Minicongreso de Fisiología VEGETAL 2006

Minicongreso de Fisiología VEGETAL 2006
19 Mayo de 2006
Presentación de los paneles por los alumnos de
Laboratorio Avanzado de Fisiología Vegetal
SESIÓN ÚNICA DE PRESENTACIÓN DE PANELES: 19 de Mayo de 2005
2005
9:30 a 18:00
Edificio de Biológicas
Editado por L.E. Hernández
1
Panel 1.
Panel 2.
Panel 3.
Panel 4.
Panel 5.
Panel 6.
Panel 7.
Panel 8.
Panel 9.
Panel 10.
Panel 11.
Panel 12.
Panel 13.
Panel 14.
Panel 15.
Panel 16.
Panel 17.
Panel 18.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA DE DOS EMBALSES
DE LA COMUNIDAD DE MADRID: Almudena Idígoras, Clara González, Marta González
ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE EMBALSES EN
FUNCIÓN DE LAS COMUNIDADES FITOPLANCTÓNICAS: Alberto Fernández, Araceli
Espí, Mercedes Monterde
EVOLUCIÓN
ESPACIO-TEMPORAL
DE
LAS
CARACTERÍSTICAS
FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID: Patricia
Martín, Mª Ángeles Lillo, Jorge Martínez
EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA EN LA COLUMNA
DE AGUA DEL EMBALSE DE SANTILLANA. Almudena Ferri, Almudena García, David
García
INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN CIANOBACTERIAS:
PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE Anabaena sp. PCC7120 (I): Jesús Timón, Zoraida
Escalona, Bárbara Rotstein
INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN CIANOBACTERIAS:
PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE Anabaena sp. PCC7120 (II): Luis Manuel Gil, Rubén
González, Ignacio
LAS FICOBILIPROTEINAS EN LA FOTOSÍNTESIS DE LAS CIANOBACTERIAS:
PAPEL DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC 7120: Albertina Martínez, Eduardo
Jubera, Sergio Martín
LAS FICOBILIPROTEÍNAS EN LA FOTOSÍNTESIS DE CIANOBACTERIAS:
PAPEL DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC 7120: Javier Navas, Hicham Tahoune,
Olivia Mendivil
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN LA
SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (I): Laura García, Alberto Salinero,
Ignacio San Pablo
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN LA
SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (II): Jon Díaz, Guillermo Esteban,
Miguel de Mulder
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN LA
SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (III): Javier Díaz, Daniel Carbajo,
Carmen Sánchez
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN LA
SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (IV): José Antonio Gijón, Elena
Marcos, María Riansares
CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO DE
FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS (I): María Carretero, Ana
Arroyo, Elisa Cuevas
CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO DE
FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS (II): Francisco
Fernández, Eva Galián, Carlos Bricio
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (I): Carla de la
Fuente, Celia Martín, Isabel Olmos
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (II): Marta
Medrano, Inés Osma, Lorena Cussó
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (III): Paula Marina
Iñigo, Sara Rodríguez, Cristina Areces
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (IV): Arancha
Rodríguez, Cristina Fernández-Oruña, Raquel Vega
2
Panel 1.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA DE DOS
EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE MADRID
Almudena Idígoras, Clara González, Marta González
El término de producción primaria hace referencia a la capacidad de incorporar materia orgánica
de un sistema; esta entrada de carbono orgánico es realizada a través de los organismos
fotosintéticos.
Gracias a la medida del carbono orgánico asimilado por un ecosistema podremos conocer las
características tróficas y fisiológicas del sistema acuático.
Para determinar las características fotosintéticas hemos realizado curvas PvsI en las que
comparamos la producción primaria en función de la intensidad lumínica. Para ello
incorporaremos a las muestras de agua NaH13CO3 como sustrato en concentraciones conocidas
con el carbono marcado. Así conoceremos el carbono inorgánico presente en el medio,
correspondiente a la actividad fitoplanctónica del medio.
Además determinaremos las características químicas del agua y estimaremos la biomasa. El
conocimiento de la comunidad fitoplanctónica nos llevará a unas conclusiones más acertadas
acerca de las características del ecosistema acuático.
Como resultados hemos obtenido que la tasa fotosintética en el embalse de Santillana aumenta
hasta una determinada intensidad lumínica, punto en el que desciende debido a que la luz no
penetra en toda la columna. Además la asimilación de carbono disminuye a medida que
aumentamos en profundidad. Sin embargo, en el embalse de Atazar al aumentar la intensidad y
disminuir la profundidad la asimilación de carbono es menor.
Con todos los datos obtenidos se corrobora la hipótesis de que Atazar es un embalse oligotrófico
y Santillana eutrófico.
3
Panel 2.
ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS FOTOSINTÉTICAS DE
EMBALSES
EN
FUNCIÓN
DE
LAS
COMUNIDADES
FITOPLANCTÓNICAS
Alberto Fernández, Araceli Espí, Mercedes Monterde
El embalse de Atazar y Santillana presentan distinto estado trófico (oligotrófico y eutrófico
respectivamente), al existir diferencias en el contenido en oxígeno, abundancia de nutrientes ([P],
[N]), implicando diferencias tanto en la diversidad como la cantidad de microorganismos
fotosintéticos. Para realizar la comparación de sus características fotosintéticas, se tomaron
muestras de agua de los dos embalses con el fin de determinar la incorporación de carbono
mediante un isótopo pesado de carbono (13C) procedimiento realizado por el Servicio
Interdepartamental de Investigación (SIDI) de la UAM; biomasa algal medida en función de la
concentración de clorofilas presentes en la columna de agua (µg l-1); y composición
fitoplanctónica mediante la visualización de muestras por microscopía. Además construimos las
curvas PvsI, donde observaremos el comportamiento de los parámetros fotosintéticos α; (eficacia
fotosintética), β; (fotoinhibición) y Pm (tasa fotosintética máxima) que se definen en estas curvas.
De la comparación de las curvas PvsI se obtiene que la fotosíntesis máxima es mayor en
Santillana que en Atazar, esto se ve confirmado con los resultados obtenidos en la cuantificación
de clorofilas, donde el mayor valor se alcanza en Santillana. La asimilación del isótopo de
carbono es mayor en el embalse eutrófico (mayor proporción de clorofilas mayor cantidad de
carbono asimilado, mayor fotosíntesis). El parámetro α justifica la diferenta de valores entre
Santillana y Atazar ya que este parámetro tiene mayor valor en Santillana indicando la mayor
actividad fotosintética de este embalse.
En cuanto a la población algal destacan las algas verdes en situación eutrófica y cianobacterias en
oligotrofía, pues son capaces de fijar el nitrógeno atmosférico no necesitando muchos
requerimientos nutricionales, como ocurre en Atazar.
Bibliografia:
1. Graham, LindaE., Algae. Ed. Prentice Hall (2000).
2. Guión de prácticas.
3. Wetzel, R.G. Limnología. Omega. Barcelona (1982).
4
Panel 3.
EVOLUCIÓN ESPACIO-TEMPORAL DE LAS CARACTERÍSTICAS
FOTOSINTÉTICAS DE LOS EMBALSES DE LA COMUNIDAD DE
MADRID
Patricia Martín, Mª Ángeles Lillo, Jorge Martínez
Para este estudio usamos como modelo dos embalses con distinto estado trófico: Santillana
(eutrófico) y Atazar (oligotrófico), representativos del conjunto de embalses de la Comunidad de
Madrid.
Compararemos la evolución espacio-temporal de las características fotosintéticas de dichos
embalses durante un periodo de tres semanas. Este análisis se realiza utilizando como herramienta
un espectrómetro de masas para conocer la asimilación biológica del carbono en distintas
condiciones de irradiancia. Los resultados se representarán gráficamente con curvas PvsI típica,
lo que nos da una idea clara de lo que está ocurriendo en cada embalse. Nos centramos en el
estudio de los parámetros alfa, beta, y fotosíntesis máxima. Tanto la afinidad de los fotosistemas
por la luz como la fotoinhibición resultan mayores en Atazar, así como la fotosíntesis máxima.
Posteriormente discutiremos los resultados en base al método de trabajo usado, al tipo de
microorganismos encontrados en cada embalse y atendiendo a las condiciones lumínicas de cada
día.
Bibliografia:
1.
Margalef, R.1983. Limnología. Omega. Barcelona
2.
Guiones de prácticas.
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Panel 4.
EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LA PRODUCCIÓN PRIMARIA EN LA
COLUMNA DE AGUA DEL EMBALSE DE SANTILLANA
Almudena Ferri, Almudena García, David García
El estudio ha sido realizado en el embalse de Santillana de la Comunidad de Madrid en las dos
últimas semanas de octubre y la primera de noviembre. Se ha analizado la producción primaria y
estudiado su variación en las diferentes capas de agua en función de distintos factores. En base a
los resultados obtenidos, se ha observado que los factores de mayor relevancia son la irradiancia
solar y las condiciones climatológicas, así como la afinidad de los fotosistemas por la luz y el
estado fisiológico de los organismos.
Observando la variación a lo largo de un día, se aprecia un patrón general que muestra un
aumento considerable de la producción primaria en las primeras horas de luz, que se mantiene
hasta las últimas horas, momento en el que disminuye bruscamente. Sin embargo, aparece una
disminución en las horas centrales del día debido a la fotoinhibición, en aquellos días en los que
la irradiancia es alta.
Según la profundidad, en las curvas de los tres días de excursión, la producción primaria va
disminuyendo de forma lineal en los primeros metros y exponencialmente en el resto. Esto se
debe principalmente a que el porcentaje de transmisión de luz disminuye según avanzamos en
profundidad.
