullosos de mí
en todo momento, como yo lo he estado de ellos.
A mi familia le tengo que dar las gracias por su dedicación y
sacrificio; hoy puedo decir que soy así gracias a lo que ellos lucharon.
Gracias también por haberme enseñado qué es lo que importa en la vida,
y por ayudarme a luchar por conseguir mis metas, levantándome cuando
lo he necesitado.
Y a mi marido, gracias por tus consejos, por aguantarme día a día,
por permitirme estar a tu lado, y por haberme regalado un cachito de ti.
Gracias peque.
Y para finalizar, esperando no haberme olvidado de nadie, gracias
a todos los que compartiréis conmigo el día de la defensa, y a los que no
podáis asistir, gracias también por la energía positiva que seguro que me
enviareis desde la distancia.
Índice
Índice
Índice Abreviaturas __________________________________________________ 27 Resumen ______________________________________________________ 33 1. Introducción _______________________________________________ 41 1.1. La pleura ________________________________________________ 43 1.2. Derrame pleural _________________________________________ 47 1.2.1. Cómo saber si un paciente presenta un derrame
pleural ____________________________________________________________ 49 1.2.2. Exudados y trasudados ____________________________________ 49 1.2.3. Causas más frecuentes de derrame pleural ________________ 51 1.2.3.1. Insuficiencia cardíaca ________________________________________ 52 1.2.3.2. Derrame pleural tuberculoso _________________________________ 53 1.2.3.3. Derrame pleural paraneumónico ______________________________ 55 1.2.3.4. Derrame pleural miscelánea __________________________________ 57 1.2.3.5. Derrame pleural paramaligno _________________________________ 61 1.2.3.6. Derrame pleural de difícil diagnóstico _________________________ 61 1.2.3.7. Derrame pleural Neoplásico o derrame pleural maligno ________ 62 1.3. Características del derrame pleural ____________________ 65 1.3.1. Epidemiología _____________________________________________ 65 1.3.2. Patogénesis del derrame pleural ___________________________ 67 1.3.3. Diagnóstico ________________________________________________ 70 1.3.4. Metodologías diagnósticas ________________________________ 71 1.3.4.1. Olor y apariencia del fluido pleural ___________________________ 71 1.3.4.2. Contaje diferencial de células del fluido pleural _______________ 72 1.3.4.3. Citología del fluido pleural ____________________________________ 72 1.3.4.4. Cultivo del fluido pleural _____________________________________ 74 Índice
1.3.4.5. Niveles de marcadores bioquímicos en el fluido pleural ________ 75 1.3.4.6. Biopsia pleural mediante aguja o biopsia transparietal ________ 77 1.3.4.7. Toracocentesis _______________________________________________ 79 1.3.4.8. Broncoscopia ________________________________________________ 80 1.3.4.9. Toracoscopia ________________________________________________ 81 1.3.4.10. Técnicas radiológicas ________________________________________ 82 1.3.4.11. Análisis inmunológicos _______________________________________ 84 1.3.4.12. Fármacos ____________________________________________________ 85 1.3.5. Pronóstico _________________________________________________ 85 1.3.6. Tratamiento _______________________________________________ 86 1.3.7. Direcciones futuras para la investigación _________________ 87 1.4. Marcadores de diagnóstico de derrame pleural _________ 88 1.4.1. Marcadores usados en clínica ______________________________ 89 1.4.2. Marcadores en estudio para el derrame pleural maligno ___ 93 1.5. Proteómica _______________________________________________ 97 1.5.1. El concepto de “proteoma” ________________________________ 98 1.5.2. Proteómica en la búsqueda de marcadores moleculares ___ 99 1.6. Marcadores propuestos en este estudio ________________ 101 1.6.1. PEDF ______________________________________________________ 101 1.6.2. Calprotectina _____________________________________________ 103 1.7. Objetivos ________________________________________________ 107 2. Materiales y métodos _____________________________________ 111 2.1. Muestras biológicas _____________________________________ 113 2.1.1. Obtención de las muestras _______________________________ 113 Índice
2.1.2. Diagnóstico de los pacientes _____________________________ 114 2.2. Preparación de las muestras para electroforesis ______ 118 2.2.1. Cromatografía de afinidad a través de una columna de
inmunoafinidad múltiple ___________________________________________ 119 2.2.2. Diálisis ___________________________________________________ 120 2.2.3. Liofilización ______________________________________________ 121 2.3. Determinación de la concentración de proteínas_______ 122 2.3.1. Método de Biuret _________________________________________ 122 2.3.2. Método de Bradford modificado __________________________ 123 2.4. Electroforesis monodimensional________________________ 124 2.4.1. Desnaturalización de la muestra _________________________ 124 2.4.2. Electroforesis
desnaturalizante
en
geles
de
poliacrilamida (SDS-PAGE) _________________________________________ 125 2.5. Electroforesis bidimensional ___________________________ 127 2.5.1. Primera dimensión: Enfoque isoeléctrico ________________ 128 2.5.2. Equilibrado de las tiras IPG ______________________________ 130 2.5.3. Segunda dimensión: Electroforesis desnaturalizante
en geles de poliacrilamida _________________________________________ 131 2.5.4. Electroforesis PAGE en condiciones nativas _____________ 134 2.6. Tinción de geles de poliacrilamida _____________________ 135 2.6.1. Tinción con azul brillante de Coomassie _________________ 135 2.6.2. Tinción
con
nitrato
de
plata
compatible
con
espectrometría de masas ___________________________________________ 136 2.7. Transferencia de proteínas a membranas mediante
Western Blot _________________________________________________ 137 Índice
2.7.1. Tinción con rojo Ponceau S _______________________________ 138 2.7.2. Inmunodetección de proteínas ___________________________ 139 2.7.2.1. Inmunodetección de la proteína PEDF _______________________ 140 2.7.2.2. Inmunodetección de la proteína S100-A9 ____________________ 140 2.8. Análisis de imagen _____________________________________ 140 2.8.1. Adquisición de la imagen _________________________________ 140 2.8.2. Análisis de patrones monodimensionales _________________ 141 2.8.3. Análisis de patrones bidimensionales ____________________ 143 2.9. Electroforesis diferencial en gel ________________________ 145 2.9.1. Preparación y marcaje de las muestras ___________________ 146 2.9.2. Electroforesis bidimensional _____________________________ 147 2.9.3. Adquisición de las imágenes ______________________________ 147 2.9.4. Análisis diferencial de intensidad ________________________ 148 2.10. Espectrometría de masas _____________________________ 149 2.10.1. Digestión de las proteínas y obtención de péptidos
trípticos ___________________________________________________________ 149 2.10.2. Análisis por MALDI-TOF y MS/MS ________________________ 150 2.10.3. Búsqueda en bases de datos e identificación de
proteínas ___________________________________________________________ 151 2.11. Determinación de la concentración de los
marcadores en el fluido pleural _____________________________ 152 2.11.1. Determinación de los niveles de la proteína PEDF _______ 153 2.11.2. Valoración de los niveles de la proteína Calprotectina ___ 153 2.12. Tratamiento estadístico de los datos _________________ 153 2.12.1. Análisis estadísticos ______________________________________ 154 Índice
2.12.1.1. Análisis estadístico univariantes _____________________________ 154 2.12.1.2. Análisis estadísticos multivariantes __________________________ 155 2.12.1.3. Curvas ROC ________________________________________________ 157 2.12.1.4. Análisis de validación cruzada _______________________________ 158 3. Resultados ________________________________________________ 161 3.1. Búsqueda de marcadores en el fluido pleural __________ 163 3.1.1. Depleción de las proteínas abundantes del fluido
pleural ___________________________________________________________ 163 3.1.2. Eficacia del prefraccionamiento del fluido pleural _______ 164 3.1.3. Obtención de mapas proteicos bidimensionales del
fluido pleural _______________________________________________________ 166 3.1.3.1. Optimización del método ____________________________________ 166 3.1.3.2. Efecto del prefraccionamiento mediante Hu-6 sobre el
patrón bidimensional de proteínas de fluido pleural humano _________________ 167 3.1.4. Comparación del proteoma del derrame pleural de
pacientes con patologías malignas y benignas _____________________ 169 3.1.4.1. 3.1.5. Análisis de Componentes principales ________________________ 174 Identificación de proteínas con expresión diferencial
en el DP de pacientes con patologías malignas y benignas_________ 177 3.2. Selección y caracterización bioquímica de proteínas
con expresión diferencial en derrame pleural maligno y
benigno ______________________________________________________ 181 3.2.3. 3.2.1.1. Caracterización de la proteína PEDF _____________________ 181 Inmunodetección de la proteína PEDF mediante
immunobloting _____________________________________________________________ 182 3.2.1.2. Análisis de las isoformas de la proteína PEDF ________________ 185 Índice
3.2.2. Validación de la proteína PEDF como marcador de
DPM ___________________________________________________________ 187 3.2.2.1. Valoración de los niveles de la proteína PEDF en el derrame
pleural _______________________________________________________________ 187 3.2.2.2. Parámetros diagnósticos del PEDF como marcador del derrame
pleural maligno _____________________________________________________________ 189 3.2.2.3. Relación de los niveles de PEDF con las caracteríticas clínicas
y bioquímicas de los pacientes ______________________________________________ 190 3.2.2.4. Correlación de los niveles de PEDF con otras variables clínicas
para la clasificación del derrame pleural maligno _____________________________ 191 3.2.3. 3.2.3.1. Caracterización de la proteína S 100 A9 _________________ 192 Inmunodetección de la proteína S 100 A9 mediante
immunobloting ____________________________________________________________ 193 3.2.4. Validación de la proteína calprotectina como marcador
de derrame pleural maligno ________________________________________ 198 3.2.4.1. Valoración de los niveles de la proteína calprotectina en el
derrame pleural ____________________________________________________________ 198 3.2.4.2. Parámetros diagnósticos de la calprotectina como marcador del
derrame pleural maligno ____________________________________________________ 202 3.2.4.3. Parámetros diagnósticos de otras variables para la
clasificación del DPM _______________________________________________________ 205 3.2.4.4. Influencia de los niveles de calprotectina sobre la predicción
del derrame pleural maligno _________________________________________________ 206 3.2.4.5. Comparación de la sensibilidad de la citología y la
calprotectina en la detección del derrame pleural maligno _____________________ 208 3.2.4.6. Validación de los datos obtenidos. ______________________________ 209 4. Discusión _________________________________________________ 211 4.1. Búsqueda de marcadores en el fluido pleural __________ 213 4.1.1. Depleción de las proteínas más abundantes del líquido
pleural ___________________________________________________________ 217 Índice
4.1.2. Detección e identificación de proteínas con expresión
alterada ___________________________________________________________ 221 4.2. Selección y caracterización bioquímica de proteínas
con expresión diferencial en derrame pleural maligno y
benigno ______________________________________________________ 232 4.2.1. Caracterización de la proteína PEDF _____________________ 233 4.2.2. Validación de la proteína PEDF como marcador de
derrame pleural maligno ___________________________________________ 235 4.2.3. Caracterización de la proteína Calprotectina ____________ 239 4.2.4. Validación
de
la
proteína
Calprotectina
como
marcador de derrame pleural maligno _____________________________ 242 4.2.4.1. Procedimiento a seguir para la utilización de la
calprotectina para la detección del derrame pleural maligno en la práctica
clínica diaria _____________________________________________________________ 249 5. Conclusiones ______________________________________________ 253 Bibliografía __________________________________________________ 257 Abreviaturas
Abreviaturas
Abreviaturas
1D: monodimensional, en una dimensión
1-DE: electroforesis monodimensional
2D: bidimensional, en dos dimensiones
2-DE: electroforesis bidimensional
3D: tridimensional, en tres dimensiones
AcN: acetonitrilo
ACP: análisis de componentes principales
ADA: adenosina desaminasa
APS: persulfato amónico
AR: artritis reumatoide
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
AUC: área bajo la curva ROC
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
CA: antígeno carbohidrato
CEA: antígeno carcinoembrionario
CHAPS: 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propanolsulfonato
CHUVI: complejo hospitalario universitario de Vigo
CP: componente principal
CPM: cáncer de pulmón microcítico
CPNM: cáncer de pulmón no microcítico
CYFRA 21-1: fragmentos de la citoqueratina 19
DIGE: diferential in-gel electrophoresis
29
Abreviaturas
DP: derrame pleural
DPB: derrame pleural benigno
DPM: derrame pleural maligno
DS: desviación estándar
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etilendiaminotetracético
ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
HCl: ácido clorhídrico
HU-6: columna de inmunoafinidad múltiple para la depleción de las 6
proteínas más abundantes del suero humano
IAA: iodoacetamida
ICAT: isotope-coded affinity tags
IEF: isoelectroenfoque
Ig: inmunoglobulina
IL: interleuquina
iTRAQ: isobaric tags for relative and absolute quantitation
LDH: lactato deshidrogenasa
LES: lupus eritematoso sistémico
LMW: marcador de peso molecular
LR: likehood ratio
milli-Q: ultrapura
MMP: metaloproteinasas de la matriz
Mr: masa molecular
MS: mass spectrometry
MudPIT: multidimensional proteins identification technology
30
Abreviaturas
NBT: azul de nitrotetrazolio
NSE: enolasa neuroespecífica
PBS: phosphate buffered saline
PEDF: pigment epithelium derived factor
PET: position emisión tomography
pI: punto isoeléctrico
PMF: peptide mass fingerprinting
PMN: polimorfonucleares
PVDF: floruro de polivinilideno
ROC: receiver operating characteristic
SDS: dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE: electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida
SELDI: surface-enhanced laser desorption/ionization
TAC: tomografía axial computarizada
TCA: ácido tricloroacético
TEMED: tetrametilendiamina
TNF: factor de necrosis tumoral
VIH: síndrome de inmunidad adquirida
VPN: valor predictivo negativo
VPP: valor predictivo positivo
31
Resumen
Resumen
Resumen
El derrame pleural (DP) es una acumulación de fluido en la
cavidad pleural, indicativa del desarrollo de una enfermedad de tipo
pulmonar, pleural o extrapulmonar. En nuestro caso, el derrame pleural
maligno (DPM) (secundario a neoplasias de tipo epitelial o a carcinomas)
es la manifestación de una enfermedad neoplásica de tipo metastásico en
estado muy avanzado. Generalmente se relaciona con una supervivencia
media corta y una elevada tasa de morbilidad y mortalidad. Es por este
motivo que una investigación exhaustiva de los marcadores que
ocasionan este tipo de patología, aparte de contribuir a mejorar el
diagnóstico y pronóstico de los pacientes, permitiría la obtención de un
seguimiento más adecuado de esta patología.
En la actualidad, la forma menos invasiva, más rápida y eficaz de
establecer el diagnóstico de malignidad es el examen citológico del líquido
pleural y, pese a que varía en función del tipo de tumor, el porcentaje
medio de DPM que se diagnostican mediante esta metodología ronda el
60 %. A pesar de que se han analizado numerosos procedimientos
bioquímicos, genéticos e inmunológicos para intentar mejorar la
sensibilidad en el diagnóstico, ninguno de estos métodos es, hasta la
fecha, aplicable en la práctica clínica diaria. Y puesto que a día de hoy se
emplean metodologías muy agresivas para el establecimiento de un
diagnóstico, sería importante encontrar un método de valoración que
fuese más cómodo, rápido y preciso, y que permitiese evitar la realización
de procedimientos agresivos como la biopsia pleural o biopsia por
toracoscopia.
En el ámbito de la investigación biomédica, la búsqueda de
marcadores mediante el empleo de metodologías proteómicas ha dado
origen a resultados bastante prometedores, por lo que en esta Tesis
35
Resumen
Doctoral se han empleado este tipo de metodologías para detectar
proteínas con utilidad clínica para el diagnóstico del DPM, y además se
ha procedido a la posterior validación de las proteínas consideradas
como candidatas a marcadores de la patología.
En un primer momento se ha llevado a cabo un estudio
proteómico de expresión diferencial con el objetivo de identificar y
cuantificar proteínas que presentaban un nivel de expresión alterado
como consecuencia del estado patológico. Como primer paso se empleó
una
estrategia
que
consiste
en
el
uso
de
un
método
de
prefraccionamiento de la muestra previo a la separación electroforética.
Este método nos permitió enriquecer la muestra en un grupo de
proteínas de interés, que en nuestro caso estaría compuesto por
proteínas que aparecían de forma minoritaria en las muestras de DP,
consiguiéndose una mejora en la resolución de los mapas, y pudiéndose
detectar un mayor número de proteínas, incluyendo las denominadas
proteínas de baja abundancia, que presentan especial relevancia en el
descubrimiento de nuevos marcadores tumorales y dianas terapéuticas.
Para iniciar la búsqueda de proteínas candidatas a marcadores de
diagnóstico utilizamos la tecnología de electroforesis diferencial en gel
(DIGE), que está basada en la electroforesis bidimensional, pero en este
caso es una técnica de tipo multiplex en la que múltiples muestras
marcadas con diferentes fluoróforos migran en un mismo gel. Tras el
análisis estadístico de los mapas proteicos obtenidos mediante esta
tecnología pudimos saber qué especies proteicas presentaban variaciones
significativas entre las muestras a estudio, que serían posteriormente
identificadas mediante espectrometría de masas (MS).
Una vez realizado el análisis de los mapas proteicos y la
identificación de las proteínas cuya expresión variaba entre la patología
maligna y benigna del derrame, pudimos seleccionar aquellas proteínas
que por sus características y sus funciones podían ser consideradas
36
Resumen
potenciales candidatas a marcadores del DPM. Además, se corroboró que
la metodología empleada en este trabajo era adecuada como herramienta
para abordar la búsqueda de biomarcadores, ya que algunas de las
proteínas cuya expresión se encontraba alterada en DPM habían sido
propuestas previamente como candidatas a marcadores tumorales para
las patologías que ocasionaban el derrame.
Las especies proteicas que fueron seleccionadas para su validación
como marcadores del DPM en esta tesis fueron sometidas a estudios de
Western Blot e inmunoblot, para comprobar la alteración observada
mediante la metodología DIGE, y a una posterior cuantificación proteica
mediante el empleo de ELISAs específicos para cada una de las
proteínas.
Como primera proteína seleccionada como marcador se consideró
al factor derivado del epitelio pigmentado (PEDF por su nombre en inglés
Pigment epithelium-derived factor), cuyo patrón de expresión de las dos
isoformas observadas en los geles DIGE permitía una clara separación
entre el DPM y derrame pleural benigno (DPB). El PEDF es una
glicoproteína que presenta una gran capacidad anti-angiogénica, mucho
mayor que cualquier otro factor conocido de producción endógena. Por
eso se procedió a comprobar la alteración de estas isoformas mediante
Western Blot en una y dos dimensiones. Pese a que mediante la
metodología DIGE ambas isoformas presentaban un ascenso en su
expresión
en
pacientes
con
patología
maligna,
en
los
mapas
monodimensionales apenas había diferencias entre los dos tipos de
patologías, y en los mapas bidimensionales se detectaron diversas
isoformas de masa molecular (Mr) y punto isoelétrico (pI) característico.
El empleo de la metodología ELISA no ayudó a verificar los resultados
puesto que existen múltiples isoformas cuya concentración hace que se
enmascaren unas a otras a la hora de cuantificar la concentración total
de la proteína.
37
Resumen
Las otras proteínas candidatas fueron la S 100 A8 y S 100 A9, que
son dos proteínas que presentan un gran potencial como marcadores
tumorales y dianas terapéuticas del cáncer. Además, también están
implicadas en reacciones inflamatorias. Tanto la proteína S 100 A8 como
la proteína S 100 A9 presentaban un patrón de expresión disminuido en
los pacientes con patología maligna cuando se analizaron mediante
metodología DIGE. Aunque en un principio se decidió realizar su análisis
mediante Western Blot por separado para valorar su expresión, el
análisis de la concentración se decidió hacer en conjunto, teniendo en
cuenta la particularidad que presentan ambas proteínas de formar el
dímero denominado calprotectina.
El análisis mediante inmunoblot de la proteína S 100 A9 reveló la
existencia de una mayor concentración de proteína en los pacientes con
DPB en relación a aquellos que presentaban DPM, lo que confirmaría los
resultados del DIGE. Debido a que las diferencias estaban tan claras, se
decidió realizar el ELISA de la calprotectina (dímero formado por las
proteínas S 100 A8 y S 100 A9) directamente, sin haber realizado
inmunodetección previa de la proteína S 100 A8, suponiéndose que se
detectaría la proteína de la misma manera que se había detectado la S
100 A9.
Después
de
realizar
las
determinaciones
bioquímicas
se
compararon las concentraciones de la calprotectina en distintos tipos de
muestras cedidas por el Complejo Hospitalario Universitario de Vigo
(CHUVI). Para el análisis de los resultados se emplearon pruebas de
significación bilateral con un límite de significación estadística p < 0,05,
obteniendo un resultado significativo (p = 0,001) a la hora de clasificar a
los pacientes con DPM de aquellos con DPB, con una probabilidad
estadística del 95 %.
La elaboración de curvas ROC (Receiver-Operating Characteristic)
permitió la obtención de un punto de corte con el que se obtenía la
38
Resumen
mayor eficiencia diagnóstica (545 ng/mL), y otro con el que se obtenía la
mayor sensibilidad (736,4 ng/mL). Además, estos resultados permitían
un diagnóstico clínico casi perfecto a la hora de clasificar a los pacientes
entre DPM y DPB.
A modo de conclusión, los resultados obtenidos en esta Tesis
Doctoral han demostrado la utilidad y efectividad de la metodología
empleada para llevar a cabo un estudio proteómico dirigido a la
búsqueda de nuevos marcadores biomoleculares para el DPM. Entre las
proteínas cuya expresión se encontró alterada y de las que se realizó un
estudio en profundidad, consideramos que la proteína calprotectina
podría ser de utilidad en clínica, y en concreto, ser utilizada como
marcador complementario a la citología del fluido pleural.
39
1.
Introducción
Introducción
INTRODUCCIÓN
1.1.
La pleura
La pleura es una membrana serosa de origen mesodérmico que
recubre el parénquima pulmonar, el mediastino, el diafragma y la
superficie interna de la pared torácica. A nivel histológico, la pleura está
formada por una monocapa de células mesoteliales aplanadas y con
microvellosidades en su superficie, que descansan sobre la lámina basal,
con varias capas subyacentes de tejido conectivo que contienen vasos
sanguíneos y linfáticos. Este tejido, de tipo conectivo, es una estructura
compleja que también está relacionada con la inflamación en el espacio
pleural (Jantz y Antony, 2008).
Figura 1. Imagen representativa de las capas que componen la pleura pulmonar (tomado
de http://www.beltina.org).
La pleura se subdivide en pleura visceral y pleura parietal,
quedando entre ambas un espacio cerrado denominado espacio o
cavidad pleural (figura 1). La pleura visceral es la que recubre la
43
Introducción
superficie del pulmón, mientras que la pleura parietal recubre la
superficie interna de la pared torácica, la cara lateral del mediastino y la
parte superior del diafragma, subdividiéndose a su vez en pleura parietal
costal, mediastínica y diafragmática (Sahn, 1990) (figura 2).
Figura 2. Imagen representativa de las capas que componen la pleura pulmonar (tomado
de
http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/2092/1/Cuidados-de-
Enfermeria-en-paciente-con-drenaje-pleural-por-neumotorax-espontaneoPLEUREVAC.html#).
Entre las dos hojas pleurales que forman la cavidad pleural existe
una anchura de entre 10 y 20 mm, aproximadamente que, en
condiciones normales, contiene una pequeña cantidad de líquido pleural
(0.1-0.2 mL/Kg de peso corporal, en cada hemitórax) encargado de
lubrificar y mantener independientes ambas membranas pleurales. La
tasa de absorción y reabsorción de este líquido es de unos mililitros al
día.
El
filtrado
inicial
de
la
circulación
sistémica
contiene
aproximadamente una concentración de proteínas de entre 0.3 y 0.4
44
Introducción
g/dL. Sin embargo, la mayor parte del líquido filtrado se reabsorbe
rápidamente mediante las vénulas, por lo que se concentra en proteínas
entre 1.0 y 1.5 g/dL (Sahn, 1990). Además, el volumen de líquido pleural
se verá modificado ante la presencia de desajustes en la homeostasis
pleural (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2006; Villena-Garrido et al.,
2006).
En la tabla 1 se muestra la composición del líquido pleural en
condiciones normales.
Tabla 1. Composición y pH del líquido pleural en condiciones normales.
Volumen
0.13 ± 0.06 mL/kg
Células/mm3
1000-5000
Células mesoteliales
0-2 %
Macrófagos
64-80 %
Linfocitos
18-36 %
CD4/CD8
0.6-1
Proteínas
Albúmina
1-2 g/dL
50-70 %
Glucosa
Similar al plasma
LDH
< 50% del valor en plasma
pH
≥ plasma
CD: Cluster of differentiation, LDH: Lactato deshidrogenasa
Por la arteria intercostal, localizada en la circulación sistémica,
viaja el suministro de sangre arterial que se dirige a la pleura parietal y
visceral. La pleura visceral está drenada por las venas pulmonares y
bronquiales, y la pleura parietal por las venas intercostales y venas
mamarias internas. El drenaje linfático de ambas pleuras difiere de
forma considerable. El drenaje de la pleura parietal está realizado por la
vía principal para el drenaje de líquido y células del espacio pleural, este
45
Introducción
drenaje ocurre totalmente en la pleura parietal, en la cual los vasos
linfáticos derivan en los nodos intercostales y a lo largo de la arteria
torácica interna. Sin embargo, la pleura visceral presenta una red
linfática dirigida hacia el hilio pulmonar, donde las estructuras que
forman la raíz del pulmón entran y salen de la víscera, aunque no parece
contribuir al drenaje de la cavidad pleural (Ferrer y Roldán, 2000).
Únicamente la pleura parietal posee fibras nerviosas sensitivas en
su capa de tejido conectivo, por lo que una irritación de la misma
producirá sensación de dolor. En contraste con la pleura parietal, la
pleura visceral no contiene fibras nerviosas sensitivas por lo que siempre
que exista dolor pleurítico indicará afectación de la pleura parietal
(Ferrer y Roldán, 2000).
La función principal de la pleura es facilitar el movimiento de los
pulmones en el interior de la caja torácica durante la respiración, porque
la fina capa de fluido del espacio pleural y las microvellosidades del
mesotelio son factores lubrificantes (Ferrer y Roldán, 2000). Para lograr
este movimiento pulmonar, la pleura debe armonizar las fuerzas
elásticas y no elásticas (tanto torácicas, como pulmonares), para
disminuir el gasto energético de los movimientos de expansión y
retracción pulmonar. Esto es posible debido a la existencia de una
presión negativa intrapleural que es capaz de evitar el colapso del
pulmón; debido a que las dos hojas pleurales se deslizan una sobre la
otra gracias al líquido pleural; y debido a las microvellosidades que
presenta su mesotelio (Jantz y Antony, 2008; Ferrer y Roldán, 2000)
(figura 3).
46
Introducción
Figura 3. Imágenes representativas de cómo ocurre la respiración pulmonar. Figura de la
izquierda donde se puede observar cómo tres presiones importantes son las que están
implicadas en la respiración: la presión alveolar (PA), la presión pleural (Ppl) y la presión
transmural (Ptm). Hay dos presiones transmurales que cambian durante el llenado y
vaciado de los pulmones: la presión transpulmonar (Pp) y la presión transmural en las
vías aéreas (Ptva). Tanto la Pp como la Ptva pueden definirse cómo presión interior menos
presión exterior. En ambos casos, la presión en el exterior es la Ppl. (Figura obtenida de
http://163.178.103.176/Fisiologia/respiratorio/pracb_7/respi_pracb_1.html). En el caso
de la figura de la derecha se puede observar como son los cambios en la presión durante
la
ventilación
pulmonar
(Figura
obtenida
de
la
siguiente
página
web
http://163.178.103.176/Fisiologia/respiratorio/ejercicios/ejerc_6/respi_ejercicio_.html).
1.2.
Derrame pleural
El derrame pleural (DP) se define como la acumulación patológica
de fluido en la cavidad pleural que rodea al pulmón, que impide que se
produzca una correcta distensión pulmonar durante la inspiración,
perjudicándose la respiración. Un DP es indicativo del desarrollo de una
enfermedad de tipo pulmonar, pleural o extra pulmonar, por lo que se
hace necesaria una aproximación sistemática a la investigación de las
47
Introducción
causas que originaron el derrame, para así poder establecer un posible
diagnóstico (Medford y Maskell, 2005).
El fluido pleural puede originarse en los capilares pleurales
(principalmente los parietales), en el espacio intersticial pulmonar, en los
ganglios linfáticos, en los vasos sanguíneos intratorácicos, o en la
cavidad
peritoneal.
La
reabsorción
de
este
fluido
se
realiza
principalmente mediante los vasos linfáticos de la pleura parietal (figura
4).
Los mecanismos por los que se origina el DP se relacionan con un
aumento de la producción de fluido o una disminución de la reabsorción
del mismo. Esto puede ser originado por cambios en las presiones
hidrostáticas capilares, cambios en las presiones coloidosmóticas (tanto
intra- como extravasculares), y cambios en las presiones negativas
intratorácicas (Villena-Garrido et al., 2006). Sin embargo, una gran
variedad de características clínicas pueden originar la acumulación de
fluido en el espacio pleural (Gu et al., 2007).
Figura 4. Imagen representativa del flujo de fluido pleural (imagen obtenida de
http://www.pcca.net/PleuralEffusion.html).
48
Introducción
1.2.1.
Cómo saber si un paciente presenta un derrame
pleural
Prácticamente todos los pacientes con DP deben someterse a una
toracocentesis diagnóstica, excepto si existe una escasa cantidad de
líquido pleural (< 1 cm de espesor en la radiografía realizada en decúbito
ipsilateral), o cuando nos hallamos ante un cuadro clínico característico
de insuficiencia cardíaca. Para poder cuantificar la cantidad de líquido
pleural existente, se debe medir en una radiografía pectoral de la cara
lateral del derrame la distancia al borde exterior del pulmón y al borde
interior de la pared pectoral. Si esta distancia es menor de 10 mm, el
diagnóstico mediante toracocentesis no debería realizarse (Light, 1995).
1.2.2. Exudados y trasudados
El DP se divide clásicamente en derrame de tipo trasudado o de
tipo exudado. El poder diferenciar entre ambos tipos es muy importante
para poder decidir los estudios que deberán ser realizados a posteriori a
los pacientes.
Por definición, un trasudado se desarrolla cuando los factores
sistémicos que influyen en la formación y absorción del fluido pleural se
encuentran alterados, haciendo que este fluido se acumule. Fluido que
puede ser originado en el pulmón, en la pleura, o en la cavidad peritoneal
(Broaddus y Light, 1992).
La zona del pulmón donde se da una acumulación de fluidos suele
presentar una gran permeabilidad de los capilares a las proteínas; sin
embargo, cuando se origina un DP de tipo exudativo se debe a una
alteración en los capilares que están localizados donde el fluido esta
alterado, lo que hace que se dé una acumulación excesiva de líquido.
49
Introducción
La
razón
principal
por
la
que
conviene
diferenciar
entre
trasudados y exudados es que, si el fluido es un trasudado no se
necesitarían más procedimientos diagnósticos y su terapia sería directa
(sobre todo de enfermedades como el fallo cardíaco congestivo, cirrosis, o
nefrosis). Sin embargo, si se demuestra que el derrame es un exudado se
requerirá una investigación diagnóstica más extensiva.
Desde los años 70, los criterios que se emplean para el diagnóstico
diferencial de los dos tipos de derrame son aquellos basados en la
medida del fluido pleural, la cantidad de LDH sérica y pleural, y la
concentración de proteínas, denominados “criterios de Light” (Light et al.,
1972).
Mediante los criterios de Light, el fluido pleural se clasificará como
exudado si se cumple alguna de las siguientes características:
- Proteínas del fluido pleural/proteínas del suero > 0.5 (unidades)
- LDH del fluido pleural/LDH suero > 0.6 (unidades)
- LDH fluido pleural > 2/3 el límite normal de la LDH sérica (el
límite de corte del fluido pleural es 200 IU/L, normalmente)
Otros autores han propuesto el empleo de diferentes criterios
bioquímicos para el diagnóstico diferencial entre trasudados y exudados.
Los más conocidos son la medida de los niveles de colesterol en el fluido
pleural (Burgess, 2004; Costa et al., 1995), el empleo del cociente
albúmina sérica/pleural (Atalay et al., 2005), y el empleo de la ratio
bilirrubina del fluido pleural/suero (Meisel et al., 1990).
Burgess, Romero, y sus respectivos colaboradores (Burgess et al.,
1995; Romero et al., 1993) compararon los criterios de Light con otros
test propuestos concluyendo que los criterios de Light son los que
permiten separar los exudados de los trasudados con mayor sensibilidad
y especificidad diagnóstica.
50
Introducción
Burgess et al. (Burgess et al., 1995) también compararon la
eficiencia de los criterios de Light y los niveles de colesterol, entre otras
mediciones (como el gradiente de seroalbúmina), demostrando que los
criterios de Light son más precisos, con una sensibilidad del 98 % (igual
que la obtenida por Romero et al. (Romero et al., 1993) y una
especificidad del 83 %, seguidos del gradiente de seroalbúmina, que
presenta una sensibilidad del 87 % y una especificidad del 92 %. Por
tanto, parece que los criterios de Light representan la mejor herramienta
para separar los trasudados de los exudados.
Cuando existe sospecha de que un paciente presenta trasudado
pleural las únicas determinaciones que suelen realizarse son la
determinación en suero y fluido pleural de LDH y proteínas. Sin
embargo, cuando la sospecha es de exudado pleural es necesario
determinar además el pH y los niveles de glucosa, realizar un recuento
celular completo y diferencial, y estudiar su citología, entre otras
valoraciones iniciales.
Debemos destacar que las características del fluido pleural pueden
cambiar ocasionalmente de trasudado a exudado, dificultando el
diagnóstico, como en el caso de los pacientes que presentan diuresis
(Broaddus, 2001; Broaddus y Light, 1992).
1.2.3. Causas más frecuentes de derrame pleural
En España, la prevalencia del DP es ligeramente superior a 400
por cada 100.000 habitantes, siendo la causa más frecuente entre los
trasudados la insuficiencia cardíaca congestiva, y entre los exudados el
DP paraneumónico, el neoplásico, o el secundario a tromboembolia
pulmonar (Villena-Garrido et al., 2006). Además, el número de nuevos
casos (incidencia) de derrame pleural debido a enfermedades sistémicas
51
Introducción
no es elevado cuando se revisan grandes series poblacionales, siendo en
España del 1 % (Ferreiro et al., 2011).
Se sabe que aproximadamente un 20 % de los derrames pleurales
son causados por patologías malignas, y dentro de estos un 50 % se
deben a cáncer de pulmón primario (Marel et al., 1995).
1.2.3.1. Insuficiencia cardíaca
La insuficiencia cardíaca es la causa más frecuente de DP y, en
particular, de los trasudados. Dos terceras partes de los pacientes con
insuficiencia cardíaca congestiva desarrollan DP, y normalmente de tipo
bilateral.
En la insuficiencia cardíaca, el líquido pleural es de tipo trasudado
y fácilmente diagnosticable mediante los criterios de Light. Aunque la
concentración de proteínas, LDH y colesterol pleurales aumentan
significativamente con el tratamiento diurético, pocas veces se alcanzan
los valores propios de un exudado. Si la presentación clínica es atípica
estaremos ante DP unilateral, DP bilateral con gran diferencia de tamaño
entre un lado y otro, DP bilateral sin cardiomegalia, presencia de fiebre o
dolor torácico y persistencia del DP a pesar del tratamiento diurético, por
lo que deberíamos realizar una toracocentesis para el diagnóstico de esta
patología (Kinasewitz, 1997).
El tratamiento es el habitual de la insuficiencia cardíaca
(diuréticos, inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina,
dioxina),
aunque
ocasionalmente
puede
ser
beneficioso
evacuar
volúmenes de 0,5 a 1,5 litros de líquido pleural mediante toracocentesis
para aliviar con mayor rapidez la disnea intensa de pacientes con DP
cuantiosos (Shinto y Light, 1990).
52
Introducción
1.2.3.2. Derrame pleural tuberculoso
La frecuencia del derrame pleural tuberculoso es muy variable y
depende de la incidencia de tuberculosis en cada país. En España es un
problema de primera magnitud, ya que se estima que la pleura está
afectada en el 23,3 % de todos los pacientes con tuberculosis (VillenaGarrido et al., 2006).
Los DP tuberculosos se originan debido a una infección pulmonar
sub-pleural originada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis. La
tuberculosis pleural se desarrolla como un DP con características de
exudado, y puede encontrarse aislada o asociada a tuberculosis
pulmonar. El derrame pleural benigno (DPB) en la tuberculosis es el
resultado de la ruptura del foco caseoso repleto del bacilo tras 6-12
semanas de la infección (figura 5), lo que provoca la entrada de antígenos
micobacterianos en el espacio pleural, donde genera la respuesta de
hipersensibilidad inmunológica (Evans, 2008; Wiwanitkit, 2011). Tras
esta infección se desencadenan una serie de reacciones inmunológicas,
en las cuales macrófagos y linfocitos T4 interaccionan entre sí mediante
sus productos, interleucinas (IL) 1 y 2, interferón-γ y factor de necrosis
tumoral-α (TNF-α), en los granulomas pleurales (Ferrer et al., 1999).
Los pacientes con DP tuberculoso presentan sintomatología subaguda, como dolor pleural, fiebre y tos, siendo en algunos casos dolores
agudos. Pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (VIH)
pueden mostrar manifestaciones más insidiosas y otros síntomas como
disnea, tracnea, astenia y diarrea, e incluso otros menos frecuentes como
hepatomegalia, esplenomegalia y linfadenopatías (Soriano et al., 1988).
53
Introducción
Figura 5. Imagen representativa de las lesiones producidas por la patología tuberculosa
en el pulmón (tomado de http://www.researchmalignantmesothelioma.com).
El DP de los pacientes con DP tuberculoso normalmente
ocupa menos de la mitad del hemitórax y raramente es masivo o
bilateral. A estos pacientes se les suele realizar un test basado en la
reactividad de su cuerpo al antígeno tuberculina. Normalmente es un
test realizado sobre la piel y en el que los anticuerpos del paciente
reaccionan contra el antígeno tuberculina. El test de la tuberculina
positivo se obtiene en el 70 % de los pacientes inmunocompetentes y en
un 40 % de los pacientes que presentan VIH (Ferrer, 1997) (figura 6).
Figura 6. Imagen representativa del test de la tuberculina; si el paciente presenta el
anticuerpo frente al antígeno suministrado, entonces aparecerá la reacción cutánea de
tumefacción y coloración rojiza que se puede observar en la figura de la derecha.
Imágenes obtenidas de http://www.tubesalud.com/pruebas-de-tuberculosis.
54
Introducción
M.tuberculosis se localiza en un 10-25 % de los pacientes (Berger y
Mejia, 1973) y en la biopsia pleural en el 40-65 % de los casos. Los
granulomas, algunas veces con caseosis central, se encuentran en el 7077 % de las muestras obtenidas mediante biopsia por aguja (Klimiuk y
Krenke, 2011).
Existen otros parámetros diagnósticos para el fluido pleural
tuberculoso. Por ejemplo, algunos estudios han demostrado que
pacientes con tuberculosis tienen niveles de la enzima adenosina
desaminasa (ADA) > 43 U/L (Aggarwal et al., 1999; Wong, 2005). Sin
embargo,
se
detectan
falsos
negativos
por
ADA
en
pacientes
inmunodeprimidos con infección por VIH (Shao et al., 2003). Además, los
falsos negativos por ADA normalmente son un 5-10 % de los casos
analizados, y en la mayoría de estos se deben a empiemas, linfomas,
derrames de tipo reumatoide y, en algunas ocasiones, por otras
neoplasias o infecciones (Orriols et al., 1992). La determinación de la
subenzima ADA2 en el fluido pleural puede incrementar la especificidad
del
diagnóstico,
puesto
que
pacientes
con
pleuritis
tuberculosa
presentan niveles elevados de esta subenzima (Ungerer et al., 1994).
En
una
minoría
de
los
casos,
el
DP
tuberculoso
puede
manifestarse como una acumulación de líquido pleural purulento
(empiema tuberculoso) en pacientes que recientemente han tenido una
tuberculosis pleural (Villena-Garrido et al., 2006).
1.2.3.3. Derrame pleural paraneumónico
Cualquier DP que se asocie con neumonía bacteriana, absceso
pulmonar o bronquiectasias es un DP paraneumónico. Una complicación
que suele aparecer relacionada con el DP paraneumónico es el empiema,
que no es más que la presencia de pus en el espacio pleural.
55
Introducción
En el desarrollo del DP paraneumónico existen 3 fases: exudativa,
fibrinopurulenta y organizativa. En la fase exudativa se acumula un
líquido pleural estéril que está relacionado con un aumento de la
permeabilidad capilar originado por la liberación de diferentes citocinas
[IL-6, IL-8, TNF-α, y factor estimulante del endotelio vascular] secretadas
con el fin de eliminar al patógeno. En la fase fibrinopurulenta, la
invasión bacteriana del espacio pleural induce daño endotelial, que
conlleva la disminución de la respuesta fibrinolítica, y el depósito de
fibrina en ambas superficies pleurales.
El líquido pleural de los pacientes con DP paraneumónico contiene
gran cantidad de células polimorfonucleares, bacterias y detritus
celulares cuyo incremento de actividad metabólica local puede justificar
la caída del pH y de glucosa, y el incremento de los valores de LDH, como
consecuencia de un aumento de la glicolisis anaeróbica en este fluido.
En la fase organizativa, aparecen diversos factores de crecimiento,
entre ellos el de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado de las
plaquetas y el factor de crecimiento transformante β, estableciendo la
fase final en la que hay un depósito de fibrina, siendo posterior la
aparición del tejido fibroso de colágeno.
Normalmente, tan pronto como se reconoce que el paciente
presenta un DP paraneumónico, se recomienda la realización de una
toracocentesis terapéutica y diagnóstica, y en caso de que el líquido
pleural no purulento se reacumule, y la primera toracocentesis tuviese
características indicativas de una posible mala evolución (cultivo
positivo, pH < 7, glucosa < 40 mg/dL, LDH > 1000 UI/L), se optaría por
la utilización a posteriori del tubo de drenaje (Light y Porcel, 2000).
Cuando un fluido no es empiémico, se debería evaluar el pH, la
glucosa y los niveles de LDH del mismo. Cuando el pH > 7,2, LDH < 1000
U/L y glucosa < 40 mg/dL, el fluido pleural se define como DP
paraneumónico no complicado, y presenta un buen pronóstico médico al
56
Introducción
tratamiento. Cuando el pH < 7, LDH > 1000 U/L y glucosa < 40 mg/dL,
el derrame se define con DP paraneumónico complicado. Estos derrames
de tipo complicado requieren el empleo de un tubo de toracotomía para
su resolución. Cuando el valor del pH se localiza entre 7 y 7,2, la glucosa
sobre 40 mg/dL y el LDH sobre 1000 U/L los pacientes deberían repetir
la toracocentesis, y los análisis de laboratorio deberían realizarse cada
24-48h (Light, 1995).
1.2.3.4. Derrame pleural miscelánea
a)
Las
DP por colagenosis
colagenosis
constituyen
un
grupo
heterogéneo
de
enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmunitario, que
comparten
características
clínicas,
como
la
afectación
articular,
afectación de las membranas serosas y afectación de los vasos
sanguíneos. Desde el punto de vista anatomopatológico, se caracterizan
por lesiones del tejido conectivo como la degeneración fibrinoide, la
formación de granulomas y la fibrosis (Villena-Garrido et al., 2006). Las
dos patologías más comunes en este grupo son el Lupus eritematoso
sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR).
