Prácticas de Bioquímica Objetivo: 1ª práctica: día 25 de febrero de 1999.

Prácticas de Bioquímica
1ª práctica: día 25 de febrero de 1999.
Cromatografía en papel de aminoácidos.
Objetivo:
La separación de sustancias constituye una de las técnicas más utilizada en un laboratorio bioquímico. Una de
las más usadas, es la cromatografía, que será una aproximación metodológica. En esta práctica se pretende
conocer y entender la base de la cromatografía en papel y de separarar e identificarar aminoácidos.
Introducción:
Existen varios factores importantes en la separación de sustancias, como pueden ser: el reparto, la adsorción,
el intercambio iónico,...etc. El factor predominante en esta técnica es el reparto entre dos fases no miscibles.
El papel actúa como soporte inerte del vapor de agua ambiental, aunque también puede llevar a cabo otras
funciones tales como movimiento capilar de los solutos (adsorción) y atracción debida a las impurezas polares
del papel (intercambio iónico). Esa fase acuosa es la fase estacionaria (líquido polar sostenido en papel). La
fase móvil es el solvente apolar que se deposita en la cubeta de cromatografía y que ascenderá por capilaridad
por el papel. El reparto ocurrirá entre la fase acuosa estacionaria y el solvente o fase móvil. El soluto se mueve
en la dirección de flujo del solvente a una velocidad que es regulada por su afinidad hacia la fase acuosa
estacionaria o la fase orgánica móvil no polar. La afinidad del soluto por la fase móvil es prueba de una mayor
velocidad de migración en la dirección del flujo.
Otros factores a destacar en la determinación de la velocidad de migración del soluto son: peso molecular, tipo
de papel empleado, tamaño de la cámara, temperatura,... etc. La velocidad de migración del soluto en la
dirección del flujo del solvente, viene determinada por lo que se denomina Rf, que es la distancia recorrida
por el soluto, desde un punto de partida, dividido por la distancia recorrida por el frente del solvente.
Distancia recorrida por el soluto .
Rf = Distancia recorrida por el solvente
El Rf de cualquier soluto de un sistema no puede ser mayor de la unidad.
Protocolo experimental:
Aminoácidos a separar:
Aspártico.
Leucina.
Lisina.
Mezcla problema.
Reactivos:
1
Disolvente: etanol/agua/amoniaco (80/10/10)
Revelador: ninhidrina (se disuelve 200 mg en 100 ml de acetona conservado a 4 ºC).
Se ponen 50 ml de disolvente en la cubeta y se tapa. Se prepara el papel, de un tamaño aproximado a 12 x 27
cm. A 2 cm de uno de los extremos se traza una línea con lápiz y se marcan 4 puntos separados a igual
distancia en los que se aplicarán unos µl de los 3 aminoácidos y de la mezcla problema. Se coloca el papel en
la cubeta de tal manera que quede sumergida aproximadamente 0.5 cm y se tapa la cubeta.
Transcurridas unas 2 o 3 horas, cuando el disolvente ya ha alcanzado una altura significativa, se retira el
cromatograma de la cubeta, se marca con lápiz el frente alcanzado por el disolvente y se seca en una estufa a
105 ºC durante 10 minutos.
Una vez seco el cromatograma se pulveriza con el revelador en una campana y de nuevo se introduce en la
estufa, ahora 5 minutos.
Los aminoácidos se distinguen por la aparición de unas manchas púrpuras en el cromatograma.
Para calcular los Rf de cada uno de los aminoácidos, hay que determinar la distancia recorrida por el
aminoácido. Se harán dos mediciones: una de la distancia recorrida por el aminoácido, tomando el centro de la
mancha. Otra para la distancia recorrida por el disolvente, considerando la señal practicada con lápiz antes de
secar el cromatograma.