Comparando los resultados de los tres muestreos, tanto a lo largo de un día como en profundidad,
se observa que el día que se registró más producción primaria fue sorprendentemente el de menor
irradiación solar. Esto permite llegar a la conclusión de que el estado fisiológico y la afinidad de
los fotositemas de los organismos fitoplanctónicos son determinantes para la producción
primaria.
Bibliografía:
1. Paul G. Falkowski, John A. Raven. “Aquatic Photosynthesis”. Editorial Blackwell
Science, 1997.
2. John T. O. Kirk. “Light & Photosynthesis in Aquatic Ecosystems” Editorial Cambridge
University Press.
6
Panel 5.
INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN
CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE Anabaena sp.
PCC7120 (I)
Jesús Timón, Zoraida Escalona, Bárbara Rotstein
Con este trabajo queremos determinar la actividad fotosintética y respiratoria en el mutante
PHB11 de Anabaena sp. PCC7120, el cual se ha obtenido por inserción del transposón Tn5 en un
gen mrpA, que formaría parte del operón denominado mrp, que parece codificar un antiportador
Na+/H+ multiproteíco. Algunas de las proteínas codificadas por este operón (MrpA, B y D)
muestran una similitud significativa a las subunidades hidrofóbicas de la NAD(P)H
deshidrogenasa (Complejo I, que en cianobacterias se localiza en el tilacoide, donde participa en
el transporte electrónico fotosintético y respiratorio).
Para analizar los efectos de esta mutación hemos llevado a cabo un estudio comparativo entre la
cepa silvestre y la mutante. Para ello, hemos determinado la respiración y la actividad
fotosintética, medida con diferentes tipos de luz (blanca, roja y a 620 nm) en ambas cepas,
utilizando un electrodo de O2 tipo Clark, así como los niveles de clorofila a y de ficocianina. Por
otro lado, hemos realizado un espectro in vivo y analizado el transporte electrónico en los
fotosistemas I y II, utilizando donadores y aceptores de electrones artificiales.
A partir de los resultados obtenidos, vemos que el mutante presenta las tasas respiratorias y
fotosintéticas disminuidas. Así mismo, la actividad en el fotosistema II y el contenido en
ficocianinas son menores. Con todo esto, podríamos concluir que este posible antiportador
Na+/H+ multiproteico, de un modo probablemente indirecto, está afectando tanto al transporte
electrónico de la cadena respiratoria como a la fotosintética y, por eso, al verse afectada en el
mutante, vemos una disminución en estos procesos.
Bibliografía:
1.
A. Blanco-Rivero, F. Leganés, E. Fernandez-Valiente, P. Calle y F. Fernandez- Piñas (2005).
mrpA, a gene with roles in resistance to Na+ and adaptation to alkaline pH in the
cyanobacterium Anabaena sp. PCC7120. Microbiology 151:1671-1682.
2.
G.A. Peschek, (1996) Interaction of photosyntesis and respiration. Biochemical Society
Transactions 24:729-733.
3.
Talia H. Swartz, Sayuri Ikewada, Osamu Ishikawa Masahiro Ito y Terry Ann Krulwich
(2005). The Mrp system: a giant among monovalent cation/proton antiporters?
Extremophiles 9: 45354
4.
T. Friedrich, K. Steinmüller, H. Weiss (1995) The proton pumping respiratory complex I of
bacteria and mitochondria and its homologue in chloroplasts. FEBS Letters 367:107-111
7
Panel 6.
INTERACCIÓN ENTRE FOTOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN EN
CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE PHB11 DE Anabaena sp.
PCC7120 (II)
Luis Manuel Gil, Rubén González, Ignacio
La cianobacterias constituyen el grupo mas amplio y diverso de bacterias fotosintéticas, aunque
son procariotas verdaderas, su sistema fotosintético se asemeja mas al de algunos orgánulos de
las células eucariotas, ya que presentan clorofila a y tienen el fotosistema II necesario para la
obtención de poder reductor y reducción del oxigeno.
Trataremos de comprobar la posible interacción entre respiración y fotosíntesis en cianobacterias
comparando el estudio de dos cepas de Anabaena sp. PCC 7120, (wild type y PHB11 mutante en
el operón mrp), mediante el análisis de: actividad fotosintética con diferentes longitudes de onda
irradiadas, respiración, y actividades por separado de PSI y PSII utilizando desacopladores
químicos, medidas como desprendimiento o consumo de O2, empleando un electrodo tipo Clark.
Se realizará una extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos y se obtendrán espectros
in vivo.
En la cepa mutante PHB11 se observa una disminución tanto de la fotosíntesis como de la
respiración respecto a la cepa salvaje, denotando una posible relación entre ambos procesos que
se ven afectados por la misma mutación.
Debido además, a la diferente adaptación de las dos cepas a medios alcalinos, y concentración de
sales, se sugiere un posible mal funcionamiento de la regulación del medio interno en la cepa
mutante, mediado por antiportadores de Na+/H+ como el localizado en el operón mrp.