El LES es una enfermedad autoinmune crónica que afecta al tejido
conjuntivo. Se caracteriza por inflamación y daño de tejidos mediado por
el sistema inmunitario de modo específico debido a la unión de
anticuerpos a las células del organismo, y al depósito de complejos
antígeno-anticuerpo. El LES puede afectar a cualquier parte del
organismo, aunque los sitios más frecuentes son el aparato reproductor,
las articulaciones, la piel, los pulmones, los vasos sanguíneos, los
riñones, el hígado (el primer órgano que suele atacar) y el sistema
nervioso. El curso de la enfermedad es impredecible, con periodos de
crisis que alternan con periodos de remisión.
57
Introducción
La AR es una enfermedad autoinmune sistémica, caracterizada
por provocar inflamación crónica, principalmente de articulaciones, que
produce destrucción progresiva, con distintos grados de deformidad, e
incapacidad funcional. En algunas ocasiones, su comportamiento es
extra-articular pudiendo afectar a diversos órganos y sistemas, como los
ojos, pulmones y pleura, corazón y pericardio, piel o vasos sanguíneos.
Aunque el trastorno es de causa desconocida, la autoinmunidad juega
un papel primordial en el progreso de la enfermedad (sobre todo si se
convierte en crónica).
Aproximadamente el 1 % de la población mundial está afectada
por la AR, siendo las mujeres tres veces más propensas a padecerla que
los hombres. La aparición suele ocurrir entre los 40 y 50 años de edad;
sin embargo, puede darse a cualquier edad. La AR puede llegar a ser una
enfermedad
muy
dolorosa
e
incapacitante.
Se
diagnostica
fundamentalmente por los signos y síntomas clínicos, así como con
ciertos exámenes de laboratorio, incluyendo el análisis del factor
reumatoide y las radiografías.
b)
DP por enfermedad cardíaca o vascular
En este grupo incluimos el DP originado por insuficiencia cardíaca
congestiva, el DP tras bypass aortocoronario, el DP y enfermedad
pericárdica, el DP tras lesiones cardíacas (síndrome de Dressler) y el DP
por tromboembolia pulmonar.
El DP por insuficiencia cardíaca congestiva ya se ha descrito en
apartados anteriores debido a que es la causa principal de DP. El DP tras
bypass aortocoronario se da en la primera semana del post-operatorio de
bypass coronario, donde la mayoría de los pacientes (89 %) presentan DP
de pequeño tamaño (Light y Lee, 2008). Muchos de estos pacientes no
tienen ninguna sintomatología, o únicamente cursan con disnea (VillenaGarrido et al., 2006).
58
Introducción
En el caso del DP y la enfermedad pericárdica, más de una cuarta
parte de los pacientes con este tipo de patología desarrollan DP.
Normalmente se trata de trasudados relacionados con un aumento de las
presiones pulmonares y sistémicas, o secundarios a la enfermedad que
origina pericarditis (Tomaselli et al., 1989).
El DP tras lesiones cardíacas (o síndrome de Dressler) se
caracteriza por el inicio con fiebre, pleuropericarditis e infiltrados
pulmonares 3 semanas después de haber sufrido una lesión miocárdica
o pericárdica. Las lesiones tras las que se han descrito son: infarto agudo
de miocardio, cirugía cardíaca (18 - 30 %), traumatismo torácico,
implantación de marcapasos, angioplastia, y punción transtorácica del
ventrículo izquierdo (Kim, Sahn 1996).
Finalmente, en el DP por tromboembolia pulmonar, en su
patogenia está implicado el aumento de la permeabilidad vascular. Los
síntomas clínicos más frecuentes son la disnea y/o el dolor torácico
pleurítico, presentes en más del 70 % de los pacientes (Villena-Garrido et
al., 2006).
c)
DP postquirúrgico
La mayoría de los pacientes sometidos a cirugía abdominal o
cardíaca presentan un DP inmediato en el postoperatorio. Su incidencia
varía entre el 60 y el 80 % según la técnica diagnóstica utilizada, y es
algo menor (35 %) cuando la cirugía se realiza en la zona del abdomen
inferior. Estos derrames suelen ocupar pequeñas porciones del tórax,
además suelen ser asintomáticos, y suelen comenzar en el primer o
segundo día tras la cirugía y desaparecer espontáneamente en un plazo
de 2-4 semanas, aunque en ocasiones se prolonguen en el tiempo (Light
et al., 2003).
59
Introducción
d)
DP por fármacos
Algunos medicamentos son una causa demostrada, aunque no
muy frecuente, de DP. Los mecanismos por los que se produce este
efecto no son conocidos, pese a que se han postulado, entre otros,
reacción de hipersensibilidad y toxicidad directa por vía inflamatoria u
oxidativa.
La lista de medicamentos causantes de DP crece día a día y en la
actualidad
abarca
enfermedades
un
amplio
cardiovasculares,
espectro
de
agentes
antiinflamatorias,
utilizados
en
quimioterápicas,
antibióticas, etc. Entre ellos, los más conocidos son la amiodarona, la
nitrofurantoína, la metisergida, la bromocriptina, y los derivados
ergolínicos (Villena-Garrido et al., 2006).
e)
DP por quilotórax y pseudoquilotórax
El quilotórax se define como la presencia de linfa o quilo en la
cavidad pleural. El quilo puede tener su origen en el tórax (por rotura del
conducto torácico o sus afluentes) o en el abdomen. A diferencia del
pseudoquilotórax, las superficies pleurales en el quilotórax son normales
(Cortés-Télles et al., 2010).
El quilotórax es una enfermedad infrecuente, y según el estudio
realizado a pacientes de forma consecutiva en un servicio médico por
Romero (Romero, 2000), afecta al 3 % de los pacientes con DP. Los
síntomas más frecuentes del quilotórax no traumático en el adulto son
disnea de esfuerzo y sensación de pesadez sobre el hemitórax afectado.
La fiebre y el dolor torácico son raros, debido al efecto poco irritante del
quilo (linfa). Su sospecha se produce generalmente tras la toracocentesis,
por el aspecto del líquido pleural.
60
Introducción
El pseudoquilotórax se produce por una rotura en casos de DP a
largo plazo, y suele ocurrir en pacientes con tuberculosis o AR. El
análisis de lípidos del fluido pleural es importante para distinguir entre
quilotórax y pseudoquilotórax, y debería ser realizado en todas las
muestras de fluido con apariencia lechosa y que, además, presentasen
turbidez tras la centrifugación.
Los quilotórax presentan niveles de triglicéridos > 110 mg/dL, que
contienen también quilomicrones, aunque normalmente no se aprecian
cristales de colesterol. Los pseudoquilotórax presentan niveles de
triglicéridos < 110 md/dL y no contienen quilomicrones, además se
caracterizan por niveles elevados de colesterol (> 200 mg/dL) (Huggins,
2010).
1.2.3.5. Derrame pleural paramaligno
Existe también una clase de DP que se denomina DP paramaligno.
Este tipo de derrame no es el resultado directo de neoplasias
relacionadas con la pleura. Se relacionan con la presencia de un tumor
primario pero, en este caso, el origen del DP no tiene relación con el
tumor y se considera de tipo benigno.
1.2.3.6. Derrame pleural de difícil diagnóstico
Nos referimos bajo este epígrafe a aquellos DP cuya causa es
incierta después de una evaluación inicial que incluya el examen físico
del paciente y el análisis del líquido pleural. Ferrer et al. (Ferrer et al.,
1996) evaluaron, durante una media de 62 meses, a 40 pacientes con
exudado
pleural
considerado
idiopático
después
de
un
análisis
exhaustivo del líquido pleural en todos los casos, y una biopsia pleural a
ciegas en el 87 % de ellos. La mayoría de estos DP se resolvieron
61
Introducción
espontáneamente, aunque en el 25 % de los casos lo hicieron después de
un período prolongado o de varias recidivas. En 32 sujetos (80 %) no se
encontró ninguna causa del DP durante el seguimiento, y sólo en 2 de
ellos (5 %) se descubrió una neoplasia. En ningún caso se diagnosticó
tuberculosis, a pesar de que 19 pacientes, todos con valores pleurales
bajos de ADA, tenían la prueba de la tuberculina positiva. Los resultados
de este estudio muestran que la mayoría de los DP idiopáticos tienen un
curso benigno. No obstante, la toracoscopia estaría indicada en pacientes
con un DP sin diagnóstico que no mejoran espontáneamente, y en los
que consideremos que la neoplasia es una causa probable (Light, 2002).
Existe otra tipología de DP de difícil diagnóstico, que se da en
pacientes que presentan recurrencia de DP tras un seguimiento clínicoradiológico de 1 año de duración, el DP reactivo.
1.2.3.7. Derrame pleural Neoplásico o derrame pleural
maligno
El DP secundario a neoplasias o derrame pleural maligno (DPM) es
la manifestación de una enfermedad neoplásica metastásica en estado
muy
avanzado, por lo que generalmente se relaciona con
una
supervivencia media corta (Sekine et al., 2008), y una elevada tasa de
morbilidad y mortalidad (Khaleeq y Musani, 2008). En la mayoría de los
estudios el cáncer de pulmón ha sido la neoplasia que ha originado este
tipo de patología de un modo más frecuente, apareciendo en un 17 - 56
% de los casos (Sekine et al., 2008). El cáncer de mama es la segunda
patología que ocasiona DP con mayor frecuencia, en un 18 % de los
casos. Los linfomas, incluyendo el linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, son
también causas importantes de DPM. Tumores menos asociados con
DPM son los de ovario, los de origen gastrointestinal y los de tipo
urinario, que representan menos del 5 % (Heffner et al., 2000).
62
Introducción
El diagnóstico certero de malignidad puede conseguirse sólo
mediante la aparición de células tumorales en el líquido, o en muestras
de tejido pleural detectadas mediante una técnica denominada citología.
El rendimiento de la citología varía ampliamente dependiendo de la
extensión del tumor en la cavidad pleural, y de la naturaleza de la
neoplasia primaria. Así, el carcinoma epidermoide, cuyas células están
unidas por abundantes puentes de unión, proporciona un peor
rendimiento de la citología que otros tumores más laxos, como el
microcítico.
Además, los derrames malignos que cursan con pH bajo tienen un
mayor rendimiento de la citología, debido a la estrecha relación entre pH
bajo y extensa afectación tumoral de la pleura (Sahn y Good, 1988).
Cuando un DP se sabe que es secundario a metástasis pleural se
debe plantear la posibilidad de eliminar el espacio pleural mediante la
unión de las capas pleurales, técnica denominada pleurodesis (que
consiste en la inyección de un agente irritante que provoca una reacción
pleural intensa capaz de fusionar las pleuras visceral y parietal) (PorcelPérez, 2002). Los pacientes que se someten a este procedimiento deben
cumplir varios requisitos: en primer lugar el paciente no puede presentar
un mal estado general, o una expectativa de vida muy corta (menos de 1
mes), ya que en estos casos es preferible optar por las toracocentesis
terapéuticas periódicas (Antony et al., 2000). En segundo lugar, la disnea
debe ser un factor limitante de la calidad de vida del paciente. En tercer
lugar, debe mejorar, claramente, la disnea del paciente. Y finalmente, el
pulmón debe estar completamente re-expandido para conseguir una
unión pleural exitosa (Antunes y Neville, 2000).
Una patología especial de la pleura es el mesotelioma pleural, que
es la neoplasia maligna de origen pleural. Se desarrolla principalmente
como consecuencia del contacto con asbestos (mineral de composición y
características semejantes a las del amianto, pero de fibras duras y
63
Introducción
rígidas que pueden compararse con el cristal hilado), de entre 20 a 40
años antes de desarrollar la neoplasia, y en España se asocia en la
mayor parte de los casos con las profesiones relacionadas con la
construcción de casas, barcos, o con otros medios de transporte (LópezAbente et al., 2005) (figura 7).
Figura 7. Imagen de las fibras de asbestos en su estado mineral. Fotografías tomadas en
el Museo de Historia Natural de Londres.
Para su diagnóstico se precisan muestras de biopsia pleural y es
importante diferenciarlo de la hiperplasia mesotelial benigna, y del
adenocarcinoma metastásico de la pleura. Hoy en día, para su
diagnóstico, se emplea un panel de marcadores inmunohistoquímicos
cuya utilización es casi imprescindible. La positividad de calretinina,
HBME-1, mesotelina y citoqueratina 5/6 sugieren mesotelioma, mientras
que el antígeno carcinoembrionario (CEA), B72.3, el antígeno epitelial
humano, MOC 31 o el BG8 sugieren adenocarcinoma metastásico
(Villena-Garrido et al., 2006).
En la tabla 2 aparece un resumen de las etiologías que suelen
presentar los DP.
64
Introducción
Tabla 2. Etiología del DP
1.3.
Características del derrame pleural
1.3.1.
Epidemiología
En el análisis realizado por Marel (Marel, 2002) se demostró que la
incidencia del derrame era del 0.32 % de los pacientes de su hospital, y
que la insuficiencia cardíaca congestiva representaba el 50 % de los
derrames. Además en su estudio se comprobó que la segunda causa más
frecuente que originaba el DP era la malignidad (21,8 %), y la tercera
causa la neumonía (17 %), seguida de la embolia pulmonar (5,6 %). Estos
cuatro diagnósticos representaron, en el estudio de Marel, más del 90 %
de todos los derrames encontrados. Sin embargo, Marel menciona que en
países como España, la tuberculosis es una de las patologías más
65
Introducción
frecuentes, y que los derrames paraneumónicos son frecuentes en países
como Francia, República Checa o Japón. En España, como ejemplo de
país desarrollado, el porcentaje de DPB debido a la presencia de
Mycobacterium tuberculosis es del 23,3 % del total (Villena-Garrido et al.,
2006; Ferrer-Roldán, 2000).
Actualmente, un 30 % de los casos de DP se originan en pacientes
jóvenes que presentan tuberculosis (Evans, 2008). Se sabe que en los
países subdesarrollados la tuberculosis es una de las enfermedades que
desencadenan DPB, y es una de las causas de muerte más importantes.
Y en la población VIH-positiva mundial, puede llegar a observarse hasta
en el 60 % de los pacientes (Evans, 2008). Según datos de la
Organización Mundial de la Salud, 8 millones de nuevos casos de
tuberculosis ocurren cada año en todo el mundo (Pérez-Rodríguez y
Villena-Garrido, 2003).
En lo referente al DPM, una de las características principales es
que es un problema clínico común en pacientes con enfermedades
neoplásicas. Pese a que no hay estudios sobre la epidemiología,
destacamos como ejemplo que la incidencia del DPM en Estados Unidos
está estimada en más de 150.000 casos anuales (Antony, 2003).
A pesar de que el DPM ocurre con todos los tipos histológicos de
cáncer de pulmón, se asocia frecuentemente al adenocarcinoma (PérezRodríguez y Villena-Garrido, 2006; Khaleeq y Musani, 2008). El otro tipo
histológico asociado a DPM, el mesotelioma, tendrá una incidencia que
variará de acuerdo con la localización geográfica (Antony et al., 2000)
sabiendo, además, que un tumor maligno puede causar un DP directa o
indirectamente.
66
Introducción
1.3.2.
Patogénesis del derrame pleural
El DPM se caracteriza por la presencia de células malignas en el
líquido pleural o por su demostración en el tejido pleural, obtenido
mediante el empleo de distintos procedimientos (biopsia percutánea,
toracoscopia, toracotomía, autopsia, etc.) (Antony et al., 2000; Heffner y
Klein, 2008), mientras que el DPB es una complicación asociada con una
variedad de enfermedades locales y sistémicas.
Figura 8. Imagen representativa de la formación de un derrame pleural maligno debido al
crecimiento
de
una
masa
tumoral
en
la
cavidad
pleural,
(tomado
de
http://viryabo.hubpages.com/hub/mesothelioma-victims_and-the-dreaded_asbestosillnesses).
Cuando existe una relación directa del tumor con la pleura esto
puede contribuir a la formación de DPM. Por ejemplo, cabe esperar que
cambios en la inflamación local ocurridos como respuesta a una invasión
tumoral pueden ocasionar un incremento de la permeabilidad capilar,
que derivará como resultado final en un DPM (Antony et al., 2000).
Además, la interferencia con la integridad del sistema linfático en algún
lugar de la pleura parietal y de los nódulos linfáticos mediastinales
67
Introducción
puede resultar en una deformación del fluido linfático (Antony et al.,
2000; Meyer, 1966).
Los estudios postmortem de pacientes afectos de DPM sugieren
que la mayoría de las metástasis pleurales surgen de un émbolo
producido por un tumor en la superficie de la pleura visceral (figura 8), o
por contacto secundario en la pleura parietal (Heffner y Klein, 2008;
Rodríguez-Panadero et al., 1989). Otros posibles mecanismos que
pueden provocar este tipo de metástasis pleurales incluyen invasión
directa del tumor (en cáncer de pulmón, neoplasia de la pared del pecho,
o cáncer de mama), propagación de la hematogénesis a la pleura parietal,
y participación linfática.
En relación a los DPB, la causa más frecuente entre los
trasudados es el fallo cardíaco congestivo, mientras que entre los
exudados son las infecciones, la tuberculosis, y las enfermedades
autoinmunes sistémicas (Salomaa et al., 1998).
Un DPB, sea de la naturaleza que sea, puede ser producido por
lesiones inflamatorias del tejido pleural o subpleural. El rasgo más
importante de la afectación pleural, sobre todo en enfermedades del
tejido conectivo, es el incremento de la permeabilidad capilar. Esta lesión
puede producirse por una infiltración directa de la pleura o por un
mecanismo inmune. Se ha demostrado que, en enfermedades como la AR
o el LES, existen inmunocomplejos circulantes que pueden localizarse en
el tejido pleural o en los capilares pleurales y activar el sistema del
complemento: esto iniciaría un daño en el endotelio, que haría que un
líquido rico en proteínas se acumulase en el intersticio pulmonar o en el
espacio pleural (Halla et al., 1980). Adicionalmente, también se podrían
producir reacciones complejas lideradas por la liberación de distintos
enzimas proteolíticos desde los neutrófilos y citocinas desde los
macrófagos, que no solamente afectarían a la permeabilidad capilar sino
que también podrían ser capaces de modular la migración de los
68
Introducción
fibroblastos, jugando un papel relevante en la extensión de la lesión
pleural (Koster et al., 1971). La severidad y persistencia de la lesión
determinarían si la evolución del DPB es hacia la resolución o hacia la
fibrosis pleural.
En procesos inflamatorios subpleurales localizados, como ocurre
con la neumonía o con el infarto pulmonar, o en enfermedades con un
daño difuso, como el síndrome del diestrés respiratorio agudo, el DP
suele desarrollarse debido a que el líquido extravascular se mueve por un
gradiente de presiones desde el intersticio pulmonar al espacio pleural, a
través del mesotelio (Antony, 2003) (figura 3).
Según Ferrer y Roldan (Ferrer y Roldán, 2000) se pueden producir
acumulaciones del fluido pleural en la cavidad pleural y normalmente
como resultado de los siguientes mecanismos:
- Incremento en la filtración capilar de la pleura, que ocurre en
pacientes con fallo cardíaco derecho o izquierdo. Y, por otro lado,
incremento de la capilaridad pleural y de la permeabilidad del mesotelio
(mecanismo
común
de
derrame
pleural
exudativo
derivado
de
infecciones).
- Disminución del drenaje linfático pleural producido por una
obstrucción a cualquier nivel del sistema linfático pleural.
- Disminución de la presión pleural como consecuencia de la
atelectasia
pulmonar
(disminución
del
volumen
de
la
pleura)
o
paquipleuritis (adhesión de las dos hojas pleurales y engrosamiento de
las mismas debido al desarrollo de tejido conjuntivo fibroso).
- Paso del fluido acumulado a través de pequeñas aberturas en el
diafragma del peritoneo de la cavidad pleural en pacientes con ascitis
(acumulación de líquido en el abdomen).
69
Introducción
1.3.3.
Diagnóstico
Cuando un paciente acude al hospital es importante que se le
realice un estudio clínico para poder establecer un diagnóstico de DP.
Por ejemplo, a la hora de predecir un DPM, factores importantes que
debemos tener en cuenta son: menos de un mes de presencia de los
síntomas, y ausencia de fiebre (Ferrer et al., 2005).
Puesto que se sabe que el DP, en muchas ocasiones, es una
complicación frecuente de las infecciones pulmonares debido a una gran
variedad de microorganismos, las siguientes fases son empleadas
frecuentemente para la distinción de la patología de las infecciones
pleurales:
- Pleura seca. Puesto que es la causa de una extensión de la
infección pulmonar contigua a la pleura. La pleura visceral empieza a
inflamarse, pero no hay acumulación de líquido pleural.
- Fase exudativa. La inflamación pleural ocasiona un incremento
de la permeabilidad de los capilares y como resultado ocasiona una
extravasación
en
la
cavidad
pleural
del
fluido
rico
en
células
inflamatorias, principalmente neutrófilos, proteínas y fibrinógeno.
- Fibropurulenta. En esta fase, que puede desarrollarse muy
despacio si el tratamiento adecuado no se aplica, el fluido pleural es rico
en microorganismos, células polimorfonucleares y detritus celulares. La
fibrina es depositada en la pleura parietal y visceral, y en algunos casos
se puede adherir a la cavidad pleural.
- Organizativa. Esta es la fase final del proceso. Se caracteriza
por la invasión de la fibrina por la red de fibroblastos que se encargan de
depositar colágeno. La pleura está cubierta de una capa rígida de tejido
fibroso. Si no se procesa, el material purulento de la pleura puede drenar
en los espacios bronquiales y causar una fístula broncopleural, o en el
tórax en donde se originará un empiema.
70
Introducción
Actualmente, se han desarrollado numerosas técnicas aplicables
al estudio del fluido pleural, aunque en muchos casos son técnicas muy
agresivas que pueden llegar a ocasionar múltiples transtornos a los
pacientes (Ferrer y Roldán, 2000).
1.3.4.
Metodologías diagnósticas
1.3.4.1. Olor y apariencia del fluido pleural
El test más barato y que probablemente es el realizado con menor
frecuencia es el diagnóstico mediante olor del fluido pleural. El olor que
el fluido presenta puede servirnos para establecer dos diagnósticos de
modo instantáneo (Light, 1997). Si el fluido tiene un olor putrefacto o
fétido, entonces se trata de un empiema pleural, que normalmente está
originado por bacterias anaeróbicas; mientras que si el fluido presenta
un olor a derivados de amonio (orina), el paciente probablemente padece
de urinotórax (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2003).
Pero no solo el olor debe ser una característica a apreciar, sino
que la apariencia también debe ser considerada a la hora de establecer
un diagnóstico rápido. Si un fluido pleural presenta una apariencia
ensangrentada, se debe realizar un hematocrito del fluido para saber si
es mucho mayor de lo esperado en un fluido normal. Si se diese esta
situación, el paciente presentaría un hemotórax. Aunque, en ocasiones,
la presencia de sangre en el líquido pleural también es indicativo de estos
tres diagnósticos: malignidad, embolia pulmonar o trauma (PérezRodríguez y Villena-Garrido, 2003).
En el caso de que el fluido pleural aparezca turbio o lechoso, se
debe examinar el sobrenadante que se obtiene tras la centrifugación. Si
el fluido pleural esta turbio antes de centrifugar, pero una vez
centrifugado aparece claro, entonces la turbidez es debida a las células o
71
Introducción
detritus presentes en este fluido. Pero si la turbidez persiste a pesar de
haber centrifugado, entonces se debe a un elevado contenido lipídico en
el líquido pleural. Ante esta situación, los pacientes presentarán un
quilotórax o pseudoquilotorax.
1.3.4.2. Contaje diferencial de células del fluido pleural
El contaje diferencial de células es útil para la determinación de la
etiología del fluido pleural. Cuando existe predominancia de células
polimorfonucleares, los pacientes son diagnosticados como derrames
paraneumónicos, embolia pulmonar o carcinoma broncogénico (Porcel,
2011). Sin embargo, cuando las células mononucleares predominan en
este fluido, estos pacientes presentan un proceso crónico en el que la
pleura está implicada, como ocurre con la enfermedad maligna, la
tuberculosis, la embolia pulmonar, y la pleuritis viral. Además, la
localización de pequeñas cantidades de células mesoteliales en el fluido
pleural será indicativo de DP de tipo tuberculoso (Hurwitz et al., 1980).
Otra de las características de la diferenciación celular puede ser la
aparición, de modo predominante, de pequeñas cantidades de linfocitos
en el fluido pleural, característica común de los derrames de tipo
tuberculoso o de DPM (Light et al., 1973).
Finalmente, la existencia de más de un 10 % de eosinófilos en el
fluido pleural será indicativo de la presencia de aire o sangre en el
espacio pleural (Porcel, 2011) y, por consiguiente, del diagnóstico posible
de neumo- o hemotórax.
1.3.4.3. Citología del fluido pleural
Ante la presencia de malignidad de los pacientes, la posibilidad de
realizar una citología del fluido nos permitirá obtener un diagnóstico
72
Introducción
rápido, eficiente y no invasivo. Sin embargo el porcentaje de DPM
diagnosticado mediante citología se sitúa entre un 40 - 87 % (Maskell y
Butland, 2003; Aleman et al., 2007; Heffner, 2008), existiendo algunos
factores que pueden influir en el diagnóstico mediante citología. Uno de
estos factores es el tipo de tumor que presenta el paciente; puesto que la
frecuencia de la citología resulta dependiente del tipo de tumor, el
rendimiento de esta metodología es mucho peor cuando se trata del
diagnóstico de carcinomas celulares de tipo escamoso, enfermedad de
Hodgkin, o sarcomas (Light, 2002). Aunque, obviamente, existirá cierta
dependencia del rendimiento del método con la habilidad del citólogo que
lo está realizando.
A)
B)
Figura 9. A) Célula mesotelial reactiva en un líquido pleural de un paciente que
presentaba neumonía neumocónica. B) Imagen obtenida tras la citología de un paciente
que presentaba células malignas (neoplasia de ovario) en un líquido pleural. Obtenido de
http://www.anamerino.com/educacional.html
Al hablar de diagnóstico de malignidad por citología sabemos que
la sensibilidad de este método diagnóstico varia, según diferentes
autores, entre un 39 % y un 80 % (Bueno et al., 1990; Nance et al.,
1991; Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2003). Los falsos positivos son
muy escasos, y en la mayoría de las series inexistentes. La citología
pleural normalmente presenta una sensibilidad mayor para la afectación
neoplásica que la biopsia pleural (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido,
2003), pero mejora cuando se realiza el diagnóstico mediante ambas
técnicas (Emad y Rezaian, 1998).
73
Introducción
Un 60 % de los casos de derrames carcinomatosos pueden ser
diagnosticados de DPM mediante esta técnica pero, en el caso de los
mesoteliomas, solo de un 20 a un 30 % de los casos son diagnosticados
correctamente (Fouradarakis, 2008). Resultados positivos en la citología
estándar nos pueden servir para diferenciar entre adenocarcinomas
pleurales y mesoteliomas, o entre mesoteliomas y linfomas (y linfocitosis
reactivos) sin necesidad de realizar otros estudios especiales (Heffner,
2008) (figura 9).
El rendimiento diagnóstico de esta técnica es dependiente además
de factores como la extensión de la patología, o la naturaleza del tumor
primario (Antony et al., 2001), como ya hemos comentado anteriormente.
Además,
es
importante
destacar
que
el
empleo
de
marcadores
inmunohistoquímicos epiteliales y glandulares puede ayudar a confirmar
la malignidad epitelial y a diferenciar mesoteliomas de adenocarcinomas
aunque, normalmente, para la obtención de estos resultados se hace
necesario el empleo de metodologías más agresivas (Johnston, 1985),
como son las biopsias.
1.3.4.4. Cultivo del fluido pleural
Las muestras obtenidas de pacientes diagnosticados como DP de
tipo exudado y con características de probable DP paraneumónico deben
ser teñidas mediante la tinción Gram positiva y cultivadas para el
diagnóstico
de
bacterias
(tanto
aerobias
como
anaerobias),
micobacterias, y hongos (Porcel, 2011). De manera rutinaria se deben
oler para ver si existe presencia de bacterias de tipo anaerobio como ya
se ha mencionado en el caso de los empiemas.
Entre los microorganismos que pueden infectar al pulmón se
incluyen bacterias, gérmenes atípicos, parásitos, hongos y protozoos, que
pueden ocasionar DP paraneumónico. De hecho, en el caso de las
74
Introducción
neumonías el 40 % de los casos son originadas por patologías
bacterianas
(Tayle
et
al.,
1978;
Reynolds
et
al.,
2010).
Los
microorganismos más implicados son Mycoplasma pneumoniae y, en el
caso de los virus, adenovirus y el virus influenza. Los síntomas clínicos
más comunes que ocasionan, y que son indicativos de neumonía atípica,
serán episodios de fiebre, dolor de cabeza, dolor de garganta y
artromialgias (dolores musculares y de las articulaciones). Se pueden
establecer diagnósticos basados en el cultivo de muestras respiratorias o
el incremento de la titulación de anticuerpos específicos en dos
determinaciones separadas al menos 15 días. Una alta titulación
sugeriría un diagnóstico de Mycoplasma sp.
Normalmente
los
pacientes
con
empiema
muestran
una
sintomatología parecida a los pacientes con DP paraneumónico; sin
embargo, en los empiemas se da una acumulación pleural de pus. Este
es el motivo por el que suelen realizarse cultivos de bacterias Gram
positivas o cultivos del fluido pleural para otros microorganismos que
pueden ocasionar también esta patología. Sin embargo, y como ya se ha
dicho anteriormente, la causa más frecuente son las bacterias y estudios
recientes han descrito que las que con mayor frecuencia ocasionan esta
patología son Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y
Hemophilus influenzae (Grijalva et al., 2011).
1.3.4.5.
Niveles de marcadores bioquímicos en el
fluido pleural
a) Adenosina desaminasa (ADA)
El poder medir los niveles de ADA en el fluido pleural resulta muy
útil en el diagnóstico de pacientes con tuberculosis puesto que en estos
se da un incremento de la concentración de este marcador, mayor al
obtenido en otros exudados pleurales. Sin embargo hay otras dos
75
Introducción
enfermedades que presentan elevados niveles de ADA, el empiema y la
pleuritis reumatoide, aunque ambas son fáciles de distinguir de la
tuberculosis pleural por el cuadro clínico que presentan.
b) Glucosa
La medida de los niveles de glucosa del fluido pleural resulta útil
puesto que niveles bajos de este marcador (< 60 mg/dL) indican la
presencia de alguno de estos cuatro desórdenes en el paciente:
tuberculosis,
patología
maligna,
patología
reumatoide,
o
derrame
paraneumónico complicado (Light, 1997). Además, una medida de la
concentración de proteínas, glucosa, y LDH en el fluido pleural puede ser
útil en la determinación de la naturaleza de los procesos inflamatorios
(Utine et al., 2005).
c) Amilasa
La medición de los niveles de amilasa en el fluido pleural es
indicativo
de
enfermedad
de
tipo
pancreático,
adenocarcinoma
metastásico o perforación esofágica. Los niveles de amilasa del fluido
pleural se elevan en aproximadamente el 10 % de los pacientes con DP
maligno, y cuando el tumor primario no se localiza en el páncreas (HaroEstarriol et al., 2007). Además, puesto que esta enzima presenta
diferentes isoformas con diferentes actividades, observar el patrón
isoenzimático de la amilasa pleural puede servirnos para diferenciar la
patología maligna de la enfermedad pancreática (Branca et al., 2001;
Segura, 2004).
Entre las diferentes afectaciones pancreáticas tenemos los DP
originados
por
pancreatitis
aguda,
debidos
probablemente
a
la
inflamación originada por esta patología, y los derrames originados por
enfermedades
pancreáticas
crónicas,
que
se
presentan
con
76
una
Introducción
extensión que se forma en el páncreas, pasa por el diafragma (dentro del
mediastino) y finalmente termina en el espacio pleural (Villena et al.,
2002).
d) Lactato deshidrogenasa (LDH)
Pese a que los niveles de LDH del fluido pleural se emplean en la
caracterización de los dos tipos de derrame (criterios de Light), no
resultan de gran utilidad para la separación de diferentes DP de tipo
exudado (Vavetsi et al., 2009). Sin embargo, es recomendable la
cuantificación de los niveles de esta proteína una vez realizada la
toracocentesis, puesto que los niveles de LDH son indicativos del grado
de inflamación pleural (Light, 1997).
e) Marcadores tumorales de uso establecido en clínica
En ocasiones, se utilizan en el diagnóstico clínico marcadores
tumorales como el CEA, el antígeno carbohidrato (CA) 15-3, los
fragmentos de la citoqueratina 19 (CYFRA 21-1), y el CA-125 medidos
mediante
electroquimioluminiscencia
o
enzimo-inmunoensayos.
Sin
embargo, y como ninguno de estos marcadores tiene suficiente potencia
diagnóstica
en
la
práctica
clínica
diaria,
se
hace
necesaria
la
combinación de varios marcadores y varias técnicas para certificar el
diagnóstico de cada uno de los pacientes (Heffner, 2008).
1.3.4.6. Biopsia
pleural
mediante
aguja
o
biopsia
transparietal
Cuando la citología pleural no es capaz de diagnosticar a los
pacientes con DPM, la técnica recomendada es la biopsia pleural. Esta
suele realizarse tras la aspiración inicial, y se considera la clave del
77
Introducción
diagnóstico. En general, la biopsia pleural es un método común de
obtención
de
tejido
pleural
para
su
examen
histológico
y/o
microbiológico. Es una técnica sencilla, que no precisa ser realizada en
quirófano, se puede hacer de forma ambulatoria y tiene una morbilidad
muy baja. Sin embargo debe realizarse por un especialista (PérezRodríguez y Villena-Garrido, 2003; Poe et al., 1994). Las patologías que
suelen diagnosticarse con mayor frecuencia mediante biopsia pleural son
el carcinoma y la tuberculosis pleural (Llorente-Fernández et al., 1984).
La biopsia pleural o transparietal fue descrita en 1955, y desde
entonces se han empleado diferentes tipos de agujas para su realización,
que fueron modificándose a lo largo del tiempo introduciendo mejoras
técnicas como las Vim Silverman (DeFrancis et al., 1955), las Abram
(Abrams, 1958), las Cope (Cope, 1958), las Raja (Ogirala et al., 1993), etc.
Actualmente, la técnica que se emplea es la biopsia computarizada
mediante tomografía guiada, puesto que ha demostrado que presenta
una sensibilidad del 87 % cuando la comparamos con la biopsia por
aguja de Abram, que presenta una sensibilidad del 47 % (Kolditz et al.,
2006).
Al hablar de diagnóstico de malignidad por citología sabemos que
la sensibilidad de este método diagnóstico varia, según diferentes
autores, entre un 39 % y un 80 % (Bueno et al., 1990; Nance et al., 1991;
Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2003). Los falsos positivos son muy
escasos, y en la mayoría de las series inexistentes.
Otros factores como el volumen del tejido pleural obtenido (Light,
1997), el número de veces que se realiza la biopsia pleural (Chang et al.,
1991) y la obtención o no de técnicas de imagen (Pérez-Rodríguez y
Villena-Garrido,
2003),
determinarán
el
éxito
en
el
diagnóstico
patológico. De hecho, según diversos autores, el empleo de técnicas de
imagen en la biopsia, junto con el análisis citológico, permite aumentar
la rentabilidad diagnóstica, situándose el diagnóstico patológico entre un
78
Introducción
86 y un 93 % (Adams y Gleeson, 2001; Adams et al., 2001; PiquerasOlmeda et al., 1999).
La obtención de tejido tumoral supone una ventaja respeto a la
citología, no solo en la diferenciación entre tejido inflamado y tumoral,
sino también a la hora de clasificar las células malignas, lo que será
importante
para
la
aplicación
de
un
tratamiento
correcto.
La
diferenciación de los linfomas, las metástasis de cáncer de ovario, y el
carcinoma pulmonar de células pequeñas, son algunas de las patologías
que se pueden diagnosticar al obtener este tejido tumoral (Screaton y
Flower, 2000).
Sin embargo, al tratarse de una técnica invasiva puede tener
efectos secundarios, de entre los que podríamos destacar la aparición de
pneumotórax, que se da en el 8 % de los pacientes a los que se le realiza,
en otras ocasiones también se produce pérdida de sangre intrapleural,
infección o fístula cutánea, debido a un mal uso de la técnica (Ferrer y
Roldán, 2000).
En algunos pacientes, la biopsia pleural con aguja solo detecta
inflamación no específica o ausencia de patología y por ello, si el DP
persiste
o
empeora,
debería
considerarse
la
realización
de
una
toracoscopia.
1.3.4.7. Toracocentesis
La toracocentesis es la extracción de líquido pleural con fines
diagnósticos o terapéuticos. Es una técnica sencilla, rápida, con alto
rendimiento diagnóstico y escasas complicaciones, que pueden evitarse
con pre-medicación y un buen uso de las técnicas diagnósticas por parte
de los clínicos.
79
Introducción
Es la primera exploración que se realiza ante una sospecha clínica
de derrame pleural, después de obtener radiografías de tórax en
proyección postero-anterior y lateral que nos confirmen la existencia del
mismo (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2003).
El fluido pleural se analiza normalmente mediante toracocentesis
salvo cuando se sospecha de derrame secundario a una enfermedad
subyacente (como el fallo cardíaco). La incidencia de enfermedades
asociadas a la toracocentesis es baja cuando se realiza por una persona
experimentada, aunque para la realización de la técnica es necesario que
esta persona se guíe mediante ultrasonidos (Villena-Garrido et al., 2006).
Las complicaciones comunes de esta metodología son la reacción vagal
(10 - 14 %) y el neumotórax (3 - 8 %).
Cuando se sospecha de la existencia de sangre (ej. hemotórax) o
pus (ej. empiema) en el espacio pleural, debería realizarse con urgencia
esta técnica. (Jones et al., 2003). En el caso de la aparición de células
malignas, microorganismos, o cuando los DP trasudativos sean debidos a
fallo cardíaco, el análisis del fluido pleural revelará información
diagnóstica evaluable y nos servirá para establecer un diagnóstico de la
causa del DP (Froudarakis, 2008; Porcel et al., 2004).
Pese a que la toracocentesis es la prueba que se suele realizar
para obtener un buen diagnóstico, la integración de otras variables
clínicas, antecedentes, exploración física, pruebas analíticas básicas y
las relacionadas con la sospecha clínica, permitirán elaborar un
diagnóstico pre-toracentesis, y así poder solicitar los estudios pertinentes
(Villena-Garrido et al., 2006).
1.3.4.8. Broncoscopia
La broncoscopia es efectiva para el diagnóstico de pacientes con
DP que tienen indicaciones específicas para esta técnica, como la
80
Introducción
hemoptisis, atelectasia o lesiones radiológicas pulmonares sospechosas
de malignidad (Sulu et al., 2011).
En pacientes con derrame idiopático y ningún otro tipo de
alteraciones, la broncoscopia ayuda a establecer un diagnóstico correcto
(Macori et al., 1998).
1.3.4.9. Toracoscopia
La
toracoscopia
(también
denominada
pleuroscopia)
puede
realizarse bajo anestesia general, comúnmente denominada toracoscopia
video-asistida, o usando la sedación o anestesia local. La toracoscopia
nos permite visualizar la cavidad pleural y no solo abastece de la
colección de imágenes de biopsias de la pleura visceral y parietal, sino
también del pulmón. El diagnóstico por toracoscopia en los derrames de
etiología no conocida es de alrededor del 90 % (Schnyder y Tschopp,
2011). Además, la toracoscopia médica da información sobre el
pronóstico de pacientes que presentan adhesiones, frente a aquellos
cuyas
adhesiones
no
son
bastante
visuales,
y
cuya
media
de
supervivencia es menor (Bielsa et al., 2008) (figura 10).
Figura 10. Esquema de toracoscopia (a) e imagen quirúrgica de una toracoscopia (b).
Imágenes tomadas de Molina et al., 2003.
81
Introducción
En las últimas décadas, con la aparición de la cirugía vídeoasistida por toracoscopia, se ha renovado el interés en el empleo de la
toracoscopia para el diagnóstico del DP (Light, 1997).
1.3.4.10.
Técnicas radiológicas
La formación de imágenes es esencial para confirmar la presencia
de DP (Mishra y Davies, 2010). Puesto que los DP pueden ser de
distribución libre o loculados, de localización típica o atípica, y de
cantidad de fluido pleural variable, será necesario el empleo de diferentes
metodologías radiológicas para su clasificación (Villena-Garrido et al.,
2006).
Una radiografía pectoral era la técnica de imagen inicial que se
solía realizar en aquellos pacientes que presentaban síntomas que
sugerían DP, aunque en la actualidad la ultrasonografía torácica
aumentó su importancia en la investigación y en el manejo del DP. Esta
metodología no sólo es más sensible para la detección del DP que la
radiografía pectoral, sino que permite distinguir entre la cantidad de
fluido y el espesamiento del mismo, y sirve de guía para el drenaje
durante la biopsia pleural, particularmente si el derrame es pequeño o
loculado (Maskell y Butland, 2003).
Dentro de las técnicas radiológicas más comunes tenemos la
ecografía torácica, la tomografía axial computarizada o la resonancia
magnética nuclear. La primera de ellas, o ecografía torácica, es un
procedimiento no invasivo y de fácil realización, siendo de gran utilidad
no sólo en la determinación del derrame, sino también en su utilización
como guía para la realización de una toracocentesis diagnóstica o
terapéutica. De entre las desventajas que presenta esta técnica, la más
destacada es la incapacidad para la identificación de la patología que
presenta el paciente, y la variabilidad en su resultado en función del
82
Introducción
personal cualificado que la realice (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido,
2003).
Mediante el empleo de la segunda de las técnicas, la tomografía
axial computarizada, somos capaces de detectar pequeñas cantidades de
líquido y podemos caracterizar la localización y disposición del derrame.
De entre las características generales que presenta esta técnica las
principales son el poder diferenciar la patología pleural de la pulmonar,
poder determinar las características de la patología subyacente, definir el
derrame como libre o loculado, servir como guía terapéutica, identificar
la colocación de tubos de drenaje, y detectar las complicaciones de los
derrames (Pugatch et al., 1978).
La última de ellas, resonancia magnética nuclear, presenta un
limitado papel en el diagnóstico del DP, aun teniendo una resolución
ligeramente superior a la de la tomografía axial computarizada en la
caracterización del líquido (figura 11).
Una característica importante es que las patologías con presencia
de acumulo de líquido, y los exudados complicados, presentan mayor
intensidad de señal y son más brillantes que los trasudados (McLoud y
Flower, 1991).
A)
Figura
B)
11.
RMN.
A)
Exploración
normal
del
tórax
(obtenido
de
http://www.zambon.es/servicios/atlas/fichas/3106.htm) B) Placas pleurales (PérezRodríguez y Villena-Garrido, 2003).
83
Introducción
Una técnica útil para el diagnóstico rápido del DPM son los
ultrasonidos. Se ha visto que son capaces de distinguir los DPM de otras
causas de DP, con una sensibilidad del 73 % y una especificidad del 100
% (Qureshi et al., 2009).
Pero hoy en día, una de las formas más precisas de obtener
imágenes de los seres humanos es gracias al empleo de radioisótopos,
mediante la tecnología denominada PET (por sus siglas en inglés position
emision tomography). Esta técnica permite el estudio de la fisiología y la
bioquímica del tejido, los efectos funcionales que las drogas presentan
sobre los mismos (farmacodinámica), y la farmacocinética de estos
tejidos. Además, este método proporciona herramientas para la medicina
experimental puesto que permite investigar la biología de tejidos
enfermos y permite obtener resultados de los mecanismos de acción, los
efectos y la eficacia de las terapias, traduciendo estos resultados a la
práctica clínica (Jones y Price, 2012).