Resultados de la práctica:
Aminoácido
Aspártico
D. aminoácido (D1)
2.3 cm
D. disolvente (D2)
17.5 cm
Rf=D1/D2
0.1314
Lisina
7.2 cm
17.5 cm
0.4114
Leucina
14.2 cm
17.5 cm
0.8114
En la mezcla problema se obtuvieron los tres aminoácidos, como se observa en el cromatograma adjunto.
Podemos comparar la polaridad de los aminoácidos, observando la distancia recorrida por cada uno de ellos
en el cromatograma. A mayor polaridad menos distancia recorrerá, a la inversa, una mayor distancia recorrida
indicará menor polaridad, por tener afinidad por la fase móvil.
La polaridad de los tres aminoácidos queda esquematizada de la siguiente manera:
Asp>Lis>Leu
El carácter ácido del ác. aspártico, se lo da su radical libre: CH2−COO¯
La lisina es una minoácido básico, cuyo radical libre es: CH2−CH2−CH2 −CH2 −H2N
La leucina es un aminoácido apolar, y su radical libre es: CH2 −CH−(CH3)2
Existen también cromatogramas descendente donde el eluyente se pone encima y va hacia abajo.
También hay cromatograma bidimensional: ascendente y descendente. El papel es cuadrado y se utiliza
cuando queremos cuantificar y cualificar muchos aminoácidos. Se utilizan dos eluyentes de distinta polaridad.
2
2ª práctica: día 25 de febrero de 1999.
Cromatografía de filtración en gel.
Objetivo:
En esta prática se pretende conocer y entender la base de la cromatografía de filtración en gel, que separan
moléculas en función de su tamaño.
Introducción:
La cromatografía de filtración en gel, también llamada de tamiz molecular, permite separar moléculas en
función de su tamaño. En este tipo de cromatografía se emplean geles que se componen de bolitas
aproximadamente esféricas de un tamaño comprendido entre las 50 y las 200 µm de diámetro, formadas por
una red tridimensional polimérica interconectada que da lugar a la formación de poros de un tamaño regular.
La matriz polimérica es insoluble en agua, pero por su carácter hidrofílico se encuentra embebida por el
disolvente.
Lo que sucede cuando se hace pasar por el gel en el tampón de elución una mezcla de moléculas de distintas
tamaños es:
a)Las moléculas muy grandes, por tener un diámetro superior al de las microesferas, no puede difundir hacia
su interior.
b)Las moléculas muy pequeñas difunden hacia el interior de los poros de las microesferas, quedando
momentáneamente detenidas, hasta que difunden nuevamente hacia fuera de la matriz del gel. Las moléculas
pequeñas se ven retrasadas en su elución con respecto a las moléculas de mayor tamaño.
c)Las moléculas de un tamaño intermedios pueden penetrar en unos poros pero no en otros, en función de su
tamaño, por lo que se ven mas o menos retenidos y poseerán un volumen de elución intermedio entre los
anteriores.
Esta cromatografía se lleva a cabo en una columna. Para cuantificar el proceso cromatográfico es necesario
definir varios volúmenes a considerar en la columna:
a)Volumen vacío(vo): es el volumen de eluyente que rodea a las bolitas de gel y que será el único accesible a
las moléculas más grandes.
b)Volumen de líquido retenido en las microesferas o bolitas de gel (Vx). Este es el volumen de eluyente
accesible a las moléculas pequeñas, y parcialmente a las moléculas de tamaños intermedios.
c)Volumen total (Vt): es la suma de los dos anteriores volúmenes: Vt=Vo+Vx.
d)Volumen de elución (Ve): se llama volumen de elución de una molécula parcialmente retenida a la
cantidad de eluyente que debe salir de la columna desde que dicha molécula penetró en el gel hasta que
empieza a salir del mismo. Este volumen deberá ser igual a la suma de volumen vacio más un volumen que
será proporcional al grado de penetración o accesibilidad de dicha molécula en las bolitas del gel.
