Marcadores moleculares: Diagnóstico de mastitis y genes de resistencia a infecciones. Patricia Cervantes A., Antonio Hernández B., Gomer H. Rivera V, Belisario Domínguez M. y Carlos Lamothe Zavaleta. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Laboratorio de Biología Molecular, Rancho Torreón del Molino Universidad Veracruzana, Veracruz, México pcervantes@uv.mx Introducción La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los países desarrollados. Por esta razón, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios en el campo de genética, fisiología y nutrición. En los rebaños lecheros, la selección de animales con alto nivel productivo, permite que características tales como la salud de las vacas se reduzca y que algunas enfermedades como la mastitis clínica aumenten. Por ello, un programa de mejora genética debe centrar su atención no sólo en obtener animales con alta producción láctea y de calidad composicional óptima, sino también incluir condiciones de salud del rebaño que favorezcan tanto al bienestar animal como a la rentabilidad de las empresas. El desarrollo de la biología molecular abrió la posibilidad de hacer estudios comparativos con modelos animales heterólogos, así como avanzar en la habilidad de generar vacas lecheras que posean nuevos genes, sin embargo el costo sustancial asociado a la aplicación de estas tecnologías en términos de tiempo e implementación todavía se considera alto, ya que el tiempo no incluye el esfuerzo involucrado en el diseño, ensamblaje y pruebas de la construcción de genes en los modelos biológicos apropiados que aseguren el éxito de estas tecnologías. Por otro lado, aún se discute la aplicabilidad de estas tecnologías en la consideración de la salud de los consumidores y de la inocuidad alimentaria. Palabras clave: Mastitis, Transgénicos, Complejo Mayor de Histocompatibilidad Biología molecular para el diagnóstico de mastitis Las técnicas moleculares desarrolladas en torno a la mastitis, van desde un diagnóstico por PCR de la cepa bacteriana y pueden incluir la detección de un gen en particular de ese agente, por PCR en Tiempo Real, PCR anidado, hasta el análisis de mutaciones con técnicas simples como el polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP, del inglés, Single Strand Conformation Polymorphism) ó la T-RFLP (del inglés, TerminalRestriction Fragment Lenght Polymorphism), cuyo principio es la amplificación del 16S rDNA de las bacterias existentes en una muestra, restricción enzimático de los distintos fragmentos obtenidos y la detección de los fragmentos terminales resultantes de la digestión (Ovidio et al, 2006). Resistencia a enfermedades Aunque las infecciones por mastitis se deben en su mayoría, a un mal manejo higiénico-sanitario de la granja, se ha demostrado que el riesgo de un animal de padecer o no esta enfermedad se transmite también de generación en generación. La heredabilidad de la mastitis (es decir, lo que depende del propio animal y puede transmitir a su descendencia) es del 10% aproximadamente (Pérez-Cabal et al, 2008). Por ello, se considera que si se utilizan metodologías adecuadas, se pueden realizar valoraciones genéticas que permiten detectar vacas y toros que transmitirían a las futuras generaciones mayor resistencia a la mastitis clínica, seleccionando así animales que presenten una menor susceptibilidad a esta enfermedad. Dentro de las estrategias de prevención se investiga acerca de la selección de animales con genes de resistencia, ya que una vez que un microorganismo productor de mastitis invade la glándula inicia su multiplicación generando por parte del huésped, una respuesta inflamatoria con el propósito de controlar o eliminar el agente invasor, ya sea recurriendo a la respuesta humoral o a la celular (Detilleux, 2001). Cuando una bacteria logra atravesar el canal del pezón las probabilidades de mastitis son altas. Pero los animales muestran diferentes grados de susceptibilidad para enfermarse y en buena parte esa resistencia es determinada genéticamente. Las bases genéticas de la resistencia a la mastitis no son totalmente