1.3.4.11.
Análisis inmunológicos
Cuando se sospecha de colagenosis como causa del DP, debería
realizarse análisis del complemento en el fluido pleural, o de anticuerpos
anti-nucleares y del factor reumatoide. Un fluido pleural con una ratio
del factor reumatoide del fluido pleural/suero > 1 puede confirmar el
diagnóstico de un derrame de tipo reumatoide en pacientes con síntomas
de la enfermedad (Halla et al., 1980). Pacientes con DPB causado por
enfermedades sistémicas como el LES normalmente presentan una ratio
en anticuerpos anti-nucleares del fluido pleural/suero > 1 (Porcel, 2011).
Los niveles del complemento en el fluido pleural son menores en ambos
DPB, tanto en el reumatoide como en LES.
El 3 % de los pacientes con AR presentan DPB. La mayoría son
varones de edad avanzada y con un largo registro de AR sintomática, que
84
Introducción
generalmente presentan un derrame mínimo o moderado, y de carácter
unilateral (Walker y Wright, 1967). El diagnóstico de estos pacientes se
basa en el reconocimiento de la enfermedad reumática y en la exclusión
de otras causas. En los pacientes que presentan patologías de tipo
reumático debemos tener un mayor cuidado a la hora de manipular la
cavidad pleural puesto que tienen un alto riesgo de infección. En la
mayoría de los casos el derrame se resuelve de modo espontáneo; sin
embargo, puede llegar a desarrollarse fibrosis pleural.
1.3.4.12.
Fármacos
En algunos casos, los DP secundarios a fármacos están asociados
con el metotrexato, el dantroleno, el matisegido y otros fármacos
dopaminérgicos,
como la amiodarona y la nitrofurantoína entre otros
(Morelock y Sahn, 1999). Estos datos no son fiables para el diagnóstico
de los pacientes, por lo que deben tenerse en cuenta otras posibles
causas para estar seguros de la retirada de la terapia.
1.3.5.
Pronóstico
En la mejora del pronóstico se evalúa la calidad de vida de los
pacientes atendiendo a los síntomas relacionados con el diagnóstico de
su derrame. Un primer objetivo es obtener un alivio en la disnea
minimizando el malestar. Además se tendría que limitar el tiempo de
hospitalización, sobre todo en los pacientes que presentan una
supervivencia mínima. El alivio del dolor es otro de los factores a tener en
cuenta para mejorar la calidad de vida de los pacientes. Esto es cierto
sobre todo en pacientes afectos de mesotelioma, cuya queja principal es
normalmente dolor en lugar de disnea.
85
Introducción
Y aunque el DP en asociación con cáncer tiene un pobre
pronóstico y una supervivencia media menor de un año, si se trata con
tiempo los pacientes pueden llegar a mejorar bastante tanto su
pronóstico como su supervivencia (Livingston et al., 1982).
1.3.6.
Tratamiento
Los principales objetivos en el tratamiento de los DPM son el
control de los síntomas y la mejora de la calidad de vida de los pacientes.
Los pacientes con derrame asintomático no requieren una intervención
para comprobar cómo mejoran con el tiempo. Sin embargo, la mayoría de
los pacientes bajo observación necesitan la realización de continuas
aspiraciones pleurales para calmar la dificultad de la respiración y, en el
70 - 90 % de ellos, cuando ocurre una acumulación de fluido se requiere
del empleo de un método de drenaje pleural para la eliminación del
mismo (Mishra y Davies, 2010).
Las tres estrategias que se suelen emplear para el tratamiento de
los DPM recurrentes son la extracción del derrame pleural, la
obstrucción del espacio pleural para evitar la reacumulación o la no
formación de fluido, y posteriormente la quimioterapia. La quimioterapia
sistémica es el tratamiento elegido en el cáncer de pulmón no microcítico
(CPNM), donde el DP, con frecuencia, se resuelve sin la necesidad de un
tratamiento local (Khaleeq y Musani, 2008).
Para prevenir la recurrencia de DP sintomático suele llevarse a
cabo la técnica denominada pleurodesis. Esta técnica se realiza
inyectando
una
substancia
irritante
en
el
espacio
pleural.
Con
aproximadamente el 75 % de los agentes empleados parece confirmarse
que son efectivos al cabo de 30 días de haberse inyectado (Haddad et al.,
2004). Es necesario saber que la pleurodesis sólo está indicada cuando
86
Introducción
la quimioterapia no se aconseja, o cuando no es efectiva (Bouros et al.,
2000).
El tratamiento habitual de pacientes con derrame paraneumónico
o empiema es a base de antibióticos. Normalmente se trata de
antibióticos de amplio espectro, que cubren tanto a microorganismos
anaeróbicos como aeróbicos; sin embargo es conveniente ajustar la
terapia de acuerdo con los resultados microbiológicos. Si el fluido pleural
cumple con los criterios de empiema, antes de comenzar con el
tratamiento se debería colocar un tubo de drenaje para la extracción de
fluido purulento. La extracción de este fluido por toracocentesis se
recomendará solo cuando la cantidad de fluido sea muy pequeña. En el
caso
de
que
los
principios
clínicos
sugieran
que
el
derrame
paraneumónico es secundario a una infección por Mycoplasma sp. se
debería administrar eritromicina (500 mg/6 h) o claritromicina (500
mg/12 h) de forma oral durante 15 días.
Pacientes con tuberculosis pleural recibirán el mismo tratamiento
que pacientes con tuberculosis pulmonar. Éste consiste en un régimen
durante 6 meses de una primera fase con isoniacida (5 - 10 mg/kg,
máximo
450
mg),
rifampicina
(10
mg/kg,
máximo
900
mg)
y
piracinamida (30 - 35 mg/kg, máximo 2.500 mg), administrados de modo
oral durante aproximadamente 2 meses; y una segunda fase con las
mismas dosis de isoniacida y rifampicina durante los siguientes 4 meses.
1.3.7.
Direcciones futuras para la investigación
Lo primordial en toda investigación futura, dada la cantidad de
resultados que existen a día de hoy realizados por toda la comunidad
científica, es la uniformización de los resultados obtenidos en DP por
diversos investigadores para así poder enfocar los futuros estudios hacia
vías únicas. Además, es necesario una mejoría de la situación que sufren
87
Introducción
los pacientes a largo plazo, sobre todo en cuanto a los síntomas
asociados con el derrame, como son la presencia de acumulación de
fluido pleural, o el sometimiento del paciente a radiografías torácicas
hasta el fallecimiento del mismo, situación que se da sobre todo en las
patologías malignas.
Además se pretende disminuir los problemas que ocasiona la
disnea, y que son originados entre otras causas por la acumulación
parcial de fluido (menor del 50 % de la evidencia radiográfica inicial).
Intentando el diagnóstico sin necesidad del empleo de metodologías
invasivas (Antony et al., 2000).
1.4.
Marcadores de diagnóstico de derrame
pleural
Con frecuencia, establecer un diagnóstico del DP es un problema
en la práctica clínica, como hemos visto en apartados anteriores,
especialmente en términos de diferenciación entre patologías malignas y
benignas, debido a las diferentes características existentes en el
tratamiento que se debería llevar a cabo, y en el pronóstico que ambas
debían presentar (Wagner et al., 2007).
La malignidad es una de las causas principales del DP de tipo
exudado, y más de un 90 % de los DPM son debidos a enfermedad de
tipo metastásico. El carcinoma de cualquier órgano puede metastatizar la
pleura, aunque los más frecuentes son el carcinoma pulmonar, el de
mama y el linfoma; menos frecuentes son los carcinomas digestivos y de
ovario. Es importante saber la etiología que presenta el derrame para
poder diferenciar entre DPM y DPB.
El diagnóstico citopatológico del fluido pleural es el método
diagnóstico más empleado en la identificación del DPM, y presenta una
88
Introducción
sensibilidad de aproximadamente el 60 %, que puede aumentar un 30 %
con ayuda de la biopsia pleural por aguja (Romero et al., 1996). Debido a
la baja sensibilidad del método, los resultados pueden llegar a ser
fallidos en cuanto a la identificación de la malignidad, y por ello se hacen
necesarios procesos más invasivos como la biopsia (Antony et al., 2000).
Uno de los aspectos en los que se centra la investigación sobre el
diagnóstico del DP es la búsqueda de nuevos marcadores, y en particular
marcadores de DPM, que puedan ser utilizados como método no invasivo
para complementar y mejorar la capacidad diagnóstica de las técnicas
antes mencionadas (Pérez-Rodríguez y Villena-Garrido, 2003).
En el siguiente apartado hablaremos de los distintos marcadores
conocidos a día de hoy. Hablaremos en primer lugar de marcadores que
se emplean en la práctica clínica diaria, a pesar de que están
especializados en el diagnóstico de una tipología específica de cáncer y
no del DPM. Posteriormente hablaremos de otros marcadores que están
en estudio y que, a pesar de que se ha visto que son relativamente
específicos para el DPM, todavía no se emplean en la práctica clínica
debido a las controversias que hay entre los resultados clínicos obtenidos
por los diferentes investigadores.
1.4.1.
Marcadores usados en clínica
En el intento de mejorar la identificación de los casos de
malignidad, varios estudios han comentado la utilidad de los marcadores
tumorales biológicos (Buccheri y Ferrigno, 2001; Miedouge et al., 1999;
Sancho,
2000).
Los
marcadores
tumorales
son
macromoléculas
producidas por las células neoplásicas, en las que su producción se ve
incrementada o disminuida en presencia de neoplasias (Wagner et al.,
2007). Además, estos marcadores pueden ser detectados en varios
89
Introducción
especímenes biológicos como la sangre, líquido seroso, y muestras de
tejido (Sancho, 2000).
Los marcadores presentan diferente sensibilidad y especificidad de
acuerdo a los tipos histológicos del tumor primario. El CEA es el
marcador más común y por ello ha sido estudiado extensamente. Este
marcador además presenta significación diagnóstica en pacientes con
patologías malignas (Liang et al., 2008). CEA es una glicoproteína que
compone el glucocálix del epitelio endodérmico, y que está presente en
altos niveles en una gran variedad de tumores. Fue descrito por Gold y
Freedman (Gold y Freedman, 1965) a partir de un homogeneizado de
cáncer colorrectal humano, y recibió su nombre debido a que también se
aisló de células mucosas del intestino en su estadio fetal. Posteriormente
se comprobó que también se localiza en tejidos adultos normales
(intestino, pulmón, páncreas, bazo, etc.), así como en numerosas
secreciones (salival, gástrica, biliar) y líquidos de lavado colónico y
aspirado bronquial. Se consideran niveles anormales de concentración de
CEA sérico valores superiores a 5 ng/mL (Bast et al., 2001), aunque en
individuos sanos pertenecientes a los grupos de riesgo de alcohólicos y
fumadores este valor se incrementa hasta 10 ng/mL. Su baja
sensibilidad en el diagnóstico de estadios tempranos, junto con su baja
especificidad, hacen que su utilidad se limite principalmente al ámbito
del pronóstico (Bast et al., 2001) y de la monitorización.
Se ha sugerido que los descensos en el drenaje linfático de la
pleura, causados por una obstrucción de los vasos linfáticos debidos a
células malignas, y a invasión pleural, pueden incrementar los niveles de
CEA en el fluido pleural (Ferrer et al., 1999; Smith et al., 2002). Lee et al.
(Lee y Chang, 2005) sugieren que CEA tiene una función en el
diagnóstico del DPM, y que su sensibilidad y especificidad es del 68 % y
93 %, respectivamente. Sin embargo esa sensibilidad no concuerda con
la encontrada en otros estudios (29 %), en los que no aconsejan el
empleo del marcador (Porcel et al., 2004).
90
Introducción
Otros marcadores, como por ejemplo el CYFRA 21-1, presentan
buena sensibilidad para CPNM, especialmente el subtipo escamoso
(Dejsomritrutai et al., 2001), aunque se sabe que esta molécula se
expresa en todos los subtipos histológicos del cáncer de pulmón (Lai et
al., 1999).
Altos niveles de CYFRA 21-1 en el derrame pueden ser debidos a
un drenaje linfático del tumor. Puesto que el 50 % de los DPM son
derivados del cáncer de pulmón, algunos expertos sugieren que CYFRA
21-1 podría ser un marcador tumoral prometedor en este sentido
(Dejsomritrutai et al., 2001; Paganuzzi et al., 2001). Sin embargo, como
ocurre con CEA, CYFRA 21-1 parece presentar diferentes funciones
según los estudios realizados. Porcel et al. (Porcel et al., 2005) han
demostrado, en su estudio con 416 pacientes, una sensibilidad de
CYFRA 21-1 del 22 % cuando la especificidad es del 100 %, por lo que el
marcador no se considera demasiado bueno en el establecimiento del
diagnostico de malignidad en los pacientes.
CA 15-3 es un marcador que aparentemente presenta elevada
especificidad para el cáncer de mama, pero no es evaluado de modo
extenso en el diagnóstico diferencial del DPM como ocurre con el CEA.
Algunos estudios han demostrado incrementos de los niveles de CA 15-3
en DPM, con una sensibilidad del 38 al 55 % y una especificidad del 97
al 100 % (Romero et al., 1996; Shimokata et al., 1988; Villena et al.,
1996).
La sensibilidad del CA 19-9 medido en el fluido es baja (24 %) pese
a que presenta una alta especificidad (100 %) a la hora de distinguir
DPM de DPB (Mezger et al., 1988). Shimokata et al. (Shimokata et al.,
1988) compararon los niveles de CA 19-9 entre pacientes con DPM y
pacientes con derrame tuberculoso, encontrando sensibilidades y
especificidades del orden de 65 y 95 %, respectivamente. Alatas et al.
(Alatas et al., 2001) detectaron que la sensibilidad y especificidad del CA
91
Introducción
19-9 en el diagnóstico diferencial de los DPM y DPB era más baja que la
obtenida en el estudio hecho por Shimokata et al. (del 36 y 83 %
respectivamente) (Shimokata et al., 1988).
Se sabe, gracias a los estudios inmunoquímicos, que el CA-125 se
relaciona con la pleura y el peritoneo (Kuralay et al., 2000). Lindgren et
al. (Lindgren et al., 1988) observaron que los niveles de CA-125 fueron
significativamente mayores en DPM secundario a adenocarcinoma
pulmonar y mesoteliomas que los vistos en derrames benignos. Además,
se ha observado también que concentraciones de CA-125 se ven
incrementadas en el 70 % de los adenocarcinomas de pulmón, y en solo
el 6 % de las mujeres con patología benigna (Canney et al., 1984).
En lo referente a los niveles de la NSE (enolasa neuroespecífica),
especialmente en tumores neuroendocrinos y en cáncer de pulmón
microcítico, se ha visto que hay un incremento de la enolasa cuando se
compara con pacientes benignos (Järvisalo et al., 1993; Lombardi et al.,
1990). Los niveles en el fluido pleural de la NSE se incrementan en DPM,
especialmente en el derivado del cáncer de pulmón microcítico. Sin
embargo,
hay
estudios
en
los
que
se
observan
diferencias
no
significativas entre la citología negativa a cáncer de pulmón microcítico
del derrame pleural y el DP tuberculoso (Shimokata et al., 1989). Otro de
los inconvenientes en el análisis de esta proteína es el hecho de que la
destrucción de células sanguíneas, como eritrocitos, plaquetas y
linfocitos,
que
contienen
NSE
en
su
citoplasma,
incrementan
considerablemente los niveles de esta proteína en pacientes con DPB
(Alatas et al., 2001). En contraste con otros marcadores tumorales, los
niveles séricos de esta enolasa son mayores que los niveles en fluido
pleural. Por lo tanto, se debería evaluar si los niveles de la NSE en
muestras de suero son mejores que los encontrados en el líquido pleural
(Alatas et al., 2001).
92
Introducción
Sin embargo, a día de hoy no se ha encontrado un marcador
tumoral con suficiente sensibilidad por lo que, como Ferrer et al. (Ferrer
et al., 1999) comentan, se hace necesaria la combinación de marcadores
para el establecimiento de un diagnóstico acertado. La combinación de
marcadores tumorales normalmente se realiza para ver si en conjunto
producen un incremento de la sensibilidad diagnóstica.
Estudios recientes han demostrado que la combinación de los
marcadores tumorales CEA y CYFRA 21-1 mejora la sensibilidad del
diagnóstico del DPM. Sin embargo, la baja sensibilidad que estos
marcadores presentan no es suficiente para poder diferenciar a los DPM
de los DPB (Liang et al., 2008). En el diagnóstico diferencial de los DPM y
DPB se ha visto que la mayor sensibilidad, especificidad y eficiencia se
obtenían con la combinación de CA 15-3 y CYFRA 21-1, tanto en suero
como en fluido pleural (Alatas et al., 2001). Y una combinación de CEA,
CA 15-3 y CYFRA 21-1 incrementaba la sensibilidad y especificidad del
diagnóstico maligno o benigno (Romero et al., 1996).
Hoy en día la combinación es una práctica muy útil para el
establecimiento de un posible diagnóstico patológico, y puede ir
acompañada de la citometría de flujo (Iqbal et al., 2010). Esta
metodología nos permite descubrir el fenotipo de las células del fluido
pleural, a la vez que se valoran los marcadores.
1.4.2.
Marcadores
en
estudio
para
el
derrame
pleural maligno
Como ocurre con muchas otras moléculas, el ácido siálico
presenta diferentes valores en función del científico que lo analice (Alatas
et al., 2001; Imecik y Ozer, 1992; Kakari et al., 1991; Patel et al., 1989;
Toumbis et al., 1992). En muestras de suero normales el 90 % del ácido
siálico está unido a α- y β-globulinas; por esta razón, los niveles séricos
93
Introducción
de ácido siálico pueden incrementarse debido a una elevación de los
niveles de globulina sérica. Esta situación puede explicar la elevación de
los niveles en pacientes con patología benigna (Carter y Martin, 1962).
Los autores que comentan que los niveles de ácido siálico total en el
fluido pleural se incrementan en patologías malignas (Alatas et al., 2001;
Imecik y Ozer, 1992) puede que tengan también razón, puesto que los
pacientes aquejados de patologías malignas presentan secreciones de
ácido siálico originado por las células malignas implantadas en la pleura,
y secreciones originadas por difusión desde el plasma al espacio pleural,
mediante los capilares pleurales. Esta situación de controversia en los
resultados científicos se dará en varias situaciones a la hora de analizar
la bibliografía de un posible candidato a marcador.
Otro marcador del DPM en estudio es la ferritina. Esta proteína
pertenece a la familia de las proteínas isoméricas que presentan una
función importante en el almacenamiento de iones, metabolismo y
detoxificación (Williams et al., 1990). Los niveles de ferritina en suero y
DP pueden ser útiles en la evaluación clínica y en el mantenimiento de
algunas patologías malignas. El empleo de la ferritina en el líquido
pleural evita las influencias del almacenamiento de iones en el cuerpo y
la proliferación de células tumorales (Volpino et al., 1984). Kuralay et al.
(Kuralay et al., 2000) han encontrado niveles de ferritina elevados en el
47,6 % de los DP malignos, y solo en el 4,7 % de los DPB.
La proteína C reactiva es una proteína hepática de fase aguda que
suele emplearse como marcador biológico de inflamación o daño tisular
(Botana-Rial et al., 2011). Se ha encontrado que los niveles de esta
proteína en el fluido pleural son mayores en pacientes que presentan
DPB paraneumónico que en otro tipo de DP exudativos o trasudativos
(Porcel et al., 2009).
El receptor soluble de activación expresado en células mieloides
pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se encarga de
94
Introducción
amplificar la respuesta inflamatoria, aunque se sobrexpresa y activa a
neutrófilos
y
monocitos/macrófagos
en
respuesta
a
productos
microbianos. También se ha demostrado que esta proteína se desprende
de la membrana de los fagocitos activados y puede ser encontrada en
forma soluble en los fluidos corporales (Porcel et al., 2009). Porcel et al.
(Porcel et al., 2009) demostraron que los niveles de este marcador
permitían la diferenciación entre patologías infecciosas y no infecciosas,
con una sensibilidad del 73 % y una especificidad del 72 % [AUC (área
bajo la curva ROC) 0.86].
La procalcitonina es una hormona de fase aguda que ha sido
estudiada debido a su capacidad para diferenciar entre infecciones
bacterianas e infecciones que no ocasionan inflamación. Se sabe que
elevados niveles de esta proteína nos sirven para discriminar entre
diferentes tipos de infecciones respiratorias, e incluso en la evaluación de
infecciones severas y de respuesta a tratamientos (Ray y Kindler, 2009).
Una concentración sérica de 0.5 ng/mL es indicativa de infección
bacteriana para los clínicos (Christ-Crain y Müller, 2007), y esta medida
será útil también para el diagnóstico del DP. De hecho, algunos estudios
han mostrado que su eficacia como marcador de infección bacteriana no
es mejor que la eficacia de la proteína C reactiva (Gaïni y Koldkajær,
2006). Sin embargo, como marcador nos va a permitir evaluar la
severidad de la infección (Porcel et al., 2009).
La proteína de unión a lipopolisacáridos es una proteína
glicosilada de 58 kDa que se produce fundamentalmente en hepatocitos;
además ha sido descrita como un marcador de diagnóstico de la
infección bacteriana (Gaïni y Koldkjær, 2006). Pese a que no ha sido
evaluada previamente, Porcel et al. (Porcel et al., 2009) observaron que
niveles en el fluido < 7 µg/mL de esta proteína reducían la probabilidad
de que la etiología del derrame fuese infecciosa (Likehood Ratio negativo
50.22), lo que podía tener implicaciones a la hora de diferenciar entre
derrames malignos y benignos. Sin embargo, cuando esta proteína
95
Introducción
presentaba niveles de > 17 µg/mL, los resultados se parecían más a los
obtenidos en otros test ya usados a día de hoy por los clínicos, como son
el análisis de la glucosa o el del pH (Porcel et al., 2009).
La mesotelina es un antígeno de diferenciación de las células
mesoteliales que está altamente expresado en mesoteliomas (Scherpereel
y Lee, 2007). Además, la medida del péptido soluble relacionado con la
mesotelina, una variante del splice de la mesotelina, puede predecir el
desarrollo de mesoteliomas en individuos expuestos a asbestos (Ray y
Kindler, 2009). En un estudio en el que se medían los niveles de
mesotelina en suero y en derrame se ha demostrado una sensibilidad del
48 - 84 %, y una especificidad del 70 - 100 %, en el diagnóstico de
mesoteliomas (Hooper et al., 2010).
El factor de potenciación del megacariocito, una proteína soluble
producida por una unión proteolítica de la mesotelina con la proteína
precursora, es secretada por la línea celular mesotelioma (Onda et al.,
2006). Ray y Kindler (Ray y Kindler, 2009) estudiaron los niveles en
suero de esta proteína y observaron que en 51 de 56 pacientes con
mesotelioma esta molécula estaba elevada, y no aparecía elevada en 70
de los sujetos control sanos estudiados, por lo que esta proteína podría
ser útil para el diagnóstico de los DPM de tipo mesoteliomas.
La glicoproteína osteopontina controla la adhesión celular. Los
niveles de osteopontina en suero son mayores en pacientes con
mesotelioma que en pacientes que presentan patologías relacionadas con
asbestos, o patologías no malignas (Pass et al., 2005). Los niveles de la
proteína osteopontina están elevados en pacientes con tipología epitelial
o sarcomatosa, así como en otro tipo de patologías malignas y no
malignas, y nos pueden servir para reflejar la duración de la exposición a
asbestos (Price y Ware, 2004).
Algunos marcadores han mostrado un incremento de su expresión
en DPM al compararlos con lo que ocurre en los casos benignos, como
96
Introducción
ocurre con la metaloproteinasa de la matriz (MMP) (Gaspar et al., 2008;
Sack et al., 2005; Sumi et al., 2003; Vatansever et al., 2009). Entre estos
marcadores, la mesotelina del derrame pleural parece que se muestra
entre las proteínas más prometedoras, con una sensibilidad del 71 %,
mayor que la citología, y una especificidad del 89 %, para el diagnóstico
del mesotelioma maligno. Sin embargo la mesotelina es incapaz de
diferenciar
entre
mesoteliomas
de
tipo
epitelial,
sarcomatosos
y
adenocarcinomas, pudiendo ocasionar falsos positivos (pacientes sin
enfermedad que serían catalogados como positivos).
En resumen, se podría decir que la medición de las proteínas
propuestas podría ser útil como herramienta adicional en la evaluación
de los DP y en el diagnóstico entre las diferentes patologías, de etiologías
infecciosas o no infecciosas. Sin embargo, en muchas ocasiones el
empleo de estos marcadores no aporta mayor información que el uso de
otras metodologías diagnósticas del fluido pleural clásicas, como la
medición del pH, glucosa, ADA o LDH. Por ello, se hace necesaria la
búsqueda de nuevas moléculas que permitan obtener mayor información
diagnóstica.
1.5.
Proteómica
Actualmente la proteómica, y concretamente las tecnologías de
electroforesis y cromatografía bidimensionales (2D), y la MS, posibilitan
el reconocimiento de numerosas moléculas (proteínas y derivados)
específicas de una enfermedad, que podrían llegar a utilizarse como
marcadores. Por este motivo haremos un breve repaso a la historia y
desarrollo
de
la
proteómica
y,
en
particular,
describiremos
las
metodologías que se emplean a día de hoy para la búsqueda de nuevos
marcadores moleculares.
97
Introducción
1.5.1.
El concepto de “proteoma”
Tras la publicación del genoma humano se han realizado
numerosos esfuerzos para poder asociar los datos obtenidos en los
diferentes experimentos con las funciones de los seres vivos. La siguiente
etapa de la investigación que se está llevando a cabo hoy en día consiste
en el estudio de los RNA (ácido ribonucleico) mensajeros (RNAm) y de las
proteínas. Se sabe que los genes pueden leerse por partes para generar
diversos RNAm, y que las proteínas recién formadas sufren diferentes
modificaciones postraduccionales (fosforilación, glicosilación, acetilación,
ubiquitinación, etc.) que pueden alterar su función y sus características.
Todo
esto
hace
que
adquiera
gran
importancia
el
estudio
del
transcriptoma (conjunto de RNAm que una célula produce en un
momento dado) y del proteoma.
Wilkins et al., en 1996 (Wilkins, 1996), fueron los encargados de
proponer el término proteoma como un equivalente del concepto
“genoma”, pero empleado para la descripción del conjunto de proteínas
expresadas por el genoma completo de una célula a lo largo de toda su
vida, o en un momento determinado. Actualmente se considera
proteómica al estudio de la abundancia, interacciones, actividades o
estructuras de las proteínas presentes en una muestra, y engloba al
conjunto de isoformas, modificaciones y alteraciones que estas proteínas
presentan (Tyers y Mann, 2003). Comparado con el genoma, el proteoma
proporciona una visión más realista de una situación biológica y, por lo
tanto, se espera que tenga mayor utilidad en el análisis genético para
valorar, por ejemplo, la presencia de una enfermedad, su progresión y su
respuesta al tratamiento (González-Buitrago et al., 2008). Inicialmente la
técnica de preferencia era la electroforesis bidimensional (2-DE), pero en
la actualidad se incluye cualquier procedimiento que sea capaz de
caracterizar grandes conjuntos de proteínas (Timms y Cramer, 2008).
98
Introducción
1.5.2.
Proteómica en la búsqueda de marcadores
moleculares
El poder analizar los mecanismos moleculares implicados en la
carcinogénesis mediante la identificación y el estudio de la expresión
global de las proteínas presentes en un tumor, en las células tumorales,
o bien en los fluidos extracelulares de pacientes con cáncer, se conoce
como “proteómica del cáncer” (Alaiya et al., 1999). Este tipo de
proteómica, además de caracterizar las bases del proceso canceroso que
las origina, presenta una importante aplicación en el ámbito clínico,
puesto que el objetivo de la misma es la identificación y caracterización
de las proteínas que aparecen expresadas diferencialmente, o que
presenten una modificación química o estructural. Estas proteínas que
aparecen de manera “diferencial” podrían constituir un patrón proteico
de expresión diferencial y/o ser, de forma individual, nuevos marcadores
con los que desarrollar métodos de predicción, diagnóstico, pronóstico o
respuesta a fármacos de la enfermedad en estudio. Además, podrán
considerarse candidatas a dianas terapéuticas contra las cuales poder
desarrollar nuevas generaciones de fármacos, para tratar la enfermedad
de una manera más eficaz y menos tóxica para el individuo (Desiderio y
Nibbering, 2007).
Desde su inicio, la proteómica se ha aplicado de forma muy
intensa al estudio de diferentes patologías, tanto para la caracterización
de las bases del proceso como para identificar nuevos marcadores.
La proteómica está basada en el empleo de metodologías diversas
como la 2-DE, la cromatografía multidimensional, la MS, los microarrays
de proteínas, de anticuerpos o de tejido, el MudPIT (Multidimensional
Protein Identification Technology), el ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags), el
SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization), etc.
99
Introducción
En la actualidad se utilizan también tecnologías que presentan
una mayor sensibilidad y que no se basan en la separación previa de las
proteínas mediante electroforesis en gel. Este es el caso de la tecnología
SELDI, metodología en la que se emplean microarrays de diferentes tipos
(intercambio iónico, afinidad, etc.) para llevar a cabo la separación
selectiva de proteínas y su posterior análisis directo mediante MS
(Espejel y Roa, 2008; Spisak et al., 2007).
Otro nuevo avance tecnológico ha sido la cromatografía líquida
multidimensional, a la que le sigue un análisis de péptidos mediante MS,
técnica conocida como MudPIT (Delahunty y Yates, 2007), o el empleo de
chips en donde se realizarán los inmunoensayos de tipo sandwich sin
necesidad de realizar ningún tipo de mezcla a priori (en el mismo chip,
con varias matrices de 10 diferentes anticuerpos de unión, se incuba una
muestra, a continuación todos los anticuerpos son transferidos al mismo
tiempo en función del ajuste, cada uno a su lugar de afinidad) (Li et al.,
2012).
Otro de los avances es el iTRAQ (de sus siglas en inglés Isobaric
tag for relative and absolute quantitation), que permite el análisis
cuantitativo de 4 muestras de modo simultáneo con una alta sensibilidad
y reproducibilidad (Pottiez et al., 2012; Wu et al., 2006).
Todas estas metodologías están dirigidas a la identificación y al
análisis cuantitativo de las proteínas que son expresadas de modo
diferencial en individuos sanos y enfermos. Además, la proteómica es
una herramienta poderosa con la que se puede llegar a obtener un mayor
conocimiento de la biología de los procesos patológicos, pudiéndose llegar
a identificar desde proteínas cuya alteración implique la modificación de
las rutas metabólicas clásicas (Bi et al., 2006), hasta proteínas
implicadas en las vías de señalización celular (Madoz-Gúrpide et al.,
2007).
100
Introducción
1.6.
Marcadores propuestos en este estudio
1.6.1.
PEDF
El factor derivado del epitelio pigmentado (PEDF - por su nombre
en inglés Pigment epithelium-derived factor) es una glicoproteína miembro
de la familia de las serpinas, con un peso molecular de 50 kDa, que fue
identificada y aislada a principios de la década de 1980 como un factor
neurotrófico purificado de cultivos de células fetales humanas del epitelio
pigmentario retiniano (Kostakis et al., 2010). Diez años más tarde, el
PEDF surgió como uno de los inhibidores naturales más potentes de la
vascularización ocular fisiológica y patológica (Tombran-Tink y Johnson,
1989).
Inicialmente, se pensaba que el PEDF era un factor neurotrófico
que podía diferenciar células Y79, pertenecientes al retinoblastoma y que
no estaban proliferando en las neuronas (Dawson et al., 1999; Jin et al.,
2002). Sin embargo, más tarde se descubrió que esta proteína
presentaba una potente actividad anti-angiogénica, mucho mayor que
cualquier otro factor conocido de producción endógena (Tombran-Tink y
Johnson, 1989). De hecho, se ha demostrado que el PEDF es el inhibidor
endógeno más potente de la angiogénesis, siendo más del doble de
potente que la angiostatina, y siete veces más potente que la endostatina
(Dawson et al., 1999). En la figura 12 se muestra la localización de los
dominios funcionales de la proteína.
101
Introducción
Figura 12. Diagrama esquemático que muestra el dominio funcional del PEDF
Algunos estudios han demostrado que una disminución de los
niveles de PEDF en el ojo se asocian con una serie de enfermedades
neurovasculares oculares y neurodegenerativas (Jin et al., 2002).
Además, la baja expresión de PEDF se ha correlacionado con un
aumento de la incidencia de metástasis y con un peor pronóstico en el
cáncer de próstata (Ek et al., 2006), el cáncer de páncreas (Halin et al.,
2004), neuroblastomas (Uehara et al., 2004), y gliomas (Crawford et al.,
2001). Por lo tanto, se puede proponer al PEDF, en la progresión del
cáncer, como un factor antiangiogénico y/o como un supresor tumoral
directo.
Las implicaciones que esta molécula presenta han sido poco a
poco descubiertas, y varios grupos han estado investigando el papel del
PEDF
en
diversas
condiciones
patológicas
como
la
enfermedad
inflamatoria crónica (Guan et al., 2003), la aterosclerosis (Zhang et al.,
2006), las complicaciones diabéticas (Yamagishi et al., 2005) y el cáncer
(Funatsu et al., 2006).
El gran atractivo que presenta esta molécula puede ser debido
también al potencial terapéutico que demuestra tener su actividad: en
las células madre neurales de mantenimiento (Filleur et al., 2005; Hase
et al., 2005), en anti-inflamación en la patología retinopatía diabética
(Ramírez-Castillejo et al., 2006), como un factor de supervivencia contra
102
Introducción
el estrés oxidativo (Zhang et al., 2006), como inductor de la migración de
células inmunitarias (Tsao et al., 2006), etc.
Se han identificado dos péptidos funcionales en el PEDF, un
péptido de 44 aminoácidos (localizado en las posiciones 78-121 de los
418 aminoácidos totales del PEDF humano) y otro péptido de 43
aminoácidos. La capacidad de la proteína para bloquear la pérdida
vascular es producida por el péptido de 43 aminoácidos que interactúa
con un receptor de 80 kDa, PEDF-RN, que ha sido identificado en células
Y-79 (Takanohashi et al., 2005) del cerebelo, en las neuronas motoras
(Alberdi et al., 1999), y en la retina neural. El péptido de 44 aminoácidos,
a través de un receptor distinto identificado en las células endoteliales,
induce la apoptosis, el bloqueo de la migración de células endoteliales, y
la angiogénesis en la córnea (Bilak et al., 2002) (figura 13).
Figura 13. Vista estéreo del diagrama de la forma nativa de la proteína glicosilada en la
orientación de la serpina típica. Las cadenas-β están en cian y las hélices-α en magenta,
las espirales y los giros están en color oro, y el residuo de hidratos de carbono se
presenta como bolas y palos. El centro reactivo de la proteína se etiqueta como RCL, y la
N-acetilglucosamina se etiqueta como NAG. Obtenida de Simovic, 2001.
1.6.2.
Calprotectina
La calprotectina es una proteína de unión al calcio y al zinc que
pertenece a la familia de las calgranulinas/S100 (Yui et al., 2003), y que
103
Introducción
presenta un papel importante en la modulación de la inmunidad innata
(Chiavaccini et al., 2011).
En cuanto a su estructura, la calprotectina tiene un peso
molecular de 24 kDa, sus genes están localizados en el cromosoma 1q21
humano, y se presenta como un heterodímero compuesto por dos
cadenas que unen calcio (con dos sitios de unión en cada cadena): la
cadena pesada (de 14 kDa, denominada MRP14/S100A9/L1H (L1
cadena pesada ) / p14) y la cadena ligera (8 kDa, MRP8/S100A8/L1L (L1
cadena ligera) / p8/CP-10), que no están unidas covalentemente (Yui et
al., 2003) (figura 14). Además, la calprotectina puede encontrarse como
un complejo formado por hetero- u homo-dímeros (de modo mono-, di-,
tri- o tetramérico) con cada cadena por separado (Terasaki et al., 2007;
Stríz y Trebichavský, 2004).
Figura 14. (a) Primer plano del motivo zinc His-3-Asp de la calprotectina. (b)
Superposición de la S100A8 (verde) y S100A9 (rosa) del heterodímero. (c) Superposición
de S100A8 (azul) y S100A9 (rojo) de las estructuras cristalinas de los dos dímeros
correspondientes. Hay tres residuos de la S100A8 que contribuyen a la estabilización
estructural del C-terminal de la hélice y que no tienen una contrapartida homóloga en
S100A9. Obtenido de Korndörfer et al., 2007.
La calprotectina también se clasifica como una proteína que
ocasiona daños asociados al patrón molecular de la molécula, un
término que describe cómo las moléculas liberadas de las células
huésped que están dañadas son capaces de inducir una señalización
inflamatoria (Chiavaccini et al., 2011). La proteína calprotectina se
104
Introducción
encuentra principalmente en los neutrófilos (representando un 5 % del
contenido proteico total y un 30 - 60 % del contenido proteico del citosol),
y en menor medida en monocitos y macrófagos, principalmente en la
membrana (alrededor del 1 % de toda la proteína citosólica de los
monocitos) (Rodrigo, 2007; Stroncek et al., 2005). Además, la proteína es
producida por las células de la médula ósea, el epitelio escamoso
(queratinizante y no queratinizante), la mucosa de las células epiteliales,
las células endoteliales, los túbulos del riñón, las células de la microglía,
etc. (Rodrigo, 2007; Yui et al., 2003).
Puesto que los principales productores de calprotectina son los
neutrófilos, se sabe también que la concentración de calprotectina
aumenta en el líquido extracelular de estas células bajo diversas
condiciones inflamatorias, lo que sugiere que esta proteína tiene
funciones importantes que influyen en los procesos inflamatorios. De
hecho hay evidencias de que la calprotectina presenta actividad
antimicrobiana (Stríz y Trebichavský, 2004), y además tiene actividad
reguladora mediada por las células que participan en reacciones
inflamatorias o inmunológicas (Cross et al., 2005; Petersson et al., 2007).
Se sabe también que sus niveles plasmáticos aumentan en enfermedades
infecciosas e inflamatorias (Viemann et al., 2007).
La calprotectina no solo tiene propiedades antimicrobianas, sino
que también presenta propiedades citostáticas (Arai et al., 2008),
antiproliferativas (Stroncek et al., 2005), inductoras de la apoptosis
(Stroncek et al., 2005; Tibble y Bjarnason, 2001), quimiotácticas
(Stroncek et al., 2005; Viemann et al., 2007; Yui et al., 2003), y participa
en las interacciones de los leucocitos con el endotelio (Ahma et al., 2003;
Passey et al., 1999).
La calprotectina también es capaz de inhibir el crecimiento de
muchas
células
tumorales
con
amplia
especificidad.
De
hecho,
Chiavaccini, Viemann y sus respectivos colaboradores (Chiavaccini et al.,
105
Introducción
2011; Viemann et al., 2007) comprobaron cómo se inhibía la actividad de
los siguientes tipos celulares: MM46 carcinoma de mama en ratón, MH134 hepatoma de ratón, EL-4 timoma de ratón, L-929 fibrosarcoma de
ratón, B16 melanoma de ratón, Ros17/2.8 osteosarcoma de rata, MCF-7
adenocarcinoma de mama humano, y MOLT-4 células de leucemia
humana.
Pese a que la calprotectina se asocia con muchos trastornos, los
más frecuentes son los relacionados con las especialidades de obstetricia
y ginecología (como el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de
endometrio, cáncer de cuello uterino, la fisiología del cuello uterino y la
vagina, el ciclo menstrual, el embarazo, etc.) (Nacken et al., 2003), o los
relacionados con las especialidades digestiva y urinaria.
106
1.7. Objetivos
Objetivos
Objetivos
La aparición de un derrame pleural de origen maligno es siempre
la expresión de una enfermedad avanzada, y el augurio de un mal
pronóstico. De ahí que el retraso en el diagnóstico suponga un
importante perjuicio para estos pacientes, puesto que normalmente su
esperanza de vida es muy baja.
Hoy en día, la forma más rápida y eficaz de establecer un
diagnóstico de malignidad del derrame consiste en el examen citológico
del líquido pleural. Sin embargo, este método presenta una baja
sensibilidad por lo que muchos pacientes deben someterse a otras
pruebas invasivas para completar el diagnóstico.
La Tesis Doctoral que se presenta se refiere a la búsqueda y
validación de marcadores útiles para el diagnóstico del derrame pleural
maligno que permitan distinguir, de modo no invasivo, a aquellos
pacientes con derrame de origen oncológico de aquellos que sufren
derrame pleural cuyo origen no es maligno.
Por ello, los objetivos planteados para la realización de esta Tesis
fueron los siguientes:

Detectar e identificar proteínas cuya expresión se encuentre
alterada en fluido pleural de pacientes con cáncer de pulmón no
microcítico, en relación al fluido pleural de pacientes con enfermedad
benigna del pulmón.

Seleccionar y caracterizar, mediante criterios bioquímicos,
posibles proteínas candidatas a marcadores de diagnóstico del derrame
pleural maligno.

Validar la utilidad clínica de los marcadores candidatos
determinando sus parámetros diagnósticos.
109
2. Materiales y métodos
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos
2.1.
Muestras biológicas
2.1.1.
Obtención de las muestras
La muestra biológica escogida para realizar el presente estudio ha
sido
el
fluido
constituidos
por
pleural.
Se
pacientes
estudiaron
con
DPB
dos
que
grupos
poblacionales,
presentaban
patologías
diagnósticas diversas y pacientes con DPM derivado de neoplasias.
A través de los Servicios de Neumología del Complejo Hospitalario
Universitario de Vigo (CHUVI), y del Hospital Policlínico de Vigo, se
obtuvieron muestras de fluido pleural de 89 pacientes diagnosticados de
DPB y 67 con DPM, que presentaban edades comprendidas entre 20 y 96
años. Una parte del fluido pleural extraído fue analizado por el centro
donador para poder establecer el diagnóstico. Para garantizar el
anonimato de los donantes, cada una de las muestras suministradas se
definió mediante un código y los parámetros género y edad del individuo,
siguiendo el protocolo aprobado por el Comité Gallego para la
investigación clínica (2007/179), la Ley de protección de datos 15/1999,
y el Real Decreto 1720/2007.
Cabe destacar que los pacientes a los que se les extrajo el fluido
pleural, no tomaban medicación alguna en el momento de la extracción,
de tal modo que la muestra obtenida no presentaba ningún tipo de
alteración farmacológica.
El fluido pleural obtenido se sometió a una centrifugación a 800 g
durante 15 min, se congeló a -20 ºC, y se mantuvo a esta temperatura
hasta que se efectuaron los análisis correspondientes.
113
Materiales y Métodos
2.1.2.
Diagnóstico de los pacientes
El diagnóstico de los pacientes estudiados se realizó siguiendo el
protocolo establecido por el Servicio de Neumología del CHUVI. Tras la
realización de la anamnesis (entrevista clínica al paciente) y de una
exploración física completa según la sospecha diagnóstica, se realizaron
una serie de determinaciones analíticas y pruebas de imagen. En ningún
caso estos pacientes fueron sometidos a pruebas complementarias que
no estuviesen indicadas de no haber sido incluidos en el estudio.