Este grado de accesibilidad se puede medir con una constante, Kav, que se puede definir como un coeficiente
de distribución cuyo valor puede relacionarse con el peso molecular y con el radio de Stoke de la sustancia.
Así, Kav , depende no solo del peso molecular, sino también del tamaño molecular o forma de la molécula.
3
Protocolo experimental:
El gel que se empleará en la práctica se llama Sephadex G50−150. El gel está constituido por largas cadenas
de dextrato entrecruzadas con epiclohidrina. El gel resulta estable ante numerosos disolventes y permite el uso
de elevados flujos de eluyente.
Se van a emplear dos compuestos de color para visualizar mejor el proceso de separación:
a)azul dextrato, polisacárido de aproximadamente 2,000,000 daltons, que tiene unido covalentemente un
cromóforo azul.
b)dicromato potásico, molécula orgánica de 294 daltons, de color amarillo.
El gel está empaquetada en una columna cromatográfica de vidrio de 1.6 cm de diámetro interno.
Como eluyente un tampón fosfato 0.05M, Ph 7.0, que se usará también para quedar empaquetada la columna.
Para aplicar la muestra se abre el paso de eluyente de la columna hasta que queda enrasado por la parte
superior del gel. Se aplica la muestra con la pipeta dejando que resbale por la pared, evitando así la formación
de turbulencias en la superficie del gel. Una vez aplicada la muestra, se abre de nuevo el paso de eluyente y se
empieza a recoger a la salida de la columna ( 20 gotas por tubo). A la vez hay que añadir nuevo tampón sobre
el gel para evitar que se seque la columna.
La cromatografía finaliza cuando han salido completamente los dos compuestos añadidos.
Resultados de la práctica:
Cada tubito contiene un volumen de 1.8 ml.
La columna que contiene el gel tiene un volumen de 50.8 ml.
El azul dextrano ocupó 15 tubitos por lo tanto un volumen total de 15*1.4=21 ml.
El dicromato potásico ( amarillo) ocupó un total de 30 tubitos y un volumen de
30*1.4=42 ml.
Ahora calculamos la Kav de los distintos compuestos:
Ve−Vo
Kav = −−−−−−−−−−
Vt−Vo
Y los resultados son :
Kav de azul dextrano = (21−21)/(50.8−21) = 0
Kav de dicromato potásico = (42−21)/(50.8−21) = 0.70
4
Los resultados obtenidos nos indican que el compuesto azul dextrano tiene un tamaño de molécula mayor que
el dicromato potásico, ya que tarda menos en atravesar la columna.
3ª práctica:26 de febrero de 1999.
Determinación de la concentración de proteínas por el método de Lowry
Objetivo:
El objetivo principal de esta práctica es el aprendizaje de uno de los métodos más ampliamente usado para la
determinación de la concentración de proteínas: método de Lowry.
Introducción:
Las proteínas son las macromoléculas más abundantes de las células. Juegan un papel esencial en todos los
procesos biológicos ( catálisis enzimática, transporte y almacenamiento de ciertas sustancias, movilidad
celular, diferenciación celular,...).
No existe un método ideal para la determinación cuantitativa de proteínas. La elección de uno u otro método
se basa en qué componentes acompañan a las proteínas, en la rapidez y precisión deseada y en la sensibilidad
del método utilizado.
Una de las maneras para determinar concentración de proteína es usando la absorción a 280nm. Este método
de medida requiere conocer el coeficiente de extinción en unas condiciones determinadas.
Otro de los métodos es el Biuret, que se basa en el hecho de que las sustancias que contienen 2 o más enlaces
peptídicos dan en solución alcalina de sulfato cúprico diluido un color violeta característico, debido a la
formación de un complejo de coordinación del átomo de cobre y cuatro átomos de nitrógeno.
La reacción de Biuret da valores bastantes fidedignos para una misma proteína, pero precisa cantidades
relativamente altas de muestra (1−20 mg).