conocidas, pero es necesario hacerse varias preguntas de tipo práctico acerca del impacto económico que tendría este comportamiento genético (Sordillo y Streicher, 2002). Los ensayos para incrementar la resistencia de la glándula mamaria a la mastitis utilizando cruces o vacunas han tenido hasta el momento un impacto muy limitado. Sin embargo la revolución contemporánea en genética animal conduce a posibilidades tales como la modificación en la velocidad y naturaleza de la respuesta celular, aumento de la producción local de anticuerpos o neutralización de toxinas y metabolitos que producen daño celular (Rainard y Riollet, 2006). Según Ovidio et al. (2006), mencionan varias vías que permitirían aumentar la resistencia a las mastitis: a. Mediante la creación de animales transgénicos que sintetizan en leche proteínas antibacterianas, es posible plantear estrategias para producir y usar animales transgénicos resistentes a la mastitis se fundamentan en la variedad de sustancias antimicrobianas presentes en la glándula mamaria de los bovinos. b. Terapia génica local de la glándula mamaria utilizando vectores adenovirales que contengan un gen que codifique para una proteína antibacteriana. Mediante estas dos tecnologías las células epiteliales mamarias sintetizarían enzimas antibacterianas, lo cual permitiría disminuir el uso de antibióticos. Así mismo, señalan que un tercio del total de antibióticos usados en los animales es para combatir la mastitis, lo que aumenta el riesgo de resistencia a los antibióticos por parte de las bacterias. Así que este tipo de biotecnologías por tratarse de la producción de proteínas, disminuirían los riesgos para el consumidor debido a que, a diferencia de los antibióticos estas enzimas una vez ingeridas en la leche se degradan durante el proceso digestivo atenuándose las reacciones alérgicas. Investigaciones tales como el aumento de la resistencia gracias a la codificación genética que estimula la producción de péptidos antibacterianos en la glándula mamaria, tuvieron lugar con investigadores en la Universidad de Vermont a finales de la década de los noventa y concluyen que el uso de transgénicos es posible para resolver problemas en la industria agrícola y pecuaria (Kerr y Wellnitz 2003; Donovan et al., 2005). Numerosos péptidos y proteínas antimicrobianos son producidos por microorganismos, plantas o animales que según su actividad van desde los que tienen un estrecho espectro como colicinas y lisostafinas hasta moléculas de mayor espectro con actividades no específicas como lisozimas y lactoperoxidasa. Unas y otras tienen ventajas y desventajas cuando se quiere elegir a una de ellas para la transgénesis (Rainard y Riollet, 2006). En el caso de la lisostafina, esta enzima posee un espectro específico anti-estafilococo. Es una endopeptidasa que hidroliza los enlaces pentaglicina en el péptidoglicano de la pared de Staphylococcus aureus produciendo la lisis celular. De forma natural la lisostafina la producen especies Coagulasa Negativa del género Staphylococcus como es el S. simulans. Se caracteriza por ser específica para S aureus, con poca actividad para otras especies del mismo género, no es tóxica y no afecta las células animales ni las proteínas de la leche. En 1990 se demostró que una concentración de 10 g de lisostafina son suficientes para prevenir mastitis en ratas en lactación y que su expresión genética puede estar orientada a un tejido en particular o a un estado fisiológico por la adición de sustancias promotoras o reguladoras, por ejemplo, la producción de Blactoglobulina que es una proteína que expresa la glándula mamaria (Wall et al, 2005). Los Marcadores Moleculares Entre los genes, marcadores QTL, SNPs, AFLP y micro-RNAs, diversas fuentes en la literatura mencionan que existen en la vaca 943 loci involucrados tanto en el desarrollo de la glándula mamaria, como en rasgos de producción y composición láctea, así como en la resistencia o suceptibilidad a la mastitis (Schwerin et al, 2003; Ogorevc et al, 2009). Un reto para los investigadores, ha sido identificar marcadores para genes de rasgos cuantitativos (QTL) que controlan la expresión de las variaciones fenotípicas en rasgos particulares (Ogorevc et al, 2009). Estos marcadores pueden ser de dos tipos: a. El primero corresponde a genes de rasgos estrechamente cercanos en un cromosoma, en la mayoría de los casos, los alelos que sirven de marcadores y son heredados juntos, se conocen como “marcadores ligados” y no permiten predecir un fenotipo sin asociar los alelos y los marcadores en un proceso que se llama fase, su estudio sólo puede llevarse a cabo en familias, con el inconveniente de sufrir por recombinación mutaciones en generaciones posteriores. b. El segundo tipo de marcador es un polimorfismo funcional, en un gen que controla la variación en un rasgo. Estos marcadores se denominan "marcadores directos". Una vez que se conoce el polimorfismo funcional, es posible predecir el efecto de alelos particulares en todos los animales de una población, sin tener primero que determinar la fase. Por lo tanto, "los marcadores directos" son más útiles que los “marcadores ligados” para la predicción de la variación fenotípica de los rasgos objetivo en una población. Estudios de mapeo de genes relacionados con datos de vacas lecheras escandinavas medias hermanas del mismo padre, demostraron una asociación de la incidencia de mastitis con QTL putativos en los cromosomas 3, 4, 14 y 27. En ese estudio se tomó en cuenta la puntuación de CCS como indicador de la incidencia de mastitis, encontrando correlaciones que oscilaban entre 0.37 y 0.97 (Rupp y Boichard, 2003). En la consideración de que el CCS es una medida de la respuesta inflamatoria que ocurre en la ubre posiblemente después de la invasión de un agente patógeno, por tanto puede no indicar necesariamente infección clínica o subclínica, sin embargo los CCS son registradas de forma regular en rebaños lecheros comerciales, mientras que la mastitis no lo es. Estas mediciones muestran una correlación que oscilan entre 0,37 y 0,97 (Klungland et al, 2001; Rupp y Boichard, 2003). En varios estudios de QTL los conteos de células somáticas se han utilizados como un indicador de mastitis, pero no se ha demostrado una relación directa entre el QTL para CCS y la resistencia y susceptibilidad a la mastitis (Rupp y Boichard, 2003). Genes de susceptibilidad y resistencia a enfermedades Cuando ocurren mutaciones que generan variaciones genéticas, alterando el riesgo de ocurrencia de una enfermedad infecciosa, se conocen como genes de susceptibilidad (Kerr y Wellnitz, 2003). Los genes de susceptibilidad / resistencia se ponen de manifiesto porque algunas de sus variantes: a. b. c. d. causan o predisponen el desarrollo de una enfermedad (alelo de susceptibilidad), presentan mayor incidencia en individuos emparentados, influencian la edad de ocurrencia y/o la progresión o ayudan a proteger contra la enfermedad (alelo protector). Diversos estudios han demostrado que las variaciones genéticas que afectan la susceptibilidad/resistencia pueden ocurrir tanto en regiones codificantes como no codificantes. Entre las primeras se encuentran, por ejemplo, los cambios en las regiones de reconocimiento de los antígenos (ARS), que pueden modificar la afinidad antígeno-anticuerpo. Entre las mutaciones en regiones no codificantes pueden mencionarse: a. b. las regiones involucradas en el corte y empalme de intrón y exón (splicing), las que pueden modificar la funcionalidad de la proteína madura, y las regiones promotoras implicadas en el control de la transcripción de los genes y que por lo tanto, pueden variar los niveles de expresión. El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) Aunque la resistencia genética es un rasgo multigénico, es decir, determinado por muchos genes, entre los cuales se encuentran los que codifican las moléculas que forman parte del sistema inmune, en rasgos bien definidos, tales como resistencia a la mastitis, es difícil la selección de genes candidatos que pueden controlar el rasgo, debido al gran número de patógenos diferentes y mecanismos fisiológicos que contribuyen a las variaciones observadas (Rainard y Riollet, 2006). Un locus