Para el análisis del DP se siguieron las recomendaciones de la
Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (Villena-Garrido et
al., 2006) por lo que en la mayoría de los casos fue necesaria la
realización de una toracocentesis (extracción de una cantidad variable de
líquido pleural), para poder realizar el análisis bioquímico, citológico y
microbiológico del líquido pleural. Cuando el empleo de esta técnica no
hizo posible el establecimiento de un diagnóstico, en los pacientes con
exudado pleural se tuvo que realizar una segunda toracocentesis y una
posterior biopsia pleural (con aguja Abrams). En función de la sospecha
diagnóstica se indicó la realización de otros estudios complementarios
(broncoscopia, tomografía computarizada del tórax y/o abdomen, etc.)
para aquellos pacientes que así lo requiriesen. Además, en los pacientes
con DP también se realizó una extracción de suero para determinaciones
analíticas generales y específicas (marcadores tumorales, test de
autoinmunidad, etc.).
Para distinguir entre trasudados y exudados se siguieron los
criterios de Light (Light et al., 1972). El fluido pleural se consideró de tipo
exudado, cuando el contenido proteico fue superior a 3 g/dL, la relación
de proteínas en líquido/suero fue mayor de 0,5 y la relación LDH
pleural/sérica mayor de 0,6.
114
Materiales y Métodos
Los pacientes con patologías malignas fueron caracterizados a
través de secuencias de pruebas diagnósticas entre las cuales se
incluyen el análisis citológico, que permite demostrar la presencia de
células malignas en el líquido o tejido pleural, y el subsiguiente estudio
anatomopatológico. Otras pruebas diagnósticas son la radiografía y la
tomografía
axial
computarizada
(TAC)
torácicas,
así
como
la
broncoscopia y la punción-aspiración de aguja fina (PAAF) en las lesiones
inaccesibles a la broncoscopia.
Además, se tuvo que demostrar la
presencia de células malignas en el líquido o tejido pleural, mediante
citología
pleural,
para
la
realización
del
subsiguiente
estudio
anatomopatológico.
El estudio anatomopatológico de los casos de DPM permite la
determinación de la naturaleza, la localización, y la extensión del tumor,
y su clasificación para poder emitir un juicio sobre el pronóstico del
enfermo, determinándose así las opciones terapéuticas adecuadas, para
lo que se suelen clasificar los tumores en función de la clasificación TNM.
Las siglas TNM hacen referencia a tres aspectos del cáncer: la T indica el
tamaño y el lugar de asentamiento del tumor primario, la N se refiere a la
afectación de los ganglios linfáticos de acuerdo con su localización, y la
M a la presencia o ausencia de metástasis a distancia, es decir, a la
afectación de otros órganos. Se sabe que cuando un paciente presenta
DPM el estadío que presenta de la clasificación TNM es siempre un T3
muy avanzado, o un T4.
En lo referente a las patologías benignas de tipo exudado fueron
clasificadas
en
cinco
subgrupos:
tuberculosos,
paraneumónicos,
miscelánea, paramalignos y no neoplásicos de origen desconocido. El
diagnóstico del DPB de tipo tuberculoso se basó en la presencia del
marcaje positivo o cultivo del bacilo Mycobacterium tuberculosis en el
líquido pleural, esputo, o biopsia pleural, o bien en la presencia de
115
Materiales y Métodos
granulomas caseosos típicos localizados en la biopsia pleural. Cualquier
DPB que esté asociado con neumonía y que presente respuesta a
tratamiento de tipo neumónico fue clasificado como DPB paraneumónico.
El grupo DPB miscelánea incluye DP que cumplían con los criterios
específicos para el diagnóstico del DP que presentasen diversos orígenes
no
incluidos
en
los
otros
subtipos
(post-quirúrgicos,
quilotórax,
secundario a enfermedad vascular de tipo colagenosis, secundaria a
toxicidad por fármacos, síndrome de Dressler, pleuritis urémica, posttraumáticos, y síndrome de hiperestimulación ovárica). Los DPB de tipo
paramaligno reciben este nombre porque son DP causados por los
efectos indirectos de neoplasias en la cavidad pleural, y también por los
efectos indirectos del cáncer o de la terapia farmacológica en la cavidad
pleural (Heffner, 2008). El DPB no neoplásico de origen desconocido se
define con cualquiera de los siguientes criterios: DP que comprende de
modo no específico una pleuritis observada mediante toracoscopia,
toracotomía, biopsia o autopsia; ausencia de síntomas, o recurrencia del
DP tras el seguimiento clínico y radiológico de un año de duración
(Villena et al, 2003).
Una vez concluido el diagnóstico, los pacientes incluidos en este
estudio se clasificaron en los grupos que aparecen en la tabla 3.
Todos los datos de la historia clínica, así como los resultados de
las pruebas realizadas, fueron registrados en una base de datos,
realizándose periódicamente seguimientos clínicos de los pacientes con
DPM, y evaluando la respuesta a los tratamientos hasta el fallecimiento
del paciente.
116
Materiales y Métodos
Tabla 3. Características clínicas de los pacientes incluidos en este estudio.
No. de
No. de
Edad, Años
pacientes
Hombres/Mujeres
Media (Rango)
67
42/25
67 (20-91)
58
32/26
68 (34-91)
42
31/11
68 (37-91)
Cáncer de mama
6
0/6
63 (34-75)
CPM
3
2/1
75 (66-76)
Cáncer de ovario
2
0/2
82 (79-85)
Neoplasia de origen tímico
2
0/2
69 (65-73)
Cáncer gástrico
2
0/2
73 (60-83)
Colangiocarcinoma
1
1/0
61
Mesotelioma
6
5/1
67 (57-87)
Linfoma
3
3/0
55 (20-79)
89
61/28
53 (20-96)
Tuberculosis
30
20/10
44 (20 -96)
Paraneumónico
29
22/7
55 (26 – 89)
Miscelánea
12
8/4
57 (24 – 83)
Postquirúrgicos
3
2/1
64 (53-74)
Quilotórax
2
2/0
62 (54-70)
Secundario a
2
2/0
48 (37-59)
Secundario a fármacos
1
1/0
24
Síndrome de Dressler
1
1/0
80
Pleuritis urémica
1
0/1
45
Tras traumatismos
1
0/1
83
Síndrome de
1
0/1
34
3
1/2
65 (40 – 81)
15
10/5
62 (37 -85)
Origen del DP
DPM
Neoplasia de origen epitelial
CPNM
DPB
enfermedades colagenosis
hiperestimulación ovárica
Paramaligno
No
neoplásico
de
origen
desconocido
DP: Derrame pleural; DPM: Derrame pleural maligno; DPB: Derrame pleural benigno;
CPNM: Cáncer de pulmón no microcítico; CPM: Cáncer de pulmón microcítico.
117
Materiales y Métodos
2.2.
Preparación
de
las
muestras
para
electroforesis
Para la realización de las técnicas proteómicas se hizo necesario
un prefraccionamiento previo de las muestras. En primer lugar se
enriquecieron en proteínas minoritarias mediante cromatografía de
afinidad y, posteriormente, fueron dializadas y liofilizadas.
En la tabla 4 se muestran los datos clínicos de los pacientes tanto
con patologías malignas como benignas, cuyas muestras sufrieron estos
tratamientos previos y que fueron utilizadas en la primera parte del
estudio basada en la búsqueda de marcadores mediante técnicas
proteómicas.
Tabla 4. Características clínicas de los pacientes incluidos en el estudio proteómico
Paciente
Edad (años)
Género
Diagnóstico
DPM 1
54
Hombre
CPNM
DPM 2
60
Mujer
CPNM
DPM 3
60
Mujer
CPNM
DPM 4
57
Hombre
CPNM
DPB 1
38
Hombre
Tuberculoso
DPB 2
25
Mujer
Tuberculoso
DPB 3
29
Hombre
Tuberculoso
DPB 4
27
Hombre
Tuberculoso
DPM: derrame pleural maligno; CPNM: cáncer de pulmón no microcítico; DPB: derrame
pleural benigno.
118
Materiales y Métodos
2.2.1.
Cromatografía de afinidad a través de una
columna de inmunoafinidad múltiple
El principio del enriquecimiento mediante cromatografía de
afinidad se basa en una separación de mezclas proteicas por su afinidad
o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las
proteínas que se retuvieron en la columna fueron aquellas que se unían
de modo específico a un ligando que previamente se había unido de
manera covalente a la matriz de la columna (fase estacionaria, también
denominada gel o resina “de afinidad”). Después de que las proteínas que
no se unen al ligando sean lavadas o eluidas a través de la columna, la
proteína o proteínas de interés que han quedado retenidas en la columna
se eluyen mediante el empleo de una solución que contiene un ligando
libre u otro compuesto que es capaz de romper la interacción entre el
ligando y la proteína.
En nuestro caso se empleó una columna cromatográfica de
afinidad múltiple Hu-6 (Multiple Affinity Removal Spin Cartridges Hu-6,
Agilent Technologies) que contiene diferentes ligandos de afinidad unidos
a una resina de soporte. Los ligandos son capaces de retener, de manera
selectiva, la albúmina, la Ig G, la antitripsina, la Ig A, la transferrina y la
haptoglobina, presentes en las muestras de fluidos pleurales.
Figura 15. Esquema del método empleado para la separación de las proteínas por
cromatografía de inmunoafinidad múltiple.
119
Materiales y Métodos
Para la preparación de la muestra se tuvo en cuenta, en cada uno
de los pases realizados, que la columna presenta una capacidad de carga
de muestra sin diluir de 7 a 10 μL. La muestra se diluyó con una
solución
tamponadora
comercial
(Agilent
Technologies)
hasta
un
volumen final de 200 μL. Esta dilución se introdujo en la columna y se
centrifugó a 100 g durante 90 segundos en una microcentrífuga
Microfuge® 18 Centrifuge (Beckman CoulterTM). Es en este paso donde se
retuvieron las proteínas abundantes (albúmina, IgG, antitripsina, etc.)
siendo el eluido la fracción de interés (fracción eluida). Para una
recuperación mayor de la fracción eluida, y teniendo en cuenta el
protocolo, se añadieron 400 μL de solución tamponadora a la columna y
se centrifugó de nuevo a 100 g durante 150 segundos. Este proceso se
realizó dos veces. A continuación, para eluir las proteínas retenidas
específicamente por la resina (fracción retenida), se introdujo en la
columna la solución tamponadora competidora comercial (Agilent
Technologies), a un volumen de 2 mL. Para la recuperación de las
condiciones iniciales de la cromatografía, se aplicó un volumen de 4 mL
de solución tamponadora inicial a la columna, eliminando así cualquier
resto de proteína que pudiera quedar adherida a la matriz.
El fluido pleural que se emplea en este método se debe
descongelar y filtrar en el momento de su utilización. En cuanto al
proceso cromatográfico, este debe ser realizado a temperatura ambiente y
los tubos de eluido deben conservarse a +4 ºC desde su recogida hasta el
final de la cromatografía.
2.2.2.
Diálisis
Debido a que concentraciones salinas superiores a 10 mM
interfieren con procesos electroforéticos como el isoelectroenfoque (IEF)
(Liumbruno, 2008), los eluidos cromatográficos obtenidos mediante la
cromatografía de afinidad fueron dializados. Para la realización de esta
120
Materiales y Métodos
técnica se emplearon membranas de diálisis con un punto de corte de
masa molecular de 12.000-14.000 Da (Medicell International Ltd.) que
son apropiadas para la mayoría de las diálisis de proteínas. Las
moléculas con un tamaño inferior al punto de corte (sales) son
eliminadas, ya que atraviesan la membrana para igualar la presión
osmótica a ambos lados, mientras que las moléculas de mayor tamaño
(en este caso proteínas) son retenidas en el interior de la misma.
Una vez lavada la membrana con agua milli-Q (ultrapura), se
depositó el eluido en su interior, y se introdujo en un matraz con 1 L de
agua milli-Q. Se dejó dializar, en agitación y con cambios frecuentes del
líquido exterior (cada 2-4 horas, durante el día, y cada 8 horas durante
la noche), a +4 ºC a lo largo de 24 horas.
Una vez finalizada la diálisis, la muestra se extrajo de la
membrana, para posteriormente conservarse a -80 ºC, hasta su
liofilización.
2.2.3.
Liofilización
Las muestras recuperadas de la diálisis fueron liofilizadas en un
liofilizador Christ Alpha 2-4 (B. Braun Biotech) y conservadas a -80 ºC
durante todo el proceso. En el momento de su utilización, las muestras
fueron resuspendidas en una solución adecuada para los posteriores
procesos analíticos: dodecilsulfato sódico (SDS), para muestras a las que
les aplicaríamos electroforesis monodimensional, y Buffer lysis para
muestras sometidas a electroforesis bidimensional.
Debemos tener en cuenta que debido al elevado contenido en urea
del Buffer lysis, una vez descongelada la muestra preparada en este
tampón, no se puede volver a congelar.
121
Materiales y Métodos
2.3.
Determinación de la concentración de
proteínas
Para la valoración de la concentración de proteínas se emplearon
diferentes métodos, en función de la cantidad de proteína esperada y de
su composición, evitándose valoraciones fuera del rango lineal de cada
uno de los métodos (rango de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer,
una relación empírica que relaciona la absorción de luz con las
propiedades del material atravesado). En todos los casos, los métodos
producen una coloración medible en el rango de luz visible mediante un
espectrofotómetro, luz que es proporcional a la cantidad de proteína
existente en la muestra valorada.
La concentración proteica se ha utilizado para calcular la cantidad
de muestra necesaria para cada método analítico y, en el caso concreto
de la concentración de muestra, para valorar la pérdida de proteína que
había ocurrido tras los métodos de cromatografía de afinidad y de
diálisis.
2.3.1.
Método de Biuret
En las muestras de fluido pleural crudo la concentración de
proteínas se determinó mediante el método de Biuret (Gornall, Bardawill
& David 1949). Este método está basado en la formación de complejos de
color entre los iones de cobre (Cu2+) y los enlaces peptídicos de las
proteínas, bajo condiciones alcalinas. Puesto que estos complejos, con
coloración violeta, absorben luz a 545 nm y son medibles mediante
espectrofotometría.
Debido a que la reacción que ocurre es específica para enlaces de
tipo amida (enlace entre un ácido y un grupo amino), que se dan en una
122
Materiales y Métodos
proporción casi constante en las proteínas (uno por cada 110 unidades
de masa), se supone que hay muy poca variación relativa en la respuesta
de diferentes proteínas. Por tanto, se considera que es un método de
valoración rápido, sencillo y preciso para determinar la concentración de
proteínas en una muestra, empleándose para disoluciones en las que
está presente una cantidad relativamente alta de proteínas (500 - 5000
µg). El patrón proteico empleado fue una disolución de seroalbúmina
bovina a una concentración inicial de 70 mg/mL.
2.3.2.
Método de Bradford modificado
Una vez realizada la purificación de la muestra se hizo necesaria
una segunda cuantificación, puesto que una de las desventajas de las
purificaciones de muestras es la pérdida de proteínas que se suele dar en
ellas. Debido a que las electroforesis 1D y 2D requieren que las muestras
(previamente
liofilizadas)
estén
resuspendidas
en
una
solución
tamponadora altamente desnaturalizante, y con una gran concentración
de detergentes (urea, tiourea, etc.), se decidió emplear una modificación
del método de Bradford (Bradford, 1976), desarrollada por Ramagli y
Rodríguez (Ramagli y Rodríguez, 1985).
El método de Bradford se basa en la utilización de una disolución
de azul brillante de Coomassie G-250, cuya máxima absorbancia es
medible a 595 nm cuando se une a la proteína (5 - 50 µg). Puesto que
existen interferencias en el método cuando la muestra contiene
detergentes en una concentración superior al 0,1 % del volumen total, o
cuando están presentes reactivos tamponantes fuertemente alcalinos, es
necesario emplear una modificación del método original de Bradford. La
modificación del método escogida consistió en una acidificación del
medio debida a la adición de 10 μL de HCl 0,1 N en cada tubo de
reacción. En este caso el patrón empleado consistió en seroalbúmina
bovina a una concentración de 5 mg/mL.
123
Materiales y Métodos
2.4.
Electroforesis monodimensional
Para la separación de las proteínas del fluido pleural inicial y de
las fracciones eluida y retenida de la cromatografía, así como para la
realización del paso previo de la transferencia de las proteínas a la
membrana, se empleó la electroforesis monodimensional (1-DE). En
concreto se utilizó la electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida en presencia de SDS o SDS-PAGE, siguiendo el método
discontinuo descrito por Laemmli (Laemmli, 1970).
2.4.1.
Desnaturalización de la muestra
La solución tamponadora de carga de Laemmli, en la cual se
prepararon las muestras obtenidas tras la cromatografía descrita en el
apartado 2.2.1. del presente capítulo, estaba compuesta por Tris-HCl 50
mM (p/v) pH 6,8; SDS 2 % (p/v); azul de bromofenol 0,1 % (p/v); glicerol
10 % (v/v); y β-mercaptoetanol 5 % (v/v). La proporción de la mezcla
varió en función de la concentración del tampón de carga empleado en
cada caso, pero siempre se preparó hasta un volumen final de 16 μL, ya
que 20 μL suponía la máxima carga del pocillo.
Una vez preparadas las muestras con la disolución de carga, se
mezclaron por agitación en vortex, se hirvieron durante 5 minutos (paso
que favorece la desnaturalización proteica), y finalmente se centrifugaron
a 3.220 g durante 30 segundos en una microcentrífuga Microfuge® 18
Centrifuge (Beckman CoulterTM). En cada carril se cargaron entre 2 y 50
μg de proteína total.
124
Materiales y Métodos
2.4.2.
Electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
La SDS-PAGE se realizó en geles verticales con un tamaño de 82
mm x 68 mm x 0,75 mm, empleando un equipo Mini-Protean Tetra Cell
(Bio-Rad), como el que aparece en la figura 16.
Figura 16. Imagen del equipo Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad) y sus accesorios (derecha).
A la derecha de la imagen se muestra la fuente de alimentación empleada (modelo
PowerPac 165-5050 de Bio-Rad).
Tabla 5. Composición del gel concentrador y de los geles separadores al 8% y 12% de
poliacrilamida.
Componente
Concentrador
4%
Separador
8%
Separador
12%
H2O milli-Q
6,10 mL
4,64 mL
3,35 mL
Tris-Cl
2,5 mL
(0,5 M pH 6,8)
SDS
Acrilamida/bis
2,5 mL
(1,5 M pH 8,8)
100 µL
1,3 mL
2,67 mL
APS 10%
80 µL
TEMED
7,5 µL
4 mL
SDS: dodecilsulfato sódico; mQ: ultrapura; APS: persulfato amónico; TEMED: N´N´N´N´tetrametiletilendiamina.
125
Materiales y Métodos
La matriz de poliacrilamida empleada tenía una relación 30 % T y
2,6 % C (T: poliacrilamida total empleada; C: crosslinker o agente
entrecruzador N´N´-bis-metilen-acrilamida). Para la polimerización de los
geles
fue
necesario
la
adición
de
agentes
aceleradores
de
la
polimerización, que en este caso fueron el persulfato amónico (APS) 10 %
(p/v) y N´N´N´N´-tetrametil-etilendiamina (TEMED) 0,05 % (v/v). El gel
separador se utilizaría a una concentración del 12 % en poliacrilamida
(p/v), en la mayoría de los casos, mientras que para el gel concentrador
la concentración usada fue del 4 % (p/v).
Los geles se colocaron en la cubeta del equipo donde se realizó la
electroforesis, y se le añadió la solución tamponadora de electrodo
(solución que consiste en un sistema tampón Tris-glicina a pH 8,3).
La corriente constante desarrollada fue de 90 V en el trayecto del
gel concentrador y de 150 V en el separador, siendo el límite de
intensidad de 1,8 A. La fuente encargada de generar el voltaje fue una
fuente de alimentación modelo PowerPac 165-5050 (Bio-Rad) (figura 16).
Cuando el frente de proteínas con el azul de bromofenol salió de la matriz
del gel, la electroforesis se dio por terminada.
En condiciones apropiadas, los polipéptidos reducidos debido a la
acción del β-mercaptoetanol se unen al SDS en base a su masa en una
relación 1 g polipéptido: 1,4 g SDS. Por lo tanto, migran en el gel como
partículas cargadas negativamente que se diferencian en su peso
molecular (Mr). La utilización de marcadores adecuados al rango de
separación usado nos permitió extrapolar los valores de la Mr de las
proteínas resueltas en otros carriles al utilizar el análisis de imagen, de
tal manera que pudimos extrapolar los valores correspondientes a las
proteínas resueltas en otros carriles del mismo gel, ya que la distancia
recorrida por una banda en un gel de composición homogénea tiene una
relación lineal con el logaritmo de la masa de esa banda.
126
Materiales y Métodos
Se emplearon 2 tipos de marcadores: uno de bajo peso molecular
(LMW Marker, Bio-Rad), que contiene proteínas en un rango de 15 a 98
kDa, y otro con proteínas de peso molecular de amplio rango, desde 6
hasta 200 kDa (BMW Marker, Bio-Rad).
En muchos de los experimentos en los que se han empleado geles
1D su objetivo final era la realización de la transferencia de proteínas a
membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF), y su consiguiente
inmunodetección específica de las proteínas de interés. Por ello, en estos
geles fue necesario el empleo de marcadores preteñidos de baja masa
molecular (Prestained SDS-PAGE Standards-Low o Broad Range, BioRad), visibles durante todo el proceso sin necesidad de la realización de
una tinción posterior. El rango de masa molecular relativa de las
proteínas
de
este
marcador
comprendía
de
6
a
200
kDa
aproximadamente, dependiendo del lote de producto empleado.
2.5.
Electroforesis bidimensional
Para realizar la electroforesis bidimensional (2-DE) tanto el fluido
pleural
como
liofilizadas
y
las
fracciones
congeladas,
cromatográficas
fueron
obtenidas,
resuspendidas
en
la
una
vez
solución
desnaturalizante (de lisis) durante 1 horas, a 30 ºC, y con agitación
suave a 35 rpm. Para ello se empleó un baño termostático con agitación
Unitronic 320 OR (P. Selecta). La solución desnaturalizante elegida
contenía urea 7 M, tiourea 2 M, y 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1propanolsulfonato (CHAPS) 4 % (p/v).
Para valorar la concentración de proteínas de las muestras así
resuspendidas se utilizó el método de Bradford modificado, detallado en
el apartado 2.3.2. de este capítulo.
127
Materiales y Métodos
En algunos casos, para establecer el patrón de Mr y punto
isoeléctrico (pI) se añadió una mezcla de proteínas conocidas (SDS-PAGE
Standards, Bio-Rad), detectables tras la tinción del gel. Los marcadores
se aplicaron en un pocillo realizado en un lateral del gel, o por inmersión
en la agarosa de sellado de un pequeño fragmento de papel de filtro que
contenía de 2,5 a 5 μL de marcador.
2.5.1.
Primera dimensión: Enfoque isoeléctrico
Para la primera dimensión, o separación de las muestras en
función de su pI, se utilizó la técnica de enfoque isoeléctrico o
isoelectroenfoque (IEF). Se emplearon tiras ReadyStripTM IPG Strips (BioRad), que están formadas por un gel de acrilamida/bis-acrilamida (4 % T
y 3 % C), copolimerizado con inmovilinas, y que presentan un gradiente
de pH continuo unido a la matriz del gel. Las tiras empleadas tenían un
tamaño de 7 y 17 cm x 3,3 mm x 0,5 mm, y presentaban rangos de pH
de 4 a 7 (rango medio), y de 3 a 10 (rango amplio).
Como paso inicial del proceso, las tiras fueron rehidratadas con
una mezcla que presentaba entre 100 - 150 μg de muestra preparada en
una solución desnaturalizante que contenía ditiotreitol (DTT) 20 mM,
anfolitos transportadores de rango de pH amplio (Bio-Lyte 3/10
Ampholyte, Bio-Rad) 0,5 % (p/v) y trazas de azul de bromofenol. El
volumen final de mezcla empleado fue de 350 μL en las tiras de 17 cm y
150 μL en las tiras de 7 cm, correspondientes a la máxima capacidad de
absorción de las tiras IPG empleadas.
La etapa inicial, o IEF, se realizó en el aparato Protean IEF Cell
(Bio-Rad) (figura 17). La mezcla de rehidratación se depositaría en un
carril de la bandeja de IEF, y encima sería colocada la tira de tal manera
que el gel quedase en contacto con la muestra y con los polos positivos
(pH más ácido) y negativo (pH más básico), en la posición adecuada
128
Materiales y Métodos
según la polaridad de la corriente. Una vez impregnada de muestra, la
tira sería cubierta con aceite mineral para evitar la evaporación durante
toda la primera dimensión.
Figura 17. Imagen del equipo Protean IEF Cell (Bio-Rad) y sus accesorios.
Para la rehidratación de los geles se mantuvo un pequeño voltaje
basal de 50 V durante 12 horas de forma activa y a 20 ºC. Sin embargo,
para evitar el daño de los electrodos por depósitos de sales, en la mitad
de la rehidratación se cubrieron los mismos con pequeños papeles de
filtro humedecidos en agua ultrapura. Una vez acabada la rehidratación
se procedió al IEF propiamente dicho, que fue realizado en todos los
pasos con un límite de corriente de 50 µA por gel y manteniéndose una
temperatura constante de 20 ºC (Parlar, Weiss 2002). El programa
empleado presentaba las siguientes etapas:
 Etapa inicial: de bajo voltaje para la eliminación del exceso de sales
(250 V durante 15 minutos y a +20 ºC)
 Rampa de voltaje lineal: comienza con el voltaje inicial de 150 V
hasta llegar a un voltaje de 4.000 V para tiras IPG de 7 cm y 10.000 V
para tiras IPG de 17 cm (tabla 6), durante aproximadamente 3 horas.
129
Materiales y Métodos
Tabla 6. Parámetros seleccionados para conseguir una rampa de voltaje lineal.
Longitud
Voltaje
Voltaje
Tiempo
Temperatura
IPG
inicial
final
7 cm
250 V
4.000 V
2h
20 ºC
17 cm
250 V
10.000 V
3h
20 ºC
Vh: voltios-hora.
 Enfoque final: Etapa que va del voltaje anterior de 4.000 V o 10.000 V
hasta un total de 20.000 Vh (voltios-hora) para tiras IPG de 7 cm y
hasta 60.000 Vh para tiras IPG de 17 cm (tabla 7), durante un período
de 6 horas aproximadamente.
Tabla 7. Parámetros seleccionados para conseguir un enfoque final
Longitud
Voltaje
Voltaje
Tiempo
Temperatura
IPG
inicial
final
7 cm
4.000 V
20.000 Vh
5h
20 ºC
17 cm
10.000 V
60.000 Vh
6h
20 ºC
Vh: voltios-hora.
 Etapa de mantenimiento o holding: programado como una etapa
constante de 500 V para que, una vez finalizado el IEF, las proteínas
sigan sometidas a una intensidad de corriente suficiente para evitar
movimientos aleatorios de los polipéptidos enfocados, en el tiempo
transcurrido entre el final del IEF y el comienzo del equilibrado.
2.5.2.
Equilibrado de las tiras IPG
Antes de proceder a la realización de la segunda dimensión fue
necesaria una preparación previa de las tiras IPG, equilibrándolas con
130
Materiales y Métodos
un tampón específico, de modo que la muestra quedase preparada para
la electroforesis desnaturalizante (Klein et al., 2004).
Las tiras debían situarse en la bandeja de equilibrado con el gel de
IEF hacia arriba, de modo que el aceite mineral de la primera etapa del
método flotase en la solución y no interfiriese en la incubación. La
primera de las soluciones empleadas en el equilibrado fue una solución
tamponadora específica que contenía urea 6 M, Tris 50 mM pH 8,8, SDS
2 % (p/v), glicerol 30 % (v/v) y DTT 1 % (p/v). Esta incubación se
realizaría dos veces a lo largo de 20 minutos (10 minutos cada vez) y
posteriormente se repetiría durante otros 20 minutos (dos veces de 10
minutos cada vez) con una solución tamponadora similar a la anterior
cuyo contenido en DTT sería substituido por iodoacetamida (IAA) 2,5 %
(p/v) y trazas de azul de bromofenol. El DTT se empleó como agente
reductor puesto que es capaz de romper los puentes disulfuro existentes
en la muestra, facilitando la solubilización de mezclas complejas de
proteínas. Al equilibrar posteriormente con IAA se consigue estabilizar
los grupos -SH obtenidos en el paso anterior, impidiendo que vuelvan a
reaccionar
formando
los
puentes,
y
facilitando
así
una
buena
desnaturalización en la segunda fase (o SDS-PAGE) en conjunto con la
acción del SDS y la urea (Shaw y Riederer, 2003). El glicerol se añadió a
este tampón para minimizar los fenómenos de electroendósmosis, que
ocasionan interferencias en el patrón bidimensional final.
2.5.3.
Segunda
dimensión:
Electroforesis
desnaturalizante en geles de poliacrilamida
La segunda dimensión se produce de forma análoga al proceso
descrito para la SDS-PAGE monodimensional (1-DE) (apartado 2.4.). El
hecho de que la segunda dimensión se base en la separación por el
tamaño de la cadena proteica se debe al empleo de SDS en la etapa de
equilibrado (Laemmli, 1970).
131
Materiales y Métodos
Para la separación electroforética se emplearon también geles de
poliacrilamida (30 % T y 2,6 % C) que presentaban un tamaño de 19,5
cm x 18,4 cm x 1,5 mm, y minigeles (82 mm x 68 mm x 0,75 mm), con
una concentración del 12 % de poliacrilamida en ambos casos. En este
caso no existe gel concentrador debido a que la tira IPG cumple ya esta
función. Los minigeles en los que se realizaría esta técnica serían
empleados para experimentos iniciales y para la transferencia de
proteínas a membranas de PVDF.
La matriz del gel se preparó al 30 % de poliacrilamida, empleando
como crosslinker o agente entrecruzador la N´N´-bis-metilen-acrilamida
(30 % T; 2,6 % C). Como agentes aceleradores de la polimerización se
empleó APS al 10 % (p/v) y TEMED al 0,05 % (v/v). En el caso de los
minigeles, haciendo uso de peines específicos para la formación de
pocillos, se originó un pequeño pocillo en una de las esquinas (superior
izquierda) del gel para cargar la mezcla de marcadores preteñidos
(Prestained SDS-PAGE Standards-Low o Broad Range, Bio-Rad), que
estuvieron visibles durante todo el proceso sin necesidad de realizar una
tinción posterior. El rango de masa molecular relativa de las proteínas
comprendía de 20 a 110 kDa en el caso de Low Range y de 6 a 200 kDa,
aproximadamente, en el caso de Broad Range como ya se había
comentado en apartados anteriores.
Una vez realizado el equilibrado de las tiras, se procedió a la
colocación sobre la parte superior de los geles verticales de la tira IPG,
sellando la unión entre ambos con agarosa de bajo punto de fusión al 0,5
% (p/v).
La etapa de electroforesis se realizó en una unidad Protean II xi
Cell (Bio-Rad) y el voltaje fue generado con las fuentes Power PAC 1000
y/ó 3000 (Bio-Rad). Para impedir el calentamiento del gel se mantuvo la
temperatura constante a 15 ºC gracias a un baño termostático (Frigiterm-
132
Materiales y Métodos
10, P. Selecta), que mantuvo un flujo continuo de agua a través del
interior de la cubeta de electroforesis (figura 18).
Figura 18. De izquierda a derecha: Protean II xi Cell; Power PAC; y baño termostático
(Frigiterm-10, P. Selecta).
Los parámetros utilizados para la migración de las proteínas en el
gel durante la electroforesis fueron:
 Entrada de la muestra en el gel: manteniéndose un amperaje
constante de 20 mA, 100 V y 2 W durante 15 minutos.
 Separación: se emplearon 40 mA (constantes), 400 V y 16 W durante
4-6 horas, hasta que el frente azul de bromofenol alcanzó la parte
inferior del gel.
En el caso de los minigeles, la electroforesis se realizó de forma
análoga al proceso descrito para la SDS-PAGE monodimensional
(apartado 2.4.), empleando el equipo Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad) y la
fuente de alimentación PowerPac 165-5050 (Bio-Rad). La única diferencia
que existe en la 2D-PAGE, con relación a la SDS-PAGE, es que no existe
un gel concentrador ni pocillos de carga, de forma que la tira con el gel
procedente del IEF debe colocarse sobre la parte superior del gel
separador, sellándose la unión con agarosa al 0,5 % (p/v), al igual que en
el caso de los geles grandes. El voltaje empleado en este caso fue de 90 V
para la entrada de la muestra en el gel y 150 V para la separación de las
proteínas, con un límite de intensidad máximo de 1,8 A.
133
Materiales y Métodos
Una vez finalizada la electroforesis, los geles se introdujeron en la
solución fijadora correspondiente para llevar a cabo la tinción, o bien las
proteínas se transfirieron a membranas de PVDF para proceder a la
inmunodetección específica de proteínas.
2.5.4.
Electroforesis PAGE en condiciones nativas
Cuando se desea estudiar la actividad biológica tras la separación
de
proteínas y
de
complejos proteicos
intactos
sin
que
sufran
desnaturalización, la electroforesis nativa es una de las técnicas más
empleadas. Con este método las proteínas, y complejos proteicos, se
separan en función de su masa, como en el caso de la SDS-PAGE, pero
también en función de su carga, pudiéndose distinguir proteínas con
cargas similares pero pI relativamente diferentes. Pese a que hay diversas
variantes del método en función del sistema empleado, en nuestro caso
se decidió emplear una técnica similar a la SDS-PAGE descrita en el
apartado 2.4., en el que se sigue el sistema de Laemmli (Laemli, 1970),
pero en este caso se omite completamente el uso de SDS y el βmercaptoetanol en las soluciones de la electroforesis. El tampón de carga
empleado en este método consistió en una mezcla compuesta por TrisHCl 75mM pH 6,8, azul de bromofenol 0,1 % (p/v), y glicerol 10 % (v/v).
Las características de este método se definen como de alto pH,
debido al uso del sistema Tris-glicina como tamponante (rango de pH
8,3-9,5), y es el indicado para resolver adecuadamente aquellas proteínas
cuyo pI es inferior y no muy cercano a 8,3 (pH del tampón de electrodo),
ya que podría producirse precipitación. Por lo tanto, todas las proteínas
con pI inferior a 8,3 migran al ánodo (Shi y Jackowski, 1998; Schägger,
1999).
Una de las características metodológicas que debemos tener en
cuenta a la hora de realizar esta técnica es la susceptibilidad que tienen
134
Materiales y Métodos
las proteínas al ataque de proteasas. Debido a ello se mantuvieron a una
temperatura de 4 ºC desde su preparación hasta su análisis. Además,
durante la electroforesis se intentó evitar el sobrecalentamiento del gel,
puesto que podría producirse desnaturalización térmica de las proteínas,
realizando el experimento a 100 V en la fase separadora y sin límite
prefijado de amperaje.
En este caso, y al igual que la SDS-PAGE, se resolvieron de 50 µg
a 1 µg de proteína en cada una de las muestras estudiadas. El gel
concentrador se mantuvo al 4 % (p/v) de poliacrilamida, mientras que el
separador se preparó al 10 % (p/v).
2.6.
2.6.1.
Tinción de geles de poliacrilamida
Tinción con azul brillante de Coomassie
Una vez obtenido el gel, se procedió a la tinción del mismo
mediante una disolución del colorante azul brillante de Coomassie R-250
al 0,1 % (p/v), que fue preparado en etanol al 40 % (v/v) y ácido acético
glacial al 10 % (v/v), donde se incubó el gel durante 2 horas. Para
desteñir se utilizó una solución al 40 % (v/v) en etanol y al 10 % (v/v) en
ácido acético glacial, incubando el gel 20 minutos y repitiendo el proceso
2 o 3 veces. Para la eliminación de los restos de colorante que no se
uniese específicamente a las proteínas se dejaron los geles en agua milliQ durante toda la noche.
Tras la tinción, se obtuvieron las imágenes de cada gel mediante el
densitómetro GS-800 (Bio-Rad), para muestras visibles. Puesto que este
densitómetro está configurado para su calibración automática cada vez
que se enciende, todas las imágenes fueron obtenidas en idénticas
135
Materiales y Métodos
condiciones, por lo que se pudieron emplear los valores de densidad
óptica (intensidad) para estudios comparativos.
2.6.2.
Tinción con nitrato de plata compatible con
espectrometría de masas
Para realizar esta tinción, una vez realizada la electroforesis, los
geles se introdujeron en una solución fijadora durante toda la noche
para poder llevar a cabo el proceso de tinción con nitrato de plata al día
siguiente. Puesto que las proteínas serían identificadas mediante MS se
tuvo que llevar a cabo una tinción compatible.
Para la tinción con nitrato de plata específica para MS se
realizaron los siguientes pasos:
Fijación: etanol 40 % (v/v), ácido acético 10 % (v/v) (toda la
noche).
Lavado: agua ultrapura (5 min).
Sensibilización: acetato de sodio 6,8 % (p/v), tiosulfato sódico
0,3 % (p/v), etanol 30 % (v/v) (60 min).
Lavados: agua ultrapura (6 x 10 min).
Reacción de plata: nitrato de plata 0,1 % (p/v) (30 min).
Lavados: agua ultrapura (3 x 20 s).
Revelado: carbonato sódico 3 % (p/v), formaldehído (37 %)
0,025 % (v/v) (15-20 min).
Lavado: agua ultrapura (20 s).
136
Materiales y Métodos
Parada: ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 1,46 % (p/v) (10
min).
Lavados: agua ultrapura (3 x 5 min).
De los geles resultantes también se obtuvieron las imágenes
digitalizadas empleando el densitómetro GS-800 (Bio-Rad) para muestras
visibles, tal y como se ha especificado en el apartado anterior.
2.7.
Transferencia
de
proteínas
a
membranas mediante Western Blot
En el caso de querer llevar a cabo una tinción con anticuerpos
específicos, los geles en una dimensión (1D) y/o minigeles en dos
dimensiones (2D) fueron sometidos a la transferencia de proteínas
empleando el método Western Blot. Este método es un tipo de sistema de
blotting, también conocido como “en tanque” o “húmedo”.
Las proteínas que estaban inmersas en el gel fueron transferidas a
membranas de PVDF de 0,45 µm para la detección de proteínas de > 10
kDa (Immobilon-P, Millipore), siguiendo para ello el método descrito por
Towbin y colaboradores (Towbin et al., 1979). Para llevar a cabo la
transferencia, una vez finalizada la electroforesis, los geles se incubaron
en una disolución amortiguadora de Tris/glicina (Tris 25 mM y glicina
192 mM, pH 8,3), con un 10 % (v/v) de metanol, para su equilibrado. La
pieza de membrana, de tamaño similar al gel, se activó en metanol 100 %
(v/v) durante 30 segundos, lo que le permitió pasar del estado
hidrofóbico a polar. Posteriormente se incubó durante 2 minutos en agua
ultrapura,
y
finalmente
se
equilibró
en
la
misma
disolución
amortiguadora que el gel durante 30 segundos. Esta disolución
amortiguadora se emplearía también para la transferencia, que se
realizaría a 100 V (límite de 1,6 A) durante 1 hora en el Mini Trans-Blot
137
Materiales y Métodos
(Bio-Rad), conectado a la fuente de alimentación Model 200/2,0 (Bio-Rad)
(figura 19). Puesto que la transferencia requiere del mantenimiento de
una conductividad y temperatura uniformes a lo largo de toda la cubeta,
fue necesario el uso de agitación en el interior del tanque.
Figura 19. Imagen de la fuente de alimentación Model 200/2,0 (Bio-Rad) y el equipo Mini
Trans-Blot (derecha) empleado para la transferencia a membrana de las proteínas.
Una vez finalizada la transferencia, la membrana se lavó con agua
milli-Q y se inició la inmunodetección. El gel se recuperó para realizar
una tinción con azul brillante de Coomassie, como control de la eficiencia
del proceso de transferencia.
2.7.1.
Tinción con rojo Ponceau S
Como precaución, para poder comprobar que realmente había
ocurrido la transferencia antes de la inmunodetección, las membranas
de PVDF fueron teñidas con un colorante que, aunque presenta baja
sensibilidad, se une de modo reversible a las proteínas.
La membrana se incubó durante 5 min en una disolución de
Ponceau S disuelto al 0,2 % (p/v) en ácido tricloroacético (TCA) 3 % (v/v).
El desteñido del mismo se realizó con agua ultrapura hasta que las
bandas y/o spots mayoritarios fueron visibles.
138
Materiales y Métodos
Antes de proceder a la inmunodetección, se destiñó lo máximo
posible la membrana, desapareciendo los restos de colorante que
pudiesen haber quedado, con la solución de bloqueo.
2.7.2.
Inmunodetección de proteínas
Una vez finalizada la transferencia de proteínas, en el caso de
membranas
procedentes
de
Western
Blot
se
procedió
a
la
inmunodetección de la proteína de interés. La membrana se bloqueó en
una disolución de leche desnatada al 5 % (p/v) en disolución
amortiguadora salina de fosfato pH 7,4 (Phosphate-Buffered Saline,
(PBS)) durante 2 horas a temperatura ambiente y en agitación. A
continuación se incubó con el anticuerpo primario a 4 ºC, en agitación
leve y durante toda la noche. Una vez lavada la membrana con PBS (3
veces por 5 minuos), se incubó con el anticuerpo secundario durante 90
minutos a temperatura ambiente y en agitación.
El anticuerpo secundario empleado (anti-ratón, específico para Ig
G (H+L) de Sigma) estaba conjugado con la enzima fosfatasa alcalina, y
se empleó diluido en la disolución de bloqueo. El siguiente paso llevado a
cabo consistió en varios lavados con PBS (2 lavados de 5 minutos),
seguidos de un lavado con Tween-20 al 0,05 % (v/v) en PBS (1 lavado x 4
minutos), y por último lavados rápidos con PBS (2 lavados de 30
segundos).
El revelado de la membrana se realizó mediante la adición del
sustrato de la fosfatasa alcalina, el 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP: 0,19 mg/mL), unido al cromógeno azul de nitrotetrazolio (NBT: 0,4
mg/mL) en Tris 100 mM pH 9,5 y sulfato de magnesio 50 mM, sin
agitación y en oscuridad. La hidrólisis de este sustrato por acción de la
enzima genera un precipitado de color azulado visible a simple vista.
139
Materiales y Métodos
El tiempo que se necesitó para la observación de las bandas
proteicas osciló entre los 5 y los 60 minutos, en función del tipo de
proteína inmunodetectada. Para parar la reacción, se sumergió la
membrana en agua destilada durante 10 minutos. El análisis posterior
de las imágenes se realizó como se describe en el apartado 2.8.
2.7.2.1. Inmunodetección de la proteína PEDF
Como anticuerpo primario se empleó 1 μg/mL de un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-PEDF humano (MAB1059, clone 10F12.2,
Millipore), en disolución de bloqueo. El anticuerpo secundario empleado
fue Ig G (H+L) de cabra anti-ratón conjugada con la enzima fosfatasa
alcalina (Sigma), diluida 1/3.000 en disolución de bloqueo.
2.7.2.2. Inmunodetección de la proteína S100-A9
Como anticuerpo primario se empleó 1 μg/mL de un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-S100-A9 humano (ab24111, abcam), en
disolución de bloqueo. El anticuerpo secundario empleado fue Ig G (H+L)
de cabra anti-ratón conjugada con la enzima fosfatasa alcalina (Sigma),
diluida 1/3.000 y 1/15.000 en disolución de bloqueo.
2.8.
2.8.1.
Análisis de imagen
Adquisición de la imagen
De cada uno de los geles y de cada una de las membranas de
PVDF obtuvimos una imagen digitalizada empleando el densitómetro GS800 (Bio-Rad), que es un tipo de escáner más potente, capaz de
calibrarse de modo automático cada vez que se enciende. La adquisición
140
Materiales y Métodos
de las imágenes se realizó desde los programas específicos de análisis de
imágenes 1D (Quantity One 4.4.1. de Bio-Rad) y 2D (PDQuest 7.3.0 de
Bio-Rad), que permiten almacenar los datos asociados a la imagen
(distribución de la intensidad, tamaño real del gel o de la membrana,
etc.), haciéndolos disponibles de modo directo para el análisis (figura 20).