El método de Lowry emplea el reactivo de Folin−ciocalteau. Se basa en la determinación de los grupos
hidroxifenólico e indol que forman parte de los aminoácidos tirosina y triptófano. Estos aminoácidos se
encuentran en proporciones relativamente constantes en muchas proteínas. La reacción de una proteína en
solución con el reactivo Folin−ciocalteau se produce en dos fases, que llevan a la aparición final de color.
1ª) Cu² + proteínas ! Cu² − proteína.
2ª) Reducción del reactivo fosfomolíbdico−fosfotúngstico por la proteína tratada
con el Cu².
La primera fase se asemeja a la reacción de Biuret. La segunda fase, la reducción del reactivo de Folin,
presenta el máximo color cuando se lleva a cabo pH 10. A este pH el reactivo es eficaz durante poco tiempo.
Conclusión: Cuanto mayor sea la concentración de proteína de la muestra más intenso será el color formado
porque existirán más enlaces peptídicos para formar el complejo de coordinación y habrá más tirosinas y
triptófanos que reduzcan el reactivo de Folin.
Mediante una recta patrón elaborada enfrentando la absorción a la concentración de proteína y conociendo la
absorción de la muestra problema, se puede determinar la concentración de proteína.
5
Algunas de las características del método de Lowry para la determinación de proteínas en solución son: es de
10 a 20 veces mas sensible que la estimación por absorción a 280 nm, es varias veces más sensible que la
reacción con Ninhidrina y también es 100 veces más sensible que la reacción de Biuret. Presenta pocas
interferencias, aunque hay que tener en cuenta que el triptófano, la tirosina, la mayor parte de los fenoles, el
ácido úrico, la guanina y la xantina reaccionan con el reactivo de Folin para producir color.
Una desventaja que presenta es que la intensidad del color varía con las diferentes proteínas. En este sentido
es menos constante que la reacción de Biuret pero más que la absorción a 280nm.
Protocolo experimental:
Soluciones:
• NA2CO3 al 4% en NaOH 0.1 N.
• CuSO4 x 5H2O al 2%
• Tartrato−NaK al 4.9%
• Reactivo de Folin−Ciocalteau.
Reactivo I: 50 ml solución 1 + 0.5 ml soluición 2 + 0.5 ml solución 3.
Reactivo II: Reactivo de Folin−Ciocalteau diluido (1 volumen de Folin + 2
volúmenes de agua destilada).
El reactivo I se prepara cada día mezclando las tres soluciones que son estables individualmente. El reactivo
II viene preparado comercialmente y sólo hay que diluirlo. Es muy tóxico.
Para medir la concentración de proteína de una muestra problema se prepara una batería de tubos por
duplicado como se indica en la tabla adjunta. Se procederá como se indica: Los tubos B (blanco) al 5 son la
recta patrón y los tubos P1 y P2 son para la proteína problema.
Tubo
H2O destilada
B
1
2
3
4
5
P1
P2
Albúmina 0.25 mg/ml
1.0 ml 0.8 ml 0.6 ml 0.4 ml
0.2 ml 0.0 ml
0.8 ml
0.6 ml
0.0 ml 0.2 ml 0.4 ml 0.6 ml
0.8 ml 1.0 ml
−
−
−
−
−
0.2 ml
0.4 ml
Proteína problema
Reactivo I
−
−
−
(Incubar 30 min a Tª
ambiente)
5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml
.0 ml
5.0 ml
5.0 ml
5.0 ml
Reactivo II
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
0.5 ml 0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
(Incubar 30 min a Tª
ambiente)
Pasados los últimos treinta minutos se midió la absorción de todos los tubos a 650 nm y los resultados
obtenidos son:
B
1
2
3
4
5
P1
P2
6
Absorvancias
Absorvancias
0.0
0.110
B´
1´
−0.002 0.108
0.195
2´
0.223
0.300
3´
0.339
0.393
4´
0.424
0.400
5´
0.432
0.107
P1´
0.106
0.187
P2´
0.199
La tabla siguiente representa la absorción frente a la cantidad de proteína con los valores de los tubos que
forman la recta patrón.