posible candidato es el locus del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). En bovinos el CMH es conocido como antígeno leucocitario bovino (BoLA) ubicado en el cromosoma 23. Uno de estos marcadores es el gen DRB3, expresado en células del sistema inmune como macrófagos, células dendríticas y linfocitos B que procesan y presentan antígenos a los linfocitos T ayudadores, para desencadenar la respuesta inmune contra patógenos infecciosos. El gen DRB3 tiene un alto polimorfismo principalmente en el exón 2. De este exón, han sido identificados 121 alelos diferentes, algunos de los cuales han sido asociados con susceptibilidad a mastitis. La región CMH incluye genes que codifican para proteínas de superficie celular que participan en la unión de péptidos (por ejemplo, péptidos de patógenos) y que presentan correctamente a las células del sistema inmunitario para que una respuesta inmune apropiada de inicio. De esta manera el CMH es un buen locus candidato cuando se tiene en cuenta la variación en la respuesta inmune o de resistencia para desafiar a una enfermedad (Detilleux, 2001). Son varios genes CMH dentro del loci de CMH, estos codifican para subunidades de moléculas de la superficie celular Clase I y Clase II. Las moléculas de clase II son heterodímeros compuestos por una subunidad α y una β. El gen DRβ, tiene un número de diferentes alelos y es uno de los varios genes de CMH. Los diferentes alelos del gen MHC difieren en la parte activa de la molécula que está implicada en péptido de unión y la presentación. Una serie de estudios han demostrado la asociación entre los alelos en el MHC locus DRβ y el conteo de células somáticas (CCS). Esto sugiere que los alelos DRβ presentes en un individuo pueden asociarse con las diferencias en la susceptibilidad o resistencia a la mastitis. Como ejemplo, se ha reportado una correlación entre la ocurrencia de mastitis y el CCS, asociando el alelo DRB3.2*16 se asociaba con CCS elevado, mientras que el DRB3.2*24 se asociaba con CCS bajo. Otros autores encontraron asociación entre el alelo DRB3.2*16 y CSCS alto; mientras que en un análisis de la asociación entre los alelos del BoLA-DRB3 y el SCS como medida de mastitis en un rebaño canadiense de vacas Hosltein (n=835), se encontró asociación entre el alelo DRB3.2*16 con bajos CCS, y entre el alelo DRB3.2*23 con casos de mastitis severos (Detilleux, 2001; Rupp y Boichard, 2003). Estos hallazgos evidenciaron la utilidad de los alelos del DRB3 bovino como marcadores de la resistencia/susceptibilidad a mastitis. Las citoquinas Los genes de citoquinas se consideran genes candidatos importantes para investigar susceptibilidad/resistencia a enfermedades infecciosas, ya que en las especies estudiadas se han identificado polimorfismos nucleotídicos simples (SNPs) asociados a la susceptibilidad/resistencia. Estos altos niveles de polimorfismo han permitido el desarrollo de marcadores genéticos asociados a enfermedades infecciosas para ser utilizados en el control sanitario y erradicación de la mastitis (Rainard y Riollet, 2006). Numerosos estudios recientes reflejan el progreso durante las últimas dos décadas para desentrañar el sistema inmune de la glándula mamaria (GM) y su funcionamiento. En la década de los 80 se prestó considerable atención a la identificación y caracterización funcional de las poblaciones de leucocitos en la GM mediante análisis de citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales desarrollados para reconocer únicamente la superficie de las moléculas. Desde 1990, esta investigación se ha ampliado al estudio de las citoquinas y de su potencial papel en la patofisiología y el control de la mastitis (Rupp y Boichard, 2003; Rainard y Riollet, 2006). La disponibilidad del gen de la citoquina y de las secuencias proteicas llevaron al desarrollo de numerosas estrategias de identificación que incluyen los anticuerpos monoclonales, cebadores para PCR y cuantificación de proteínas. Además, se produjeron citoquinas recombinadas para explorar su posible capacidad inmunomoduladora y terapeútica para el control de la enfermedad (Wall et