Figura 20. Imagen del densitómetro CS 800 (Bio-Rad) empleado para el escaneado de
geles y membranas.
Las imágenes obtenidas fueron adquiridas con una resolución
media (63,5 µm x 63,5 µm), empleándose el modo de transmisión de luz
para los geles, y el modo refractivo para las membranas. En el caso de
los geles, fue necesario el empleo de un filtro de luz complementario al
color de tinción del gel, que para los geles teñidos con nitrato de plata se
corresponde con el filtro de luz verde, y para los teñidos con azul
brillante de Coomassie con el filtro para luz roja, mientras que las
membranas de PVDF se escanearon con un filtro de luz verde. Las
imágenes obtenidas en ambos casos se denominan mapas proteicos o
mapas 1D o 2D.
2.8.2.
Análisis de patrones monodimensionales
Las imágenes de los geles teñidos mediante azul brillante de
Coomassie, nitrato de plata, y/o las membranas procedentes de la
141
Materiales y Métodos
transferencia y de la posterior inmunotinción de geles 1D, fueron
analizadas con el programa Quantity One 4.4.1. (Bio-Rad). Este programa
trabaja con archivos de tipo lsc, por lo que todas las imágenes 1D fueron
adquiridas de modo específico.
El análisis estándar comienza con la delimitación del número de
carriles que presenta el gel/membrana, carriles que debemos ajustar
para corregir posibles desviaciones (efectos de borde, o curvaturas de
carriles laterales). A continuación, el programa nos permite determinar y
eliminar el posible ruido de fondo que existe, pudiendo posteriormente
detectar con mayor precisión cada una de las bandas. Esta detección se
puede realizar de manera manual, señalándose aquellas bandas que el
programa no ha considerado como tales, o bien eliminando aquellos
artefactos considerados como bandas. Esta intervención manual se hace
necesaria para ajustar el ancho de las bandas, y para la delimitación de
las mismas.
Completada la detección, se establecen los valores de Mr
correspondientes a los marcadores de peso molecular empleados y se
calcula, mediante regresión logarítmica, el coeficiente de correlación
entre la distancia recorrida por los marcadores y el logaritmo de Mr,
extrapolando los valores de masa correspondientes a las bandas de las
muestras, y eliminando el valor de aquel marcador que no se ajustó a
dicha correlación.
El programa nos permite obtener un archivo de texto con todos los
datos, en los que cada banda proteica aparece identificada con un
número de carril y banda, y tiene asociada información sobre la masa y
la cantidad de señal (denominada en el programa trace quantity),
representativa de la cantidad de proteína. Dicha cantidad viene dada por
el área bajo la curva de intensidad de la banda, por lo que la unidad de
medida será intensidad multiplicada por la longitud de la banda (mm),
aunque para su simplificación se emplea el término intensidad para
142
Materiales y Métodos
referirnos a la cantidad de señal detectada. Además, es posible calcular
la cantidad relativa de proteína en cada una de las bandas, en relación
con el resto de bandas pertenecientes a la misma muestra, y en el caso
de tener un patrón de cantidad de proteína (un duplicado de la
membrana en otro gel), es posible hacer una determinación de la misma.
Además de todas las aplicaciones ya mencionadas, el programa
ofrece diferentes opciones de visualización, representaciones gráficas e
informes.
2.8.3.
Análisis de patrones bidimensionales
Dada la complejidad que presentan los patrones 2D, su análisis
tuvo que ser realizado a través de un programa específico. En este
estudio se han comparado los geles y membranas 2D de proteínas
empleando el software PDQuest 7.3.0. (Bio-Rad), que es considerado uno
de los programas informáticos más robustos del mercado, ante el
solapamiento o superposición de las manchas proteicas o spots (Dowsey
et al., 2003; Marengo et al., 2005; Rogers et al., 2003).
En este caso, el funcionamiento se basa en la asignación para
cada uno de los puntos detectados en un gel/membrana de unas
coordenadas X e Y (pixels), que se corresponden con su posición
horizontal y vertical en la imagen (lo que nos proporciona el área de cada
uno de los spots) y un valor Z que determina la intensidad de la señal
(Marengo et al., 2005). En cada spot, el volumen del mismo se calculará
como la intensidad multiplicada por el área (intensidad x mm2), lo que
nos proporciona una medida cuantitativa de cada proteína.
Para poder dar comienzo al análisis, las imágenes de los geles y de
las membranas fueron modificadas con este software, de modo que se
recortaron automáticamente siguiéndose un mismo criterio, en el que
sólo se excluyesen los bordes de los geles y membranas donde no
143
Materiales y Métodos
hubiese spots. Tras este paso se procedió al ajuste de los parámetros de
identificación para la detección automática de spots, señalando el spot
que hemos considerado más pequeño (lo que sirvió para determinar el
tamaño máximo de impurezas), el más grande (que permite detectar
arrastre o spots solapados) y el menos intenso (estableciendo así el nivel
de ruido de fondo).
Cuando las manchas proteicas son detectadas mediante el
programa PDQuest, la imagen original es filtrada y suavizada para una
mejor visualización de los puntos detectados. A partir de la imagen
filtrada, se construyen a continuación los spots tridimensionales
ajustados a un modelo gaussiano. El resultado final son tres imágenes
separadas: la original digitalizada, la filtrada y procesada, y la gaussiana.
Procesadas las imágenes, y de modo individual para cada una de
ellas, se procedió a eliminar de forma manual las marcas detectadas que
no se correspondían con spots. Estas marcas, visibles en la imagen
digitalizada y en la filtrada, no se observan en la imagen sintética
gaussiana. Por este motivo, sobre la imagen gaussiana es sobre la que se
realizará el análisis de los datos (ya que en un experimento ideal la
distribución de las proteínas debería ajustarse a una curva de Gauss).
Una de las ventajas que podemos obtener con este sistema es que, al
modelizar las manchas solapantes, con arrastre o cluster, podemos
obtener datos de intensidad y posición (y por tanto de cantidad, Mr y pI)
muy próximos a los reales (Garrels, 1989).
Detectadas y revisadas las marcas, se procedió al reconocimiento y
alineamiento de las imágenes, mediante un proceso denominado
matching. Sobre las imágenes de los geles o membranas a analizar se van
marcando aquellos spots presentes en todas las imágenes (de modo
automático o manual), y gracias al empleo de coordenadas X e Y, se
pueden ir reconociendo los puntos que representan los mismos spots en
las diferentes imágenes.
144
Materiales y Métodos
Una de las cosas importantes es que, mediante una de las
opciones del programa, es posible intercambiar la imagen escaneada de
los mapas de la comparación o matchset por sus correspondientes
imágenes filtradas o gaussianas, tantas veces como lo deseemos,
facilitándonos la visualización de los spots. Sin embargo, la imagen de
referencia o master es una imagen gaussiana no modificable en este
sentido.
Finalizado
el
alineamiento,
el
programa
nos
permite
la
normalización de los datos en partes por millón (ppm), o porcentaje (%),
calculando un valor de la cantidad normalizada que denomina “volumen
relativo”; valor que se corresponde con el área del spot multiplicada por
el valor de intensidad relativa a la intensidad total detectada en el gel o
en la membrana. El empleo de parámetros relativos nos permite la
eliminación de las diferencias debidas a la tinción con nitrato de plata
(puesto que el fondo de tinción también determina la intensidad de los
spots), al fondo de la inmunodetección en el caso de las membranas, y a
otros factores como son los errores de manipulación. Se puede
considerar, por tanto, que el “volumen relativo” de un spot es un dato
que representa a la cantidad de proteína (Byrjalsen et al., 1999; López et
al., 2001; Tsuji et al., 1999; Yan et al., 1999).
Los datos obtenidos para cada imagen se pueden exportar y
utilizar para hacer una serie de análisis cualitativos o cuantitativos.
Además, el programa permite obtener histogramas de intensidad en uno
o varios spots, así como datos de regresión, superposición de imágenes,
etc.
2.9.
Electroforesis diferencial en gel
La metodología empleada para determinar la expresión diferencial
de proteínas entre muestras de DPM y DPB se llevó a cabo utilizando
145
Materiales y Métodos
una
variante
de
la
electroforesis
bidimensional
denominada
Electroforesis Diferencial en Gel (DIGE).
2.9.1.
Preparación y marcaje de las muestras
Las muestras de 4 pacientes con DPB y 4 pacientes con DPM
fueron centrifugadas, y los precipitados resultantes se resuspendieron en
50 μL de urea 8 M, tiourea 2 M, CHAPS 4 % y Tris 30 mM,
determinándose la concentración de proteínas mediante el método de
Bradford modificado (ver apartado 2.3.2. del presente capítulo).
Los fluoróforos CyDye (Cy2, Cy3, Cy5) se reconstituyeron en
dimetilformamida anhidra. Una vez reconstituidos, el Cy2 mostró
coloración amarilla, el Cy3 roja, y el Cy5 azul. Para la manipulación de
los fluoróforos se mantuvo la muestra en una cámara oscura y en hielo.
Para el marcaje se empleó el Cy5 para 2 muestras de DPB y 2 de
DPM, el Cy3 para los otras 2 muestras de DPB y 2 de DPM, y el Cy2
para los estándares internos, con la intención de reducir el error
experimental debido al marcaje diferencial.
Cada estándar interno se componía de 6,25 μg de proteína de cada
una de las muestras, y para todas las muestras se prepararon 50 μg de
proteína total. En cada vial de muestra se añadieron 400 pmoles del
fluoróforo correspondiente por cada 50 μg de proteína. Una vez
preparada la muestra se dejó reaccionar en hielo durante 30 minutos en
oscuridad. El marcaje se terminó mediante la adición de lisina (1 μl de
Lisina 10 mM/50 μg proteína), dejándola reaccionar durante 10 minutos
en hielo. Las muestras, combinadas tras el marcaje, se disolvieron en un
tampón de rehidratación compuesto por urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4
% (p/v), DTT 0,2 % (p/v) y 0,5 % (v/v) anfolitos 3-10.
146
Materiales y Métodos
2.9.2.
Electroforesis bidimensional
Para la primera dimensión, la separación se realizó en geles de
poliacrilamida de 24 cm de longitud, con rango no lineal de pH de 3 - 11
(Immobilon Dry Strip, Amersham Biosciences).
El IEF se realizó en el IPGphor™ Manifold (GE Healthcare Life
Sciences). En primer lugar se llevó a cabo la rehidratación activa,
aplicando 10 V durante 12 horas. A continuación se aplicaron 500 V de
manera constante durante 1 hora; posteriormente, y en gradiente, se
aplicarían 1.000 V durante 1 hora; después se mantuvo en gradiente
hasta 5.000 V durante 2 horas; 5.000 V constantes durante 7 horas; y
finalmente habría un paso final de mantenimiento con un voltaje
constante a 500 V. La fase de equilibrado de las muestras se realizó
conforme a lo que se describió en el apartado 2.5.2. del presente
capítulo.
La segunda dimensión se llevó a cabo en un sistema DALTsix
(Amersham Biosciences). Tras el ensamblaje de los cristales, se
prepararon los geles de poliacrilamida (12 % T y 2,6 % C), que
presentaron unas dimensiones de 25,5 cm x 20,5 cm x 1 mm. La SDSPAGE se realizó a una intensidad constante de 2 W/gel, con temperatura
estable de + 20 ºC durante 17 horas.
2.9.3.
Adquisición de las imágenes
Una vez realizada la 2-DE, las imágenes de los geles fueron
adquiridas en el densitómetro Typhoon 9400 (Amersham Biosciences)
con filtros específicos para las señales de fluorescencia que se iban a
medir, donde se aplicaron las longitudes de onda de excitación y emisión
correspondientes a cada fluoróforo (tabla 8). Los geles se escanearon
147
Materiales y Métodos
entre los cristales, con iluminación basal, y aplicando las longitudes de
onda de excitación y emisión correspondientes.
Tabla 8. Longitudes de onda de excitación y emisión de los tres fluoróforos CyDye
empleados.
Cy2
Cy3
Cy5
λ excitación
488
512/52
625/50
λ emisión
515
565/615
670
λ: longitud de onda en nm.
2.9.4.
Los
Análisis diferencial de intensidad
estudios
comparativos
de
cada
una
de
las
imágenes
adquiridas en un único gel fueron realizados mediante el programa
DeCyder, versión 6.5 (Amersham Biosciences), con su módulo Differential
In-Gel Analysis, que fue capaz de detectar automáticamente cada una de
las manchas correspondientes a las proteínas resueltas, y realizar los
análisis comparativos ofreciendo una medida ajustada de los cambios de
abundancia de las proteínas diferenciales. Además de la detección de
manchas proteicas, permitió la sustracción del fondo de la imagen, la
normalización de los valores de intensidad y la eliminación de artefactos.
Para comparar muestras de DPB frente a DPM se empleó en el
módulo
Biological
Variation
Analysis.
Este
módulo
permite
el
emparejamiento de las manchas proteicas detectadas en todos los geles,
gracias a la existencia del estándar interno constituido por todas las
muestras analizadas, y es capaz de calcular los cambios en la
abundancia relativa de cada uno de los spots analizados. Además,
detecta spots cuya diferencia entre los dos grupos estudiados es
significativa mediante la prueba t de Student (p < 0,05). Puesto que la
148
Materiales y Métodos
prueba paramétrica contemplada en el programa no era la adecuada
para el pequeño tamaño muestral, se realizaron estudios de comparación
de muestras empleando la correspondiente prueba no paramétrica (U de
Mann-Whitney).
2.10. Espectrometría de masas
2.10.1.
Digestión de las proteínas y obtención de
péptidos trípticos
Para la identificación mediante MS de las proteínas de interés,
éstas fueron extraídas de geles 2D preparativos revelados con la tinción
de nitrato de plata específica para masas, que es mucho más sensible y
permite la visualización de un mayor número de proteínas usando una
menor cantidad de muestra para ello. Sin embargo, para la identificación
de las proteínas alteradas encontradas en los geles obtenidos tras el
análisis DIGE, se realizaron geles 2D preparativos que fueron revelados
con azul brillante de Coomassie, el empleo de esta tinción permitía
cargar una mayor cantidad de muestra por gel, y por tanto podríamos
detectar mucho mejor las proteínas alteradas. La digestión fue realizada
de manera similar para ambos tipos de tinciones, aunque con ligeras
diferencias entre ellas que serán detalladas a continuación.
Las piezas de gel obtenidas mediante el digestor automático
Proteineer dp (Bruker) se introdujeron en una placa de 96 pocillos. Para
eliminar la tinción, los geles teñidos con nitrato de plata fueron tratados
con una disolución de 30 mM de Potasio hexacianoferrato II (K2 [Fe
(CN)6]) y 100 mM tiosulfato de sodio pentahidratado (Na2S2O3·5H2O). En
el resto de los geles teñidos con Coomassie se realizaron 2 lavados con
agua milli-Q durante 10 min y se eliminó el colorante del gel mediante la
149
Materiales y Métodos
incubación con 20 μL de acetonitrilo (AcN) 100 % (v/v) durante 15
minutos, y el posterior congelado durante 30 minutos.
Una vez retirado el líquido del último lavado, las piezas de gel se
secaron al vacío durante aproximadamente 30 minutos en una
centrífuga Speed-Vac (Savant) para deshidratar la muestra. La muestra
se incubó con 10 mM DTT en bicarbonato de amonio (NH4HCO3) 25 mM
(50 mM en el caso de geles teñidos con nitrato de plata) durante 30
minutos a 56 ºC para que se produjese la reducción. Una vez
transcurrido este tiempo el DTT se retiró rápidamente y se añadió a
continuación IAA 55 mM en 25 mM NH4HCO3 (50 mM para geles teñidos
con nitrato de plata) durante 15 minutos en oscuridad. La digestión fue
acompañada de 12,5 ng/µL de tripsina (Roche Molecular Biochemicals)
en 25 mM de NH4HCO3, pH 8,5, a 37 ºC durante toda la noche.
Tras la digestión, el sobrenadante fue recolectado y 1 µL del
mismo fue añadido a la placa de MALDI, donde se dejó secar a
temperatura
ambiente.
Después
se
añadieron
0,5
µL
de
una
concentración de 3 mg/mL de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico
(Sigma) en 50 % (v/v) de ACN que fueron añadidos sobre el péptido
digerido y seco, y se dejó para que se secase a temperatura ambiente.
2.10.2.
Análisis por MALDI-TOF y MS/MS
Para el análisis de la huella peptídica se empleó un MALDI-TOF,
modelo Voyager DE-STR Biospectrometry Workstation con cámara de
colisión (Applied Biosystems).
Como soporte se utilizó una placa de MALDI en la cual se
depositaron, en cada una de las celdas que presenta, una mezcla de cada
una de las muestras digeridas y de la matriz de ácido α-ciano-4hidroxicinámico. De esta manera, cuando la muestra fue golpeada por el
láser, los analitos se ionizaron entrando en una cámara de vacío que los
150
Materiales y Métodos
condujo hacia el analizador del espectrómetro. El espectrómetro opera en
un modo de reflector positivo que es capaz de alcanzar un voltaje de
aceleración de 20.000 V. Además, para poder calibrar el espectro se
emplearon péptidos internos de la digestión con tripsina.
Se adquirieron los espectros de masas y los péptidos identificados
de modo ambiguo mediante PMF (por sus siglas en inglés: peptide mass
fingerprinting) fueron enviados a un segundo analizador, fragmentándose
por colisión (MS/MS). En este caso se obtuvieron espectros de masas
correspondientes a oligopéptidos o aminoácidos (figura 21).
Figura 21. Imagen representativa de cómo ocurre la activación de los iones de la
muestra, cómo estos viajan a través del tubo de MALDI, y el patrón de masas obtenido al
final del proceso de identificación peptídica.
2.10.3.
Búsqueda en bases de datos e identificación
de proteínas
Una vez generados los espectros de masas, se calcularon los
valores de m/z experimentales y se realizaron búsquedas en bases de
151
Materiales y Métodos
datos, como NCBInr (por sus siglas en inglés: National Center for
Biotechnology Information), con el motor de búsqueda Mascot Daemon
search engine
2.1
(Matrix Science,
http://www.matrixscience.com;
(Cottrell, London 1999)), en las cuales se compararon los valores teóricos
de m/z de las secuencias aminoacídicas contenidas en estas bases.
Los parámetros de búsqueda empleados fueron: reglas de corte
para la enzima tripsina, posibilidad de un único error de corte de la
enzima, cabamidometil como modificación fija, y oxidación como
modificación variable. Además, para los valores de masa monoisotópica
seleccionados para PMF, la masa de proteína fue ilimitada, y se designó ±
50 ppm de tolerancia para la masa del péptido. Para cuestiones de
secuencias y búsquedas de iones en MS/MS, la tolerancia de la masa de
los péptidos fue de ± 100 ppm y la tolerancia de los fragmentos de ± 0.3
Da. La mayor parte de los resultados se aceptaron (p < 0,05 siendo p la
probabilidad de que lo observado se parezca a un evento aleatorio).
Cuando el resultado de la búsqueda fue significativo (> 95 %
confianza), la proteína se consideró identificada.
2.11. Determinación de la concentración de
los marcadores en el fluido pleural
Estos ensayos fueron realizados tanto en las muestras de fluido
pleural de pacientes con patología maligna como en pacientes con
derrame pleural benigno.
152
Materiales y Métodos
2.11.1.
Determinación de los niveles de la proteína
PEDF
Se determinó la concentración de la proteína PEDF en el fluido
pleural empleándose para ello el inmunoensayo específico Pigment
Epithelium-Derived
Factor
(PEDF)
Sandwich
ELISA
Kit
(Chemicon
International, USA & Canada). El ELISA fue desarrollado según las
instrucciones del fabricante, estimando las concentraciones de PEDF en
función de la recta patrón obtenida a partir del análisis de las diluciones
de las series de los estándares. Dicho análisis fue realizado en un lector
de microplacas de 96 pocillos (EnVision Multilabel Plate Reader, Perkin
Elmer) a una longitud de onda de 450 nm.
2.11.2.
Valoración de los niveles de la proteína
Calprotectina
Se determinó la concentración de la calprotectina en el fluido
pleural mediante el empleo del inmunoensayo específico Human
Calprotectin ELISA Kit (Hycult biotech, Paises Bajos). El ELISA fue
desarrollado
siguiendo
las
instrucciones
del
fabricante,
y
las
concentraciones de Calprotectina se estimaron en función de la recta
patrón obtenida a partir del análisis de las diluciones en serie de los
estándares. Dicho análisis fue realizado en un lector de microplacas de
96 pocillos (EnVision Multilabel Plate Reader, Perkin Elmer) a una
longitud de onda de 450 nm.
2.12. Tratamiento estadístico de los datos
Las pruebas se realizaron con el programa estadístico SPSS en su
versión 15.0 para WINDOWS (Copyright© SPSS Inc. 1989-2002).
153
Materiales y Métodos
2.12.1.
Análisis estadísticos
En todos los casos, tanto en la parte de la búsqueda de
marcadores como en la validación de los mismos, antes de realizar los
análisis estadísticos de cada uno de los parámetros bioquímicos a
estudio fue necesario comprobar si los valores de las variables se
ajustaban a una distribución normal; para ello se aplicó el test de
Kolmogorov-Smirnov a cada muestra poblacional.
Una vez comprobada la normalidad de cada variable se realizó el
test de Levene, con el cual se verificó la existencia de homogeneidad de
varianzas de la variable a estudio para cada uno de los factores
considerados. Realizados ambos test pudimos encontrarnos ante dos
situaciones diferentes:
- Distribución normal de la variable de estudio y existencia de
homogeneidad de varianzas para dicha variable. En este caso fue
necesario el empleo de un test de tipo paramétrico para la igualdad de
medias.
- Si la distribución de la variable de estudio no era normal o no
existía homogeneidad de varianzas para dicha variable. En este caso fue
necesario el empleo de estadística de tipo no paramétrica.
2.12.1.1.
Análisis estadístico univariantes
Para la comparación del volumen relativo de los spots de pacientes
con DPB y DPM se empleó la prueba no paramétrica de la U de Mann
Whitney para dos muestras independientes. Considerándose un límite de
significación asintótica (bilateral) del 95 %, admitiéndose diferencias
significativas si p ≤ 0,05.
Para realizar un análisis estadístico de la comparación de los
niveles de marcadores debemos tener en cuenta que al emplear la
154
Materiales y Métodos
estadística paramétrica, el test de contraste de hipótesis para dos
muestras independientes empleado fue la t de Student, mientras que
para realizar los análisis de varianza, el test por defecto en este caso fue
el ANOVA de 1 factor.
En la estadística no paramétrica, el test de contraste de hipótesis
para dos muestras independientes empleando sería la U de MannWhitney, y para realizar el análisis equivalente al análisis de varianza
paramétrico se empleó el test de Kruskal-Wallis.
2.12.1.2.
Análisis estadísticos multivariantes
Los datos de volumen relativo de los spots cuya variación
cuantitativa
había
resultado
estadísticamente
significativa
fueron
estudiados mediante el análisis de componentes principales (ACP).
Además, para el análisis de las diferentes variables clinicopatológicas,
con los candidatos a marcadores fue empleada la regresión logística. La
base
metodológica
de
estas
pruebas
estadísticas
se
detalla
a
continuación.
a)
Análisis de componentes principales
Las relaciones que se presentan entre x variables correlacionadas
pueden transformarse en otro conjunto de nuevas variables no
correlacionadas entre sí llamado conjunto de componentes principales
(CPs). En este estudio los CPs extraídos del análisis fueron contrastados
estadísticamente con la prueba U de Mann-Whitney, considerándose
significativos si p ≤ 0,05. La matriz de correlaciones contiene las
correlaciones entre las variables originales y cada uno de los CPs
extraídos del análisis.
155
Materiales y Métodos
b)
Regresión
Existen varias opciones para estimar un modelo de regresión, de
entre los que destacan, por su facilidad de aplicación e interpretación, el
modelo de regresión lineal y el modelo de regresión logística. Cuando la
variable dependiente es una variable continua, el modelo de regresión
más utilizado fue la regresión lineal, mientras que cuando la variable de
interés fue dicotómica (es decir, toma dos valores como sí/no,
hombre/mujer) se utilizó la regresión logística.
c)
Correlación
La correlación es una medida sobre el grado de relación entre 2
variables sin importar cuál es la causa y cuál es el efecto. La
dependencia de la que se habla en este sentido es la dependencia de la
varianza de las variables. Existen diferentes tipos de correlación:
- Correlación de Pearson: es un índice que mide la relación lineal
entre dos variables aleatorias cuantitativas y, que a diferencia de la
covarianza, es independiente de la escala de medida de las variables.
- Correlación de Spearman: es una correlación lineal entre dos
variables pero que, a diferencia de la de Pearson, esta emplea valores
medidos a nivel de una escala ordinal (si las variables están medidas a
nivel de intervalo/razón deben convertirse a ordinales antes de
emplearla).
- Tau de Kendall: Es un estadístico usado para medir la asociación
entre dos cantidades medibles. Es una medida de la correlación del
rango, de la similitud de los órdenes de datos cuando se clasifican
cantidades.
156
Materiales y Métodos
2.12.1.3.
Curvas ROC
Para la elaboración de una curva de características operativas
relativas (curva ROC), se siguió el procedimiento descrito por Beck y
Shultz (Beck, Shultz 1986). En esta curva están representados, para
cada uno de los posibles puntos de corte que son tomados en función de
los niveles de marcador de la muestra poblacional de pacientes con DPM,
el porcentaje de verdaderos positivos (sensibilidad) en el eje de
ordenadas, frente al porcentaje de falsos positivos (100-especificidad) en
el eje de abscisas. El porcentaje de verdaderos positivos se calcula en
función del número de individuos correctamente clasificados como
enfermos por la prueba, con respecto al total de individuos de la muestra
poblacional. El porcentaje de falsos positivos se calcula en función del
número de individuos que, estando sanos, son erróneamente clasificados
como enfermos por la prueba, con respecto al total de individuos de la
muestra poblacional.
Con ayuda del perfil de la curva ROC se determinó un punto de
corte final para establecer los parámetros diagnósticos para el DPM de
los niveles de los marcadores medidos mediante el ELISA. Estos
parámetros se definen y calculan como se detalla a continuación (Bailar
y Mosteller, 1992):
- Sensibilidad diagnóstica: probabilidad de que el resultado de la
prueba sea positivo (presencia de la enfermedad) cuando está presente la
enfermedad.
- Especificidad diagnóstica: probabilidad de que el resultado de la
prueba sea negativo (ausencia de la enfermedad) cuando no está
presente la enfermedad.
- Eficiencia diagnóstica: parámetro que relaciona el número total
de resultados correctos con el total de la muestra poblacional a estudio.
157
Materiales y Métodos
- Likehood ratio: Indica cuánto más probable es un resultado
determinado de una prueba diagnóstica en un paciente con una
enfermedad dada, comparado con un paciente que no presenta la
patología (pudiendo ser positivo o negativo). Se calcula dividiendo la
probabilidad de un resultado de una prueba diagnóstica en personas con
la enfermedad de interés, entre la probabilidad de dicho resultado en
personas sin la enfermedad.
- Valor predictivo positivo: Probabilidad de que una persona tenga
la enfermedad cuando la prueba diagnóstica da un resultado positivo.
- Valor predictivo negativo: Probabilidad de que una persona no
tenga la enfermedad cuando la prueba diagnóstica da un resultado
negativo.
- Odds Ratio: Indica la magnitud de asociación entre exposición y
el resultado (es el riesgo de haber estado expuesto, dada la enfermedad).
2.12.1.4.
Análisis de validación cruzada
La validación cruzada o cross-validation, es una técnica empleada
para evaluar los resultados de un análisis estadístico y garantizar que
son independientes de la partición entre datos de entrenamiento y datos
prueba. Consiste en repetir y calcular la media aritmética obtenida de las
medidas de evaluación sobre diferentes particiones.
Este tipo de análisis se utilizan en entornos donde el objetivo
principal es la predicción y en los que se quiere estimar cómo de preciso
es un modelo que se llevará a cabo, puesto que esta validación cruzada
es una manera de predecir el ajuste de un modelo a un hipotético
conjunto de datos de prueba cuando no disponemos del conjunto
explícito de datos de prueba.
158
Materiales y Métodos
La validación cruzada dejando uno fuera o Leave-one-out crossvalidation implica separar los datos de forma que para cada repetición
(interacción) tengamos una sola muestra para los datos de prueba, y
todo el resto se quedaría conformando los datos de entrenamiento.
Figura
22.
Validación
cruzada
dejando
uno
fuera.
Imagen
tomada
http://es.wikipedia.org
159
de
3. Resultados
Resultados
Resultados
3.1.
Búsqueda de marcadores en el fluido
pleural
3.1.1.
Depleción de las proteínas abundantes del
fluido pleural
Para conseguir la depleción de las seis proteínas mayoritarias del
fluido se procesaron los fluidos pleurales de 4 pacientes con DPB
tuberculoso y de 4 pacientes con DPM derivado de adenocarcinoma
pulmonar,
empleando
una
columna
de
afinidad
múltiple
(Hu-6)
específica para la eliminación de las proteínas mayoritarias del suero
humano: albúmina, haptoglobina, Ig G e Ig A, antitripsina y transferrina.
Posteriormente se determinó la concentración de proteínas en
todas las muestras antes de su procesamiento. Esto se hizo para realizar
un correcto ajuste del límite real de saturación de la columna, puesto
que en todos los casos se comprobó que, al emplearse una concentración
de proteínas elevada, aún en el rango de separación establecido por la
casa comercial la retención de las proteínas mayoritarias no era 100 %
eficaz.
Como se muestra en la tabla 9, este método es capaz de eliminar
más del 90 % del contenido proteico del fluido, con una media de
recuperación de proteínas minoritarias del 8,4 %. En la tabla se observa
además que la concentración media de proteínas en las muestras de
fluido pleural crudo es ligeramente superior en las muestras derivadas
de tumor que en las benignas. Sin embargo, el análisis en conjunto de la
concentración de las muestras no ha revelado la existencia de diferencias
163
Resultados
significativas en la concentración entre cada una de ellas (p = 0,386 para
el contraste de medias con la prueba U de Mann-Whitney).
La comparación de datos de la concentración de proteínas de la
fracción retenida de todas las muestras entre ambos tipos patológicos,
tampoco demostró la existencia de diferencias significativas (p = 0,564),
ni entre las muestras de la fracción eluida (p = 0,127).
Tabla 9. Cantidad de proteína (mg) en DPM y DPB.
DPM
Inicial
Fracción eluida
Fracción retenida
(Media ± DS)
(Media ± DS)
(Media ± DS)
4,45 ± 0.48
0,44 ± 0,03 (9,8 %)
3,12 ± 0,81 (70,0 %)
4,13 ± 0.38
0,63 ± 0,32 (15,3 %)
2,94 ± 0,65 (71,2 %)
(n=4)
DPB
(n=4)
DPM: derrame pleural maligno, DPB: derrame pleural benigno, de pacientes con CPNM y
tuberculosis, respectivamente. Antes y después de la depleción mediante la columna Hu6. El porcentaje del total de proteínas se muestra entre paréntesis. DS: desviación
estándar.
3.1.2.
Eficacia del prefraccionamiento del fluido
pleural
Para poder evaluar la eficacia del funcionamiento de la depleción
de las 6 proteínas más abundantes, las muestras de fluido pleural, tanto
antes como después de la depleción, se separaron mediante métodos
electroforéticos. En primer lugar se resolvieron 10 µg de proteína de
muestras de la fracción cruda del líquido pleural, de la fracción retenida
en la columna, y de la fracción eluida (donde se localizan las proteínas
minoritarias). En la figura 23 se muestra un gel SDS-PAGE teñido con
azul brillante de Coomassie.
164
Resultados
Como podemos observar, en los dos carriles cargados con fluido
pleural crudo (carriles 1 y 4) aparece una banda más intensa entre las
masas moleculares de 60 y 65 kDa, que se corresponde con la proteína
albúmina. Esta proteína aparece también en los dos carriles de la
fracción retenida (carriles 2 y 5) pero, sin embargo, apenas se observa en
la fracción eluida (carriles 3 y 6), lo que confirma una buena separación
cromatográfica.
Figura 23. Separación mediante SDS-PAGE de 10 μg de fluido pleural crudo (carriles 1 y
4), de la fracción retenida en la columna Hu-6 (carriles 2 y 5), y de la fracción eluida
(carriles 3 y 6). LMW: proteínas marcadoras de masa molecular; DPM: derrame pleural
maligno; DPB: derrame pleural benigno.
El mismo patrón se observa en las masas de aproximadamente 22
- 30 kDa y sobre 50 kDa, que se aprecian claramente en las fracciones
cruda y retenida, y en menor medida en la fracción eluida. Estos valores
de masa se corresponden con el Mr aproximado de las cadenas ligeras y
pesadas de las Ig A e Ig G, que constituyen el segundo elemento más
abundante (20 - 25 %) del fluido pleural, tras la albúmina.
Estos
patrones
fueron
observados
en
todas
las
muestras
procedentes de pacientes con patología benigna y pacientes con patología
maligna.
165
Resultados
3.1.3.
Obtención
de
mapas
proteicos
bidimensionales del fluido pleural
3.1.3.1. Optimización del método Para la comprobación de la distribución proteica en mapas
bidimensionales, se resolvieron 150 µg de proteína en tiras de IPG de 17
cm con un gradiente de pH de 3 a 10 y de 4 a 7, utilizando geles de
poliacrilamida
al
12
%
en
la
segunda
dimensión,
que
fueron
posteriormente teñidos con nitrato de plata.
Como se observa en la figura 24, la mayoría de las proteínas
estaban localizadas en torno a un rango de pH de 4-7, puesto que los
rangos 3-4 y 7-10 no presentaban un número elevado de spots
susceptibles de análisis. Por ello, para ampliar la resolución de la
muestra en el eje del pI, se escogió el rango de pH 4-7 para los análisis
posteriores.
Figura 24. Mapas 2D obtenidos a partir de la fracción eluida en la cromatografía HU-6 de
muestras de DPM, resueltas en rangos de pH de 4-7 (izquierda) y de 3-10 (derecha). Mr:
masa molecular relativa; pI: punto isoeléctrico.
166
Resultados
3.1.3.2. Efecto del prefraccionamiento mediante Hu-6
sobre el patrón bidimensional de proteínas de fluido pleural
humano La optimización de la 2-DE nos permitió evaluar el efecto del
prefraccionamiento de la columna Hu-6 sobre los geles bidimensionales
de las proteínas del líquido pleural. En la figura 25 podemos observar los
tres geles 2D correspondientes a un paciente con DPB, en los que se
separaron 100 µg de proteína usando tiras IPG de pH 4-7. La
disminución en la carga de proteínas junto con el empleo de un rango de
pH adecuado, mejoró la resolución total, tanto del fluido pleural crudo
como de las dos fracciones cromatográficas.
Figura 25. Mapas representativos de la separación de una muestra de fluido pleural
total, y de las fracciones obtenidas mediante cromatografía de afinidad de un paciente
con DPM. En los mapas se han señalado las proteínas que son retenidas por la columna.
Los recuadros correspondientes a cada proteína se han ampliado en la figura 26. pI:
punto isoeléctrico.
Como podemos observar en la figura 25, la fracción de muestra
total presenta una gran cantidad de proteínas abundantes que impiden
la visualización de las proteínas minoritarias existentes en la misma. Al
167
Resultados
igual que ocurría con la separación mediante SDS-PAGE, se observó la
presencia de albúmina, Ig G, Ig A, haptoglobina, antitripsina y
transferrina en la fracción cruda y en la retenida, y su ausencia o
disminución en la fracción eluida. En este caso la mejoría es más
evidente debido al empleo de una tinción con nitrato de plata, 100 veces
más sensible que el azul brillante de Coomassie empleado en los geles 1D
(Görg et al., 2004; Vercauteren et al., 2007).
Como era de esperar, tras el prefraccionamiento se comprobó que
la fracción eluida presentaba una mejor resolución en los geles 2D que
las fracciones cruda y retenida. Para facilitar la visualización de la
mejora producida tras la cromatografía, en la figura 26 se muestran
ampliadas las áreas de los mapas donde se localizan las proteínas
abundantes.
Figura 26. Ampliación de las zonas de la figura 25 correspondientes a cada una de las
proteínas retenidas por la columna, donde se pueden observar manchas proteicas no
visibles en el fluido pleural crudo o en la fracción retenida, pero sí en la fracción eluida.
168
Resultados
3.1.4.
Comparación
del
proteoma
del
derrame
pleural de pacientes con patologías malignas y benignas
Las muestras de DP eluido de 4 pacientes con DPB tipo
tuberculoso y 4 pacientes con DPM derivado de carcinoma de tipo
epitelial fueron comparadas mediante la metodología DIGE. Todas las
muestras fueron procesadas y resueltas como se detalla en el apartado
2.9. del capítulo anterior, obteniéndose mapas proteicos de la fracción
eluida de DPB y de DPM, todos ellos marcados con los fluoróforos Cy3 y
Cy5, y mapas proteicos del estándar interno empleado que fue marcado
con el fluoróforo Cy2. En la figuras 27 y 28 se muestran mapas
representativos de los resultados obtenidos tras el marcaje, y de los
diferentes tipos de escaneados realizados a los geles.
Figura 27. De izquierda a derecha, mapas representativos para una muestra del
estándar interno, una muestra de un paciente con DPM y una muestra de un paciente
con DPB. Las tres muestras fueron resueltas en el mismo gel. En función de la longitud
de onda de excitación y emisión empleada, solamente se aprecian las proteínas marcadas
con el fluoróforo correspondiente.
169
Resultados
Figura 28. Imágenes de los cuatro geles DIGE donde se puede observar la emisión de
fluorescencia de cada una de las muestras. En todos los geles, el estándar interno está
marcado con Cy2, que emite en la longitud de onda del verde. En los geles 1 y 2 las
muestras de DPB emiten en la longitud de onda del naranja mientras que las de DPM
emiten en la del rojo. En los geles 3 y 4 las muestras DPM emiten en la longitud de onda
de naranja, y las muestras DPB en la longitud de onda del rojo.
Un primer paso en este método consistió en la comparación de
cada una de las muestras con el estándar interno resuelto en el mismo
gel pero marcado con fluoróforos diferentes. Así se detectaron las
manchas proteicas (a partir de ahora denominadas spot), se eliminó el
fondo de la imagen, y se normalizaron los valores de intensidad de cada
spot. Estos datos fueron expresados en volumen relativo (intensidad por
el área del spot) y relativizados al volumen del spot correspondiente en el
estándar interno del mismo gel.
El número promedio de spots detectado inicialmente en el
conjunto total de mapas fue de 1681. En uno de los grupos de geles
(compuesto por dos muestras y el estándar) aparecían 2.108 especies
proteicas, en el segundo grupo 1.619, en el tercer grupo 1.413, y en el
cuarto 1.587. De todos los spots detectados, solo 974 aparecían en todos
los geles, y esta cantidad sería la empleada para realizar los análisis
estadísticos.
El análisis de la suma total de los volúmenes normalizados de
todas las especies proteicas detectadas en los mapas pertenecientes a
pacientes con patologías malignas presenta un valor mayor que el
detectado en pacientes con patologías benignas (14.872 frente a 13.436).
170
Resultados
Sin embargo, el análisis estadístico de este resultado no reveló la
existencia de diferencias significativas (p = 0,114) entre los volúmenes
normalizados de ambas patologías.
En lo referente al volumen normalizado de cada especie proteica,
el test U de Mann-Whitney mostró que únicamente 41 de los 974 spots
mostraban diferencias significativas (p = 0,021) en su expresión entre las
muestras eluidas de pacientes con DPM y DPB (tabla 10): 25 de ellos
presentaban un incremento en su expresión en los pacientes con DPM,
mientras que 16 mostraban un descenso.
Tabla 10. Spots que presentaron variaciones significativas al comparar la expresión
proteica entre fluido pleural de pacientes con tuberculosis y fluido pleural de pacientes
con CPNM.
Spot
Volumen
normalizado DPM
Media ± DS
Volumen
normalizado DPB
Media ± DS
Cociente
DPM/DPB
695
0,62 ± 0,26
1,24 ± 0,14
0,50
708
1,19 ± 0,21
0,79 ± 0,09
1,49
727
0,61 ± 0,24
1,21 ± 0,16
0,50
872
0,79 ± 0,11
0,54 ± 0,07
1,46
877
1,17 ± 0,44
0,67 ± 0,10
1,74
896
1,14 ± 0,49
0,62 ± 0,09
1,84
905
1,10 ± 0,31
0,65 ± 0,12
1,69
921
1,03 ± 0,20
0,70 ± 0,15
1,47
967
1,20 ± 0,50
0,41 ± 0,15
2,91
1126
1,39 ± 0,32
0,71 ± 0,13
1,96
1167
0,44 ± 0,28
1,61 ± 0,23
0,27
1184
0,49 ± 0,28
1,50 ± 0,24
0,33
1193
0,38 ± 0,27
1,60 ± 0,23
0,24
1247
1,76 ± 1,04
0,64 ± 0,19
2,74
1277
1,40 ± 0,50
0,50 ± 0,11
2,83
1280
1,07 ± 0,10
0,66 ± 0,14
1,61
1348
1,41 ± 0,45
0,42 ± 0,10
3,36
1354
1,26 ± 0,23
0,51 ± 0,09
2,46
1365
1,17 ± 0,34
0,63 ± 0,16
1,86
171
Resultados
Spot
Volumen
normalizado DPM
Media ± SD
Volumen
normalizado DPB
Media ± SD
Cociente
DPM/DPB
1377
1,13 ± 0,27
0,75 ± 0,07
1,51
1619
0,59 ± 0,22
1,31 ± 0,38
0,45
1626
0,35 ± 0,09
1,57 ± 0,34
0,22
1707
1,27 ± 0,23
0,89 ± 0,21
1,42
1756
1,31 ± 0,33
0,51 ± 0,10
2,57
1921
1,82 ± 1,03
0,37 ± 0,03
4,92
1945
1,33 ± 0,17
0,68 ± 0,20
1,96
1987
1,87 ± 0,71
0,61 ± 0,12
3,08
2084
1,52 ± 0,63
0,55 ± 0,13
2,76
2154
1,24 ± 0,30
0,53 ± 0,18
2,34
2209
1,25 ± 0,24
0,56 ± 0,09
2,24
2211
0,49 ± 0,19
1,35 ± 0,19
0,36
2214
0,43 ± 0,13
1,52 ± 0,44
0,27
2231
0,27 ± 0,23
1,96 ± 0,66
0,19
2234
0,48 ± 0,25
1,45 ± 0,47
0,33
2239
0,34 ± 0,14
1,50 ± 0,50
0,36
2240
0,39 ± 0,26
1,37 ± 0,52
0,29
2331
0,27 ± 0,23
1,96 ± 0,61
0,14
2332
1,32 ± 0,37
0,45 ± 0,02
2,97
2414
0,28 ± 0,12
1,88 ± 0,88
0,15
2416
0,21 ± 0,05
1,98 ± 0,86
0,11
2511
1,54 ± 0,33
0,38 ± 0,11
4,05
Media:
media
del
volumen
relativo
normalizado
respecto
al
estándar
interno
correspondiente; DS: Desviación estándar; DPB: derrame pleural benigno; DPM: derrame
pleural maligno.
A partir de dos geles promedio se realizaron representaciones 3D
donde se pueden apreciar los cambios en el volumen para cada uno de
los spots con diferencias significativas (figura 29).