8
Panel 7.
LAS FICOBILIPROTEINAS EN LA FOTOSÍNTESIS DE LAS
CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC
7120
Albertina Martínez, Eduardo Jubera, Sergio Martín
Las cianobacterias utilizadas en esta práctica son procariotas fotosintéticos capaces de fijar
nitrógeno molecular en condiciones aerobias. Para realizar la fotosíntesis presentan dos tipos
principales de pigmentos: clorofila a y ficobilinas. Esta última está compuesta por un núcleo de
aloficocianina, y ficocianinas y ficoeritrinas que actúan como antenas. Además, contienen
proteínas de unión llamadas linkers y proteínas asociadas al ficobilisoma (FNR). Los
ficobilisomas absorben la luz entre 560-650 nm, y actúan como complejos antena asociados al
fotosistema II.
Utilizamos, en nuestro caso, dos cepas de Anabaena PC7120, una de las cuales es el mutante
LC1, que mediante el trasposón TN5, ha sido mutado en el gen cpcB que codifica la síntesis de
ficocianinas. Para comprobar el efecto de la falta de este pigmento en la fotosíntesis probamos
valores de fotosíntesis máxima irradiando a distintas longitudes de onda.
Bibliografia: Guión de prácticas
9
Panel 8.
LAS
FICOBILIPROTEÍNAS
EN
LA
FOTOSÍNTESIS
DE
CIANOBACTERIAS: PAPEL DEL MUTANTE LC1 DE Anabaena sp. PCC
7120
Javier Navas, Hicham Tahoune, Olivia Mendivil
Las cianobacterias son organismos procarióticos gram negativos; al igual que las plantas
superiores van a presentar dos fotosistemas, clorofila a, pigmentos accesorios y van a realizar
fotosíntesis oxigénica acíclica y respiración aerobia [1]. Estos organismos poseen ficobilisomas
que son unas estructuras presentes en las membranas tilacoidales que tienen como función la
captación y transferencia de energía lumínica. Los ficobilisomas están organizados en dos
subestructuras: el núcleo y las antenas y van a aparecer acoplados al fotosistema II, ampliando el
rango de absorción lumínica que permite al organismo vivir en diferentes condiciones de
irradiancia. El núcleo está compuesto por aloficocianina y cada antena está compuesta por
ficocianina y ficoeritrina o ficoeritrocianina [2]. Los organismos que hemos utilizado en nuestros
experimentos son Anabaena sp. PCC 7120 que es una cianobacteria filamentosa fijadora de N2,
y una cepa derivada, la LC1 que es resultante de una transposición con Tn5 en el gen cpcB. Este
gen codifica para la subunidad β de la ficocianina [3].
El estudio de los parámetros de respiración y fotosíntesis en las dos cepas ha revelado unos
valores metabólicos mayores en la cepa mutante (pese a tener un menor contenido en pigmentos),
mostrando además una mayor tasa de crecimiento en el cultivo. En el póster se expondrán los
resultados más significativos de este estudio.
Bibliografía:
1. Amaya Blanco-Rivero. Tesis Doctoral.2003
2. Robert MacColl. Cyanobacterial Phycobilisomes. Journal of Structural Biology 124, 311334 (1998)
3. Francisco M. M. Granero. Diploma de Estudios Avanzados. 2003
10
Panel 9.
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN
LA SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (I)
Laura García, Alberto Salinero, Ignacio San Pablo
Uno de los estreses más importantes que afecta a la disminución del desarrollo de las plantas, es
la salinidad. Nosotros, hemos analizado los efectos de este tipo de estrés en la fijación de
nitrógeno. Para ello, hemos utilizado el sistema biológico guisante (Pisum sativum L. cv. Argona)
- Rhizobium leguminosarum.
Las plantas de guisante, inoculadas con Rhizobium, se sometieron a dos tratamientos: un
tratamiento control (0 mM NaCl) y otro con una concentración 75 mM de NaCl. Hemos
estudiado varios parámetros; la expresión del gen NifH, la detección de la proteína nitrogenasareductasa, utilizando un antisuero, y la actividad de la nitrogenasa como tal, mediante la
reducción de acetileno a etileno medido por cromatografía de gases.
En este trabajo, observamos que las plantas sometidas a estrés salino, presentan una menor
expresión del gen NifH, en términos de transcripción y traducción, así como una disminución en
la actividad de nitrogenasa, y esto se ve reflejado en un menor desarrollo de la raíz y de los
nódulos.
Por lo que nuestro método de estudio, con sus resultados correspondientes nos lleva a valorar que
los altos niveles de sal producen una disminución en la fijación de nitrógeno por parte de la
planta.
Bibliografía:
1. Bolaños L, Martín M, El-Hamdaoui A, Rivilla R, Bonilla I. 2006. Nitrogenase inhibition
in nodules from pea plants grown under salt stress occurs at the physiological level and
can be alleviated by B and Ca.
