Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base

Informe final de proyecto
Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base
de la cadena alimentaria
Centro: NEIKER
Participantes:
Ana Hurtado (ahurtado@neiker.net)
Jon I. Esteban, Beatriz Oporto
Gorka Aduriz, Ramón A. Juste.
Entidades participantes:
ELIKA - Fundación Vasca para la Seguridad Agroalimentaria
Diputaciones Forales
Año 2006
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Prevalencia y caracterización de patógenos bacterianos en la base de la
cadena alimentaria
1.- Introducción
La Comisión Europea en su Libro Blanco sobre Seguridad Alimentaria recomienda
que los estados miembros asuman una serie de actuaciones dirigidas
fundamentalmente a controlar la presencia de ciertos microorganismos con
implicaciones en salud pública a lo largo de toda la cadena alimentaria, para poder
garantizar así una buena higiene de los alimentos. Las especies animales destinadas al
consumo humano pueden constituir un importante reservorio de distintos
microorganismos que hoy día se consideran patógenos emergentes, como Salmonella
spp., Campylobacter spp., Listeria spp., y determinados tipos de E. coli. Además, en
ocasiones también pueden padecer cuadros clínicos de mayor o menor gravedad
causados por estos agentes, con las consiguientes pérdidas económicas y el
menoscabo del bienestar animal. En consecuencia, dada la importancia que la
presencia de estos patógenos en las explotaciones ganaderas, base de la cadena
alimentaria, puede tener de cara al consumidor por un lado, y al bienestar animal por
otro, se plantean los siguientes objetivos concretos:
1.- Establecer la prevalencia de Salmonella sp., Campylobacter sp., E. coli
O157:H7 y no-O157, y Listeria monocytogenes, en explotaciones ganaderas de
bovino lechero y cárnico, ovino, porcino y aves de la Comunidad Autónoma del País
Vasco.
2.- Caracterizar las cepas aisladas mediante técnicas moleculares que sirvan tanto
para identificar genes asociados a patogenicidad y virulencia como para realizar un
trazado epidemiológico de posibles brotes de infección.
Los resultados obtenidos servirán para conocer las condiciones sanitarias de nuestra
cabaña y, desde el punto de vista de la Salud Pública, para reducir el riesgo potencial
de infecciones alimentarias por estos patógenos.
2.- Métodos de aislamiento y detección
Se han evaluado diversas metodologías de aislamiento y detección utilizando técnicas
de bacteriología clásicas, técnicas de detección inmunoenzimática e inmunomagnética,
pruebas bioquímicas y serológicas, y brevemente estas son las metodologías adoptadas:
• Salmonella spp.: Se ha puesto a punto una técnica para la detección de Salmonella
spp. en heces animales que combina la detección inmunoenzimática (VIDAS) con
técnicas bacteriológicas clásicas, obteniéndose un límite de detección de 3UFC / 25
g heces bovinas. Brevemente, la técnica incluye un pre-enriquecimiento de la
muestra en medio líquido no selectivo, tras el cual se inocula en los medios de
enriquecimiento selectivo Rappaport-Vassiliadis soja (RVS) y Tetrationato de
Muller-Kauffmann con novobiocina (MKTTn) y posteriormente se procede a la
detección inmunoenzimática. Paralelamente, el cultivo obtenido del preenriquecimiento se inocula también en el medio semisólido selectivo MSRV. Las
muestras positivas por VIDAS y/o MSRV se inoculan en dos medios sólidos
selectivos en los que tras su incubación se comprueba la presencia de colonias que
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por sus características pueden ser consideradas como pertenecientes al género
Salmonella. que se confirman mediante pruebas bioquímicas y serológicas.
• Listeria monocytogenes: Se ha puesto a punto la técnica de detección
inmunoenzimática (VIDAS) para la detección de L. monocytogenes en heces
animales con un límite de detección de 2UFC / 25 g heces bovinas. Tras un preenriquecimiento de la muestra en medio líquido selectivo, se inocula en un medio
de enriquecimiento selectivo y se procede a la detección inmunoenzimática
(VIDAS). Las muestras positivas por VIDAS se inoculan en un medio sólido
selectivo en el que tras su incubación se comprueba la presencia de colonias que por
sus características pueden ser consideradas como posibles L. monocytogenes, las
cuales se confirman mediante pruebas bioquímicas y serológicas, y si fuese
necesario por PCR.