172
Resultados
Figura 29. Representación 3D de los spots que presentaron variaciones significativas al
comparar la expresión proteica entre el fluido pleural de pacientes con DPB y el fluido
pleural de pacientes con DPM. En cada cuadro se muestra una vista en 3D de un spot de
un paciente con patología maligna (izquierda), el número de spot, y la vista 3D de un spot
correspondiente a un paciente con patología benigna (derecha).
173
Resultados
3.1.4.1. Análisis de Componentes principales
Cuando recogemos la información de una muestra de datos, lo
más frecuente es tomar el mayor número posible de variables (en nuestro
caso spots). Sin embargo, si tomamos demasiadas variables tendremos
que tener en cuenta múltiples coeficientes de correlación, siendo difícil
poder visualizar relaciones entre las variables. Además, si se toman
muchas variables, lo normal es que estas estén relacionadas o que
midan lo mismo bajo distintos puntos de vista. Por eso es necesario
intentar reducir el número de variables a analizar siempre que sea
posible.
Las relaciones que se presentan entre x variables correlacionadas
(que miden información común) pueden transformarse en otro conjunto
de nuevas variables, no correlacionadas entre sí, llamado conjunto de
CPs de tal manera que la varianza biológica de los datos se reduzca a
unos pocos CPs que sean capaces de explicar la mayor parte de la
varianza observada.
Las nuevas variables son combinaciones lineales de las anteriores
y se van construyendo según el orden de importancia en cuanto a la
variabilidad total que se recoge de la muestra. Cuando la correlación de
algunas variables con la CP1 es > 0,8 se dice que estas variables
“saturan” en el CP1, porque constituyen un grupo diferenciado de
variables dentro de la matriz de correlaciones. El CP1 tiene, por lo tanto,
la
varianza
máxima
y
los
componentes
sucesivos
explican
progresivamente proporciones menores de la varianza.
En nuestro estudio, se realizó el ACP, en primer lugar con los
datos del volumen relativo normalizado de todos los spots presentes en
los cuatro geles (974 spots). En este análisis se consiguió reducir la
varianza biológica de los datos originales a 7 CPs, que explicaron el 100
% de la variabilidad entre DPM y DPB (tabla 11).
174
Resultados
Aplicando la prueba no paramétrica de comparación de medias U
de Mann-Whitney a los CPs originados en el análisis, entre los tres
primeros CPs que explicaban el 69 % de las diferencias entre los grupos
se comprobó que solo el CP2 era estadísticamente significativo (p =
0,021) y era el responsable de un 24,3 % de la varianza.
Tabla 11. Componentes obtenidos en el ACP utilizando los datos de los 974 spots
presentes en los cuatro geles analizados por el método DIGE.
Componente
principal
1
Total
278,99
Autovalores iniciales
% de la varianza
28,64
% acumulado
28,64
2
236,67
24,30
52,94
3
155,12
15,93
68,87
4
96,79
9,94
78,81
5
91,64
9,41
88,22
6
63,53
6,52
94,74
7
51,16
5,26
100,00
Total: valor absoluto o autovalor de cada componente principal.
Figura 30. Representaciones gráficas en 2D (izquierda) y 3D (derecha) de los CPs más
significativos obtenidos tras el ACP de los 974 spots. En el gráfico en 2D se representan
los dos primeros CPs. En el gráfico en 3D se presentan los tres primeros CPs, de los
cuales sólo el CP2 presentó diferencias significativas al analizarlo mediante la prueba de
la U de Mann-Whitney. CP: componente principal; DPB: derrame pleural benigno; DPM:
derrame pleural maligno.
175
Resultados
En la figura 30 se muestran representaciones 2D y 3D de los
resultados obtenidos en el ACP, donde pueden observarse las diferencias
existentes entre el grupo de pacientes con enfermedad maligna y el de
pacientes con enfermedad benigna. En el gráfico 2D se observa más
claramente cómo las muestras de DPB presentaron valores positivos
para el CP2, mientras que los DPM presentaron valores negativos. Este
CP2, como se puede apreciar en la figura 30, es el factor que permite una
separación efectiva de las muestras en función del grupo al que
pertenecen.
Este mismo análisis multivariante se llevó a cabo con los
volúmenes relativos estandarizados de los 41 spots que presentaron
diferencias significativas al estudiarlos estadísticamente con la prueba U
de Mann-Whitney. En este caso, se encontró también una reducción de
la variabilidad biológica a 7 CPs, capaces de explicar el 100 % de la
varianza entre grupos (tabla 12).
Tabla 12. Componentes obtenidos en el ACP utilizando los datos de los 41 spots que
presentaban variaciones significativas al comparar su expresión entre el fluido pleural
benigno y el fluido pleural maligno.
Autovalores iniciales
Componente
principal
1
2
3
4
5
6
7
Total
% de la varianza
% acumulado
32,73
6,16
2,35
1,81
0,91
0,61
0,43
72,73
13,70
5,22
4,01
2,03
1,36
0,96
72,73
86,43
91,65
95,66
97,69
99,04
100,00
Total: valor absoluto o autovalor de cada componente principal.
Tras la aplicación de la prueba U de Mann-Whitney a los CPs
extraídos de este nuevo análisis, se comprobó que el CP1 era significativo
(p = 0,021) y explicaba aproximadamente el 73 % de la varianza entre los
176
Resultados
grupos. Una vez representados gráficamente los tres primeros CPs (figura
31), se observa que las muestras de DPB presentaron valores negativos
para el CP1, mientras que las muestras de DPM presentaron valores
positivos, de modo que el CP1 era capaz de separar de una manera
efectiva los dos grupos estudiados en este análisis, al igual que ocurría
en el caso anterior.
Figura 31. Representaciones gráficas en 2D (izquierda) y 3D (derecha) del CP1 junto con
los otros CPs capaces de explicar la mayor variabilidad (CP2 y CP3), obtenidos tras
analizar los 41 spots que presentaron variaciones significativas. CP: componente
principal; DPB: derrame pleural benigno; DPM: derrame pleural maligno.
3.1.5.
Identificación de proteínas con expresión
diferencial en el DP de pacientes con patologías malignas y
benignas
Los 41 spots que mostraban niveles significativamente diferentes
entre las muestras eluidas de pacientes con patología maligna y
pacientes con patología benigna fueron sometidos a identificación
mediante MS (Figura 32).
177
Resultados
Figura 32. Mapa representativo de un gel resultante de la metodología DIGE donde se
resaltan las manchas proteicas que fueron analizadas mediante MS.
Con este fin se realizaron geles 2D preparativos (con mayor
cantidad de proteína) de una muestra estándar que contenía las 8
muestras empleadas para el DIGE. En la figura 12 se muestra un mapa
2D analítico y el mapa preparativo equivalente, donde la cantidad de
proteína empleada fue cuatro veces mayor (Figura 33).
Figura 33. Geles representativos de fluido pleural obtenidos con fin analítico (izquierda) y
preparativo (derecha).
Los spots seleccionados fueron extraídos del gel preparativo y
digeridos con tripsina. Los péptidos trípticos se analizaron a través de
178
Resultados
MALDI-TOF, y en los casos en los que existía una cantidad de proteína
suficiente (obteniéndose señal de iones peptídicos) pero no una
identificación, las muestras se analizaron mediante MS/MS, y los
espectros resultantes fueron contrastados con la base de datos SwissProt.
En algunos casos, los spots no pudieron ser identificados debido a
la poca cantidad de proteína presente en el gel. En la tabla 13 se
muestran las identidades de las proteínas resueltas.
Tabla 13. Identidad de las proteínas analizadas mediante MS.
Spot
DPM
DPB
DPM
Volumen
Volumen
/
normalizado normalizado DPB
Media ± SD
Media ± SD
Identidad
Nº
acceso
SwissProt
Función
Respuesta
inmunitaria
Movimiento
celular
Coagulación
695
0,62 ± 0,26
1,24±0,14
0,50
Complemento C3
P01024
708
1,19 ± 0,21
0,79±0,09
1,49
Gelsolina
P06396
727
0,61 ± 0,24
1,21±0,16
0,50
Cadena β del
fibrinógeno
P02679
872
0,79 ± 0,11
0,54±0,07
1,46
Complemento C3
P01024
Respuesta
inmunitaria
877
1,17 ± 0,44
0,67±0,10
1,74
α 1-B-glicoproteína
P04217
Respuesta
inmunitaria
896
1,14 ± 0,49
0,62±0,09
1,84
Hemopexina
P02790
Homeostasis
905
1,10 ± 0,31
0,65±0,12
1,69
Hemopexina
P02790
Homeostasis
921
1,03 ± 0,20
0,70±0,15
1,47
Hemopexina
P02790
Homeostasis
967
1,20 ± 0,50
0,41±0,15
2,91
Albumina
P02768
Homeostasis
1126
1,39 ± 0,32
0,71±0,13
1,96
Factor derivado del
epitelio pigmentado
P36955
Antiangiogénico
1167
0,44 ± 0,28
1,61±0,23
0,27
Cadena β del
fibrinógeno
P02675
Coagulación
1184
0,49 ± 0,28
1,50±0,24
0,33
Región C de la cadena 1
de la Ig-γ
P01857
Respuesta
inmunitaria
1193
0,38 ± 0,27
1,60±0,23
0,24
Cadena β del
fibrinógeno
P02675
Coagulación
1277
1,40 ± 0,50
0,50±0,11
2,83
Hemopexina
P02790
Homeostasis
1280
1,07 ± 0,10
0,66±0,14
1,61
Hemopexina
P02790
Homeostasis
179
Resultados
Tabla 13. Identidad de las proteínas analizadas mediante MS (Continuación).
Spot
DPB
DPM
DPM
Volumen
Volumen
normalizado normalizado
/
Media ± SD Media ± SD
DPB
Identidad
Nº
acceso
Función
SwissProt
1348
1,41 ± 0,45
0,42±0,10
3,36
Hemopexina
P02790
Homeostasis
1354
1,26 ± 0,23
0,51±0,09
2,46
Hemopexina
P02790
Homeostasis
1365
1,17 ± 0,34
0,63±0,16
1,86
Ceruloplasmina
P00450
Metabolismo iónico
1377
1,13 ± 0,27
0,75 ± 0,07
1,51
Factor derivado del
epitelio pigmentado
P36955
Antiangiogénico
1619
0,59 ± 0,22
1,31 ± 0,38
0,45
Actina citoplásmica
1
P60709
Movimiento celular
1626
0,35 ± 0,09
1,57 ± 0,34
0,22
Actina citoplásmica
1
P60709
Movimiento celular
1707
1,27±0,23
0,89 ± 0,21
1,42
Complemento C3
P01024
Respuesta
inmunitaria
1756
1,31 ± 0,33
0,51 ± 0,10
2,57
Hemopexina
P02790
Homeostasis
1945
1,33 ± 0,17
0,68 ± 0,20
1,96
Complemento C3
P01024
Respuesta
inmunitaria
1987
1,87 ± 0,71
0,61 ± 0,12
3,08
Inhibidor de
metaloproteinasas 2
P16035
Inhibidor de
metaloproteína
2084
1,52 ± 0,63
0,55 ± 0,13
2,76
Apolipoproteina A-1
P02647
Metabolismo lipídico
2154
1,24 ± 0,30
0,53 ± 0,18
2,34
Hemopexina
P02790
Homeostasis
2209
1,25 ± 0,24
0,56 ± 0,09
2,24
Hemopexina
P02790
Homeostasis
2211
0,49 ± 0,19
1,35 ± 0,19
0,36
Proteína sérica A4
amiloide
P35542
Respuesta
inmunitaria
2231
0,27 ± 0,23
1,96 ± 0,66
0,14
S 100 A9
P06702
Unión al calcio
2234
0,48 ± 0,25
1,45 ± 0,47
0,33
α-2-macroglobulina
P01023
Proteasa
2239
0,34 ± 0,14
1,50 ± 0,50
0,22
Proteína sérica A4
amiloide
P35542
Respuesta
inmunitaria
2414
0,28 ± 0,12
1,88 ± 0,88
0,15
S100 A8
P05109
Unión al calcio
2416
0,21 ± 0,05
1,98 ± 0,86
0,11
β -2-microglobulina
P61769
Respuesta
inmunitaria
2511
1,54 ± 0,33
0,38 ± 0,11
4,05
Hemopexina
P02790
Homeostasis
DPM: Derrame pleural maligno; DPB: Derrame pleural benigno; DPM/DPB:
variación encontrada entre derrames malignos y benignos; SD: desviación
estándar.
Fueron identificadas 35 proteínas de las 41 significativas, es decir,
un 86 %. Entre las proteínas identificadas detectamos proteínas
180
Resultados
relacionadas con la homeostasis (40 %), con la respuesta inmunitaria (20
%), con el movimiento celular y la coagulación (13,3 %), la unión de
calcio y la angiogénesis (13,3 %) y, finalmente, con la inhibición de
metaloproteinasas, el metabolismo lipídico y la actividad proteinasa (13,3
%).
3.2.
Selección y caracterización bioquímica
de proteínas con expresión diferencial en
derrame pleural maligno y benigno
De todas las proteínas identificadas que presentaban diferencias
significativas en su expresión entre los pacientes con patología maligna y
benigna, seleccionamos para su estudio las que por su función y por sus
características parecían más interesantes como posibles candidatos a
marcadores del DPM. Éstas han sido las proteínas: PEDF, y las proteínas
S 100 A8 y S 100 A9.
3.2.3.
Caracterización de la proteína PEDF
La proteína PEDF se identificó a partir de dos spots con una Mr
teórica de 51 kDa y un pI aproximado de 6 (figura 34), que presentaba
una ratio de aumento de expresión de 1,51 y 1,96 veces en los mapas 2D
de pacientes con patología maligna (tabla 13, Spots 1126 y 1377;
apartado 3.1.5. del presente capítulo).
En la figura 34 se representan las isoformas que presentaban
diferencias significativas en los niveles de PEDF mediante la tecnología
DIGE. Como podemos apreciar en la figura, en el caso del derrame
existían dos isoformas de esta proteína cuya expresión variaba entre los
pacientes con patología maligna y los pacientes con patología benigna.
181
Resultados
Figura 34 Volumen relativo de los spots correspondientes a la proteína PEDF obtenidos
en cada gel DIGE en relación con su volumen en el gel estándar. DPM: derrame pleural
maligno; DPB: derrame pleural benigno.
3.2.1.1. Inmunodetección de la proteína PEDF mediante
immunobloting
Como primer paso en la detección mediante inmunoblot de la
proteína PEDF, se realizó una electroforesis monodimensional, seguida
de Western Blot e inmunodetección con el anticuerpo monoclonal. En
esta electroforesis se cargaron muestras eluidas mediante cromatografía
de afinidad múltiple (apartado 2.2.1. del capítulo anterior) y crudas (sin
tratamiento previo) de una de las parejas empleadas para la tecnología
DIGE, empleando dos concentraciones diferentes de proteína.
El
inmunoblot
reveló
la
existencia
de
dos
bandas
de
aproximadamente 50 kDa, que podían ser fácilmente detectadas cuando
se separaban las muestras eluidas en geles de poliacrilamida al 12 %, no
182
Resultados
siendo tan aparentes cuando la separación se realizaba con muestras
crudas (figura 35). Además, el análisis de las bandas no reveló la
existencia de diferencias significativas entre ambas muestras de DPB y
DPM.
Figura 35. Imagen representativa del inmunoblot de la proteína PEDF. Muestra eluida:
fracciones eluidas de la cromatografía de afinidad múltiple HU-6. DPM: derrame pleural
maligno de orígen epitelial, DPB: Derrame pleural benigno de tipo tuberculoso.
Una vez obtenido este resultado el siguiente paso fue la realización
de un análisis de todas las parejas de muestras empleadas para el
estudio DIGE, utilizando tanto muestras crudas como muestras eluidas,
de manera que se pudiese observar si en otras parejas se cumplía la
misma condición que en la anterior.
En el caso de las muestras crudas se observó una banda muy
fuerte en torno a 48 kDa, que se correspondía con el peso molecular de
la proteína PEDF (figura 36). Al realizar el mismo análisis con muestras
eluidas pudimos observar una banda en torno a 50 kDa, que se
correspondía con la proteína PEDF y que estaba presente en todas las
muestras, que aparecía con menor intensidad de lo que ocurría con las
muestras eluidas (figura 37).
Figura 36. Imagen representativa del inmunoblot de la proteína PEDF en diferentes
muestras con DPM y DPB, empleando muestras crudas.
183
Resultados
Figura 37 Imagen representativa del inmunoblot de la proteína PEDF en diferentes
muestras con DPM y DPB, empleando muestras eluidas.
El estudio cuantitativo de las bandas realizado mediante el
Quantity One demostró que, en general, no existían diferencias en los
niveles
de
la
proteína
PEDF
entre
las
diferentes
muestras,
independientemente del grupo patológico estudiado. De hecho, en el caso
del inmunoblot realizado en muestras crudas, salvo en la última pareja
analizada en la cual sí que existían diferencias significativas entre los
resultados obtenidos, el resto de las bandas no presentaban diferencias
entre las parejas estudiadas (figura 38). El análisis de la última pareja
mostró un aumento significativo de la intensidad de la proteína en el
paciente con patología maligna. Sin embargo, el análisis de muestras
eluidas de esta misma pareja mostró niveles más bajos de intensidad
para el paciente con DPM (figura 39).
En el inmunoblot realizado en
muestras eluidas, la pareja con mayor diferencia entre los valores de la
proteína fue la pareja 3, lo que no concuerda con lo obtenido en
muestras crudas; de hecho parecía haber una inversión de los resultados
entre ambas.
0.12
Muestras crudas
Trace RD X mm
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
DPM
DPB
DPM
DPB
DPM
DPB
DPM
DPB
Figura 38 Gráfico representativo de los valores obtenidos del análisis mediante el
Quantity One del inmunoblot de la proteína PEDF en muestras crudas.
184
Resultados
Muestras eluidas
0.5
Trace RD x mm
0.4
0.3
0.2
0.1
0
DPM
DPB
DPM
DPB
DPM
DPB
DPM
DPB
Figura 39. Gráfico representativo de los valores obtenidos del análisis mediante el
Quantity One del inmunoblot de la proteína PEDF en muestras eluidas.
3.2.1.2.
Análisis de las isoformas de la proteína PEDF
El estudio de las isoformas en el fluido pleural de la proteína
PEDF se llevó a cabo siguiendo el procedimiento que se describe a
continuación. En primer lugar se realizó una electroforesis bidimensional
en minigeles, seguida de Western Blot e inmunodetección.
Figura 40. Inmunodetección de la proteína PEDF en mapas 2D. Las imágenes superiores
corresponden a muestras de pacientes con DPM, mientras que las imágenes inferiores se
corresponden con muestras de pacientes con DPB. Sobre cada una de las imágenes se
muestra una visión 3D de las isoformas que aparecen en cada uno de los inmunoblots.
185
Resultados
En la figura 40 se muestra la detección con el anticuerpo
monoclonal de ratón anti PEDF humano, donde se aprecian los spots de
la proteína PEDF en las muestras eluidas de pacientes con DPM y DPB
sometidos a 2D-PAGE y Western Blot.
El análisis de esta proteína nos permitió la detección de más de 12
isoformas en cada uno de los casos, y en la mayoría de las membranas
analizadas aparecieron duplicados o triplicados de los spots entre los que
no había ni una unidad de pH de diferencia entre ambos (figura 41). Esto
nos serviría para explicar por qué mediante la tecnología DIGE aparecían
dos spots con puntos isoeléctricos diferentes, en los cuales aparecía
identificada la misma proteína, el PEDF.
Figura 41. Inmunodetección de la proteína PEDF en mapas 2D mediante el anticuerpo
monoclonal human anti-mouse PEDF protein en el que se muestran los diferentes spots
que aparecen en cada uno de los inmunoblots.
Cada spot de PEDF resuelto en los inmunoblots 2D mostró diferente
variación en los pares maligno-benigno (figura 42). Se puede observar que la
mayor parte de las isoformas aparecen incrementadas en pacientes con
patología maligna, y que la variación media global en todo el conjunto de
spots fue de un aumento de 1,3 en el caso de los pacientes con DPM. Sin
embargo se encontraron isoformas con un aumento de expresión que
mostraban una variación de 2,8 veces, mientras que otros de los spots
mostraban un cambio de 1,8 veces.
186
Resultados
Cantidad normalizada
2500
2000
1500
1000
500
0
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13
Spot
Figura 42. Inmunodetección de la proteína PEDF en mapas 2D en el que se muestran los
diferentes spots que aparecen en cada uno de los inmunoblots y gráfico representativo de
la cantidad normalizada de proteína existente en cada spot.
3.2.2.
Validación
de
la
proteína
PEDF
como
marcador de DPM
A pesar de que la proteína PEDF presentaba múltiples isoformas,
se realizó el estudio de la valoración de esta proteína mediante un ELISA
comercial capaz de detectar todas las isoformas posibles de esta
proteína.
3.2.2.1. Valoración de los niveles de la proteína PEDF en
el derrame pleural
En
este
estudio
se
incluyeron
un
total
de
52
pacientes
diagnosticados de DP. De acuerdo con los criterios de diagnóstico que se
describen en el apartado 2.7.2. del capítulo anterior, los pacientes se
agruparon para el análisis estadístico como se resume en la tabla 14. En
esta cohorte, el grupo formado por pacientes con DPM se correspondió
con 22 pacientes que presentaban CPNM, mientras que el grupo formado
por pacientes con patologías benignas estaba compuesto por 30
pacientes, en el que la mayoría de ellos padecían tuberculosis (27
pacientes), aunque también había 2 pacientes que presentan DP
paraneumónico y 1 paciente con DP de tipo idiopático.
187
Resultados
Tabla 14. Comparación de los niveles de PEDF en DPM y DPB.
Origen del
derrame
Nº de pacientes
PEDF, µg/mL
Media ± DS
(Rango)
Valor de p
DPM
CPNM
22
DPB
Tuberculoso
4,59 ± 1,69
(1,95 – 7,37)
a
27
4,15 ± 1,41
(1,18 – 6,43)
Paraneumónico
2
2,34 ± 0,25
(2,16 – 2,52)
Idiopático
1
2,62
0,166
DPM: derrame pleural maligno; CPNM: cáncer de pulmón no microcítico; DPB: derrame
pleural benigno; DS: desviación estándar aP < ,166 entre DPM y DPB.
Usando la metodología específica de ELISA, se determinó la
concentración de la proteína PEDF (µg/mL) en los diferentes grupos
estudiados, mostrándose los resultados en la tabla 14, donde el nivel
medio de PEDF en el grupo de pacientes con patología maligna fue de
4,59 µg/mL, ligeramente superior al de los pacientes con patologías
benignas, 3,97 µg/mL, lo que confirma los resultados proteómicos
obtenidos en los estudios anteriores, en los que encontrábamos un ligero
incremento de los valores de este marcador en los pacientes con
patología maligna. Sin embargo, esta diferencia no alcanza una
significación estadística (p < 0,166).
Puesto que no hay diferencias entre la patología benigna y
maligna, no se realizaron pruebas adicionales para ver si existían
diferencias en la concentración de esta proteína entre las diferentes
patologías estudiadas.
188
Resultados
3.2.2.2. Parámetros diagnósticos del PEDF como marcador
del derrame pleural maligno
Como era de esperar a partir de los resultados descritos, el
rendimiento diagnóstico de los niveles de PEDF en los pacientes no
demostró ser de utilidad en la discriminación del orígen del DPM. El área
bajo la curva ROC fue de 0,68 (IC del 95 %) (figura 43).
Para un punto de corte establecido de 4,25 µg/mL, puesto que era
el que proporcionaba la más alta precisión, se obtuvieron los parámetros
de sensibilidad y especificidad, de 59,09 % y 63,33 %, respectivamente.
Los valores predictivos positivos y negativos, LR positivos y negativos, y
eficiencia diagnóstica, se muestran en la tabla 15, aunque como se
puede apreciar no son unos datos aceptables en un buen candidato a
marcador del DPM.
Figura 43. A la izquierda diagrama de cajas de todos los valores de PEDF obtenidos en
los ELISAs realizados a pacientes con patologías malignas y benignas. A la derecha curva
ROC resultante del análisis de estos valores mediante el estudio estadístico pertinente.
189
Resultados
Tabla 15. Sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo, likehood
ratio positivo y negativo, y eficiencia del PEDF para clasificar entre DPM y DPB.
Sensibilidad Especificidad
%
%
Grupo y
punto de
corte
DPM vs.
DPB
(95 % IC)
(95 % IC)
59,09
63.33
(36,4 – 79,3)
(43,9 – 80,1)
VPP
%
54,17
VPN
%
LR
Positivo
LR
Negativo
(95 % IC)
(95 % IC)
67,86
1,61
Eficiencia
0,65
61,54
(1,0 – 2,5) (0,3 – 1,3)
≤ 4,25
µg/mL
DPM: Derrame pleural maligno; DPB: Derrame pleural benigno; IC = intervalo de
confianza; VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo; LR: likehood
ratio.
3.2.2.3. Relación
de
los
niveles
de
PEDF
con
las
caracteríticas clínicas y bioquímicas de los pacientes
Otro de los análisis que se realizó fue la investigación de la posible
relación de los niveles de PEDF en el líquido pleural con las
características clínico-patológicas de los pacientes (tabla 16). Para ello se
evaluó la cantidad media y el rango de PEDF que existía en relación con
cada una de las características clínicas y, mediante un test estadístico
paramétrico, se evaluó si existían diferencias significativas entre dichas
medidas.
Los resultados mostraron que no existían diferencias entre los
niveles de PEDF en relación con el género, la edad, el hábito tabáquico, o
el tamaño del DP.
190
Resultados
Tabla 16. Valores de la proteína PEDF en el fluido pleural en relación con las
características clínico patológicas de los pacientes estudiados.
Características
Nº de
Pacientes
PEDF
Media ± DS (rango)
(µg/mL)
Valor de
p
33
19
4,15 ± 1,47 (1,18 – 7,04)
4,38 ± 1,74 (1,61 – 7,36)
0,602
25
27
3,92 ± 1,27 (1,61 – 6,43)
4,53 ± 1,76 (1,18 – 7,36)
0,164
Hábito tabáquico
No-fumador
Fumador y ex-fumador
21
29
4,36 ± 1,51 (1,61 – 7,01)
4,02 ± 1,54 (1,18 – 7,04)
0,435
Tamaño del DP
< 1/3
> 1/3
13
39
4,07 ± 1,45 (1,95 – 6,43)
4,29 ± 1,61 (1,18 – 7,36)
0,661
Género
Hombre
Mujer
Edad
≤ 50
> 50
DP: Derrame pleural; Nº: número; DS: Desviación estándar.
3.2.2.4. Correlación de los niveles de PEDF con otras
variables clínicas para la clasificación del derrame pleural maligno
Por último se analizó la existencia de relaciones entre los niveles
de PEDF de muestras tanto benignas como malignas y los niveles de
leucocitos, polimorfonucleados (PMN), monocitos, ADA, LDH, contenido
de proteínas, glucosa y valores de pH del DP. Como se puede apreciar en
la tabla 17, las correlaciones significativas se encontraron entre el PEDF
y los monocitos (p = ,010), y el PEDF y los polimorfonucleares (p = ,023),
ambos en el caso de los pacientes con DPM, y tanto con la metodología
de correlación de la Tau de Kendall como mediante la Rho de Spearman.
Estos resultados demuestran la existencia de relaciones entre los
niveles de estos tipos celulares y la patología DPM, en los que la proteína
PEDF también está influyendo.
191
Resultados
Tabla 17. Corelación entre los niveles de PEDF con variables diagnósticas del DP.
Valor de p para el PEDF (ng/ml)
Tau de Kendall
Rho de Spearman
Todos
DPM
DPB
Todos
DPM
DPB
Leucocitos
0,655
0,481
0,329
0,649
0,490
0,306
PMN
0,210
0,023
0,815
0,251
0,043
0,828
Monocitos
0,151
0,010
0,815
0,178
0,021
0,828
ADA
0,859
0,575
0,536
0,858
0,518
0,522
LDH
0,692
0,809
0,502
0,758
1,000
0,666
Proteínas
0,111
0,511
0,230
0,118
0,488
0,289
Glucosa
0,517
0,910
0,401
0,479
0,916
0,381
pH
0.737
0,239
0,537
0,650
0,154
0,706
pleural
maligno;
DPM:
Derrame
DPB:
Derrame
pleural
benigno;
PMN:
polimorfonucleados; ADA: Adenosina desaminasa; LDH: Lactato deshidrogenasa.
3.2.3.
Caracterización de la proteína S 100 A9
La proteína S 100 A9 se identificó a partir de un spot con una Mr
aproximada de 14 kDa y un pI de 9,5 (figura 44), que presentaba una
ratio de descenso de expresión de 0,14 veces en los mapas 2D de
pacientes con patología maligna, o lo que es lo mismo, esta proteína
aparecía un 86 % más elevada en pacientes con patologías benignas
(tabla 13, Spot 2231; apartado 3.1.5. del presente capítulo).
192
Resultados
Figura 44. Mapa preparativo en el que aparecen marcados todos los spots que
presentaban variaciones significativas entre las patologías malignas y benignas, y en el
que aparece señalado el spot que se identificó como proteína S 100 A9.
3.2.3.1. Inmunodetección de la proteína S 100 A9
mediante immunobloting
Con el fin de detectar la proteína S 100 A9 tanto en muestras
crudas (sin haberles realizado ningún tipo de tratamiento previo) como
en muestras eluidas de la cromatografía de inmunoafinidad múltiple HU6 (apartado 2.1. del capítulo anterior), se separaron diferentes cantidades
de proteínas mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de
PVDF mediante Western Blot.
Para la inmunodetección de la proteína S 100 A9 se empleó el
anticuerpo de ratón anti-S 100 A9 humano. En la figura 45 observamos
que, en el caso de la muestra cruda, aparecen una serie de bandas que
no se corresponden con el tamaño esperado para la proteína S 100 A9 y
que podrían corresponderse con uniones inespecíficas del anticuerpo a
inmunoglobulinas.
193
Resultados
Figura 45. Membranas representativas de los inmunoblots obtenidos tras el análisis de
diferentes diluciones de una muestra cruda (izquierda) y eluida (derecha) de un paciente
con patología maligna. LMW: Marcador de peso molecular.
Cuando se analizó la muestra eluida (figura 45) se observó una
banda de aproximadamente 32 kDa que podría corresponderse con
agregados de proteínas S 100 A9, o bien con la unión de la proteína S
100 A9 a otras proteínas de su misma familia. Para comprobar si los
resultados obtenidos en lo referente al patrón de bandas se debían a la
formación de complejos de unión heteromérica de esta proteína con otras
de la familia de las S 100, o bien a la formación de complejos
homoméricos,
se
realizó
una
separación
de
proteínas
mediante
electroforesis en condiciones no desnaturalizantes, o PAGE nativa.
Tras haberse realizado la transferencia de las proteínas a una
membrana de PVDF mediante Western Blot, pudimos comprobar los
resultados de esta metodología mediante la inmunodetección de la
proteína S 100 A9, en la que observamos que realmente se formaban
varios complejos, de alto peso molecular, pero no había ninguna banda
bien definida que nos caracterizase a la proteína (figura 46).
Figura 46. Membrana obtenida tras el inmunoblot de diferentes diluciones de una
muestra cruda.
194
Resultados
En el estudio de las proteínas que presentan una gran capacidad
de formar complejos homo y heteroméricos, se debe tener en cuenta que
las condiciones que se tienen que emplear para separar las proteínas y
poder visualizarlas deben ser más desnaturalizantes para lograrlo. Por
eso decidimos probar la adición de urea a las muestras y la incubación a
100 ºC de las mismas, previa electroforesis, durante un periodo mayor de
tiempo.
En un primer análisis se probó la adición de urea a las muestras.
La urea y la tiourea rompen los enlaces de hidrógeno y se utilizan
cuando la unión de los hidrógenos ocasiona la agregación no deseada, o
la formación de estructuras secundarias que afectan a la movilidad
proteica. La concentración de urea típicamente más usada es 8 M. Como
se puede apreciar en la figura 47, no se detectaron diferencias entre el
empleo de dicho compuesto en el patrón observable de las muestras. Al
igual que en la SDS-PAGE, en la 2D-PAGE también se emplea urea para
la desnaturalización de las proteínas, por tanto se comprobó cuál era el
resultado que se obtendría si se transferían las proteínas de una 2DPAGE a una membrana PVDF y se realizaba el inmunoblot. En este caso
el resultado tampoco fue concluyente (datos no mostrados).
Figura 47. Membrana obtenida tras el estudio de la adición de urea a las muestras tras
la SDS-PAGE y el inmunoblot. LMW: Marcador de peso molecular.
195
Resultados
Teniendo en cuenta que la urea no tenía efecto en las muestras, se
decidió aplicar durante mayor tiempo una temperatura de 100 ºC a las
mismas para forzar la desnaturalización de las proteínas.
Utilizando estas condiciones pudimos ser capaces de detectar una
banda de alrededor de 28 kDa, que se corresponde con el tamaño
descrito del homodímero de la proteína S 100 A9 (figura 48).
Figura 48. Membrana obtenida tras la aplicación de 100 ºC durante 30 min previa SDSPAGE. Ab: anticuerpo; LMW: Marcador de peso molecular.
Una vez puesto a punto el método de detección se comprobó el
resultado obtenido tras el análisis de esta proteína en las 8 muestras (4
pacientes con patologías benignas y 4 con patologías malignas) que se
habían empleado para la detección de las proteínas candidatas mediante
la técnica DIGE. Como se puede observar en la figura 49, los pacientes
con patología benigna presentaban una banda en torno a 28 kDa que no
estaba presente, a simple vista, en los carriles correspondientes a los
pacientes con patologías malignas.
Figura 49. Membrana obtenida tras el inmunoblot de diferentes muestras de pacientes
con patología maligna y benigna. DPM: Derrame pleural maligno; DPB: Derrame pleural
benigno; LMW: Marcador de peso molecular.
196
Resultados
Las bandas obtenidas fueron analizadas mediante el programa
Quantity One 4.4.1 (Bio-Rad), que permite la representación gráfica de su
intensidad, así como el cálculo de su masa molecular (figura 50).
Figura 50. Niveles de S 100 A9 en DPB y DPM. El histograma representa la intensidad de
señal detectada en cada una de las bandas del inmunoblot. El gráfico de puntos muestra
la separación que hay entre los pacientes con patologías benignas y malignas en cuanto a
la intensidad de señal.
Las diferencias de intensidad detectadas entre las muestras con
patologías benignas y malignas fueron significativas (p = 0,021) al
realizarle el análisis no paramétrico de igualdad de medias o test U de
Mann-Whitney. Y pese a que la ratio entre la intensidad de los pacientes
con patologías maligna y benigna no era exactamente igual que la
obtenida mediante la metodología DIGE (tabla 18), los resultados nos
permitieron concluir que la proteína sí que se expresaba de manera
diferencial entre ambos tipos de muestras.
197
Resultados
Tabla 18. Valores normalizados de la intensidad y volumen obtenidos mediante el
inmunoblot y la metodología DIGE. Y ratio obtenida de la división de los resultados de las
muestras de DPM entre DPB.
Patología
Inmunoblot
DPM
Intensidad
Normalizada
1,14
DPB
5,48
DIGE
Ratio
DPM/DPB
Volumen
Normalizado
0,27
Ratio
DPM/DPB
0,14
0,21
1,96
DIGE: del inglés diferencial in gel electrophoresis; DPM: derrame pleural maligno; DPB:
derrame pleural benigno.
3.2.4.
Validación de la proteína calprotectina como
marcador de derrame pleural maligno
En múltiples artículos describen la gran capacidad que tiene la
proteína S 100 A9 de formar heterodímeros con la proteína S 100 A8,
originando un dímero que se conoce con el nombre de Calprotectina.
Debido a que en nuestro estudio ambas proteínas se expresaban con una
disminución estadísticamente significativa entre las dos patologías
estudiadas, nos pareció interesante validar la concentración de este
heterodímero en lugar de realizar un estudio por separado de ambas
proteínas.
3.2.4.1. Valoración
de
los
niveles
de
la
proteína
calprotectina en el derrame pleural
Se valoraron 67 muestras de DPM y 89 de DPB con diferentes
patologías, que fueron clasificadas en diferentes grupos en función de la
etiología del derrame que presentaban. En la tabla 19 se representa el
número de pacientes de cada uno de los grupos patológicos empleados,
así como cada una de las etiologías del derrame a las que se
correspondía cada uno de los pacientes. También aparece el género, y la
media y rango de edades de estos pacientes.
198
Resultados
Tabla 19. Pacientes incluidos en el estudio de valoración de los niveles de calprotectina
en derrame pleural
Origen del DP
DPM
Neoplasias de origen epitelial
CPNM
Cáncer de mama
CPM
Cáncer ovárico
Neoplasia epitelial tímica
Cáncer gástrico
Colangiocarcinoma
Mesotelioma
Linfoma
DPB
Tuberculosis
Paraneumónico
Miscelánea
Post-quirúrgicos
Quilotórax
Secundario a enfermedades
vasculares tipo colagenosis
Secundario a fármacos
Síndrome de Dressler
Pleuritis urémica
Post-traumáticos
Síndrome de
hiperestimulación ovárica
Paramalignos
No neoplásicos de origen
desconocido
No. de
Pacientes
No.
Hombres/Mujeres
Edad, años
Media (Rango)
67
42/25
67 (20-91)
58
42
6
3
2
2
2
1
6
32/26
31/11
0/6
2/1
0/2
0/2
0/2
1/0
5/1
68
68
63
75
82
69
73
(34-91)
(37-91)
(34-75)
(66-76)
(79-85)
(65-73)
(60-83)
61
67 (57-87)
3
3/0
55 (20-79)
89
61/28
53 (20-96)
30
29
12
3
2
2
20/10
22/7
8/4
2/1
2/0
2/0
44 (20 -96)
55 (26 – 89)
57 (24 – 83)
64 (53-74)
62 (54-70)
48 (37-59)
1
1
1
1
1
1/0
1/0
0/1
0/1
0/1
24
80
45
83
34
3
15
2/1
10/5
65 (40 – 81)
62 (37 - 85)
DPM: derrame pleural maligno; DPB: derrame pleural benigno; No: Número; CPNM:
Cáncer de pulmón no microcítico; CPM: Cáncer de pulmón microcítico.
El análisis de los resultados del ELISA demostró la existencia de
diferencias significativas (p < ,001) en la concentración ente patologías
malignas y benignas (tabla 20). De hecho, los pacientes con patologías
malignas presentaban una media en la concentración de la proteína
199
Resultados
calprotectina de 257,2 ng/mL, mientras que en los pacientes con
patologías benignas la media era diez veces mayor: 2.627,1 ng/mL.
Sin embargo, estos valores fluctuaban en función del tipo de
patología
del
que
se
estuviese
hablando,
existiendo
diferencias
significativas entre los distintos grupos estudiados. Por ejemplo en el
caso de los DPM de tipo epitelial y los DPM de tipo mesotelioma (238.7
ng/mL vs 435.8 ng/mL, p < ,03), cuyas diferencias entre grupos eran
significativas. En la tabla 20 se muestran estos resultados de las
diferencias existentes entre grupos.
En el caso de los pacientes con patologías benignas también
existían diferencias significativas al considerar los distintos subgrupos (p
< ,01). Las comparaciones entre grupos muestran que los niveles de la
proteína calprotectina en pacientes con DPB tipo tuberculoso (2.982,3
ng/mL) fueron significativamente mayores (p < ,01) que en los pacientes
que se clasificaron como miscelánea (1.654,8 ng/mL), paramalignos
(1.316,9 ng/mL; p < ,054), o no neoplásicos de origen desconocido
(1.234,1 ng/mL; p < ,01). Además, aquellos pacientes aquejados de DPB
tipo
paraneumónico
también
expresaron
elevados
niveles
de
calprotectina (3.517,9 ng/mL). Sin embargo, estos niveles no fueron
estadísticamente significativos al compararlos con el grupo de pacientes
que presentaban DPB de tipo tuberculoso. A pesar de ello, si se
comparaban los niveles de los pacientes con DPB paraneumónico con
pacientes que presentaban patologías que estaban dentro del grupo
miscelánea o no neoplásicos de origen desconocido, sí se encontraban
diferencias
estadísticamente
significativas
entre
ambos
grupos
patológicos (p < ,02 y p < ,01, respectivamente).
200
Resultados
Tabla 20. Concentración de calprotectina en muestras de derrame pleural de pacientes
con patologías malignas y patologías benignas.
Origen del DP
DPM
Neoplasias
de
origen
epitelial
CPNM
Cáncer de mama
CPM
Cáncer ovárico
Neoplasia epitelial tímica
Cáncer gástrico
Colangiocarcinoma
Mesotelioma
Linfoma
DPB
Tuberculosis
Paraneumónicos
Miscelánea
Post-cirugía
Quilotórax
Secundario a
enfermedades vasculares
tipo colagenosis
Secundario a fármacos
Síndrome de Dressler
Pleuritis Urémica
Post-traumáticos
Síndrome de
hiperestimulación ovárica
Paramalignos
No neoplásicos de origen
desconocido
No. de
pacientes
Calprotectina, ng/mL
Media (Rango)
Valor p
67
58
42
6
3
2
2
2
1
6
3
257,2 (90,7 – 736,42)1
238,7(90,7 – 545) 2
255,4 (118 - 545)
163,6 (90,7 - 315,9)
239,5 (97,7 - 381,3)
183,8 (93,3 – 274,3)
242,9 (196,3 - 289,4)
154,1 (136,4 - 171,8)
238,6
435,8 (116,2 – 736,4)
258,8 (196,6 – 338,7)
89
30
29
12
3
2
2
2.627,1 (21 – 9.530,1) 3
2.982,3 (414,5 – 6.965,3) 4, 5, 6
3.517,9 (21 – 9.530,1) 7, 8
1.654,8 (353,2 – 5.709)
763,6 (353,2 – 1.008,1)
679,1 (522,6 – 835,5)
4.562,5 (3.415,9 – 5.709)
1
1
1
1
1
1.169,2
1.415,6
572,58
2.265,5
1.660,9
3
15
1.316,9 (241,6 – 2.236,8)
1.234,1 (172,6 – 4.494,8)
 .001
DPM: derrame pleural maligno; ; DPB, derrame pleural benigno. 1p < ,01 entre los grupos
de DPM. 2p < ,03 frente a mesoteliomas. 3p < ,01 entre los grupos de DPB. 4p < ,01 frente
a miscelánea. 5p < ,054 frente a paramalignos. 6p < ,01 frente a no neoplásicos de origen
desconocido. 7p < ,02 frente a miscelánea. 8p < ,01 frente a no neoplásicos de origen
desconocido.
201
Resultados
3.2.4.2. Parámetros diagnósticos de la calprotectina como
marcador del derrame pleural maligno
Otro de los análisis realizados ha sido la evaluación del
rendimiento diagnóstico de la calprotectina en el líquido pleural de los
pacientes con DPM y DPB para la determinación de la utilidad de la
proteína en la diferenciación del origen del DP. Se determinó la curva
ROC representando, para cada posible punto de corte, el porcentaje de
verdaderos positivos (sensibilidad) frente al porcentaje de falsos positivos
(100-especificidad). En la figura 51A aparece la curva ROC obtenida de
los 67 pacientes con patologías malignas y los 89 con patologías
benignas. El AUC de la calprotectina resultó ser de 0,963 (con un
intervalo de confianza del 95 %, 0,932 - 0,994). La figura 51B representa
las concentraciones individuales de calprotectina en los diferentes
grupos diagnósticos estudiados.
