MOMENTOS DE Universidad de la AMAZONIA Momentos de Ciencia 6:(2), 2009 CIENCIA Aislamiento, cultivo y esporulación del hongo fitopatógeno Microcyclus ulei en el piedemonte amazónico colombiano Ramón Alexis Calderón-Álvarez1,*, Olga Lucia Rodríguez A.2 & Lorena Quintero2 1 2 Biólogo con énfasis en Biorrecursos, Universidad de la Amazonia. Florencia (Caquetá). Colombia. Investigadora, Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas –SINCHI–. Bogotá, D. C. Colombia. Recibido 26 de mayo de 2009; aceptado 25 de agosto de 2009 Resumen Microcyclus ulei (P. Henn.) v. Arx, es un hongo patógeno de las especies del género Hevea sp. que causa la enfermedad conocida como el Mal Suramericano de la Hoja, la cual limita la producción del caucho natural en América. Esta investigación tuvo como objetivo la estandarización de un protocolo de aislamiento, cultivo y esporulación in vitro de M. ulei que fuera reproducible y que permitiera obtener suficiente cantidad de inóculo para la caracterización de dicho agente patógeno. La colecta se realizó en jardines clonales y viveros de caucho ubicados en los departamentos de Caquetá y Guaviare, en donde se identificaron plantas con lesiones causadas por el agente patógeno. Se colectaron foliolos en estadio B1 y B2 que fueron colocadas en bolsas de papel y llevadas al laboratorio a una temperatura de 4 °C para su aislamiento y cultivo en condiciones in vitro. Haciendo uso de cámara de flujo laminar y bajo estereoscopio se observaron las lesiones de las cuales se iban a realizar los aislamientos, estas lesiones debían estar esporuladas y no presentar contaminaciones por otros microorganismos. Las conidias fueron colectadas con una aguja micológica y luego transferidas a un medio de cultivo PDA modificado. Posterior a los 10 días de cultivo se observaron colonias dispersas y de coloración beige, que después de 30 a 40 días de cultivo iniciaron el desarrollo de estromas. Para evaluar todos los estadios de desarrollo del hongo se indujo esporulación. © 2009 Universidad de la Amazonia. Todos los derechos reservados. Palabras clave: aislamientos, cultivo, Microcyclus ulei. Abstract Microcyclus ulei (P. Henn.) V. Arx, is a pathogenic fungus of the species of genus Hevea sp. that causes a disease known as South American Leaf Blight, which limits the production of natural rubber in America. This study aimed to standardize a reproducible protocol for in vitro isolation, cultivation and sporulation of M. ulei, in order to obtain enough inoculum for the characterization of this pathogen. The collection was carried out in clonal gardens and nurseries of rubber located in the departments of Caqueta and Guaviare, where plants were identified with lesions caused by the pathogen. Leaflets in stage B1 and B2 were collected, placed in paper bags and carried to the laboratory where they were stored at a temperature of 4 °C for isolation and cultivation under in vitro conditions. Injured leaves of Hevea were observed using a stereoscope inside a flow chamber, in order to obtain samples for the isolation. Lesions should be sporulated and none contaminated by any other microorganism. Conidias were collected using a mycological needle and transferred to an amended cultivation media PDA. Ten days later, colonies were observed dispersed and beige colored, and 20 to 30 days after they began to develop stromas. Sporulation was induced in order to evaluate all stages of fungus development. © 2009 Universidad de la Amazonia. All rights reserved. Key words: isolation, cultivation, Microcyclus ulei. Introducción En América Central y del Sur la principal limitante para el establecimiento de nuevos cultivos de caucho natural (Hevea sp.) la constituye el hongo fitopatógeno Microcyclus ulei que causa el Mal Suramericano de la Hoja (SALB en inglés). Esta es una enfermedad endémica de la región amazónica y está identificada como una de * Autor para correspondencia. E-mail: bioalex12@gmail.com 105 las cinco enfermedades más agresivas en plantas, que llega a causar pérdidas en la producción hasta del 70 %, incluso en clones que se han identificado como resistentes al hongo M. ulei. Esta enfermedad reviste importancia debido a que produce defoliaciones prematuras, reduce la actividad