• Escherichia coli: Para la determinación de la presencia de E. coli O157:H7 se
puso a punto inicialmente la técnica VIDAS de detección inmunoenzimática, sin
embargo posteriormente se demostró una mayor sensibilidad utilizando un sistema
de detección inmunomagnética. Así, se demostró que la técnica de detección
inmunomagnética para E. coli O157 (Dynabeads anti-E. coli O157) en heces
animales proporcionaba una sensibilidad de 100 bacterias E. coli O157 en 106 o más
microorganismos de flora acompañante por ml de muestra. De esta manera, tras un
pre-enriquecimiento de la muestra en medio líquido selectivo, se procede a la
separación inmunomagnética, seguida de la siembra de los complejos de las
Dynabeads-bacteria en dos medios sólidos selectivos y posterior lectura de las
placas. A partir de colonias sospechosas de ser E. coli O157:H7, se realizan
subcultivos para su posterior confirmación por PCR. Para la detección de E. coli
verotoxigénicos (VTEC), se aplica la técnica de PCR descrita más adelante sobre
las colonias obtenidas a partir de la siembra del pre-enriquecimiento selectivo en
Agar McConkey.
• Campylobacter spp.: La técnica VIDAS demostró ser poco específica para
Campylobacter por lo que para la determinación de la presencia de Campylobacter
spp. en heces animales se ha puesto a punto un procedimiento basado en el uso de
técnicas bacteriológicas clásicas con medios selectivos. Tras un enriquecimiento de
la muestra en medio líquido selectivo se inocula en un medio selectivo sólido, se
incuba en microaerofilia y se comprueba la presencia de colonias que por sus
características puedan ser consideradas como posibles Campylobacter spp. Estas se
subcultivan para su posterior confirmación e identificación de especie por PCR.
3.- Métodos de caracterización
- Se han puesto a punto las técnicas de tipado serológico por aglutinación con antisueros
comerciales para L. monocytogenes, y para los 5 principales serotipos de Salmonella
enterica subsp. enterica con implicación en infecciones humanas: S. Enteritidis, S.
Typhimurium, S. Hadar, S. Infantis y S. Virchow.
- Se han puesto a punto diversas técnicas de PCR para la detección de cepas de E. coli
verotoxigénicos y la confirmación de aislados sospechosos de E. coli O157:H7, la
identificación de las especies C. jejuni y C. coli entre los aislados identificados como
Campylobacter spp., la identificación de L. monocytogenes y la identificación de los
tipos multiresistentes DT104/U302 de Salmonella.
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• Salmonella spp.: Se han desarrollado una PCR múltiple que nos permiten
confirmar la pertenencia del aislado al género Salmonella, y determinar si se trata
de tipos multiresistentes DT104/U302. Para la confirmación del género Salmonella
se amplifica un fragmento del gen invA presente en todas las especies del género y
necesario para la invasión celular; y, para las cepas multiresistentes DT104/U302
del serovar Typhimurium se amplifica un fragmento de 162 bp.
• Listeria monocytogenes: En el caso de Listeria nuestro interés es identificar la
especie patógena L. monocytogenes para lo cual hemos utilizado los cebadores
especie-específicos que amplifican un fragmento del gen que codifica para una
proteína asociada a la invasión (iap).
• Escherichia coli: Para el estudio y caracterización de las cepas de E. coli
verotoxigénicas se han adaptado dos PCRs múltiples que nos permiten identificar el
serotipo O157:H7, y determinar la presencia/ausencia de los genes que codifican
para los principales factores de virulencia de E. coli verotoxigénico: las toxinas
Shiga stx1 y stx2, la intimina codificada por el gen eaeA responsable de la adhesión
de la bacteria a los eritrocitos, y la enterohemolisina A codificada por el gen
plasmídico hlyA.
• Campylobacter spp.: Se han puesto a punto dos PCRs, una genérica para la
confirmación de la pertenencia del aislado al género Campylobacter mediante la
amplificación con cebadores género-específicos del gen 16S rRNA, y otra múltiple
para la detección simultanea y específica de las especies C. jejuni y C. coli. Así
mismo se han puesto a punto las técnicas de tipado molecular (PFGE y RFLPs) para
la caracterización de aislados.