2. El-Hamdaoui, M. Redondo-Nieto, B. Torralba, R. Rivilla, I. Bonilla, L. Bolaños.
Influence of boron and calcium on the tolerance to salinity of nitrogen-fixing pea plants.
2002
3. Fundamentos de Fisiología
Interamericana.2000.
Vegetal.
J.Azcón-Bieto,
M.Talón.
McGraw-Hill.
11
Panel 10.
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN
LA SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (II)
Jon Díaz, Guillermo Esteban, Miguel de Mulder
Las plantas pueden ser afectadas por distintos tipos de estrés; esto se traduce en efectos adversos
en el desarrollo. De entre los tipos de estrés que pueden existir, el causado por un exceso de
salinidad en el medio es el que vamos a abordar. Para esto estudiamos el efecto de la salinidad
sobre la fijación de nitrógeno realizada por el complejo Rhizobium – Leguminoseae,
centrándonos en el complejo nitrogenasa reductasa, que es el que realiza esta función. Como
material hemos usado la planta del guisante Pisum sativum y la cepa de Rhizobium
leguminosarum 3841-GFP.
Usamos dos tratamientos distintos, unas plantas crecieron bajo un tratamiento control y otras bajo
un tratamiento al que se le añadía una solución de NaCl 75mM. A primera vista las plantas que
habían sufrido el tratamiento salino presentaban menor desarrollo y una menor concentración de
nódulos radiculares. Con la técnica de RT-PCR se puede comparar la expresión del gen nifH, que
codifica para el componente II de la nitrogenasa. Medimos la cantidad de proteínas mediante una
electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida con SDS. Mediante un electro-blotting y
una posterior detección de la nitrogenasa por un anticuerpo específico para la proteína
revelaremos la presencia de ella en ambas muestras. Por último evaluaremos la actividad
enzimática de la nitrogenasa valiéndonos de un cromatógrafo de gases, esta medida será obtenida
como reducción de acetileno a etileno.
Por esto concluimos, que el tratamiento salino produjo un déficit en el desarrollo del nódulo, lo
que se vio traducido en una menor concentración y actividad de la enzima encargada de fijar el
N2 atmosférico.
12
Panel 11.
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN
LA SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (III)
Javier Díaz, Daniel Carbajo, Carmen Sánchez
La fijación biológica de nitrógeno (FBN) sólo la realizan organismos procariotas que poseen el
enzima nitrogenasa, bien en vida libre o en simbiosis con ciertas plantas (Sprent and Sprent,
1990). Así, la planta recibe una fuente de nitrógeno y la bacteria dispone del carbono necesario
para su crecimiento. A causa de esta simbiosis se origina un órgano mixto, el nódulo, donde se
realiza la reducción del nitrógeno.
Las leguminosas son plantas sensibles a sal según la clasificación de Greenway y Munns
(Greenway and Munns, 1980). El efecto más común de la salinidad sobre las plantas es la
reducción del desarrollo. El estrés salino puede afectar a la simbiosis de leguminosas con
rizobios, indirecta o directamente, produciendo finalmente una reducción de la nodulación y una
disminución de la actividad nitrogenasa específica.
Hemos realizado un estudio sobre plantas de guisante (Pisum sativum) en simbiosis con
Rhizobium leguminosarum, sometidas a estrés salino, estableciendo un grupo control.
Para afrontar el estudio del efecto del estrés salino sobre la FBN, realizamos una RT-PCR para
medir la expresión del gen nifH (que codifica para el componente II de la nitrogenasa);
realizamos un SDS-PAGE para cuantificar la cantidad global de proteínas presentes en nódulos, y
con dicho gel realizamos un Western-blot para localizar el producto proteico de nifH. Aparte,
hemos medido la actividad nitrogenasa del enzima por cromatografía de gases.
Observamos, además de la reducción del desarrollo, retraso en la nodulación y clorosis, menor
expresión de nifH en plantas con sal y menor cantidad de proteínas extraídas (si bien esto revertía
en la última semana por senescencia nodular en plantas control). En el Western-blot debíamos
localizar menor concentración de proteína NifH en plantas con sal. La actividad nitrogenasa
también fue menor en plantas con sal. Concluimos que la fijación biológica de nitrógeno es un
proceso extremadamente sensible a estreses ambientales, en concreto el salino.
Bibliografía:
1. Sprent JI, Sprent P. 1990. Nitrogen fixing organisms. Pure and applied aspects. Ed.
Chapman and Hall. University Press, Cambridge
2. Greenway, H, Munns R. 1980. Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes. Annu.
Rev. Plant Physiol., 31: 149-190.
3. http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/fijacionN.htm
4. http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/salinidad.htm
13
Panel 12.