fotosintética de la planta, llegando a disminuir la producción de látex entre un 20 % y 75 %, siendo esta la causa de las mayores perdidas Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110 para el productor. De igual forma la presencia de razas o variantes del hongo M. ulei, hace cada vez menos efectivo el control químico del patógeno que causa la enfermedad, lo que ocasiona la destrucción de las plantaciones ocasionado un serio problema a nivel mundial, que repercute en pérdidas anuales de 15 al 20% de la producción (Gómez & López 2002,Compagnon 1998). El hongo M. ulei se ha estudiado desde comienzos del siglo pasado y aunque se ha avanzado en el conocimiento de su morfología, diversidad patogénica y comportamiento en campo, debido a que es un hongo biotrófico, una de las mayores limitantes en la investigación ha sido la dificultad de su manejo in vitro, razón por la cual se desconoce mucho de su fisiología y de los factores asociados a la virulencia del patógeno (Bos &Parlevliet 1995). De igual forma la pérdida de patogenicidad, reducción de la esporulación y viabilidad del inocuo, son fenómenos que se presentan en los hongos fitopatógenos como M. ulei debido a la serie de repiques sucesivos, siendo estos fenómenos comunes en este tipo de hongos (Junqueira et al. 1986). Esta investigación se realizo con el objetivo de obtener aislamientos in vitro de M. ulei provenientes de la región amazónica colombiana. estado anamórfico de M. ulei que se caracterizan por presentar una intensidad de esporulación en un rango comprendido entre 4 y 5 según la escala de Mattos et al. (2003) (Figura 2) esto con el fin de colectar muestras con suficientes conidios para el proceso de aislamiento en laboratorio. Las muestras fueron transportadas en bolsas de papel Kraf y a una temperatura de 4 °C. Metodología Figura 1. Localización geográfica del Jardin Clonal y parcela clonal de observ ac ión del Inst i tuto Amazónic o d e Investigacion e s Cie n tífi ca s – SINCHI – . M od if ic ado d e GoogleEarth. Versión 2009. Europa Technologies Images Terrametrics. Área de estudio Las colectas del material vegetal de caucho natural (Hevea spp.) afectadas por M. ulei realizaron en el vivero de ASOHECA (Gremio cauchero) ubicado en la localidad de Itarka (Figura 1), Municipio de La Montañita (Caquetá, Colombia) y en los viveros de caucho ubicados en el municipio El Retorno (Guaviare). En esta región las condiciones climáticas propias de la Amazonia colombiana favorecen el desarrollo del patógeno, por lo que es considerada una zona de no escape al Mal Suramericano de la Hoja. Colecta del material foliar infectado con M. ulei A través de la observación macroscópica de los síntomas causados por M. ulei en el material foliar se muestrearon de forma aleatoria las plántulas de caucho colectando foliolos en estadio B o C según Halle et al. (1978) con lesiones abaxiales de tipo conidial (apariencia afelpada y acuosa de un color verde cenizo) ocasionadas por Fusicladium heveae, Figura 2: Foliolos en estado C de clones de caucho colectados en vivero provenientes la Vereda Itarka (La MontañitaCaquetá, Colombia), con lesiones conidiadas del el hongo fitopatógeno M. ulei. 106 Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110 50 ml; posteriormente, con un agitador de vidrio (flameado) se realizó el macerado y se adicionó una solución de cloranfenicol a 50 ppm, en una proporción de 10 ml por cada gramo de estroma. Luego se adiciona 0,5 ml de esta suspensión de macerado a erlenmeyers de 125 ml con medio de cultivo para esporulación (alrededor de 25 ml), después se tomo un rastrillo (estéril) y se procedió a esparcir la solución por toda la superficie del medio de cultivo. La incubación se realizó empleand o un f o toperíodo de 12 h luz (empleando una lámpara de 40 W de luz blanca fluorescente) y 12 h oscuridad, a 23 ºC durante 1215 días (Sambugaro 2003). Después de 30-45 días de crecimiento, se tomaron nuevamente los cultivos estromáticos y con una aguja de punta curva (estéril) se transfirió una porción del estroma a un frasco de vidrio (estéril) de aproximadamente 10 ml. Luego se fragmentó el estroma empleando un agitador de vidrio y se transfirieron de nuevo con el asa a un erlenmeyer de 125 ml con medio