al, 2005; Rainard y Riollet, 2006). Consideraciones finales Para el control de la mastitis se han tratado de desarrollar diferentes estrategias, en el caso del desarrollo de las vacunas inmunomoduladoras no se han logrado reportado los resultados deseados, sin embargo en el estudio de los factores que intervienen en la inmunodepresión durante el periparto podrían mejorar las tasas de éxito de las estrategias inmunoterapeúticas (Rainard y Riollet, 2006). Otros factores estudiados son los hormonales, ya que a través de hormonas de estrés conocidas como reguladores cruzados de la función inmune (corticosteroides), se disminuyen el número total, la distribución y la función de los leucocitos en sangre, descienden las IgM en la secreción láctea e inhiben la producción de citoquinas. En cuanto al estrés oxidativo muchos autores lo asocian con una rápida diferenciación del parénquima secretor, el crecimiento intenso de la glándula mamaria y la instauración de la síntesis y secreción de leche acompañada por una mayor demanda de energía y un incremento de los requerimientos de oxígeno. Esta demanda de oxígeno aumenta la producción de reactivos derivados del oxígeno, denominados colectivamente cómo especies reactivas al oxígeno (ROS). La acumulación de excesivos ROS puede llevar a la condición denominada de estrés oxidativo que juega un papel decisivo en la mediación de las respuestas inflamatorias incontroladas y causa daño tisular (Rainard y Riollet, 2006). En el uso de los factores genéticos desde hace varias décadas se ha puesto especial atención a la identificación de los marcadores genéticos e inmunológicos para utilizarse en la selección basada en una mayor resistencia a la mastitis durante los periodos de mayor susceptibilidad a la enfermedad. La liberación de la secuencia del genoma de la vaca posibilitó el descubrimiento de nuevos marcadores y la creación de mapas de proximidad filogenética con otras especies (sintenia), ha sido importante el hallazgo reciente de miARN y los mecanismos epigenéticos que se asocian a resistencia/susceptibilidad de mastitis (Ogorevc et al, 2009). En México se requieren más grupos de investigación que interactúen para la identificación tanto de los mecanismos genéticos como epigenéticos en los diversos ecosistemas donde se desarrolla la ganadería, lo que permitirá influir en el manejo y control de esta enfermedad. Literatura consultada: Detilleux J. 2001. Genetic Improvement of Resistance to Infectious Diseases in Livestock. J. Dairy Sci. 84(E. Suppl.):E39-E46 Donovan David M, Kerr David E y Wall Robert J. 2005. Engineering Disease Resistant Cattle. Transgenic Research. Vol: 14:5, 563-567. Kerr D. E. y Wellnitz O. 2003. Mammary expression of new genes to combat mastitis. J Anim Sci. 2003, 81:38-47. Klungland H., Sabry A., Heringstad B., Olsen H.G., Gomez-Raya L., Vage D.I., Olsaker I., Odegard J., Klemetsdal G., Schulman N., Vilkki J., Ruane J., Aasland M., Ronningen K., Lien S. 2001. Quantitative trait loci affecting clinical mastitis and somatic cell count in dairy cattle. Mamm. Genome 12, 837–842. Ovidio CF., Rojas PP., Rodríguez Ll. 2006. New biotechnological approaches to treat mastitis. Agro-Ciencia 22(1): 49-58. Ogorevc J., Kunej T., Razpet A., Dovc P. 2009. Database of cattle candidate genes and genetic markers for milk production and mastitis. Animal Genetics. 40, 832–851. Pérez-Cabal M. A. , Yaici S. y Alenda R. 2008. Clinical mastitis in Spanish dairy cows: incidence and costs Spanish Journal of Agricultural Research 6(4), 615-622 Rainard P. y Riollet C. 2006. Innate immunity of the bovine mammary gland. Vet. Res. 37 369-400. Rupp R. y Boichard D. 2003. Genetics of resistance to mastitis in dairy cattle. Vet. Res. 34, 671–688. Schwerin M, Czernek-Schäfer D, Goldammer T, Kata SR, Womack JE, Pareek R, Pareek C, Walawski K, Brunner RM. 2003. Application of disease-associated differentially expressed genes--mining for functional candidate genes for mastitis resistance in cattle. Genet Sel Evol. 35 Suppl 1:S19-34. Sordillo L.M. y Streicher K.L. 2002. 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