Figuras 51. Curva ROC con los valores de la calprotectina y niveles del DPM y DPB de
cada patología. AUC, área bajo la curva ROC; DPM: derrame pleural maligno; DPB:
derrame pleural benigno.
202
Resultados
Con ayuda del perfil de la curva ROC se determinaron los dos
puntos de corte más adecuados para establecer los parámetros
diagnósticos del DPM de los niveles de calprotectina valorados mediante
ELISA. La tabla 21 muestra la especificidad, sensibilidad, VPP, VPN, LR
positivos y negativos, y los datos de eficiencia. Los resultados positivos
de la proteína calprotectina se definieron como los valores por debajo o
iguales a los del punto de corte, y los negativos como los resultados
obtenidos por encima de ese punto de corte.
Tabla 21. Puntos de corte, sensibilidad, especificidad, valores predictivos, LR positivo y
negativo y eficiencia de la calprotectina para clasificar entre DPM y DPB.
Grupo y punto
Sensibilidad Especificidad
de corte
%
%
(95 % IC)
(95 % IC)
DPM vs DPB
97,01
88,76
≤545 ng/mL
(89,6-99,6)
(80,3-94,5)
DPM vs DPB
100
83,15
(94,6-100)
(73,7-90,2)
92,54
83,33
(83,4-97,5)
(65,3-94,4)
DPM vs. TB
98,51
96,67
≤612 ng/mL
(92-100)
(82,8-99,9)
95,52
96,55
(87,5-99,1)
(82,2-99,9)
TB vs subgrupoI
86,67
80
≤1660.9 ng/mL
(69,3-96,2)
(61,4-92,3)
≤736.4 ng/mL
DPM vs. DPB
subgrupo I
≤455.4 ng/mL
DPM vs
Paraneumónico
≤532.5 ng/mL
VPP
VPN
%
%
86,7
97,5
81,7
100
92,5
83,3
98,5
96,7
98,5
90,3
85,7
81,2
LR
LR
Positivo
Negativo
(95 % IC)
(95 % IC)
8,63
0,034
(7,9-9,4)
(0,008-0,1)
5,93
(5,4-6,5)
0
5,55
0,09
(4,7-6,6)
(0.03-0.3)
29,55
0,01
(27,5-31,8) (0,001-0,2)
27,7
0,05
(25,4-30,2) (0,005-0,4)
4,33
0,17
(3,5-5,4)
(0,05-0,5)
Eficiencia
92,3
90,4
89,7
97,9
95,8
83,3
DPM: Derrame pleural maligno; DPB: Derrame pleural benigno; DPB subgrupo I: DP
miscelánea, paramalignos y no neoplásicos de origen desconocido; TB: tuberculosos; IC:
intervalo de confianza; VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo; LR:
likehood ratio.
203
Resultados
El primer punto de corte, ≤ 545 ng/mL, fue seleccionado debido a
que presentó la mayor eficiencia (92,31 %), con una sensibilidad del
97,01 % y una especificidad del 88,76 %. También se estableció un
punto de corte de ≤ 736,4 ng/mL para una sensibilidad del 100 %, con
una alta especificidad (83,15 %) y una eficiencia ligeramente inferior
(90,38 %) a la del punto de corte anterior.
Además, se analizó la capacidad de distinción de los diferentes
grupos mediante el empleo de esta proteína. Se vio que este marcador
mostraba la máxima eficiencia en la discriminación entre DPM y DPB de
origen tuberculoso (tabla 21, figura 52 A) con una sensibilidad de 98,51
%, una especificidad de 96,67 % y una LR de positivo de 29,55 y negativo
de 0,01. También discrimina con buena precisión el DPM del DPB
paraneumónico, con una sensibilidad de 95,52 %, una especificidad de y
96,55 %, y con un valor de LR positivo de 27,7 y negativo de 0,05 (tabla
21, figura 52 B).
Los niveles de calprotectina también eran capaces de discriminar
entre los pacientes con DPM y los pacientes que presentan DPB del
subgrupo I (miscelánea, paramalignos y no neoplásicos de origen
desconocido), con una eficiencia del 89,69 % para el punto de corte de ≤
455,4 ng/mL (tabla 21, figura 52C).
Otra de las cuestiones importantes que planteaba esta proteína es
que, empleando un punto de corte de 1.660,9 ng/mL, podíamos
diferenciar entre pacientes que presentaban DPB de tipo tuberculoso y
pacientes incluidos en lo que denominamos subgrupo I, con una
eficiencia del 83,33 % (tabla 21, figura 52D).
204
Resultados
Figura 52. Curvas ROC correspondientes a la capacidad de la calprotectina para
distinguir entre diferentes subtipos de derrames.
3.2.4.3. Parámetros diagnósticos de otras variables para
la clasificación del DPM
En las muestras de DP en las que se determinó el valor
diagnóstico de la calprotectina, se analizaron los parámetros diagnósticos
de otras variables que de forma rutinaria se determinan en la práctica
clínica, utilizando para ello los puntos de corte establecidos. Como
podemos ver en la tabla 22, solamente la enzima ADA es capaz de
205
Resultados
detectar la patología con una sensibilidad superior al 90 %. No obstante,
su baja especificidad indica un elevado número de falsos positivos, lo que
hace que la eficiencia de este marcador sea baja.
En cuanto al resto de los marcadores, todos ellos presentan
alguno de estos valores tan bajo que empeora el resultado final de
eficiencia, y hace que se clasifique mal a pacientes que presentan
enfermedad maligna o a pacientes que no la presentan, por lo que no se
podrían considerar buenos marcadores.
Tabla 22 Puntos de corte, sensibilidad, especificidad, LR positivo y negativo, y eficiencia
de los leucocitos, PMN, monocitos, ADA y concentración de proteína para clasificar entre
DPM y DPB.
Marcador
Leucocitos
(L/mm3)
PMN (%)
(%)
ADA (U/L)
(g/L)
de corte
≤ 1,150
≤ 24
Monocitos
Proteína
Punto
> 75
≤ 37.9
≤5
Sensibilidad
Especificidad
LR
LR
%
%
Positivo
Negativo Eficiencia
(95 % IC)
(95 % IC)
(95 % IC)
(95 % IC)
53,13
79,07
2,54
0,59
(40,2-65,7)
(69,0-87,1)
(2-3,3)
(0,4-1)
80,95
49,43
1.6
0,39
(69,1-89,8)
(38,5-60,4)
(1,3-2)
(0,2-0,7)
76,56
50,57
1,55
0,46
(64,3-86,2)
(39,6-61,5)
(1,2-2)
(0,3-0,8)
94,74
49,35
1,87
0,11
(85,4-98,9)
(37,8-61)
(1,5-2,4)
(0,03-0,3)
58,21
65,17
1,67
0,64
(45,5-70,2)
(54,3-75)
(1,3-2,2)
(0,4-1)
68
62,67
61,59
68,66
62,18
PMN: polimorfonucleados; ADA: Adenosina desaminasa; IC: Intervalo de confianza; LR:
Likehood ratio.
3.2.4.4. Influencia de los niveles de calprotectina sobre la
predicción del derrame pleural maligno
Para ver si existía alguna influencia de las características clínicas,
bioquímicas y de los niveles de calprotectina sobre la predicción del DPM,
se necesitó acudir a métodos estadísticos de regresión logística
206
Resultados
univariante (tabla 23). Los modelos de regresión nos permiten evaluar la
relación entre una variable (dependiente) respecto a otras variables en
conjunto (independientes). Debemos tener en cuenta que cuando la
variable que hemos tenido que introducir en el modelo fue una variable
categórica (de más de dos categorías), fue necesario recurrir a una serie
de transformaciones para que los resultados obtenidos sobre la variable
en cuestión fuesen correctos e interpretables.
Usando el punto de corte más exacto (545 ng/mL), que era el que
tenía una sensibilidad menor pero era capaz de diagnosticar de un modo
acertado un mayor número de pacientes, se ha visto que existe una
fuerte asociación de los bajos niveles de calprotectina con la probabilidad
de padecer o no la patología. De hecho, los valores obtenidos en el
análisis univariante demuestran que es el marcador que presenta la
mayor magnitud de asociación [u Odds Ratio (OR)] de todos los
estudiados (256,75, p < ,001). Este mismo análisis univariante reveló la
existencia de asociaciones significativas para la edad del paciente, el
consumo de tabaco, el tamaño del DP, el estado del recuento celular, la
concentración de ADA, y la concentración total de proteína, lo que indica
que en función de las características de los pacientes hay individuos más
o menos propensos a desarrollar MPE.
Cada uno de estos valores predictivos significativos fueron
introducidos en un modelo multivariante de regresión logística para así
poder evaluar la asociación entre los niveles bajos de calprotectina y el
DPM con el ajuste de otras variables explicativas. El modelo final
obtenido indica que la asociación no dependía de ninguna de las otras
variables, y que los niveles de calprotectina, empleando para ello el punto
de corte ≤ 545 ng/mL, se mantuvieron como un único predictor
significativo del error máximo permitido, con una OR ajustada de 553,28
(p < ,001), frente a la más elevada del resto de valores predictivos, de
3.05 (p = ,62), correspondiente a la concentración de proteínas del
líquido pleural (tabla 23).
207
Resultados
Tabla 23. Resultados de los análisis de regresión logística univariante y multivariante de
las caraceterísticas demográficas y de los marcadores seleccionados.
Análisis univariante
Valor
Análisis multivariante
Valor
OR (95 % IC)
de p
OR (95 % IC)
de p
Género = Hombre
1,30 (0,66 – 2,53)
,44
―
―
Edad ≥60
4,13 (2,07 – 8,27)
< ,001
1,13 (0,19 – 6,53)
,90
Tabaco
1,82 (0,93 – 3,57)
,08
1,07 (0,18 – 6,34)
,94
Neoplasia previa
1,43 (0,66 – 3,12)
,37
―
―
2,36 (1,10 – 5,06)
,03
0,57 (0,05 – 6,04)
,64
4,28 (2,09 – 8,75)
< ,001
1,51 (0,27 – 8,49)
,64
Linfocitos 75 (%)
3,34 (1,63 – 6,83)
,001
0,53 (0,06 – 5,08)
,58
Proteínas ≤5 (g/L)
2,61 (1,36-5,00)
,004
1,67 (0,31 – 8,94)
,55
ADA ≤38 (U/L)
17,54 (5,05 – 60,94)
< ,001
3,18 (0,30 – 33,17)
,33
256,75 (54,32– 1213,61)
< ,001
663,14 (35,37– 12433,89)
< ,001
Características
Tamaño del DP
1/3
Leucocitos ≤1150
(L/mm3)
Calprotectina ≤545
(ng/mL)
OR: odds ratio; IC: Intervalo de confianza
3.2.4.5. Comparación de la sensibilidad de la citología y la
calprotectina en la detección del derrame pleural maligno
De los 67 pacientes que presentaban patología maligna 34 de ellos
tuvieron una citología pleural positiva en la primera toracocentesis,
mientras que 33 presentaron citología negativa, y por tanto la
sensibilidad resultante fue del 50,75 %. Al determinar los niveles de
calprotectina en los pacientes mal clasificados por la citología la
sensibilidad de la prueba fue muy alta para cualquiera de los dos puntos
de corte mencionados anteriormente. Empleando el punto de corte de
mayor precisión (≤ 545 ng / ml) fueron bien clasificados 31 de los 33
pacientes de cáncer con citología negativa, mejorando la sensibilidad de
la citología hasta el 97 %. Y empleando el segundo punto de corte
208
Resultados
propuesto, ≤ 736,42 ng/mL, se pudieron clasificar correctamente a todos
los pacientes con citología negativa (100 % de sensibilidad).
3.2.4.6. Validación de los datos obtenidos.
Para la validación de los resultados obtenidos en el grupo de
estudio, con respecto a la capacidad diagnóstica de la calprotectina, se
ha realizado un procedimiento estadístico de remuestreo denominado
Análisis de validación cruzada por el método “dejando uno fuera”, en el
cual se han obtenido los resultados que se observan en la figura 53 en lo
referente a la curva ROC de cada uno de los análisis estadísticos
realizados. Como podemos observar, los resultados obtenidos son muy
similares a los conseguidos con los datos originales.
Figura 53. Análisis de validación cruzada por el método “dejando uno fuera”.
209
4. Discusión
Discusión
Discusión
Para
poder
realizar
un
correcto
diagnóstico,
pronóstico
y
monitorización de las enfermedades, uno de los métodos más usados a
hoy en día es la búsqueda e identificación de tantos marcadores como
sea posible. Éste es precisamente el objetivo de esta Tesis, en la que se
han empleado técnicas de una de las áreas más prometedoras de la
bioquímica, la proteómica, para la identificación de aquellas proteínas
que presentaban expresión alterada en el DPM. En este trabajo se han
utilizado metodologías como el DIGE, basado en una búsqueda sin ideas
preconcebidas sobre la existencia o la identidad de los biomarcadores,
que incrementa la cantidad de potenciales marcadores descubiertos en
un único procedimiento experimental (Byrne et al., 2008), y técnicas
como el ELISA, que permiten la detección de pequeñas diferencias en los
niveles de las proteínas, no apreciables mediante otras metodologías.
4.1.
Búsqueda de marcadores en el
fluido pleural
El DPM representa una importante fuente de morbilidad para los
pacientes con cáncer. De hecho, en estudios postmorten de pacientes con
enfermedades neoplásicas se ha observado que el 15 % de estos
pacientes presentaban DP (Antony et al., 2000).
Los DPM pueden ser originados a partir de tumores malignos
primarios de la pleura, o de enfermedades malignas intratorácicas o
extratorácicas subyacentes, que llegan a la cavidad pleural por vía
linfática, o por diseminación contigua (Heffner, 2008). Aunque no existen
estudios epidemiológicos, se ha estimado que en Estados Unidos, por
213
Discusión
ejemplo, la incidencia anual de los DPM es de más de 150.000 casos,
siendo el cáncer de pulmón la causa principal que ocasiona DPM,
seguido del cáncer de mama (Cohen y Hossain, 1966; Jemal et al., 2006;
Jemal et al., 2009; Stenbygaard et al., 1999). La enfermedad oncológica
es también una de las principales causas de DP de tipo exudado; de
hecho, diferentes estudios han demostrado que entre el 42 y el 77 % de
los derrames exudativos son secundarios a malignidad (Valdés et al.,
1996; Heffner, 2008).
El espacio en el que se localiza el fluido pleural está conectado con
el parénquima pulmonar, existiendo un equilibrio a nivel celular y
humoral entre ambos (Jantz y Antony, 2008). En condiciones fisiológicas
el líquido pleural es un ultrafiltrado del plasma, y su cuantía se estima
en 0,15 mL/kg de peso para cada hemitórax (Porcel-Pérez, 2010). Por
eso, cuando este balance se rompe ante la presencia de un tumor,
aparece una concentración de moléculas alterada en el fluido pleural
(Jantz y Antony 2008). Este fluido, además, se caracteriza por ser una
muestra biológica de fácil acceso para el estudio de marcadores
tumorales (Heffner, 2008; Hung et al., 2003; Ishikawa et al.,
1997;
Kataria y Khurshid 2001).
El análisis de diferentes tipos de muestras biológicas (células
tumorales, tejidos y fluidos) para la identificación de proteínas con
expresión diferencial, ha sido una alternativa empleada para el
descubrimiento de nuevos biomarcadores (Hanash et al., 2008). En
estudios basados en técnicas proteómicas no es frecuente la utilización
de fluido pleural, siendo los fluidos biológicos más usados para la
búsqueda de nuevos biomarcadores el suero, el plasma, el fluido
cerebroespinal y la orina (Good et al., 2007). Sin embargo, existen
multitud de fluidos biológicos todavía no estudiados, como son el fluido
de lavado del colon, la saliva, el fluido pleural y el lavado bronco-alveolar,
el fluido sinovial, el aspirado de fluido del pezón, las lágrimas, el semen,
el fluido del tracto genital femenino y el fluido amniótico, para los cuales
214
Discusión
existen trabajos de caracterización puntuales, aunque todavía no existe
información a gran escala como ocurre con el suero (Giusti et al., 2012;
Hu et al., 2006).
En la introducción de este trabajo hemos explicado los distintos
tipos de marcadores tumorales existentes, aunque poco efectivos, para la
detección de la patología maligna en pacientes con DP. Pese a que se
sabe que los marcadores tumorales juegan un papel muy importante a la
hora
de
dirigir
al
clínico
hacia
un
diagnóstico,
pronóstico
o
monitorización, en función de la patología que estemos estudiando, y del
marcador, se obtendrán diferentes resultados.
Por todo ello, uno de los retos principales a día de hoy en la
investigación de cualquier patología es el hallazgo de parámetros
bioquímicos que puedan llegar a convertirse en marcadores efectivos
para el diagnóstico de una enfermedad.
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es coincidente con el
objetivo marcado por la comunidad científica que acabamos de
mencionar, la búsqueda de nuevos marcadores tumorales en el fluido
pleural que sirvan para establecer un diagnóstico certero de la existencia
de la patología maligna en el DP.
El hecho de que se escojan pacientes con derrame de tipo exudado
es debido al hecho de que son fácilmente diferenciables de los
trasudados. Sin embargo, el poder clasificar los exudados entre sí es
muy difícil. Sería bueno poder clasificar a los pacientes que presentasen
DPM de un modo rápido, y así se podrían empezar a aplicar las terapias
correspondientes sin necesidad de que se prolongase más en el tiempo,
mejorando la supervivencia de los pacientes. También es deseable buscar
marcadores medibles en fluidos para evitar la aplicación de métodos
diagnósticos invasivos.
215
Discusión
Con este objetivo en este trabajo se han empleado metodologías
proteómicas de expresión como la 2-DE y su variante DIGE, y la MS, con
el fin de comparar los geles proteicos en líquido pleural de individuos con
una patología benigna, como es la tuberculosis, y de pacientes con
patologías malignas, y poder identificar las proteínas alteradas. Así,
hemos podido detectar, e identificar, las proteínas con alteraciones en
sus niveles de expresión en relación al DPM.
En función de la estrategia empleada diremos que los estudios
proteómicos existentes hoy en día están catalogados como top-down (de
arriba a abajo) y bottom-up (de abajo a arriba). Los denominados topdown son aquellos en los que se intenta la separación del mayor número
posible de proteínas intactas mediante técnicas como la 2-DE o sistemas
multidimensionales y, una vez separadas las proteínas, se digieren con
tripsina y se analizan los péptidos resultantes mediante técnicas como la
MS para tratar de identificar las proteínas por comparación con la
información existente en bases de datos (Kelleher, 2004; Wehr, 2006). La
principal ventaja de este tipo de metodologías es que nos proporcionan
información sobre la cantidad de proteínas y sobre su estructura
(González-Buitrago et al., 2008). Esta ha sido la aproximación escogida
para nuestro estudio proteómico.
Sin embargo en los métodos denominados bottom-up (Wehr, 2006)
las proteínas introducidas en el espectrómetro de masas generan
péptidos por escisión enzimática. Aunque en este caso las proteínas se
pueden separar primero por electroforesis o cromatografía no es muy
normal hacerlo, puesto que únicamente contendría una muestra
específica de un tipo proteico. En este tipo de experimentos una mezcla
compleja de proteínas puede ser digerida inicialmente formando iones
(ESI-MS). Esta metodología de ionización por electrospray puede estar
acoplada a una cromatografía líquida (en línea). En este último caso, se
pueden llegar a separar de miles a cientos de miles de péptidos, y por lo
tanto se requiere la separación en dos o más dimensiones antes del
216
Discusión
análisis cromatográfico. La identidad de la proteína original se determina
por comparación de los espectros de masas con masas de péptidos
teóricos calculados a partir de una base de datos proteómicos, o
genómicos (Wehr, 2006).
Debido a que el estudio a nivel proteómico de los fluidos biológicos
es relativamente reciente, todavía existen pocos artículos donde se
analice el líquido pleural con esta finalidad. Por el contrario, el proteoma
mejor caracterizado es el del plasma y suero humano que contiene miles
de proteínas diferentes, entre las que se encuentran aquellas que ejercen
funciones específicas en la sangre y otras muchas secretadas o perdidas
por las células y tejidos de todo el cuerpo. Aunque esto hace que sea una
muestra ideal para la búsqueda de biomarcadores, la gran abundancia
de unas pocas proteínas como la albúmina y las inmunoglobulinas hace
que las proteínas de interés normalmente queden enmascaradas
(González-Buitrago et al., 2008).
Puesto que el fluido pleural es una muestra biológica cuyas
concentraciones proteicas dependen fundamentalmente de las del suero,
la gran abundancia de proteínas mayoritarias también impide la
visualización de las proteínas de interés secretadas por las células
tumorales, por lo que se hace necesaria una preparación previa antes de
aplicar técnicas proteómicas.
4.1.1.
Depleción de las proteínas más abundantes
del líquido pleural
De un modo similar a lo que ocurre con el suero, la investigación
del contenido del DP requiere de metodologías de prefraccionamiento
previo con el fin de eliminar las proteínas que presentan una alta
abundancia y así evitar la interferencia que estas proteínas suelen tener
con las de mayor interés biológico (Faca et al., 2007).
217
Discusión
En proteómica, una de las estrategias habituales que se suele
llevar a cabo para eliminar proteínas muy abundantes consiste en la
realización del prefraccionamiento de la muestra, previo a la separación
electroforética, con el objetivo de enriquecer las muestras en proteínas
poco abundantes, difíciles de visualizar en un mapa 2D obtenido a partir
de una muestra no fraccionada. De hecho, numerosos autores han
desarrollado diversas técnicas de fraccionamiento, entre las que se
incluyen distintos tipos de cromatografía, extracción secuencial con
diversos disolventes, y precipitación selectiva, entre otras (Blonder et al.,
2002; Görg et al., 2004; Molloy, 2000; Prinz et al., 2004). Otros autores
como Soltermann et al. (Soltermann et al., 2008) demostraron la gran
utilidad del acoplamiento de una cromatografía de manera directa a la
caracterización de proteínas por MS (LC-MS/MS), y Hsieh et al. (Hsieh et
al., 2006), emplearon un kit de limpieza previo de la muestra, que
permitía una mejor resolución final de las proteínas.
En suero se ha demostrado que la cromatografía de afinidad
resulta de gran utilidad a la hora de eliminar proteínas tan abundantes
como la albúmina (que constituye un 51-71 % del total de proteínas) o
las inmunoglobulinas (8-26 %) (Cho et al., 2005) y, puesto que el líquido
pleural presenta una composición bastante similar a la del suero, la
depleción mediante cromatografía de afinidad también es un método
factible en estas muestras.
En
nuestro
cromatografía
de
estudio,
afinidad
en
concreto,
múltiple
para
se
ha
empleado
una
las
seis
proteínas
más
abundantes en suero, denominada Hu-6, que presenta anticuerpos
específicos que retienen las proteínas albúmina, transferrina, Ig G, Ig A,
antitripsina y haptoglobina (Pernemalm et al., 2008). Esta misma
cromatografía ya se había empleado anteriormente para muestras de
suero de pacientes con cáncer de próstata, donde sus autores lograron
incrementar el número de spots detectados en mapas proteicos de suero
218
Discusión
obtenidos
mediante
el
empleo
de
la
técnica
2D-DIGE,
en
aproximadamente un 76 % (Byrne et al., 2008).
El procesamiento del fluido pleural a través de la columna Hu-6
permitió separar la muestra en dos fracciones cromatográficas. La
fracción eluida, no retenida por los anticuerpos de la columna, contenía
las
proteínas
minoritarias
del
DP.
La
fracción
retenida,
estaba
enriquecida en las proteínas mayoritarias que se habían unido a los
anticuerpos específicos. Los perfiles cromatográficos obtenidos fueron
muy similares cuando se procesaron las muestras de fluido pleural de
ambos tipos de pacientes (con enfermedad benigna o maligna).
Debido a que el proceso cromatográfico requería el uso de
disoluciones
tamponadoras
ricas
en
sales,
se
hizo
necesaria
la
realización de un paso previo a la electroforesis para la eliminación de
estas sales, puesto que son una de las principales interferencias en la 2DE (Herbert, 1999). Las sales afectan al comportamiento de la corriente
eléctrica; de hecho, un voltaje superior a 100 V durante la rehidratación
de la muestra es indicativo de que la concentración de sales es
demasiado elevada (Ahmed, 2009). Los métodos de desalado, en concreto
el empleado en este experimento (diálisis frente a agua ultrapura),
presentan una serie de inconvenientes: al tratarse de membranas con un
tamaño de poro determinado, las proteínas de baja masa molecular
pueden pasar por difusión a su través; además se pueden perder
proteínas por adsorción a la membrana de filtración o de diálisis
(Greenlee et al., et al., 2009; Kim, 2010). Para este trabajo, se escogieron
membranas con un corte de 12,000-14,000 Da, de modo que la mayoría
de las proteínas que se pueden separar en la electroforesis no se
perdiesen durante la diálisis.
Por otro lado, cualquier manipulación de las muestras conlleva
una posible desnaturalización de las proteínas. Si bien la pérdida de la
conformación 3D nativa no afecta a este estudio, puesto que la
219
Discusión
electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, para reducir
este riesgo las muestras deben mantenerse a 4ºC durante todo el
prefraccionamiento,
Para comprobar la integridad de las proteínas y la eficacia del
proceso
cromatográfico,
se
realizó
la
separación
en
geles
de
poliacrilamida en una dimensión. En la fracción eluida observamos que
no se detectan, o se detectan de forma más tenue, las bandas de
albúmina y del resto de proteínas abundantes. Además, se puede
observar cómo el total de bandas que se visualizan en la fracción eluida
es mucho mayor que en la fracción cruda, y sobre todo que en la
retenida. Por tanto, la cromatografía permitió separar las seis proteínas
más abundantes del resto de la muestra, de tal manera que la fracción
eluida quedó enriquecida en proteínas poco abundantes.
Cuando se realizó la separación en dos dimensiones, en la cual los
geles fueron teñidos con nitrato de plata, 100 veces más sensible que la
tinción con Coomassie empleada en los geles 1D (Görg et al., 2004;
Vercauteren et al., 2007), se pudo comprobar nuevamente la eficacia de
esta
cromatografía.
abundantes
En
(albúmina,
la
Igs
fracción
A
y
G,
retenida,
las
antitripsina,
seis
proteínas
haptoglobina
y
transferrinas) quedaron retenidas por los anticuerpos de la columna,
haciendo que las proteínas minoritarias eluyesen. Por este motivo, la
fracción
eluida
presenta
una
mayor
concentración
de
proteínas
minoritarias, que es el objetivo de la cromatografía empleada.
La separación cromatográfica permitía detectar más especies
proteicas, al considerar la suma de spots detectados en fracción eluida y
fracción retenida, con respecto a los spots detectados en el fluido pleural
crudo. Esto se debe en parte a que las técnicas de prefraccionamiento
permiten aumentar la muestra que se resuelve en un gel, reduciendo
además en este caso el rango dinámico, ya que se elimina la albúmina
(aproximadamente el 50 % de la muestra total), varias proteínas y una
220
Discusión
gran cantidad de Igs. Estos hechos, además de permitir la resolución de
un mayor número de proteínas, permiten visualizar proteínas de
abundancia media o baja.
Numerosos autores han destacado la importancia que tiene el uso
de este tipo de metodología para la detección de proteínas alteradas en el
plasma (Hanash et al., 2008; Lee et al., 2003; Mathivanan et al., 2010;
Simpson et al., 2008). De hecho, Byrne et al. (Byrne et al., 2008) han
demostrado la utilidad y eficacia de este tipo de fraccionamiento previo al
análisis del total de proteínas eluidas, para la posterior identificación de
marcadores tumorales del cáncer de próstata mediante 2D-DIGE y MS.
Esta es una tendencia que ha sido reconocida en los estudios
proteómicos, especialmente de suero, en los últimos años, ya que es
esperable que las proteínas biomarcadoras sean del tipo de receptores
secretados, factores de transcripción, etc., que se encuentran en baja
cantidad en el suero (Pelech et al., 2003). De ahí la utilidad de la técnica
descrita en los estudios proteómicos, especialmente de los realizados en
suero.
4.1.2.
Detección e identificación de proteínas con
expresión alterada
En la búsqueda e identificación de marcadores tumorales
mediante herramientas proteómicas, y en concreto mediante el empleo
de la 2-DE, existen varias aproximaciones técnicas posibles. Pese a las
ventajas que aporta la 2-DE a la proteómica, la gran cantidad de pasos
que requiere y que no son todavía susceptibles de automatización, la
corriente eléctrica (cuyo comportamiento depende de la temperatura), la
resistencia que genera la muestra, la cantidad de agua que pudiese
haber penetrado en las tiras IPG, las características de la fuente de
alimentación, etc., hacen que existan numerosos factores que afectan a
221
Discusión
la reproducibilidad de la técnica. El uso de la muestra a temperaturas
inadecuadas, y la adición de sustancias tamponadoras no aconsejables,
hace que se produzcan modificaciones proteicas que se pueden llegar a
ver reflejadas en el gel 2D (Ly y Wasinger, 2008).
En nuestro estudio, y como variante a la 2-DE, se empleó la
técnica DIGE con el fin de identificar marcadores tumorales por su
diferente expresión en los dos grupos de muestras. Esta metodología,
pese a presentar las mismas desventajas que la 2-DE, el hecho de poder
resolver las muestras en un mismo gel hace que la reproducibilidad de la
técnica sea mayor y por tanto reduce al mínimo los factores modificables
de la técnica. Un inconveniente de este método es que no permite obtener
información de las especies proteicas que están presentes sólo en una de
las muestras de un grupo de pacientes, ya que el programa empleado no
analiza los spots si no están presentes todas las muestras del grupo
(Hegmans et al., 2007; Pernemalm et al., 2009).
Se resolvieron muestras de la fracción eluida de pacientes con
patologías benignas y malignas, que fueron marcadas con los fluoróforos
Cy3 y Cy5, y se obtuvo un estándar interno constituido por una parte
proporcional de cada una de las muestras incluidas en el mismo
experimento, marcado con Cy2. El uso del marcaje con fluoróforos
permitió una mayor sensibilidad en la detección de las proteínas, puesto
que presenta un rango dinámico lineal de tres órdenes de magnitud, y
por tanto una sensibilidad de detección mucho mayor. De hecho el rango
lineal de los fluoróforos es de 105 mientras que el del nitrato de plata es
de 102 (Liumbruno, 2008).
El marcaje fluorescente, sin embargo, depende de la abundancia
de Lysina en las proteínas, de modo que la resolución final del DIGE
suele ser peor, y la automatización suele obligar a eliminar spots debido
a la incertidumbre de su detección. Esto ocurre en particular con
proteínas que presentan un alto contenido en carbohidratos (altamente
222
Discusión
glicosiladas) si presentan un porcentaje bajo en lisinas que suelen
resolverse mal en la zona de enfoque de los mapas fluorescentes (de ahí
los problemas con este tipo de marcaje).
En nuestro estudio, una vez adquiridas las imágenes se detectaron
aproximadamente 1.600 especies proteicas presentes en cada uno de los
geles. Tras el procesamiento y la normalización de los volúmenes
relativos (representativos de la cantidad de proteína), se compararon los
datos de cada uno de los geles con el fin de encontrar manchas proteicas
similares.
En el conjunto de mapas se detectaron 974 manchas proteicas
comunes a todos ellos. Una vez realizada la prueba no paramétrica de
comparación de medias U de Mann-Whitney, adecuada para dos
muestras
independientes
con
un
tamaño
muestral
pequeño,
se
detectaron 41 manchas proteicas que presentaban una variación
estadísticamente significativa con un nivel de confianza del 95 %. Desde
el punto de vista estadístico debemos considerar que el análisis de un
limitado número de muestras conlleva un riesgo de omisión de proteínas
que podrían expresarse de manera diferencial. De todos modos, este
riesgo no significa que aquellas proteínas que fueran clasificadas como
significativas sean clasificadas de modo opuesto mediante la inclusión de
más muestras en el estudio (Byrjalsen et al., 1999).
Por
otra
parte,
se
emplearon
herramientas
estadísticas
multivariantes para determinar la expresión diferencial de proteínas. El
análisis de CP de las 974 manchas proteicas permitió reducir su
variabilidad a tan solo 7 CPs, cada uno de los cuales es una función
lineal de los volúmenes relativos que presentan las manchas proteicas
empleadas como variables originales, que puede representar un factor
que explica la variabilidad biológica. En este caso, el conjunto de los 7
CPs permite explicar el 100% de la diferencia entre los grupos de
pacientes con enfermedad benigna y maligna. Para comprobar si alguno
223
Discusión
de estos CPs permitía por sí solo diferenciar ambos grupos, se realizó un
análisis de comparación de medias mediante la prueba U de MannWhitney, donde se detectaron diferencias significativas en el CP2, de
modo que mediante la representación gráfica de los CPs se pudo
establecer una asíntota que dividía los dos grupos. Sin embargo, la
varianza explicada por este CP no fue muy alta (24,29 %). Debido a esto,
se repitió el análisis de componentes principales, aplicándolo en este
caso a los 41 spots con diferencias significativas entre los dos grupos de
pacientes. Se hallaron 7 CPs, al igual que en el caso anterior, que eran
capaces de explicar el 100 % de la variabilidad biológica contenida,
siendo el CP1 significativo tras realizarse la prueba U de Mann-Whitney,
y permitiendo separar los grupos frente a cualquiera de los CPs
restantes. En este caso, la varianza explicada por este CP1 fue alta
(72,73 %).
La resolución y alineamiento de estos 41 spots fue comprobada de
manera manual, detectándose una variación (aumento o disminución) de
sus volúmenes relativos (equivalentes a sus niveles en fluido pleural)
entre 1,4 y 9,5 veces en muestras de pacientes con DPM derivado de
adenocarcinoma
pulmonar,
con
respecto
a
enfermos
con
DPB
tuberculoso.
Las proteínas cuyos niveles presentaban diferencias significativas
entre DPB y DPM fueron sometidas a un proceso de identificación por
MS. Aquellas manchas proteicas cuya intensidad de tinción fue baja en
los geles analíticos, reflejando por tanto una baja cantidad de proteína,
no pudieron ser detectadas, por lo que se tuvo que realizar un gel
preparativo con una mayor cantidad de proteína para poder extraerlas e
identificarlas. A pesar de ello, algunas proteínas procesadas mediante
MS no dieron lugar a suficiente cantidad de información como para
permitir una correcta identificación.
224
Discusión
De manera global se pudieron identificar más del 85% de las
proteínas con diferencias significativas entre individuos con patología
benigna y maligna. La mayoría fueron identificadas en función de su
huella peptídica por MALDI-TOF, que es una de las herramientas más
empleadas para la identificación de proteínas (Cañas et al., 2007; Niwa,
2008), a pesar de que existen múltiples técnicas con el mismo fin (LuqueGarcía y Neubert, 2007).
Por lo tanto, la comparación mediante la metodología DIGE de
muestras de DPB asociado a tuberculosis y DPM derivado de CPNM nos
ha permitido encontrar 17 proteínas alteradas. De todas las proteínas
identificadas
posteriormente
mediante
MS,
se
consideraron
como
candidatas a marcadores para el diagnóstico del fluido pleural el PEDF,
las proteínas S 100 A8 y S 100 A9, la gelsolina y el inhibidor de
metaloproteinasas tipo 2, ya que su función está relacionada con el
cáncer. El resto de las proteínas detectadas están relacionadas con la
homeostasis sanguínea, con la coagulación y/o con la respuesta
inmunitaria y, puesto que muchas de estas proteínas pueden llegar a
estar influenciadas por otras enfermedades, o por el estado anémico del
paciente, se consideró que tenían menor potencial como marcadores.
El PEDF, también denominado serpina F1 o EPC-1, es una
glicoproteína de 50 kDa de la familia de las serpinas (inhibidoras de serín
proteasas). El análisis mediante la tecnología DIGE de esta proteína
demostró la existencia de un incremento significativo del volumen
relativo, de entre 1,5 y 2 en las muestras de DPM con respecto a las de
DPB, en los dos spots detectados. El papel que esta proteína tiene en el
cuerpo humano todavía no está claro y, en algunos casos, presenta
controversias (Ek et al., 2006). El PEDF parece expresarse en tejidos
fetales y adultos, incluyendo cerebro y columna vertebral, ojo, hígado,
plasma, hueso, riñón, corazón y pulmón. Dentro de las funciones que
realiza, una de las primeras que se han descrito ha sido su actividad
neurotrópica en células cerebelares, que inhibían el crecimiento de la
225
Discusión
microglía ocular (Dawson, 1999). Además, parece ser un potente
inhibidor de la angiogénesis sensible a hipoxia (Abramson et al., 2003),
de tal manera que es capaz de regular la neovascularización de la retina
(Zhang et al., 2006). También se ha visto que presenta función antiapoptótica. Estas funciones están presentes en dos epítopos diferentes
de la proteína, donde se ha elucidado que el péptido de 43 aminoácidos
confiere actividad antiangiogénica y anti-apoptótica, mientras que el
péptido de 44 aminoácidos presenta actividad neurotrópica (Ek et al.,
2006).
A pesar de que en nuestro caso la proteína aumentaba en los
pacientes con DPM, algunos autores destacan una bajada en los niveles
de PEDF relacionada con el aumento de la densidad vascular
intratumoral, y con la presencia de metástasis tumoral (Cosgrove et al.,
2004; Ek et al., 2006; Simpson et al., 2008). Sin embargo, otros autores
destacan la existencia de un aumento de PEDF en pacientes que
presentan adenocarcinoma con estadios III o IV de la enfermedad (Ueara
et al., 2004), o bien la expresión aumentada en pacientes con CPNM,
aunque únicamente en pacientes con adenocarcinoma, apareciendo una
menor expresión en pacientes con otros tipos de CPNM (Zhang et al.,
2006).
El análisis mediante la tecnología DIGE de la proteína S 100 A9
demostró la existencia de un ratio de descenso de expresión de 0,14
veces en los mapas 2D de pacientes con patología maligna frente a los
pacientes con patología benigna, que en ese caso se trataba de pacientes
con DPB de tipo tuberculoso. Se sabe que tanto la proteína S 100 A8
como la S 100 A9 son moléculas proinflamatorias expresadas y
secretadas por fagocitos reclutados, y parecen tener un papel crucial en
la respuesta inmunitaria innata. Además, en presencia de inflamación
son parámetros sensibles que pueden emplearse para la monitorización
de la enfermedad y la respuesta a tratamientos (Foell et al., 2007). Se
han observado también estas dos proteínas como marcadores para las
226
Discusión
infecciones causadas por micobacterias, como en el caso del DPB tipo
tuberculoso. Por tanto, una mayor expresión en pacientes con patologías
benignas detectado mediante la metodología DIGE, en el que solamente
estamos analizando muestras con DPB tuberculoso y DPM con cáncer de
pulmón, sería coincidente con lo obtenido en estudios previos.
En relación con la proteína gelsolina, los análisis realizados
mostraron un aumento de la gelsolina en los pacientes con cáncer de
pulmón. La gelsolina es una proteína de 20 kDa (Shieh et al., 1999),
dependiente de calcio y regulada por PIP2 (fosfatidil-inositol 4,5bifosfato), que está implicada en el crecimiento celular y en la actividad
de las células apoptóticas (Okano et al., 2006; Sun et al., 1999). Además,
es esencial para el mantenimiento de la morfología celular y la motilidad
(Dosaka-Akita et al., 1998).
La sobreexpresión de gelsolina en pacientes con cáncer de pulmón
puede relacionarse con un mal pronóstico de la enfermedad, debido a
que un incremento de la expresión de esta proteína en células
cancerosas
se
correlaciona
con
una
invasión
linfática,
y
como
consecuencia en un aumento de la motilidad de estas células, existiendo
por tanto probabilidad de metástasis (Shieh et al., 1999).
Curiosamente, en pacientes con cáncer de pulmón que han sido
consumidores de gran cantidad de tabaco se observa una expresión
significativamente negativa de esta proteína en comparación con
pacientes no fumadores o fumadores de menos de 20 paquetes al año
(Dosaka-Akita et al., 1998). Esto es debido a que las sustancias
carcinógenas del tabaco afectan a la metilación del ADN de los
neumocitos tipo II que revisten el pulmón, impidiendo la expresión de la
proteína (Dosaka-Akita et al., 1998).
El inhibidor de metaloproteinasas tipo 2 es una proteína de 21
kDa
que
forma
un
complejo
de
manera
selectiva
con
las
metaloproteinasas tipo 2 (Kallakury et al., 2001; Stetler-Stevenson et al.,
227
Discusión
1990), y se une mediante interacciones adicionales a dominios de
hemopexina (Tuuttila et al., 1998). En este trabajo se ha detectado un
aumento
significativo
en
pacientes
con
patología
maligna.
Una
sobreproducción de la actividad de estas enzimas está asociada a una
variedad de condiciones patológicas, como ocurre con la conversión de
las células tumorales a patologías malignas (Stetler-Stevenson et al.,
1990), además de estar relacionado con una desorganización del
parénquima pulmonar (Garbacki et al., 2009).
El aumento del tejido conectivo es un rasgo característico de
muchas condiciones fisiológicas y patológicas. Entre éstas se incluyen la
remodelación extensiva del tejido durante procesos de desarrollo,
destrucción del tejido relacionado con la inflamación y las enfermedades
autoinmunes, y metástasis en cáncer. Las metaloproteinasas presentan
un gran potencial de degradación de todos los componentes de la matriz
extracelular (Tuuttila et al., 1998). Para el control de la proteólisis se
requiere un balance delicado entre la activación y la inhibición de estas
metaloproteinasas. La mayoría de ellas se secretan como preproenzimas,
que requieren la activación y conversión a propéptidos; por ello una de
las
vías
de
control
de
estas
proteínas
son
los
inhibidores
de
metaloproteinasas (Tuuttila et al., 1998). Hay estudios que demuestran
que no sólo los inhibidores de metaloproteinasas actúan como tal, sino
que la α-2-macroglobulina también es un inhibidor severo de éstas (Visse
y Nagase, 2003).
El citoesqueleto es una estructura muy dinámica que se remodela
como respuesta a una gran variedad de señales. El estímulo generado
por los factores de crecimiento promueve el ensamblaje de la actina a la
membrana plasmática generándose movimiento, mientras que las
señales apoptóticas causan la destrucción del citoesqueleto mediante
cambios morfológicos. En nuestro trabajo se han identificado dos spots
pertenecientes a la actina, con un descenso de los valores en el DPM con
relación al DPB. La actina del citoesqueleto celular es una parte esencial
228
Discusión
de las interacciones entre membranas y de las funciones intracelulares, y
está relacionada con el control de la locomoción, secreción y endocitosis
del citoplasma de los macrófagos (Stüven et al., 2003). Durante estas
actividades el citoplasma, que contiene numerosos filamentos de actina,
presentará estructura de gel o sol, en función de su concentración.
Cambios en esta concentración serán los que regularán la movilidad de
los macrófagos (Yin y Stossel, 1979), junto con los cambios en la
concentración de calcio.
La proteína α-2-macroglobulina es una proteína inhibidora de
varias enzimas relacionadas con los leucocitos durante la fagocitosis,
siendo una proteína importante durante la inflamación y la inducción de
daño en los tejidos. Además, actúa como proteína transportadora de
varias hormonas (Alexandrakis et al., 2000). En nuestro estudio la
proteína α-2-macroglobulina fue detectada con niveles disminuidos en
pacientes con cáncer de pulmón, lo cual se relaciona con otros estudios
donde esta proteína está disminuida en DPM (Alexandrakis et al., 2000;
Kunter et al., 2002).
Para el mantenimiento de la homeostasis sanguínea existen
múltiples proteínas que son capaces de transportar iones por la sangre.
