Biotecnología y Genética Molecular

BIOTECNOLOGÍA Y
GENÉTICA MOLECULAR
Conceptos de biotecnología y genética molecular.
Importancia y beneficios de la biotecnología.
Genética y Tecnología del DNA recombinante: estrategias de
clonación. Enzimas de restricción: especificidad. Construcción de
moléculas de DNA recombinante. Vectores de clonación.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): fundamentos.
Organismos transgénicos: plantas transgénicas. Utilidad en
agricultura y ganadería. Animales transgénicos: transferencia,
transmisión y expresión de transgenes. Bioética y Bioseguridad.
BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA
MOLECULAR
La Biotecnología
Es la aplicación de técnicas aplicadas a la biología, mediante el uso de
organismos vivos, para la generación de bienes y servicios.
La biotecnología de avanzada apoya diversas disciplinas y técnicas
tales como:
Biología molecular (ingeniería genética o genética molecular)
Biología celular (microinyección de células, cultivo de tejidos,
clonación)
Embriología (fertilización in vitro y cultivos in vitro, animales
transgénicos)
Bioquímica (técnicas de microsecuenciación de proteínas y ácidos
nucleicos)
BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA MOLECULAR
La aplicación de técnicas de Biotecnología Vegetal ha
aportado métodos que hicieron posible extender la
capacidad vegetativa de muchas especies vegetales
de interés económico, permitiendo la propagación
rápida de clones de individuos selectos.
La micropropagación mediante el cultivo in vitro de
meristemas, yemas, etc. es el método biotecnológico
que mayores logros aportó al desarrollo de la
agricultura.
GENÉTICA MOLECULAR
oLa genética molecular estudia todo lo relacionado
con la manipulación del ADN y del ARN.
oManipulación del ADN
recombinante
tecnología del ADN
oUno de los objetivos de la tecnología del ADN
recombinante es aislar segmentos de ADN
específicos e introducirlos en un genoma más
pequeño denominado vector.
Herramientas utilizadas en la manipulación del ADN
Enzimas de restricción (tijeras moleculares)
ADN ligasas
Vectores de clonación: plásmidos, virus (fagos)
cósmidos
Otros
Enzimas de restricción
Enzimas capaces de degradar el ADN extraño (1970 en
bacterias)
Son endonucleasas
Función: reconocer y cortar ADN extraño, en secuencias
específicas de nucleótidos llamadas
reconocimiento (palíndromes).
secuencias
de
Deben su nombre -palíndromes- a que se leen de la misma
manera en un sentido y en otro de cada cadena del ADN.
Ej: 5´ A C G T 3´
3´ T G C A 5’
Enzimas de restricción
Cada una de las enzimas toma el nombre de la bacteria de la cual ha
sido aislada. Ej.: Eco RI es la primera enzima de restricción
identificada en Escherischia coli.
Las enzimas de restricción actúan como tijeras moleculares. Se
conocen más de 100 distintas y cada una corta en una secuencia
específica a cada hebra de ADN.
Pueden cortar en el mismo lugar de las dos cadenas o pueden hacerlo
en posiciones distintas, en el primer caso generan extremos romos y
en el segundo extremos cohesivos, pegajosos o escalonado, así
pueden unirse a otros trozos que sean complementarios.
Enzimas de restricción
Enzima
Bacteria
Tipo de extremo
Eco RI
Escherichia coli
cohesivos
Bam HI
Bacillus amyloquefaciens
cohesivos
Hae III
Haemophilus aegyptius
romos
Kpn I
Klebsiella pneumoniae
cohesivos
Sma I
Serratia marcenscens
romos
ADN Ligasas
Las ADN ligasas son enzimas cuya función es regenerar las uniones de
las moléculas de ADN, generando el rADN
Enzimas de restricción
Vectores de Clonación
Vectores: plásmidos, virus, fagos, cósmidos, capaces de mover genes
de un organismo a otro
El uso de fragmentos de ADN con vectores cumple un rol fundamental
en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material
genético de un organismo a otro.
Un plásmido vector es una molécula de ADN circular de doble cadena
que contiene un sector con un origen de replicación del ADN y un
marcador selectivo, por ej., un gen que codifica para resistencia a un
antibiótico. Los plásmidos vectores contienen a menudo genes
marcadores adicionales que identifican un segmento llamado “inserto”.
Vectores
Los plásmidos se introducen en la célula bacteriana.
Hay plásmidos (ej. pBR322) que son portadores de genes
con resistencia a antibióticos y poseen un sitio de clonaje
de manera que al introducir el ADN extraño se interrumpe
el gen y solo queda como resistente a uno de los
antibióticos que luego permite identificar la bacteria que
lleva el inserto o ADN extraño.
Los plásmidos al replicarse, también replican el ADN
clonado (permite clonar 10 – 12 pares de bases ¨pb¨).
Marcadores moleculares
Tipos de Marcadores
Los marcadores moleculares son aquellos sectores que
permiten identificar una secuencia de interés.