4.- Establecer la prevalencia de los principales patógenos causantes
de infecciones alimentarias: Salmonella sp., Campylobacter sp., E. coli
verotoxigénicos y Listeria monocytogenes en explotaciones ganaderas
de la CAPV
El estudio de prevalencia ha sido diseñado en dos etapas:
4.1 detección de explotaciones positivas (prevalencia de explotaciones positivas)
4.2 prevalencia de animales excretores (prevalencia individual).
4.1. Estudio de prevalencia de EXPLOTACIONES POSITIVAS
Se ha calculado el promedio de explotaciones a investigar para cada especie animal para
que se detecte al menos un animal positivo. Para ello se ha tenido en cuenta el censo de
cada una de las especies animales objeto de estudio (vacuno de carne, vacuno de leche,
ovino, porcino y aves), la prevalencia esperada para cada uno de los patógenos, y la
precisión requerida. Así, se ha establecido tomar muestras de heces de hasta 30
animales por explotación que serán analizadas en una única mezcla o pool y hasta un
total de 371 explotaciones (82 de vacuno de leche. 124 de vacuno de carne, 122 de
ovino, 17 de porcino y 26 aves).
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En el caso de las aves (pollos de carne) se muestrearon todas las naves de cada
explotación (entre 1 y 3 naves por explotación), tomando dos pooles de heces de al
menos 150 gramos en cada nave, obtenidos mediante la recogida de heces frescas de 30
puntos por pool. Cada uno de los dos pooles se ha analizado por separado,
considerándose positiva la nave cuando al menos uno de ellos es positivo.
Los resultados de prevalencia de explotaciones positivas analizadas en pooles de heces
para cada uno de los patógenos según se ha indicado fueron las siguientes:
Salmonella spp.
Salmonella spp. se aisló en todos los sistemas de producción analizados con una
prevalencias de explotaciones positivas del 2.4% en vacuno de carne, 5.7% en ovino y
6.1% en vacuno de leche. Salmonella se aisló en una única explotación de porcino
(5.8% de las explotaciones). De igual manera sólo una manada de una explotación de
pollos fue positiva, lo que representa el 2.9% de las explotaciones analizadas.
En 6 de las explotaciones positivas se identificaron 3 de los serotipos más
frecuentemente asociados con infecciones en humanos, en concreto S. Typhimurium se
aisló en 3 explotaciones: 1 de ovino, una de vacuno de leche (3 aislados) y una de
vacuno de carne (2 aislados), S. Enteritidis en una explotación de vacuno de carne y en
la única explotación positiva de pollos y S. Virchow en una explotación de vacuno
leche. Otros serotipos detectas fueron Diarizonae, Derby, Newport, Agona y Rissen,
entre otros.
L. monocytogenes
La prevalencia de L. monocytogenes fue relativamente alta. En vacuno de leche fue
donde mayor porcentaje de positividad se encontró (46.3%), seguida del vacuno de
carne (30.6%) y ovino (14.2%). Todas las explotaciones de ganado porcino fueron
negativas. En las explotaciones de aves L. monocytogenes fue el segundo patógeno en
prevalencia (9/34 explotaciones; 16/60 manadas), aunque dada su ubicuidad en el medio
ambiente no se puede descartar la contaminación cruzada de las heces que se recogieron
del suelo.
Los resultados preliminares de serotipado de una pequeña selección de aislados de L.
monocytogenes han identificado al complejo 4b como el serotipo predominante.
Campylobacter termofílicos
La carne de pollo contaminada es considerada la principal fuente de infección para el
hombre, aunque se desconoce el grado de implicación de otros reservorios animales. Por
ello, en este proyecto se estudiaron, por un lado, 60 naves pertenecientes a 34
explotaciones de pollos de carne de cría al aire libre (“free range”) del País Vasco, y por
otro, 343 explotaciones de rumiantes y porcino.
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En el estudio de las aves se encontró una prevalencia del 70.6% de explotaciones
positivas (76.7% de las naves). Las especies identificadas fueron C. jejuni y C. coli,
pero C. coli se aisló con más frecuencia que C. jejuni (15 vs. 13 explotaciones),
detectándose ambas especies en 3 de las explotaciones.