EFECTO DE LA SALINIDAD SOBRE LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN
LA SIMBIOSIS Rhizobium leguminosarum-GUISANTE (IV)
José Antonio Gijón, Elena Marcos, María Riansares
Actualmente la salinización de los suelos es un problema mundial debido a que afecta a las
relaciones simbióticas de distintas especies vegetales, entre ellas, algunas de interés comercial
como la establecida por Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841GFP con Pisum sativum L. cv.
Argona, sobre la que centraremos nuestro estudio.
Estudiaremos cómo afecta la salinidad al desarrollo de la planta, a la formación de los nódulos
simbióticos (como número de nódulos por planta.) y a la fijación de nitrógeno a nivel de
transcripción (mediante análisis de RT-PCR en gel de agarosa), de síntesis de proteínas (a través
de electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida con SDS) y de actividad enzimática de
la nitrogenasa, enzima responsable de la fijación del nitrógeno (midiendo la producción de etileno
mediante cromatografía de gases).
Para realizar el estudio a nivel de transcripción y traducción nos centramos en el gen nifH que
codifica para la subunidad II de la nitrogenasa, mientras que para determinar la actividad
enzimática nos basamos en la inespecificadad del complejo nitrogenasa que, además de reducir el
nitrógeno, es capaz de reducir otros compuestos con triples enlaces, como el acetileno.
También comentaremos la influencia de la adición de determinados nutrientes, como el boro y el
calcio, en la mejora de la fijación de nitrógeno y la formación de nódulos bajo condiciones de
estrés salino.
Por tanto, basándonos en nuestros experimentos de laboratorio y en la bibliografía relacionada,
observamos que la salinidad tiene efectos sobre la simbiosis Rhizobium- guisante, que se traducen
en una disminución del crecimiento y de la fijación del nitrógeno, y que se pueden contrarrestar
mediante adición de nutrientes como boro o calcio.
14
Panel 13.
CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO
DE FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS (I)
María Carretero, Ana Arroyo, Elisa Cuevas
El cultivo in vitro es una serie de técnicas empleadas para la propagación vegetativa de plantas.
Esto se hace necesario en los casos en los que la reproducción sexual no ofrece resultados
satisfactorios, frenar la propagación de patógenos o para modificar plantas genéticamente
confiriéndoles una ventaja adicional. El fundamento es la regeneración de una planta completa a
partir de un fragmento (explantos, protoplastos, gametos, suspensiones celulares, etc.) de la
misma, gracias a la capacidad totipotente de las células vegetales. Para ello desarrollamos
protocolos en los que usando diferentes proporciones de fitohormonas (auxinas y citoquinina)
logramos el desarrollo diferencial de las zonas de la planta que nos interesen según el objetivo
concreto de nuestro experimento.
En el laboratorio se analizaron explantos procedentes de hojas y tallo de tres especies vegetales:
tabaco (Nicotiana tabacum), clavel (Dianthus caryophylus) y zanahoria (Daucus carota) a los
que se aplicaron tres tratamientos en los que se variaron las concentraciones de fitohormonas:
Alta, media y baja auxina. Todo ello en estrictas condiciones de esterilidad, para evitar la posible
contaminación debida a la riqueza en nutrientes del medio de cultivo.
En términos generales los resultados obtenidos con el tratamiento de alta auxina son de un
elevado desarrollo de los tejidos radiculares, mientras que los de media y baja auxina son de
formación de callos y parte aérea respectivamente.
La generación de plantas transgénicas de interés biotecnológico depende en gran medida de los
procedimientos de regeneración de estas a partir del material vegetal manipulado. Se comentará
una aplicación de estas técnicas consistente en la obtención de vacunas comestibles procedentes
de la expresión en patata (Solanum Tuberosum) de un antígeno de la Hepatitis B.
Bibliografía:
1. Mason HS, Warzecha H, Mor T, Arntzen CJ. 2002. Edible plant vaccines: applications
for prophylactic and therapeutic molecular medicine. TRENDS in Molecular Medicine 8,
No.7
2. Tacket CO , Mason HS, Losonsky G, Clements JD, Levine MM,. Arntzen CJ. 1998.
Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic
potato. Nature Medicine 4, 607-609. doi:10.1038/nm0598-607.
15
Panel 14.
CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS: ADECUACIÓN DEL CONTENIDO
DE FITOHORMONAS Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS (II)
Francisco Fernández, Eva Galián, Carlos Bricio
El cultivo in vitro es una técnica de propagación vegetativa que aprovecha la totipotencialidad de
las células vegetales como herramienta de diferentes aplicaciones biotecnológicas. En nuestro
caso se utilizaron plantas de zanahoria (Daucus carota), tabaco (Nicotiana tabacum) y clavel
(Dianthus caryophylus) para observar la influencia de algunos fitorreguladores (citoquininas y
auxinas) en su crecimiento, mediante la técnica de cultivo in vitro de explantos. El cultivo in vitro
es muy utilizado para la regeneración de plantas transgénicas, ya sea con fines alimentarios,
ornamentales, industriales o farmacológicos. Es preciso un ensayo preliminar que determine la
proporción de los fitorreguladores necesaria para conseguir la micropropagación vegetativa de las
plantas; y el resultado de esta emplearlo en la regeneración de plantas clónicas. En el Módulo de
Cultivo in vitro se analizó la respuesta de explantos de hoja y tallo a diferentes concentraciones
de auxinas y citoquininas, como se muestra en el póster. Asimismo, se discutirá la aplicación de
la técnica de cultivo in vitro de la regeneración de trigo transformado mediante el bombardeo de
partículas sobre el tejido escutelar de embriones inmaduros. La transformación seguida en este
experimento se llevó a cabo mediante un procedimiento llamado biolística, que consiste en el
disparo de partículas de oro o tungsteno y que tiene aglomerado DNA foráneo sobre células,
tejidos u órganos vegetales, lo que hace posible integrar el DNA en el genoma de las células
vegetales.
Bibliografía:
1. AZCÓN-BIETO J, TALÓN M. 2001. Fundamentos de Fisiología Vegetal. McGraw-Hill
Interamericana.
2. BECKER D., BRETTSCHNEIDER R., LÖRZ H. 1994. Fertile transgenic wheat from
microprojectile bombardment of scutellar tissue. The Plant Journal 5, 299-307.
16
Panel 15.
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (I)
Carla de la Fuente, Celia Martín, Isabel Olmos
La especie Lycopersicon esculentum , objeto de nuestro estudio, es una planta de tomate
ampliamente cultivada en regiones mediterráneas. Hay factores, como el uso de aguas freáticas,
que provocan que el medio alcance altas concentraciones de sal, suponiendo un factor de estrés
para esta planta, que presenta una menor tolerancia a la toxicidad asociada con la absorción
excesiva de los iones Na+ y Cl- en comparación con la especie salvaje de tomate L. pennellii. El
efecto inmediato de este estrés es la reducción del desarrollo vegetal, debido en parte a la
disminución del potencial osmótico del medio que favorece la plasmolisis celular por el aumento
relativo del potencial hídrico de la planta; y además al desequilibrio nutricional consecuencia de
la interferencia de los iones de la sal con otros nutrientes esenciales para la planta. Estos efectos
primarios hacen que aparezcan otros estreses secundarios, como el daño oxidativo debido a un
aumento de las especies reactivas de oxígeno (EROs).
Centramos nuestro estudio en la identificación de algunos de los mecanismos de los cuales
dispone la planta para solventar este daño. Analizamos la expresión génica de enzimas
específicas (ascorbato peroxidasa, APX que interviene en el ciclo de detoxificación de EROs y
∆-pirrolina-5-carboxilato sintetasa que interviene en la síntesis de la prolina) mediante la técnica
de la RT-PCR y la actividad de APX mediante un gel nativo de poliacrilamida. También
analizamos otros parámetros relacionados con situaciones de estrés: acumulación de L-prolina
(osmolito compatible que evita la desnaturalización de proteínas vitales e interviene en el ajuste
osmótico de la planta); acumulación de malondialdehído (producto de la peroxidación de lípidos
inducida por el estrés oxidativo) mediante colorimetría; y por último la degradación de clorofilas
o clorosis. Comparamos los resultados obtenidos a partir de la realización de ensayos con plantas
control y con plantas sometidas a estrés por salinidad al ser regadas con una disolución
suplementada con 200 mM NaCl.
Bibliografía:
1. Mittova V.; Theodoulou F.L.; Kiddle G.; Volokita M.; Tal M.; Foyer C. H.; Guy M.
(2004). Comparison of mitochondrial ascorbate peroxidase in the cultivated tomato,
Lycopersicon esculentum, and its wild, salt-tolerant relative, L. pennellii – a role or matrix
isoforms in protection against oxidative damage. Plant, Cell and Environment. 27: 237–
250
2. Zhu JK (2001) Plant salt tolerance. TRENDS in Plant Science 6:
17
Panel 16.
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (II)
Marta Medrano, Inés Osma, Lorena Cussó
Mediante distintas técnicas bioquímicas y de biología molecular estudiamos los efectos que
produce el estrés salino sobre plantas de Lycopersicon esculentum. En las plantas, el estrés
genera el aumento de las especies reactivas de oxigeno (EROS) las cuales inducen la expresión
de genes que codifican proteínas implicadas en la respuesta a la salinidad como ascorbato
peroxidasa (APX), la cual actúa en el ciclo ascorbato-glutation para la eliminación de las EROs, y
pirrolina-5-carboxilasa sintetasa (P5CS) que cataliza la síntesis de L-prolina la cual se acumula
como respuesta a estrés salino. Distintos estudios sobre prolina han determinado que su
concentración es mayor en épocas de verano, donde la limitación de agua y nutrientes es superior
que en otoño.