de cultivo para esporulación. La incubación se realizó siguiendo el mismo procedimiento del método anterior, con lo que se obtuvieron los aislamientos de M. ulei. Una vez en el laboratorio, se procedió a tomar las muestras de campo que fueron colectadas y se almacenaron en cajas de petri las cuales contenían un disco de papel filtro húmedo (con agua estilada estéril), luego fueron guardadas en el laboratorio a temperatura de 24 °C y bajo luz cercana a los 2 000 lux durante 12 h constantes (Junqueira et al. 1984) lo cual favoreció la producción de conidios. Después de este periodo de incubación, se realizó una observación bajo estereoscopio, la cual permitió comprobar la presencia de conidios en la superficie de las lesiones. Aislamiento, cultivo y esporulación de M. ulei. Para el aislamiento y crecimiento de M. ulei se prepararon medios de cultivo adaptando las metodologías descritas por Junqueira et al. (1984) y Cardoso & Mattos (2007) y para el medio de c u ltivo de es p oru l ación se ajust a ron las metodologías propuestas por Gasparotto et al. (1997), Mattos et al. (1999) y Cardoso & Mattos (2007). El aislamiento del hongo M. ulei se realizó en el laboratorio (in vitro), donde los folíolos de caucho que exhibieron las mejores lesiones fueron examinados bajo estereoscopio y después de verificar que estaban aparentemente libres de hongos contaminantes, se procedió a usar agujas micológicas para colectar las conidias mediante toques leves en la superficie de la masa de esporas sobre la lesión para que algunos conidios y conidióforos se adhieran a la punta de la aguja (Gasparotto et al. 1997); luego se transfirieron a cajas de petri que contenían medio de cultivo para aislamiento (alrededor de 10 ml por caja) realizando cinco piques por caja y por duplicado. Posteriormente, las cajas fueron debidamente flameadas y selladas con papel cristaflex y se incubaron a 23 °C a oscuridad total (Ziebell 2000, Sambugaro 2003). Después de tener el hongo aislado y en crecimiento por 20 - 30 días, se procedió a transferir el micelio formado a un erlenmeyer de 125 ml que contenía 20 ml de medio de cultivo para crecimiento y fueron incubadas a 23 °C y en oscuridad total. Para la esporulación de M. ulei se p r oc e dió a to m ar cu l tivos en m edio de crecimiento con 30-40 días de edad, y en condiciones estériles se procedió a tomar con ayuda de una aguja de punta curva una fracción de estroma y se deposito en un tubo de ensayo de Resultados y discusión Los folíolos colectados de Hevea spp. infectados con M. ulei se caracterizaron por presentar lesiones abaxiales con forma irregular y de apariencia felposa color verde-cenizo con un rango de intensidad de ataque que oscilo entre e 3 a 4 con base en la escala de Chee (1976) y un rango de intensidad de 3 - 6 (Figura 2), con base en la escala de intensidad de esporulación de Mattos et al. (2003). El aislamiento directo a partir de las lesiones foliares conidiadas en medio de cultivo para aislamiento se logro debido a que los foliolos colectados presentaron lesiones con la fase asexual de M. ulei, la cual fue suficiente para realizar un aislamiento exitoso, coincidiendo con lo expresado por Chee & Holliday (1986) quienes afirman que la cantidad de inoculo presente en las hojas de caucho en estado B o C, en donde las lesiones están en fase conidial, es generalmente suficiente para efectuar un aislamiento efectivo. También se evidencio la aparición de colonias de diversos agentes contaminantes que alteraron el desarrollo y crecimiento del hongo M. ulei. Con la relación a la dificultad para obtener aislamientos conidiales de M. ulei con buena capacidad 107 Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110 d i v e rso s a g entes m ic ro b i a no s sapro fi tos oportunistas. Con base en estas afirmaciones se logra explicar la dificultad que se presento en esta investigación para obtener aislamientos de M. ulei. En esta investigación se obtuvo un total de 12 aislamientos de M. ulei provenientes de la región amazónica. Después de ajustar el proceso de aislamiento, al cabo de 12 días se observó la aparición de pequeñas colonias dispersas y de coloración beige (Figura 3A) las cuales, 10 días después se tornaron grisáceas y estromáticas (Figura 