Pueden ser:
•Directos o sea dentro del gen (intragénicos)
•Indirectos usando a otro gen o marcador cercano en el
cromosoma para poder identificar diferencias entre
individuos
Manipulación del ADN
El ADN motivo de estudio, puede ser cualquier
ADN animal o vegetal o un genoma bacteriano
completo, se digiere con enzimas de restricción
para obtener pequeños fragmentos de ADN con
extremos cohesivos.
Por otro lado, el plásmido vector se corta con
enzimas de restricción en un lugar de clonado
específico y único.
Se ponen en contacto el ADN extraño y el vector y
se agrega ADN ligasa que une los extremos
pegajosos de ambos segmentos. Esta nueva
molécula es el rDNA.
Manipulación del ADN
Las moléculas de rDNA se introducen en la bacteria huésped y se
multiplican independientemente del cromosoma bacteriano.
Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula
multiplicada a partir de una única bacteria que da origen a una colonia,
esta técnica se denomina clonación.
Se identifica y selecciona el clon celular que lleva la molécula de rDNA.
Como los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al
exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el
plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán.
La bacteria con su rDNA recombinante se transfiere a un vegetal.
Por último, se debe detectar si se produjo o no la recombinación.
CLONACIÓN
El término clon proviene de la jardinería; desde
hace siglos los jardineros generan plantas nuevas
a partir de gajos. Estas plantas son genéticamente
idénticas y constituyen un clon. Por lo que se
define a un clon como un grupo de células u
organismos genéticamente idénticas.
La clonación molecular se hace utilizando células
hospedadoras, bacterias normalmente.
realizar la clonación se utilizan vectores.
Para
CLONACIÓN
CLONACIÓN
Oveja Dolly
Se tomó una célula de la glándula mamaria de una
oveja Doeset (raza finlandesa) de seis años y se
colocó el material genético de esa célula en un
huevo vaciado (sin núcleo) de una oveja escocesa
Blackface. Aplicaron una suave corriente eléctrica
La nueva célula dio origen a un embrión que fue
implantado en el útero de la oveja. Varios meses
después, dio a luz a un animal idéntico a sí misma.
La clonación de esa oveja abrió un debate sobre la
ética de este tipo de experimentos, sobre todo por
el temor a que se pueda utilizar en humanos.
Lo realmente novedoso fue que se había logrado
clonar a un animal desde una célula adulta ya
diferenciada. Esta noticia sugería que el núcleo de
una célula ya diferenciada era aún totipotente.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Método fue desarrollado por K. Mullis en 1983, se
extendió rápidamente tanto en investigación básica
como en diagnóstico clínico.
Esta técnica permite multiplicar in vitro fragmentos de
ADN sin necesidad de recurrir a vectores y su replicación
en bacterias.
Se puede amplificar pequeñas cantidades de ADN miles
de veces. El fragmento a multiplicar puede tener desde
50 hasta más de 2000 nucleótidos de longitud. Se basa,
en su forma más simple, en reacciones sucesivas a
distinta temperatura, y estas reacciones se repiten entre
20 y 40 veces.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
oSe calienta la muestra hasta lograr la
separación de las dos cadenas de ADN
“desnaturalización” a 95 C.
oSe incorporan los primers, o iniciadores.
oSe disminuye la temperatura a 50 – 60 C
(apareamiento
de
la
cadena
de
oligonucleótidos con la hebra del ADN molde)
oLa ADN polimerasa extiende los primers, a
70 ,
se
sintetizan
las
secuencias
complementarias de hebra molde.
oSe agrega a la solución los nucléotidos
(dexosiribonucleósidos trifosfatos).
Reacción en Cadena de la Polimerasa
o La temperatura está limitada a la temperatura en la cual trabaja la
ADN polimerasa. La más utilizada es la bacteria Thermus aquaticus Taq polimerasa, actúa eficientemente entre los 75 y 80°.
o El resultado de la amplificación de numerosos ciclos da lugar a la
amplificación geométrica del segmento del ADN.
o Cada ciclo dura unos 5 minutos, y para una amplificación útil se
necesita 20 ciclos. Actualmente se hacen de manera automática.
o La PCR tiene varias aplicaciones: en criminología sirve para
obtener copias de la muestra de ADN de los sospechosos (huella
genética), pruebas de paternidad, y recuperación de ADNs de
especies extinguidas o a punto de extinguirse.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Los fragmentos de ADN amplificados pueden ser analizados de
diferente forma:
Visualización del fragmento de ADN en un gel de agarosa, por
electroforesis, proceso mediante el cual se produce la separación
por difusión bajo la acción de un campo eléctrico.
Hibridación
con una sonda marcada radioactivamente, cuya
secuencia de bases complementarias está contenida en el
fragmento de interés.
Colocar directamente el ADN en forma de pequeñas manchas (dot
blot) para su posterior hibridación con la sonda. La localización de la
sonda radioactiva se logra mediante autoradiografías.
Utilidad
Es un instrumento valioso en la determinación de lazos de parentesco o
en pruebas de paternidad.
Detección de individuos portadores de un gen recesivo o de interés.
Test de paternidad.