Vamos a realizar una comparación entre plantas sometidas a estrés salino y plantas control. Los
métodos empleados han sido: RT-PCR y electroforesis en gel de agarosa para medir la expresión
génica; electroforesis en gel nativo de poliacrilamida para determinar la actividad enzimática de
la APX; colorimetría de malondialdehído, para estimar la peroxidación de lípidos y otra
colorimetría para calcular la concentración de prolina.
Bibliografía:
1. Proline as a measure of stress in tomato plants. Wilfried Claussen Received 23 March
2004; received in revised form 29 July 2004; accepted 30 July 2004.
18
Panel 17.
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (III)
Paula Marina Iñigo, Sara Rodríguez, Cristina Areces
El estrés oxidativo se define como una situación en la que existe tanto un aumento en la
velocidad de generación de especies reactivas del oxígeno (EROs) como producto de una
disminución de los sistemas de defensa. Es en esta situación de estrés oxidativo en la que se
manifiestan las lesiones que producen los radicales libres. Estos reaccionan químicamente con
lípidos, proteínas, carbohidratos y ADN en el interior de las células, y con componentes de la
matriz extracelular, por lo que pueden desencadenar un daño irreversible que, si es muy extenso,
pudiendo llevar a la muerte celular.
El estudio del estrés salino se centro en la utilizando de una variedad de planta del tomate
(Lycopersicon esculentum) muy tolerante a niveles moderados de salinidad. Por ello se
emplearon concentraciones elevadas de NaCl (200 mM) para poder analizar las respuestas al
estrés.
En nuestro experimento se analizaron parámetros de estes oxidativo como la identificación de la
actividad enzimática de la ascorbato peroxidasa (APX), la expresión génica a través de la RTPCR de la APX, la peroxidación de lípidos de membrana (que causa la acumulación de
malondialheido), el cambio en la cantidad de clorofilas (debido a una daño en el mecanismo de
síntesis de las mismas que producirá clorosis en las plantas estresadas) y la determinación del
contenido de prolina (aminoácidos que está relacionado con la protección de las proteínas frente a
la desnaturalización). Todos estos parámetros se ven incrementados en plantas en las que se ha
inducido este estrés, provocando en algunos casos una toxicidad alta.
Bibliografia:
1. Amon DI. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts- polyphenoloxidase in Beta
vulgaris. Plant Physiology 24:1-15.
2. Buege JA, Aust SD. 1978. Microsomal Lipid Peroxidation. Meth. Enzymol. 52:302-310.
3. Dionisio-Sese ML, Tobita S. 1998. Antioxidant responses of rice seedlings to salinity
stress. Plant Science, 135:1-9.
19
Panel 18.
ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD EN PLANTAS (IV)
Arancha Rodríguez, Cristina Fernández-Oruña, Raquel Vega
La salinidad es uno de los factores abióticos de estrés más importantes que afectan a las plantas.
El exceso de salinidad provoca una serie de efectos primarios, el más común es la reducción del
desarrollo debido a una disminución del potencial osmótico del medio y a una toxicidad
específica que produce un desequilibrio nutricional. Como consecuencia de éstos, aparece una
serie de efectos secundarios entre los que destaca el daño oxidativo, cuyo síntoma es el aumento
de las especies reactivas de oxígeno (peróxido de hidrógeno y el ión superóxido). Para atenuar la
toxicidad celular , las plantas poseen una serie de enzimas como la APX y SOD que minimizan
esos efectos.
Se va a estudiar las respuestas de la planta a nivel de cambio en la expresión de genes que
codifican proteínas (APX y P5CS) mediante la técnica de la RT-PCR y la actividad de las
proteina APX in gel.
Asimismo, se medirá la peroxidación de lípidos (midiendo la concentración de MDA acumulado
mediante una espectofotometría) y la degradación de la clorofila (tanto cla como clb mediante el
uso del espectofotómetro) como indicadores de los daños sufridos por la planta.
Por último, se hará un análisis más detallado de la acumulación de prolina como mecanismo de
defensa frente al estrés salino y sus posibles implicaciones en la regulación de otros mecanismos
en respuesta al estrés.
Bibliografía:
1. Andel Hamid A.Khedr , Mohammad A. Abbas , Amal A. Abdel Wahid , W.Paul Quick
and Gaber M. Abogadallah. 2003. Proline induces the expression of salt-stress-responsive
proteins and may improve the adaptation of Pancratium maritimum L. to salt-stress.
Journal of Experimental Botany, vol.54, 392, 2553-2562.
2. Wilfried Claussen . 2004. Proline as a measure of stress in tomato plants. Plant Science
168, 241-248.
3. Tomomichi Fujita, Albino Maggio , Mario Garcia-Rios , Ray A.Bressan and Laszlo
N.Csonka. Comparative Análisis of the Regulation of Expression and Structures of Two
Evolutionarily Divergent Genes for P5CS from Tomato. Plant Physiol. (1998) 118: 661674.
4. Guión de practicas del modulo de estrés salino.
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