A partir de los valores de absorción de los tubos problema, calculamos la concentración de proteína de la
solución problema:
4ª práctica: día 10 y 11 de febrero de 1999.
Caracterización funcional de la fosfatasa alcalina intestinal de rata.
Objetivo:
Es el conocimiento de la cinética enzimática a través del estudio de los parámetros cinéticos de la enzima
fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) presente en el extrato de mucosa intestinal de rata.
Introducción:
Estas enzimas catalizan la hidrólisis de ésteres del ácido fosfórico. Se distinguen dos tipos principales:
−Fosfomonoesterasas, que hidrolizan monoésteres del ácido fosfórico.
−Fosfodiesterasas, que hidrolizan diésteres del ácido fosfórico.
La fosfatasa alcalina es una fosfomonoesterasa que hidroliza monoésteres fosfóricos cualquiera que sea su
radical R. Está presente en todos los materiales biológicos. Se le denomina alcalina porque presenta su
máxima actividad a valores elevados de pH. Es particularmente abundante en tejidos óseo, mucosa intestinal e
hígado.
En nuestro experimento utilizaremos fosfatasa alcalina de mucosa intestinal de rata. Para determinar la
actividad enzimática usaremos como sustrato un monoéster fosfórico sintético, el p−nitrofenilfosfato (pNØP),
siendo los productos de la reacción
El fosfato y el p−nitrofenol, compuesto de color amarillo a pH alcalino. La intensidad de color amarillo
producida en un tiempo dado es proporcional a la actividad fosfatasa presente y se mide por su absorción a
una longitus de onda de 405 nm en un espectrofotómetro o un colorímetro.
Protocolo experimental:
1º Preparación del extracto enzimático de mucosa intestinal.
(en la práctica se nos daba la fosfatasa alcalina ya preparada)
2º Medida de la linealidad con el tiempo de la actividad fosfatasa.
Para medir la linealidad con el tiempo de esta actividad enzimática, se prepara una bateria de tubos por
duplicado como se indica en la tabla siguiente y se procede como se indica:
Tubo
1
2
3
4
C
7
Tris−HCl 0.5 M, pH 8.5
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
300 µl
300 µl
300 µl
300 µl
300 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
−
5´
10´
15´
20´
10´
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
PNØP 2mM
H2O destilada
Fosfatasa alcalina
Mantener a Tª ambiente
Para la reacción por adición
De NaOh 0.2 N
Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha
habido reacción enzimática. Al finalizar los tiempos correspondientes a cada tubo se miden las absorvancias
de cada uno de ellos a 405 nm. La absorción del tubo C se tomará como 0. Las absorvancias obtenidas son:
1
0.10
1´
0.10
2
0.22
2´
0.22
3
0.30
3´
0.231
4
0.38
4´
0.48
C
0
Ahora representamos los datos obtenidos en una gráfica donde enfrentamos el tiempo con las absorción.
3ª Medida de la linealidad con la cantidad de enzima de la actividad fosfatasa.
Para medir la linealidad con la cantidad de enzima de esta actividad fosfatasa se prepara una batería de tubos
por duplicado como se indica en la tabla siguiente y se procede como se indica:
Tubo
Tris−HCl 0.5 M, pH 805
PNØP 0.2 mM
H2O destilada
Fosfatasa alcalina
Mantener a Tª ambiente
Parar la reacción por adición de
NaOH 0.2 N
1
2
3
4
C
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
350 µl
300 µl
250 µl
200 µl
300 µl
50 µl
100 µl
150 µl
200 µl
100 µl
20´
20´
20´
20´
20´
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha
habido reacción enzimática. Una vez finalizados los 20 minutos y se ha parado la reacción con el NaOH, se
miden las absorvancias y los resultados obtenidos son:
1
0.04
2
0.11
3
0.20
4
0.28
C
0
8
1´
0.03
2´
0.12
3´
0.21
4´
0.20
Representamos una gráfica con los datos obtenidos enfrentando la cantidad de fosfatasa alcalina con las
absorvancias de cada tubo.