También sirve en el diagnóstico de enfermedades
En el desarrollo de vacunas
En el estudio de especies extinguidas
En la determinación del sexo en embriones, identificación de embriones
potencialmente transgénicos,investigación de mutaciones en embriones
Clonación de genes de secuencia desconocida,
Variaciones génicas en poblaciones.
Organismos transgénicos
Organismos transgénicos.
Son especies cuyo genoma ha sido alterado por la transferencia de
genes, es decir que posee genes extraños integrados en su patrimonio
genético.
Debido a su importancia genética, en vegetales se ha utilizado la técnica
del rADN en la obtención de mejores variedades.
Animales transgénicos
El primer caso se conoció cuando en 1982 dos investigadores en EEUU
obtuvieron ratones de entre dos y tres veces mayores a lo normal.
Habían transferido por microinyección el gen de la hormona de
crecimiento a células huevo de ratón y luego implantaron estas células
en oviductos de hembras capaces de llevar a cabo la gestación.
Para la obtención de los animales transgénicos, los principales
procedimientos son: la microinyección y la utilización de virus como
vectores.
Microinyección
Consiste en inyectar el gen de interés a uno de los pronúcleos
procedentes de las células sexuales masculinas o femeninas. Así,
se obtuvieron los ratones transgénicos. De cada 100 embriones
manipulados, se obtienen 1 a 5 ratones transgénicos, este valor
disminuye en mamíferos.
Este procedimiento se ha usado para obtener la primera cerda
transgénica que
terapeútico.
produce
una
proteína
humana
de
interés
La leche de “Genie” produce la proteína C que controla la
coagulación de la sangre.
Al año de vida, cuando la cerda llegó a su madurez, se comprobó
que la cerda producía la proteína humana en su leche.
MICROINYECCIÓN
oSe construyó un fragmento de ADN con una
copia del gen humano de interés y una
secuencia promotora.
oEl promotor procedía del gen que codifica la
proteína de la leche del ratón.
oSe
Se recogieron los embriones de una cerda
donante y se seleccionaron los huevos
fecundados, estos se inyectaron con el ADN
extraño usando una micro pipeta de cristal. El
ADN se inyectó en la región del pro núcleo
macho y el ADN extraño se incorporó en uno
de los cromosomas del cerdo.
oLas células fecundadas se implantaron en
una cerda madre “de alquiler” y se obtuvo la
lechona portadora del ADN extraño en todas
sus células.
Utilidad de los anímales transgénicos
Sirven para suministrar información sobre la función del gen y la
regulación de su expresión, es decir su traducción en proteína.
El gen insertado puede determinar la síntesis de una sustancia
útil que se puede extraer, en especial de la leche (proteínas),
cuando se trata de un mamífero.
Mejora en la producción animal.
Por transferencia de genes humanos a los cerdos, se intenta
conseguir que los órganos de este animal se pueden utilizar para
ser transplantados al hombre.
Todavía es insuficiente el conocimiento de los genes que sería
interesante transferir para alcanzar estos objetivos.
Utilidad de los anímales transgénicos
Científicos del INTA Balcarce y
de la Univ. de San Martín
obtuvieron una vaca transgénica
capaz
de
producir
leche
maternizada. En edad adulta su
leche contendrá dos proteínas
importantes para los humanos,
la lisozima y la lactoferrina. La
lisozima
tiene
propiedades
antibacterianas que los bebés
necesitan
y
normalmente
absorben al mamar de pecho de
su mamá y la lactoferrina que
está
involucrada
en
la
incorporación del hierro a los
glóbulos rojos, necesario para la
correcta oxigenación de la
sangre.
Utilidad de los anímales transgénicos
Revista Nuestro Holando
La genómica está tomando cada vez
más importancia en la selección
genética del ganado lechero. Esto se
debe, entre otras cosas, a la cantidad de
información que aporta y a la posibilidad
de acortar el intervalo generacional.
Desde hace más de 50 años, se
comenzó a utilizar el semen bovino
congelado, empleando en las vacas de
los mejores rodeos del mundo, los toros
más destacados de la raza, mejorando
así la capacidad productiva de las vacas
lecheras en forma sorprendente. En los
últimos tiempos se pide a la industria
seleccionar además por otros rasgos
ligados a calidad y fortaleza de las
ubres, disposición de patas y pezuñas,
capacidad corporal, etc.
Utilidad de los anímales transgénicos
Estos gatos han sido modificados genéticamente con la
inserción de un gen que codifica para una proteína
PROTEINA FLUORESCENTE VERDE (GFP). El gen de
la GFP, que tiene su origen en las medusas, es decir que
se ha logrado insertar la proteína de medusa en un gato
y esta se expresa normalmente cuando es iluminado con
ciertas frecuencias de luz.
Esta GFP fue el descubrimiento por el cual se otorgó a 3
científicos el premio nobel de química en 2008. Esta
proteína se usa para evaluar si un gen insertado se está
expresando o para evaluar la extensión de tejidos
tumorales, entre otras aplicaciones.
En el caso de los gatos que brillan intensamente, los
científicos esperan poder utilizar a los animales
modificados genéticamente en el estudio del VIH /
SIDA.
Esta técnica no produce otros efectos en la salud del
gatito