3B), coincidiendo con los resultados de Gasparotto et al. (1997), quienes afirman que luego de 12 días de incubación se puede observar claramente la germinación de la fase asexual de M. ulei. Después de cuatro semanas de crecimiento se encontró densas masas estromática oscuras y compactas, con crecimiento muy lento sobre el medio de cultivo (Figura 3C). Los aislamientos con edad de 30 - 45 días en medio de crecimiento esporulante, Junqueira et al. (1984) afirman que la tasa de éxito de un aislamiento realizado el mismo día de la colecta de las hojas, es de 70 % a 80 %, mientras que después de 15 días conservando la mu estr a en co n d i ci o nes a m b ie nta l es, l a efectividad desciende entre un 10 % y 15 %; por tal razón, la siembra del patógeno en este estudio fue realizada entre 12 y 24 h después de la colecta, buscando con esto maximizar el éxito en el proceso de aislamiento, obteniendo que los con i d i os r e cié n r et i rad os de l as le s ion e s esporuladas presentaron mayor variabilidad y menos contaminantes. Igualmente, Junqueira et al. (1984) manifiestan que la obtención en laboratorio del inóculo primario de la fase anamórfica de M. ulei (F. heveae) ha sido uno de los factores que han limitado las investigaciones del mal suramericano de la hoja de caucho, dado que los aislamientos obtenidos sufren una rápida pérdida de viabilidad de los conidios y poseen una alta susceptibilidad a la contaminación por Figura 3. Características macroscópicas de M. ulei observado en estereoscopio. A. Colonias filamentosas de 12 días de edad. B. Crecimiento estromático a los 22 días de edad. C. Masa estromática de 35 días de edad. D. Colonia altamente conidiada al cabo de 15 días de edad en medio para esporulación. 108 Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110 Con esta investigación se determinó que los medios de cultivo para el aislamiento, crecimiento y espo r ul a ció n son más favorable s par a crecimiento del hongo fitopatógeno M. ulei, dado que en ellos encuentra los requerimientos nutricionales para su desarrollo. fueron transferidos a medio de cultivo para esporulación desarrollando en 15 a 20 días una apariencia ligeramente aterciopelada, con una coloración marrón brillante (Figura 3D), la cual es caracterí s tica de l a s col o nia s a lta m e n te conidiadas. Holliday (1970) relató un aumento en la producción de conidios de M. ulei después de irradiación de luz a los cultivos con más de 14 días de edad por 30 o 40 min diarios, con una longitud de onda próxima a la luz al ultravioleta, es decir 300 - 365 nm. Por otro lado, Chee (1978) sugirió una hora de luz al día para aumentar la producción de conidios, mientras que Schrader (1980) sostiene que los cultivos de M. ulei con 14 a 16 días de edad aumentan significativamente la producción de conidios, cuando son iluminadas por uno o dos días con ciclos de 0,5 h de luz de una lámpara fluorescente de 40W a intervalos de 1,5 horas de oscuridad. Lieberei et al. (1983) afirman que los aislamientos de M. ulei expuestos a 90 min de luz diariamente por uno a dos días aumenta entre 13 y 24 veces la producción de conidios. En este trabajo l o s cultivos fueron iluminados 90 min diariamente, con lo que se obtuvo buenos aislamientos “esporulantes”, corroborando lo afirmado por Lieberei et al. (1983). Algunos aislamientos realizados en cultivo in vitro no presentaron germinación, posiblemente por factores físicos y químicos, entre ellos pH, temperatura y luminosidad que, según Mattos et al. (2003), son factores primordiales a la hora de hacer un estudio en medio artificial de este hongo. De igual forma juega un papel importante el tipo de medio de cultivo empleado para el asilamiento, crecimiento y esporulación del hongo, en los cu ales s e e ncuentr a n los requerimientos nutricionales para el desarrollo del patógeno. En experimentos con varios medios de cultivo para el aislamiento, crecimiento y esporulación in vitro de M. ulei realizados por Junqueira et al. (1984) indican que el medio más favorable para el crecimiento y esporulación de hongo fue el medio para crecimiento donde la producción de conidios fue máxima después de 12 días de incubación efectuando l a ad i ción d e a g ua de coco recomendado por Mattos (1999). Coincidiendo con lo obtenido con en esta investigación ya que estos medi o s de cul t ivo favor e cie r on el crecimiento y la esporulación del hongo. Sin embargo otros autores como Lieberei et al. (1983), muestran que la esporulación es mejor en medios poco enriquecidos como el agar papa dextrosa al 0,5 % con una iluminación diaria de 90 min. Agradecimientos Los autores agradecen sinceramente al proyecto Caracterización Morfológica y Molecular del Hon g o Microcyclus u l ei C aus a nte del Mal Suramericano de la Hoja en el Cultivo del Caucho (Hevea brasiliensis), Convenio 035/04 IICA-MADR y contrato 018/04 IICA-Unión Temporal: Instituto Am a zó n ico d e Investigaci o ne s Ci e ntíficas SINCHI - Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Literatura citada Bos, L. &. J. E. Parlevliet. 1995. Concepts and terminology on plant/pest relationships: Toward Consensus in Plant Pathology and Crop Protection. Annu. Rev. Phytopathol. 33:269-102. Cardoso, S. & C. R. R. Mattos. 2007. Modo operatório para preparação do meio de cultura para Microcyclus ulei. Programa de melhoramento genético de clones de seringueira com resistencia ao fungo Microcyclus ulei. Projeto CMB (Cirad-Michelin-Brasil). Documento Técnico D3. Chee, K. H. & Holliday. 1986. P. Enfermedad suramericana de la hoja del hule (caucho) Hevea. Instituto para la Investigación y Desarrollo del Hule de Malasia, MRRDB. Monografía 13. Presentado en la serie técnica n° 37 Avances de la investigación en caucho natural. CONIF. 1997. Bogotá. Chee, K. H. 1976. South American Ieaf blight of Hevea brasiliensis: spore dispersal of Microcyclus ulei. Annals of Applied Biology, 84(2):147-152. Chee, K. H. 1978. South American Leaf Blight of Hevea brasiliensis: Culture of Microcyclus ulei. Trans. Br. Mycol. Soc. 70(3): 341. Compagnon, P. 1998. El Caucho Natural. Biología - Cultivo Producción. CIRAD - C.P. México. Gasparotto L. F., A. F. Dos, J. C. R. Pereira & F. A. Ferreira. 1997. Doenças da seringueira no Brasil. Embrapa-SPI. Brasília. Gómez, D. & B. López. 2002. Respuesta del caucho (Hevea brasiliensis) a la aplicación del bioinsumo orgánico Biofun estrella en el control del mal sur americano de la hoja (Microcyclus ulei). Universidad de la Amazonia, Facultad de Ing e nierías, Prog ra ma de Ing e niería Agroecológica. Florencia, Caquetá. 16-39 p. Hallé, F., R. A. A. Oldeman & P. B. Tomlinson. 1978. Tropical trees and forest. Berlin, Springer-verlag. Holliday, P. 1970. South american leaf blight (Microcyclus ulei) of Hevea brasiliensis. Phytopathological papers, 12: 1-31. Junqueira, N. T. V., G. M. Chaves, L. Zambolim, R. da S. Romeiro & L. Gasparotto. 1984. Isolamento, cultivo e esporulação de Microcyclus ulei, agente etiológico do maldas-folhas da seringueira. Revista Ceres, v.31, p.322-331. Junqueira, N. T. V., L. Zambolin, G. M. Chaves & L. Gasparoto. 1986. Esporulação “in vitro”, viabilidad dos conídios e 109 Calderón-Álvarez et al. / Momentos de Ciencia 6(2), 2009, pp: 105 - 110 de s e r i n g ue i ra ( Hevea s pp . ) v i s an do r e sis t enc i a ao Microcyclus ulei. Tese (Mestre). Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”. Botucatu (SP, Brasil). Schrader, A. 1980. Cyanideinfluss anf sporenkeimung und mycelentwicklung bei Microcyclus ulei, dem. Erreger der sudamerikanischne Blatt-Kranlheit auf Hevea. Braunschweig, Botan. Inst. Tu. Ziebell, P. 2000. Los factores que afectan el desarrollo y la producción del caucho Hevea en el Caquetá y Putumayo (Zonas Húmedas). Informe final del área de fitopatología. Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas SINCHI. Santafé de Bogotá. Colombia. patogenicidade de Microcyclus ulei. Fitopatología Brasileira, 11 (2): 667. Lieberei, R., A. Schrader, B. Biehl & K. H. Chee. 1983. Effect of cyanide on Microcyclus ulei cultures. Journal of the Rubber Research, Institute of Malaysia. 31(3): 227-235. Mattos, C. R. R. 1999. Meios de cultura com água de coco verde para esporulação de Microcyclus ulei. Fitopatologia Brasileira 24:470. (Resumo). Mattos, C. R. R., D. García, F. Pinard & V. Le Guen. 2003. Variabilidade de isolados de Microcyclus ulei no Sudeste de Bahia. Fitopatologia Brasileira. 28 (5): 502-507. Sambugaro, R. 2003. Caracterização anatómica foliar de clones 110