4ª Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
Determinación de la Km
Para medir el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad fosfatasa se prepara una batería de 8
tubos como se observa a continuación y se procede como se indica:
Tubo
1
Tris−HCl 0.5 M pH 8.5
100 µl
PNØP 0.2 mM
20 µl
H2O destilada
780 µl
Fosfatasa alcalina
100 µl
Mantener a Tª
20´
ambiente
Parar la reacción por 3 ml
adición de NaOH 0.2 N
2
3
4
5
6
7
C
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
40 µl
70 µl
120 µl
180 µl
300 µl
500 µl
120 µl
760 µl
730 µl
680 µl
620 µl
500 µl
300 µl
680 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
−
20´
20´
20´
20´
20´
20´
20´
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha
habido reacción enzimática. Se mide la absorción de todos los tubos a 405 nm y los resultados obtenidos son:
C
0
1
0.12
2
0.20
3
0.25
4
0.28
5
0.32
6
0.33
7
0.32
(La representación gráfica la haremos después del punto 5º)
5º Efecto inhibidor del ión fosfato sobre la actividad enzimática.
Determinación de la ki.
Para medir el efecto inhibidor del ión fosfato sobre la actividad fosfatasa se prepara una batería de 8 tubos
como se indica a continuación y se procede como sigue:
Tubo
Tris−HCl 0.5 M pH 8.5
1
100 µl
2
100 µl
3
100 µl
4
100 µl
5
100 µl
6
100 µl
7
100 µl
C
100 µl
PNØP 0.2 mM
20 µl
40 µl
70 µl
120 µl
180 µl
300 µl
500 µl
120 µl
Po4Hna2 10 mM
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
50 µl
H2O destilada
730 µl
710 µl
680 µl
630 µl
570 µl
450 µl
250 µl
630 µl
9
Fosfatasa alcalina
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
20´
Mantener a Tª ambiente 20´
20´
20´
20´
20´
20´
20´
3 ml
Parar la reacción por
adición de NaOH 0.2 N
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
3 ml
Después de la adición de NaOH, se añade al tubo C 100 µl de enzima. Este tubo es un control en el que no ha
habido reacción enzimática.
Una vez finalizado el tiempo correspondiente, se mide la absorción:
C
0
1
0.03
2
0.13
3
0.06
4
0.07
5
0.13
6
0.17
7
0.23
Para representar la gráfica, donde enfrentaremos el inverso de la concentración frente al inverso de las
absorvancias, primero hay que calcular las concentraciones:
/S1/: 2nm*20 µl = 1000 µl * /S1/; /S1/= 0.04 nM
/S2/: 2nm*40 µl = 1000 µl * /S2/ ; /S2/=0.08 nM
/S3/: 2nm*70 µl = 1000 µl * /S3/; /S3/=0.14 nM
/S4/: 2nm*120µl = 1000 µl * /S4/; /S4/=0.24 mM
/S5/: 2nm*180 µl = 1000 µl * /S5/; /S5/=0.36mM
/S6/: 2nm*300 µl = 1000 µl * /S6/; /S6/=0.60 mM
/S7/: 2nm*500 µl = 1000 µl * /S7/; /S7/=1.0 mM
/Sc/: 2nm*120 µl = 1000 µl * /Sc/; /Sc/= 0.24 mM
En la gráfica están expresados los inversos de las concentraciones y los inversos de las absorvancias. El
cálculo de Km, Vmax y de Ki, vienen expresados en le gráfica siguiente:
1
10