Además de la albúmina, que en este estudio había sido eluida en el
prefraccionamiento, existen otras proteínas como la hemopexina y la
ceruloplasmina que se encargan del transporte de iones por la sangre.
En nuestro estudio se observa un incremento significativo en los
pacientes con patología maligna en un spot de ceruloplasmina, y en 11
spots de hemopexina.
La ceruloplasmina es una proteína de 132 kDa (Bento et al.,
2007), que presenta actividad ferroxidasa y es capaz de movilizar metales
en el hígado para oxidarlos posteriormente, incorporando el grupo férrico
a su molécula. Se ha visto que el incremento en suero está relacionado
con algunas patologías malignas. La expresión del gen de esta proteína
229
Discusión
se ha detectado en algunos tejidos como el bazo, pulmón, testículo y
cerebro. Además, se ha visto que existen incrementos rápidos durante
infecciones, traumas y embarazos (Hellman y Gitlin, 2002), por lo que se
puede relacionar con la presencia de la inflamación pleural rápida y el
incremento del contenido de esta proteína en el fluido pleural, debido al
adenocarcinoma tumoral en los pacientes con DPM. En estos pacientes
se ha detectado un incremento de 1,9 veces en relación a pacientes con
DPB, en los que puede que la inflamación surja en un tiempo no tan
rápido como en el caso de los DPM (más progresivamente).
La hemopexina es una glicoproteína sérica de 63 kDa, que se une
al grupo hemo de la hemoglobina con gran afinidad para transportarlo a
un receptor específico de la superficie celular de los hepatocitos (Altruda
et al., 1985; Tolosano y Altruda, 2002). Se ha visto que se encuentra
aumentada en otros tipos de cáncer, y en otros fluidos biológicos
(Dowling et al., 2007). En nuestro análisis presenta niveles entre 1,5 y
4,1 mayores en DPM, lo que se correlaciona con los resultados obtenidos
por estos autores.
A pesar de que los lípidos tienen un papel importante en el
metabolismo celular, todavía no está establecida la importancia que estos
tienen en la fisiología y en las enfermedades de la pleura (Pachón y
Escuín,
2005).
La
apolipoproteína
A-I
(Apo-AI)
es
una
proteína
relacionada con el metabolismo lipídico. Forma parte de las lipoproteínas
HDL, y se encarga del transporte de colesterol desde los tejidos hasta el
hígado. Los niveles de apolipoproteínas en líquido pleural son inferiores a
sus niveles en suero; sin embargo los niveles relativos de HDL líquido
pleural/suero son similares a los niveles relativos de Apo-AI líquido
pleural/suero (Vaz et al., 2001). Esta proteína, sintetizada en el hígado y
en el intestino, aparece incrementada en pacientes con patología maligna
de nuestro estudio con un aumento de 2,8 veces.
230
Discusión
El resto de las proteínas identificadas, todas ellas relacionadas con
la respuesta inmunitaria o con la agregación plaquetaria, representan un
24% del total de proteínas identificadas. En este grupo están presentes el
factor C3 del complemento, la glicoproteína α-1-B, la β-2-microglobulina,
la cadena γ- y la cadena β del fibrinógeno, la región C de la Ig-γ y la
proteína sérica amiloide A-4.
La detección de los complejos formados por los factores del
complemento en los fluidos biológicos indica directamente activación del
complemento (Salomaa et al., 1998). Para la predicción del tipo
patológico de DP se ha sugerido el análisis de la vía del complemento que
está activada. Niveles elevados de los factores del complemento C3, y de
su producto C5b-9, suelen aparecer en pacientes con DPB tuberculoso,
mientras que niveles disminuidos de estos factores normalmente se
asocian con DPM o con reumatitis (Shitrit et al., 2008). En nuestras
muestras se han detectado 4 spots identificados como el factor C3 del
complemento, tres de ellos presentaron valores elevados en las muestras
de DPM, mientras que sólo en una de ellas disminuía.
La glicoproteína α-1-B fue identificada a partir de un único spot
que presentaba un aumento de 1,7 veces en los pacientes con DPM. Esta
proteína se considera un marcador de la respuesta inflamatoria, puesto
que presenta dominios similares a las Igs, a los antígenos de
histocompatibilidad o al antígeno receptor de células T.
La proteína β-2-microglobulina ha sido caracterizada en el fluido
pleural en numerosos estudios (García et al., 2004; Kamble et al., 2005;
Suzuki et al., 2005). En ellos encontraron un incremento significativo de
sus niveles en el DPM de pacientes con mieloma múltiple. Estos datos no
concuerdan con el descenso encontrado por nosotros en pacientes con
DPM, en el único spot identificado como beta-2-microglobulina.
231
Discusión
4.2.
Selección y caracterización bioquímica
de proteínas con expresión diferencial en
derrame pleural maligno y benigno
Basándonos en los estudios realizados por Ueara, Zhang y sus
respectivos colaboradores (Ueara et al., 2004; Zhang et al., 2006) sobre la
proteína PEDF en los que destacaban la existencia de un aumento de
PEDF en pacientes que presentaban CPNM, en estadios III y IV de la
enfermedad, decidimos que esta proteína podía ser un buen candidato a
marcador debido a la similitud con las muestras que estábamos
empleando nosotros para nuestra validación, en la que todas ellas
presentaban estadios III y IV, y la mayoría de los pacientes estaban
diagnosticados como CPNM. Además, numerosos autores relacionaban
esta proteína con la presencia de metástasis tumoral y un aumento de
densidad vascular (Cosgrove et al., 2004; Ek et al., 2006; Simpson et al.,
2008), por lo que decidimos validarla y así poder confirmar si nuestros
resultados se asemejaban a los observados por los diferentes autores.
En lo referente a las proteínas S 100 A8 y S 100 A9, sabemos que
las proteínas de la familia de las S 100 han sido objeto de revisión,
debido al potencial que presentan como marcadores tumorales y dianas
terapéuticas del cáncer, cada vez más evidente (Foell et al., 2007;
Gebhardt et al., 2006; Raquil et al., 2008; Salama et al., 2008). Existen
estudios que las relacionan con procesos metastáticos del pulmón
(Salama et al., 2008) o con condiciones inflamatorias en el cáncer
(Gebhardt et al., 2006; Kim et al., 2009), siendo por ello comunes en
cánceres gástricos, en cáncer de mama y en adenocarcinoma de pulmón
(Cross et al., 2005). Sin embargo, de lo que no se duda es de su relación
con procesos inflamatorios. De hecho se ha observado un aumento de la
producción de ambas proteínas en diferentes muestras de pacientes con
enfermedades
inflamatorias
(Lügering
et
al.,
1995).
Además,
232
la
Discusión
concentración sérica de la proteína calprotectina se ha relacionado con la
AR, o variables clínicas como el número de articulaciones inflamadas
(Brun et al., 1994; Hammer et al., 2007; Hammer 2010).
Por todo esto consideramos que estas proteínas eran los
candidatos más prometedores a marcadores de diagnóstico del DPM, y
por ello decidimos realizar un estudio de validación en profundidad.
4.2.1.
Caracterización de la proteína PEDF
La proteína PEDF se identificó a partir de dos spots cuya masa
molecular aproximada era de 51 kDa. Debido a la existencia de estas dos
isoformas, como primera aproximación se decidió realizar una puesta a
punto del método de inmunoblot, para poder ver si en las muestras sin
ningún tipo de tratamiento previo éramos capaces de visualizar esta
proteína. Aunque, según un estudio previo realizado en derrame, sería
necesario un pretratamiento de las muestras para la visualización de la
banda correspondiente a esta proteína (Hsieh et al., 2006), como la
proteína había sido detectada en muestras crudas de otros tejidos como
la córnea y conjuntiva (Shao et al., 2004), homogeneizados de tejido
pulmonar (Cosgrove et al., 2004), suero (Petersen et al., 2003), etc. nos
pareció buena idea la detección de esta proteína en muestras sin
pretratamiento.
Una vez puesto a punto el método, las 8 muestras de fluido
pleural empleadas para la metodología DIGE fueron resueltas mediante
1-DE, transferidas a membranas e inmunodetectadas con anticuerpos
anti-PEDF. El análisis mediante inmunoblot de la proteína PEDF nos
permitió visualizar las bandas correspondientes a la proteína que
presentaban un peso molecular en torno a 50 kDa, que era el esperado.
De forma similar a lo aquí descrito, Shao, Cosgrove, Chen, Petersen y sus
correspondientes colaboradores (Chen et al., 2009; Cosgrove et al., 2004;
233
Discusión
Petersen et al., 2003; Shao et al., 2004) encontraron esta gran banda de
aproximadamente 50 kDa. La existencia de isoformas con masas
moleculares
similares
o
diferentes
puntos
isoeléctricos,
como
se
apreciaba al utilizar la metodología DIGE, podría explicar el espesor de la
banda observada.
La cuantificación de la mencionada banda correspondiente a la
proteína PEDF reveló que no existían diferencias significativas en la
expresión de esta proteína entre ambas patologías. Este resultado es
congruente con la existencia de diferentes isoformas, de modo que,
aunque alguna de las isoformas de esta proteína sí que presenta una
sobreexpresión en DPM, en conjunto esta sobreexpresión quedaría
enmascarada por la existencia de otras con menor expresión. Para
comprobar este hecho, decidimos realizar la electroforesis bidimensional
de muestras con patologías malignas y benignas, y la posterior
transferencia a membrana e inmunoblot de la proteína PEDF, para
detectar la existencia de isoformas.
Del mismo modo que lo obtenido en suero por Petersen y
colaboradores (Petersen et al., 2003), en DP se obtuvieron 12 isoformas
de la proteína PEDF en cada inmunoblot, apareciendo incluso duplicados
o triplicados entre los que no existía ni una sola unidad de pH de
diferencia. Sin embargo el análisis de las isoformas mediante el programa
PDQuest
no
reveló
la
existencia
de
diferencias
estadísticamente
significativas entre las isoformas de ambas patologías.
Estos resultados restaban interés sobre el PEDF y su posible valor
como marcador de diagnóstico del DP ya que eran contradictorios o, al
menos no confirmatorios de los resultados que se habían obtenido en la
comparación de proteomas mediante DIGE. Sin embargo, el PEDF ha
sido descrito en numerosos trabajos como factor relacionado con el
cáncer y nos pareció muy interesante la estrecha relación demostrada
entre el PEDF y la angiogénesis. Por ejemplo, está descrito que los niveles
234
Discusión
de PEDF son un factor importante a la hora de predecir el pronóstico de
varios tipos de cáncer, como ocurre con el adenocarcinoma pancreático
(Good et al., 1990), carcinoma hepatocelular (Matsumoto et al., 2004) y
cáncer prostático (Halin et al., 2004).
Por todo ello, en nuestro caso decidimos seguir adelante con su
validación y ver qué ocurría cuando se determinaba la concentración de
la proteína mediante metodologías más sensibles, como la técnica ELISA,
aún siendo conscientes de que dicha metodología no nos permitiría la
diferenciación entre isoformas, sino simplemente la cuantificación de la
cantidad total de proteína detectada en cada una de las muestras.
4.2.2.
Validación
de
la
proteína
PEDF
como
marcador de derrame pleural maligno
La validación de la proteína PEDF mediante la metodología ELISA
fue realizada en fluido pleural crudo, sin prefraccionamiento previo como
ocurría en algunas de las muestras empleadas en el inmunoblot. Esto se
debe a que queríamos reproducir al máximo las condiciones que los
clínicos se encontrarían si esta técnica se llegase a implantar en un
futuro en los hospitales. Al comparar los niveles medios de PEDF que se detectaron
mediante la metodología ELISA, entre el grupo de pacientes con
patologías benignas y los pacientes con patologías malignas, observamos
que el nivel medio de concentración de la proteína en el grupo de
pacientes con DPM fue de 4,59 mg/mL, nivel ligeramente superior al
detectado en pacientes con DPB, que fue de 3,97 mg/mL. Esto
confirmaría los resultados obtenidos tras el análisis realizado mediante
la metodología proteómica de inmunoblot; sin embargo, las diferencias
detectadas no alcanzaron la significación estadística (p < 0,166).
Buscando en la bibliografía estudios que midiesen niveles de
PEDF en líquido pleural observamos que son muy escasos, de hecho sólo
235
Discusión
en el realizado por Hsieh et al. (Hsieh et al., 2006) se determina la
cantidad de PEDF que hay en líquido pleural y, aunque en otros también
parecen hablar de estas patologías, en ninguno de ellos miden
directamente la cantidad de esta proteína en el fluido pleural. Hsieh et al.
(Hsieh et al., 2006) comparan la expresión de PEDF en pacientes que
presentan patologías de exudados malignos y de trasudados, detectando
unos niveles de expresión del PEDF incrementados en el caso de
muestras de pacientes aquejados de trasudado pleural. Pese a que en
nuestro estudio son las muestras malignas las que aparecen con una
concentración incrementada de la proteína, los resultados obtenidos por
Hsieh et al. (Hsieh et al., 2006) no son comparables a los nuestros, por la
diferente naturaleza de las muestras empleadas. Sin embargo, sí que
podemos decir que el rango de concentración de PEDF encontrado en
nuestro estudio en líquido pleural coincide con el rango de los niveles
descritos en suero por varios autores, de 5 mg/mL como promedio
(Ogata et al., 2007; Petersen et al., 2003).
Como era de esperar tras los resultados obtenidos, el rendimiento
diagnóstico de los niveles de PEDF no demostró ser útil para la
discriminación de la patología maligna. El área bajo la curva ROC
detectada fue de 0,6 (IC del 95 %). Aunque hay estudios que muestran a
esta proteína como candidata a marcador de patologías malignas, como
cáncer de próstata, (Byrne et al., 2008) el valor detectado del AUC
tampoco fue demasiado buena (0.788), y la sensibilidad diagnóstica del
estudio no les servía para clasificar al marcador como tal.
Una corriente en la investigación del cáncer es la identificación y
la modulación de los eventos que ocurren en la génesis tumoral. La
angiogénesis es uno de estos eventos conocido por ser fundamental en el
desarrollo, crecimiento y metástasis de las neoplasias, y es una de las
características que diferencia a un tumor del tejido que lo hospeda
(Folkman, 1990). Esta evidencia sugiere que la angiogénesis está
regulada por un balance neto entre factores positivos (angiogénicos) y
236
Discusión
negativos (angiostáticos) producidos por el tumor y otras células (Boehm
et al., 1997; Crowther et al., 2001; Lewis y Pollard, 2006). Se sabe que
los tumores producen inhibidores angiogénicos como la angiostatina, la
trombospondina y la endostatina (Cao, 1999; Folkman, 2006; Lawler y
Detmar, 2004). Además, podemos decir que los niveles de PEDF son un
factor importante a la hora de predecir el pronóstico de varios tipos de
cáncer, como ocurre con el adenocarcinoma pancreático (Good et al.,
1990), carcinoma hepatocelular (Matsumoto et al., 2004) y cáncer
prostático (Halin et al., 2004).
Una de las funciones propuestas para el PEDF es como potente
inhibidor de la angiogénesis y, por tanto, un descenso en los niveles de
esta proteína estaría asociado con una mayor progresión de la neoplasia
y con metástasis (Byrne et al., 2008; Cai et al., 2006; Halin et al., 2004).
Sin embargo, a pesar de que las diferencias no son estadísticamente
significativas, en nuestras muestras aparece incrementado en pacientes
con patologías malignas.
La participación del PEDF en la supervivencia y muerte celular
(funciones contrapuestas), podría deberse a que el PEDF es un factor de
crecimiento que es a la vez neuroprotector, y un potente modulador
endógeno de la angiogénesis. El PEDF comparte algunos rasgos con el
VEGF; ambas proteínas son neuroprotectores, haciéndolas objetivos
interesantes para el tratamiento de diversas enfermedades, como ocurre
con la enfermedad de Parkinson (Falk et al., 2010), pero tienen diversas
funciones que las hacen diferentes, sobre todo en lo referido a los
sistemas vasculares. Mientras que el VEGF tiene como función la
permeabilidad vascular de las células endoteliales, el PEDF presenta
actividad anti-angiogénica, y capacidad para inhibir la migración de
células endoteliales (Falk et al., 2010). Estas acciones opuestas son
particularmente apreciables en el ojo, donde muchos estudios han
demostrado cómo la homeostasis angiogénica es mantenida por un
delicado equilibrio entre estimuladores angiogénicos, como VEGF-A e
237
Discusión
inhibidores angiogénicos como PEDF.
El hecho de que no existan diferencias notables entre los
pacientes con DPM y DPB analizados en este trabajo puede radicar en el
origen de las muestras empleadas. Por un lado, los niveles más altos de
PEDF en DPM podrían deberse a un intento de limitar el daño tumoral,
como se ve en la esclerosis lateral amiotrófica (Falk et al., 2010), donde
parece existir una regulación positiva en la cantidad de PEDF del liquido
cefalorraquídeo de los pacientes aquejados de esta enfermedad. Sin
embargo, por otro lado las muestras con patologías benignas presentan
condiciones inflamatorias y, como se ha observado, el PEDF también
tiene propiedades anti-inflamatorias relacionadas con la aterosclerosis
(Yamagishi et al., 2006; Nakamura et al., 2009).
Debemos tener en cuenta que el PEDF es un potente inhibidor de
la angiogénesis y, por tanto, un descenso en los niveles de esta proteína
estará asociado con una mayor progresión de la neoplasia y con
metástasis (Byrne et al., 2008; Cai et al., 2006; Halin et al., 2004). Esto
podría explicar el porqué en nuestras muestras aparece incrementado en
pacientes con patologías malignas, como una manera que el cuerpo
presenta de controlar que no siga desarrollándose esa situación de
metástasis y progresión tumoral.
Los niveles de PEDF medidos en DP no mostraban relación con las
características
clínico-patológicas
de
los
pacientes,
siendo
estos
resultados similares a los obtenidos en estudios previos por Feng et al.
(Feng et al., 2011) y Uehara et al. (Uehara et al., 2004), en lo que a edad
y género se refiere.
Por el contrario, se comprobó estadísticamente que existía una
correlación entre los niveles de PEDF detectados en muestras de
pacientes con patologías benignas y malignas, y la cantidad de
monocitos, leucocitos y PMN. El que exista esta correlación positiva del
PEDF con los PMN y monocitos en las muestras de pacientes con DPM se
238
Discusión
relaciona con lo obtenido por Bard et al. (Bard et al., 2004), que
detectaron la presencia de esta proteína en exosomas derivados de
células tumorales y linfocitos en liquido pleural de pacientes con
neoplasias. Se sabe que los exosomas son vesículas de origen endosomal
obtenidas a través de la membrana, y secretadas por diferentes tipos
celulares, entre los que se incluyen las células epiteliales, los linfocitos y
las células tumorales; siendo los dos últimos tipos celulares la tipología
más abundante de células detectadas en el fluido pleural de los
pacientes que analizaron (Bard et al., 2004).
En resumen, hemos sido capaces de ver los niveles de expresión
del PEDF en pacientes con DPM y DPB, demostrando que la
concentración de la proteína es similar en ambas muestras, y los niveles
coinciden con los detectados en muestras de suero. Lamentablemente,
los niveles de esta proteína no permiten un diagnóstico preciso del DPM.
Sin embargo, el que la proteína PEDF presenta varias funciones, entre
las que se incluyen la anti-tumorigénesis y la inflamación, podría anular
la utilidad de esta proteína en muestras con patologías malignas o
benignas, sobre todo de tipo inflamatorio, ya que podrían obtenerse
diferentes resultados en función de la patología que se esté estudiando.
4.2.3.
Caracterización de la proteína Calprotectina
En este estudio, en la fracción eluida del fluido pleural se
encontraron dos especies proteicas pertenecientes a la familia de las
proteínas S 100, correspondientes a las proteínas S 100 A8 y S 100 A9.
Los valores de volumen estandarizado encontrado en los pacientes con
DPM fueron entre 4 y 5 veces menores que en pacientes con DPB.
Las proteínas de esta familia son pequeñas moléculas acídicas de
10-20 kDa, encontradas exclusivamente en vertebrados. Se localizan en
casi todos los fluidos corporales debido a que son secretadas por
239
Discusión
neutrófilos. Se caracterizan por ser proteínas que se unen al calcio
mediante el motivo hélice-vuelta-hélice y tienen habilidad para formar
homodímeros,
heterodímeros
u
oligómeros
entre
los
diferentes
componentes de su familia (Salama et al., 2008).
En el caso concreto de las proteínas S 100 A8 y S 100 A9 se sabe
que son capaces de formar heterodímeros siendo el ratio de formación de
dímeros-monómeros de 10:1 respectivamente (De Seny et al., 2008). En
condiciones inflamatorias ambas se producen de forma independiente.
La proteína S 100 A9 se encontrará ante condiciones inflamatorias
agudas como la gingivitis, mientras que la producción de S 100 A8 se
limita a inflamaciones de tipo crónico (Zwadlo et al., 1988). En ausencia
de calcio, la forma heterodimérica es la preferente. Estos complejos
formados por la proteína S 100 A8 y la S 100 A9, se denominan
comúnmente como calprotectina (Foell et al., 2007).
La calprotectina se puede encontrar en la bibliografía bajo varios
sinónimos (complejo de las proteínas S100A8 y S100A9, antígenos
27E10, factor relacionado con la inhibición de macrófagos, proteínas
MRP8/14, L1L L1H y proteínas calgranulina A/B). La calprotectina es un
heterodímero de 24 kDa compuesto por cadenas ligeras (MRP8) y
pesadas (MRP14) (8 y 14 kDa). Es un miembro de la familia de las
proteínas S 100, que son proteínas de unión al calcio. En presencia de
calcio, los complejos heterodiméricos suelen tetramerizarse en dímeros,
trímeros y tetrámeros (Stríz et al., 2004).
La calprotectina también contiene zinc, de hecho presenta una
capacidad de unión al zinc más elevada que otras proteínas S 100. Estos
dominios no se verán afectados por la unión del calcio. Además, tanto S
100 A8 como S 100 A9 contienen histidina con secuencias de unión al
zinc,
que
se
supone
que
están
involucrados
en
la
actividad
antibacteriana de esta proteína (Terasaky et al., 2007).
240
Discusión
Antes de proceder a su validación mediante la técnica ELISA se
realizó un estudio de caracterización electroforética las proteínas para
obtener una visión un poco más general de lo que está sucediendo con
las proteínas en cada una de las patologías estudiadas.
El análisis mediante inmunoblot de la proteína S 100 A9 resultó
ser más difícil de lo esperado a priori. Por un lado, la gran capacidad que
esta proteína presenta de formar complejos entre ella misma, o entre
componentes de su familia y, por otro, la alta resistencia del dímero a la
desnaturalización (McCormick et al., 2005) hizo necesario el empleo de
condiciones más desnaturalizantes a la hora de realizar las diferentes
pruebas en los geles 1D. Los agentes desnaturalizantes empleados
fueron
la
urea
y
la
temperatura,
que
modifican
la
estructura
tridimensional de las proteínas. El hecho de que mediante la técnica
DIGE permitiera la separación de los monómeros se debe a que en la
electroforesis bidimensional se utilizan agentes desnaturalizantes como
la urea y el DTT, y a que se permite una mejor resolución de las
proteínas al separarlas no solo por su masa molecular, como ocurre con
la electroforesis monodimensional, sino también por su pI.
Una vez puesto a punto el método, las 8 muestras de fluido
pleural empleadas en la metodología DIGE fueron resueltas mediante 1DE, transferidas a membranas e inmunodetectadas con anticuerpos
anti-S 100 A9. En condiciones desnaturalizantes, calentando la muestra
a 100 ºC durante 1h, se pudo observar una banda en torno a 29 kDa que
se correspondería con el dímero S 100 A9 (cuyo monómero tiene un
tamaño de 14 kDa). De forma similar a lo aquí descrito Kumar, Qin y sus
respectivos colaboradores (Kumar et al., 2001; Qin et al., 2010)
encontraron esta banda de aproximadamente 29 kDa en condiciones
desnaturalizantes, aunque en su caso sí fueron capaces de detectar
además una forma monomérica de 14 kDa. Una posible explicación es
que en derrame puede que la proteína S100 presente un ratio
dímero/monómero mayor de lo que ocurre en otros fluidos corporales,
241
Discusión
siendo mucho más difícil la detección de la forma monomérica (De Seny
et al., 2008).
A pesar de no poder separar el monómero de la proteína S100 A9,
realizamos un estudio cuantitativo de las bandas del dímero separadas
mediante electroforesis monodimensional. Como era esperable, este
análisis reveló la existencia de diferencias significativas en la expresión
de esta proteína entre ambas patologías estudiadas, corroborándose los
datos obtenidos para el monómero mediante DIGE.
4.2.4.
Validación de la proteína Calprotectina como
marcador de derrame pleural maligno
Debido a la gran complejidad a la hora de separar los dímeros
formados por la proteína S 100 A9 cuando se realizan las tecnologías 1DE y 2-DE, a la hora de utilizar la metodología ELISA decidimos hacerla
con el complejo dimérico formado por las proteínas S 100 A8 y S 100 A9,
denominado calprotectina.
La validación de esta proteína se realizó en un grupo de pacientes
que presentaban DP derivado de patologías malignas (de origen epitelial,
mesoteliomas y linfomas) y en pacientes cuyo derrame se derivaba de de
patologías benignas (en su mayoría pacientes con tuberculosis o
neumonía, así como pacientes con derrames de otro tipo denominados
paramalignos, no neoplásicos de origen desconocido y miscelánea).
Debido a que los pacientes son tratados por el Servicio de
Neumología del CHUVI pudimos tener acceso a información de las
características clínico-patológicas de los mismos, y por tanto pudimos
analizar otros marcadores como el ADA, LDH, glucosa, etc., que podrían
ofrecer información adicional a nuestro estudio.
La determinación de los niveles de calprotectina mediante ELISA
fue realizada en muestras de fluido pleural crudo, sin prefraccionamiento
242
Discusión
previo, debido a que queríamos reproducir al máximo las condiciones
que se encontrarían los clínicos en caso de que la técnica se implantase
en un futuro en los hospitales, como práctica diagnóstica habitual.
Al comparar los niveles medios de calprotectina detectados
mediante la metodología ELISA observamos cómo estos niveles eran diez
veces menores en derrames malignos que los detectados en derrames
benignos (p < ,001). Si nos fijamos en los valores medios de
concentración de calprotectina vemos cómo son similares entre los
distintos tipos de neoplasias evaluadas, a excepción del DPM de tipo
mesotelioma,
que
presenta
niveles
más
elevados
que
difieren
significativamente de los DPM de origen epitelial.
En lo referente a los pacientes que presentan patologías benignas,
observamos cómo también existen diferencias en las concentraciones de
la proteína entre ambos grupos, siendo los pacientes tuberculosos y
paraneumónicos los que presentan valores más elevados. Además, la
comparación de los pacientes tuberculosos y paraneumónicos con el
resto de grupos de pacientes con patologías benignas mostró la
existencia de diferencias significativas, lo que sugiere que la calprotectina
también podría ser empleada para la discriminación entre las diferentes
etiologías benignas del derrame.
Las proteínas pertenecientes a la familia de las S 100 han sido
objeto de revisión debido al potencial que presentan, cada vez más
evidente, como marcadores tumorales y dianas terapéuticas del cáncer
(Foell et al., 2007; Gebhardt et al., 2006; Raquil et al., 2008; Salama et
al.,
2008).
Existen
estudios
que
demuestran
la
existencia
de
concentraciones elevadas de S 100 A8 y S 100 A9 implicadas en procesos
metastásicos. Esto se demostró porque los tumores primarios secretan
factores solubles como VEGF, TGF-β y TNF-α que inducen la expresión
de S 100 A8 y S 100 A9 en las células mieloides y endoteliales dentro del
pulmón antes de que exista metástasis (Salama et al., 2008). Otros
243
Discusión
autores sugieren una relación directa de la expresión de ambas proteínas
con condiciones inflamatorias en el cáncer (Gebhardt et al., 2006; Kim et
al., 2009), siendo por ello comunes en cánceres gástricos, en el cáncer de
mama y en el adenocarcinoma de pulmón (Cross et al., 2005).
Sin embargo, a pesar de su clara relación con el cáncer, no hay
duda de que estas proteínas están directamente implicadas en procesos
de inflamación. Así, se ha observado un aumento de la producción de
ambas proteínas en diferentes muestras de pacientes con enfermedades
inflamatorias (Lügering et al., 1995). Además, la concentración sérica de
la proteína calprotectina se ha relacionado con varias variables asociadas
a la actividad de la AR y psoriásica, o variables clínicas como el número
de articulaciones inflamadas (Brun et al., 1994; Hammer et al., 2007;
Hammer 2010), y variables biológicas como la proteína C reactiva y la
concentración y velocidad de sedimentación globular (Kane et al., 2003).
Desde hace años se sabe que estas proteínas S 100 desarrollan
funciones intracelulares y extracelulares. Dentro de las funciones
intracelulares se incluyen algunas como: regulación de la fosforilación de
las proteínas y de la actividad enzimática, la homeostasis de calcio, la
regulación de los componentes del citoesqueleto y la regulación de los
factores de transcripción. En relación a las actividades extracelulares,
algunos
miembros
de
la
familia
actúan
como
quimioatrayentes,
activadores de macrófagos y moduladores de la proliferación celular
(Salama et al., 2008).
Actualmente existen escasos estudios sobre la presencia de
calprotectina en DPM. De hecho, en el análisis realizado por Davidson et
al. (Davidson et al., 2010) aparecían niveles de calprotectina en derrames
procedentes de 36 mujeres con cáncer de mama, que van desde 301
hasta 9.431 ng/mL. En nuestro caso podemos decir que nuestros
resultados no son comparables, debido a que Davidson et al. (Davidson
et al., 2010) realizaban un análisis de diferentes fluidos en conjunto
244
Discusión
mientras que nosotros solamente analizamos fluido pleural. En otro
estudio, realizado en DPM originado por carcinomas de ovario en
estadios avanzados, Odegaard et al. (Ødegaarg et al., 2008) describen
una serie de niveles valorados en diferentes fluidos que van desde 2.008
hasta 3.335 ng/mL, valores que difieren de nuestros resultados, aunque
hay que señalar que en nuestro caso sólo tenemos dos muestras con este
tipo de DPM. Además, es importante señalar que en ambos estudios
mencionados se emplea un ensayo de ELISA diferente (Kristinsson et al.,
1998; Tibble et al., 2001) para medir la proteína calprotectina, pudiendo
existir discrepancias al tratarse del empleo de diferentes anticuerpos.
Para poder evaluar el valor diagnóstico de la proteína se hizo
necesario la realización de un análisis estadístico del rendimiento
diagnóstico mediante las curvas ROC (Beck y Shultz, 1986), que
permitieron una determinación de la sensibilidad, especificidad y
eficiencia diagnóstica del estudio. Este análisis mostró una buena
capacidad de distinción entre DPM y DPB, con un AUC de 0,963,
sustancialmente mayor que los valores de AUC obtenidos para los
marcadores bioquímicos utilizados por rutina en los mismos pacientes,
como son el ADA, la LDH, etc.
En el estudio se encontraron dos posibles puntos de corte para la
clasificación de la muestra como benigna o maligna. Estos puntos de
corte se establecieron en base a diversos criterios: un primer punto de
corte de ≤ 545 ng/mL que logra la máxima precisión con una
sensibilidad y especificidad de 97,01 y 88,76 %, respectivamente. Y un
segundo punto de corte de ≤ 736,4 ng/mL que logra una sensibilidad del
100 %, pero cuya especificidad disminuye en este caso hasta 83,15 %.
Además, la calprotectina mejora en gran medida la sensibilidad y
la especificidad de los marcadores clásicos empleados para el diagnóstico
del DPM, como son el CEA, CA-125, CYFRA 21-1 y CA 15-3 (Liang et al.,
2008), e incluso mejora el uso de varios paneles que combinan varios
245
Discusión
marcadores (Villena et al., 2003). Sin embargo, no podemos obviar un
estudio en el que encontraron que la metaloproteinasa de la matriz 9
(MMP-9) jugaba un papel muy importante a la hora de distinguir los
derrames pleurales malignos originados por el cáncer de pulmón (no
estudiaron otros orígenes malignos) de los pacientes con patologías
benignas de tipo inflamatorio, con una sensibilidad y especificidad del 80
y 100 %, respectivamente (Kremer et al., 2010).
Además
de
los
buenos
parámetros
diagnósticos
de
la
calprotectina, el análisis mediante regresión logística de la concentración
de esta proteína corroboró la gran importancia que tiene para la
determinación del riesgo de presentar un derrame de origen maligno. En
nuestro caso, otros de los parámetros que también influyen en la
probabilidad de que el derrame se deba a una enfermedad neoplásica
son: presentar una edad superior a 60 años, presentar un gran tamaño
del derrame (> 1/3), tener valores bajos de ADA (≤ 38 U/L) y leucocitos (≤
1.150 L/mm3), tener un contenido en linfocitos > 75 %, una
concentración de proteínas ≤ 5g/L y, en menor medida, el hábito
tabáquico. Sin embargo, la contribución de estos factores fue mínima al
compararla con la contribución que tiene la calprotectina, lo que hace
que estos factores no sean significativos en el análisis multivariante.
Como ya se ha citado anteriormente, la calprotectina pertenece a
la familia de las proteínas de unión al Ca+2 citoplasmático, denominadas
familia S 100. Y se ha demostrado que estas proteínas están implicadas
tanto en la respuesta inflamatoria como en trastornos neoplásicos (Cross
et al., 2005; Foell et al., 2007; Gebhardt et al., 2006; Kristinsson et al.,
1998; Raquil et al., 2008; Salama et al., 2008). Curiosamente, la función
relacionada con el cáncer es de alguna manera contradictoria. Por un
lado, es un poderoso agente apoptótico producido por las células
inmunitarias y, por otro lado, la expresión en células tumorales de la
proteína calprotectina también se ha asociado con el desarrollo del
tumor, la invasión del cáncer, o la metástasis (Gebhardt et al., 2006; Kim
246
Discusión
et al., 2009; Kristinsson et al., 1998; Salama et al., 2008). Además, la
calprotectina tiene también una doble función como proteína intracelular
y extracelular, dificultando aún más su importancia biológica en los
fluidos pleurales.
En cuanto a la relación que esta proteína presenta con la
inflamación, podemos decir que es indudable que es una proteína proinflamatoria, y que juega un papel importante en varias enfermedades
inflamatorias (Cross et al., 2005; Foell et al., 2007; Gebhart et al., 2006;
Roth et al., 2003), por lo que altos niveles de esta proteína se esperarían
en pacientes con enfermedades de tipo inflamatorio, como la mayoría de
las patologías benignas consideradas en este estudio (Vermeire et al.,
2006; Kallel et al., 2011).
En lo referente a los niveles detectados en DPM, podríamos
habernos encontrado niveles elevados de esta proteína, puesto que está
involucrada en la inflamación asociada a la carcinogénesis (Gebhardt et
al., 2006; Ghavami et al., 2009; Salama et al., 2008). Sin embargo, en
nuestro caso hemos encontrado niveles de calprotectina que van desde
90,7 hasta 736,42 ng/ mL en DPM. Estos niveles son claramente
inferiores a los detectados en DPB, pero eso no quiere decir que en los
pacientes oncológicos la calprotectina tenga una expresión inhibida. El
hecho de que el DP sea un síntoma de enfermedad, obviamente implica
que no existen para este estudio controles sanos con los que comparar.
Únicamente se puede asegurar que la expresión de calprotectina en DPM
es inferior a la expresión en DP de origen benigno.
Los niveles de calprotectina más altos encontrados en DPB, en
comparación con los detectados en DPM, podrían ser debidos a la
función antimicrobiana de la calprotectina. Se ha propuesto que esta
proteína se libera masivamente cuando los neutrófilos mueren, para
inhibir el crecimiento de una variedad de patógenos fúngicos y
bacterianos
(Corbin
et
al.,
2008;
Nisapakultorn
et
al.,
247
2001;
Discusión
Santhanagopalan et al., 1995). De acuerdo con esto, hemos encontrado
los mayores niveles de calprotectina en pacientes con neumonía y DP
tuberculoso, mientras que los niveles más bajos se detectaron en otras
patologías benignas no infecciosas.
En un estudio reciente, realizado por Kremer et al. (Kremer et al.,
2010), se analizaron varios marcadores en el líquido pleural de varios
pacientes que presentaban cáncer de pulmón y enfermedad inflamatoria
benigna. Curiosamente se encontró que las concentraciones de DP de los
siete marcadores biológicos analizados fueron menores en los pacientes
que presentaban cáncer. De una manera similar a lo que ocurre con la
calprotectina, dos de estos marcadores (MMP-2 y MMP-9) se expresan en
diversos procesos patológicos, tales como la inflamación y el cáncer, y
también en respuesta a infecciones (Kremer et al., 2010).
Se sabe que la concentración de cualquier molécula en los fluidos
corporales se ve influenciada por muchos factores; entre ellos se podrían
incluir la proximidad de la secreción al fluido, o la dilución del líquido,
por lo que los niveles de calprotectina no tienen por qué ser
necesariamente los mismos cuando se miden en el plasma/suero o en
líquido pleural. En este sentido, no consideramos una contradicción el
hallazgo de altos niveles plasmáticos de calprotectina en cáncer de
ovario, en comparación con los tumores benignos (Ødegaard et al., 2008),
o en el suero de pacientes con cáncer de próstata (Hermani et al., 2005),
y también en muestras de suero y heces de pacientes con carcinoma
colorrectal (Kallel et al., 2011; Kristinsson et al., 1998; Vermeire et al.,
2006). De acuerdo con esto, la MMP-2 y MMP-9 detectados en los niveles
inferiores de DP de los pacientes con cáncer de pulmón (Kremer et al.,
2010) también se han asociado con un aumento de la extensión del
tumor, y con un mal pronóstico en el cáncer de pulmón (Kodate et al.,
1997), y se ha detectado sobreexpresión en los ovarios y en pacientes con
cáncer de mama (Somiari et al., 2006; Zhang et al., 2011; Zhang et al.,
2012). Estamos de acuerdo con Kremer et al. cuando afirman que,
248
Discusión
independientemente de los mecanismos implicados, la existencia de
alteración en los niveles de una molécula en el DP, que en nuestro sería
la calprotectina, es de importancia clínica considerable.
4.2.4.1. Procedimiento a seguir para la utilización de la
calprotectina para la detección del derrame pleural maligno en la
práctica clínica diaria
Una
de
las
aplicaciones
clínicas
más
interesantes
de
los
resultados de este trabajo es la utilización de la proteína calprotectina
para mejorar la sensibilidad de la citología. Como ya hemos mencionado,
la citología pleural es un examen de laboratorio para detectar la
presencia de células cancerosas en el espacio pleural o en el área que
rodea los pulmones. Sin embargo, el porcentaje de DPM diagnosticado
mediante esta técnica se sitúa entre un 40-87% dependiendo del origen
de la patología (Maskell y Butland 2003; Alemán et al., 2007; Heffner
2008). (Froudarakis, 2008). Por lo tanto, aunque su especificidad es muy
buena, la citología es una técnica que presenta baja sensibilidad, por lo
que se requiere la utilización de otros métodos (muchos de ellos invasivos
para asegurar un correcto diagnóstico del DPM.
En este trabajo, hemos visto cómo la adición del análisis de la
calprotectina, empleando cualquiera de los dos puntos de corte mejora
los resultados de la citología en cuanto a la correcta detección de
pacientes con DPM. El punto de corte de mayor precisión (≤ 545 ng/mL)
nos permitió la detección de 31 de los 33 pacientes oncológicos con
citología negativa, mejorando la sensibilidad de la citología hasta el 97 %.
Empleando el segundo punto de corte propuesto, ≤ 736,42 ng/mL, se
logra clasificar correctamente a todos los pacientes con citología negativa
(100 % de sensibilidad).
249
Discusión
Una de las cuestiones que nos planteamos a la hora de validar los
resultados de nuestro estudio es determinar en qué paso del protocolo de
diagnóstico de la etiología del DP debería efectuarse la valoración de la
proteína calprotectina.
A la vista de nuestros resultados, sería muy útil determinar los
niveles de calprotectina en aquellos pacientes en los que tras la
toracocentesis, presentan citología negativa para células malignas.
Podría utilizarse el punto de corte ≤ 736,42 ng/mL, que presentaba un
100 % de sensibilidad. Además, el método de medición puede ser
fácilmente incorporado en la práctica clínica diaria sin ningún riesgo o
incomodidad para el paciente.
El algoritmo propuesto sería el mostrado en la figura 54. Si la
citología es positiva, se confirma la malignidad de la enfermedad del
paciente. En los casos dudosos o de citología negativa, podrían
determinarse los niveles de calprotectina. En aquellos pacientes con
niveles mayores a 736 ng/mL podría descartarse malignidad y se
consideraría que el derrame es de origen benigno. Por tanto, la
determinación de calprotectina evitaría a estos pacientes pruebas
invasivas posteriores, y las pruebas a las que se someterían serían las
específicas para enfermedades benignas. Sin embargo, si los niveles de
calprotectina
son
inferiores
a
736
ng/mL
no
podría
excluirse
determinantemente la malignidad, por lo que estos pacientes tendrían
que
ser
sometidos
a
pruebas
diagnósticas
adicionales
como
la
toracoscopia o biopsia pleural, pruebas invasivas necesarias para
confirmar la presencia de enfermedad maligna.
250
Discusión
Figura 54. Algoritmo de diagnóstico de derrame pleural incluyendo la determinación de
calprotectina.
A pesar de su potencial utilidad clínica, estos resultados deben
validarse antes de aplicarlos en la rutina hospitalaria. En este sentido, al
realizar la validación habría que incrementar el número de pacientes, en
particular en el caso de algunas patologías, que deberían ser reclutados
en
diferentes
hospitales.
También
sería
necesario
realizar
la
cuantificación de los niveles de calprotectina en distintos laboratorios,
para confirmar la robustez del método.
251
5. Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones
1. Para el estudio del proteoma del fluido pleural humano la
cromatografía de afinidad múltiple es adecuada como método de
fraccionamiento previo a la electroforesis bidimensional. Este
prefraccionamiento
permite
el
enriquecimiento
en
proteínas
minoritarias, el incremento de la resolución de los mapas
proteicos y la detección de proteínas poco abundantes en el fluido
pleural.
2. La comparación de los mapas bidimensionales de fluido pleural de
individuos con enfermedad tuberculosa y de pacientes con cáncer
de pulmón no microcítico ha permitido la detección de diferencias
estadísticamente significativas en la expresión de 17 proteínas,
pudiendo considerarse candidatos a marcadores del derrame
pleural maligno. De ellas, en especial las proteínas PEDF,
gelsolina, TIMP-2, S 100 A8 y S 100 A9 son las de mayor interés,
por su estrecha relación con el proceso tumoral.
3. La determinación de los parámetros diagnósticos del PEDF,
medido en el fluido pleural, reveló su escasa utilidad para
discriminar pacientes según la etilogía maligna o benigna del
derrame. Este resultado es concordante con la existencia de
múltiples isoformas de ésta proteína en el fluido pleural.
4. El heterodímero calprotectina, formado por la unión de las
proteínas S 100 A8 y S 100 A9 se ha revelado en este estudio
como un excelente marcador no invasivo para determinar el origen
maligno o benigno del derrame pleural.
255
Conclusiones
5. En clínica la calprotectina sería de gran utilidad como método
complementario
a
la
citología,
puesto
que
permitiría
la
clasificación correcta de pacientes con derrame pleural maligno
cuya citología fuese negativa, y evitaría la realización de pruebas
invasivas innecesarias en pacientes con derrame pleural benigno.
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Portal médico
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Salud, enfermedad, medicina y remedios
http://www.tubesalud.com/pruebas-de-tuberculosis
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Wikipedia
http://es.wikipedia.org/
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