En las explotaciones del segundo estudio se detectó la presencia de alguna especie
termofílica de Campylobacter en 203 de las 343 explotaciones analizadas (67.1% de
vacuno de leche, 58.9% de vacuno de carne, 55.0% de ovino, 52.9% de porcino). El
análisis por PCR identificó C. jejuni en el 20.7% de las explotaciones y C. coli en el
6.4%. C. coli se aisló en los cuatro sistemas de producción y fue la especie más
prevalente en explotaciones porcinas, en las que sin embargo no se encontró C. jejuni.
Además, en los cuatro tipos de explotaciones se aislaron con alta prevalencia otras
especies termofílicas de Campylobacter pendientes de identificar a nivel de especie
(17.6% de las explotaciones de porcino, 18.3% de las de ovino, 36.3% de las de vacuno
de carne y 48.8% de las de leche). Los resultados demuestran que el ganado porcino,
vacuno y ovino sano constituye un importante reservorio de distintas especies de
Campylobacter. Por todo ello es importante implementar buenas prácticas de manejo en
explotaciones de rumiantes y porcino, así como seguir investigando la implicación de
las especies termofílicas distintas a C. jejuni y C. coli en infecciones humanas.
E. coli verotoxigénicos (VTEC)
Para determinar la prevalencia de E. coli O157:H7 se utilizaron las técnicas de
detección inmunoenzimática VIDAS y de separación inmunoenzimática (E. coli O157
Dynabeads, IMS) y PCR (genes rfbE y fliC), mientras que la prevalencia de ECVT noO157 se evaluó por PCR de los genes stx a partir de 10 colonias lactosa positivas
aisladas en MacConkey tras un enriquecimiento. Ambos métodos de inmunodetección
(VIDAS e IMS) mostraron un nivel de concordancia moderado-bueno (Kappa=0.649)
pero el IMS mostró una sensibilidad complementaria del 87.5%. Así, la prevalencia de
explotaciones positivas a E. coli O157:H7 estimada fue de 8.7% en ovino, 7.0% en
vacuno de leche y 1.6% en vacuno de carne; todas las explotaciones de ganado porcino
y de aves fueron negativas. En lo que respecta a VTEC no-O157, tampoco se aislaron
en las explotaciones de porcino ni de aves, y la prevalencia observada en explotaciones
ovinas fue del 50.8%, y algo inferior en vacuno (20.7% en vacuno de leche y 46.0% en
vacuno de carne).
4.2. Estudio de prevalencia INDIVIDUAL en explotaciones positivas
En una segunda fase se seleccionaron entre 7 y 11 explotaciones positivas a cada uno de
los cuatro patógenos para determinar la prevalencia a nivel individual dentro de dichas
explotaciones. Para ello se tomó muestra de aproximadamente 50 animales dentro de las
explotaciones seleccionadas y se analizaron de manera individual. En el caso de
explotaciones de aves no se realizó un muestreo individual puesto que se consideró la
nave la unidad analítica, de manera que los resultados de pooles se considerarían así
mismo resultados individuales.
Salmonella spp.: Se analizaron 4 explotaciones de ovino (200 animales) obteniéndose
algún animal positivo en 3 de ellas, con valores de prevalencia individual de 6.0, 10.0 y
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14.0% y una media de prevalencia individual de excretores del 7.0%. En ninguna de
ellas se identificó ninguno de los 5 serotipos más patógenos para el hombre, a pesar de
que en una de ellas se había aislado S. Typhimurium en la muestra de pool. Se
analizaron 5 explotaciones de vacuno de leche (239 animales) obteniéndose algún
animal positivo en 3 de ellas, con valores de prevalencia individual de 6.0, 10.0 y
54.7%, y una media de prevalecia individual del 15.4%. Los 5 casos detectados en la
segunda explotación (10% prevalencia individual) se identificaron como pertenecientes
al serotipo Typhimurium. En la única explotación de porcino positiva se determinó una
prevalencia individual del 12.5% cuando se analizaron de manera individual 48
animales.
L. monocytogenes: Se determinó la prevalencia individual analizándose un total de 418
animales procedentes de 9 explotaciones (4 de ovino, 4 de vacuno de leche y 1 de
vacuno de carne). En ovino se obtuvieron prevalencias de 2.0 y 4.2% en 2 de ellas,
mientras que en las otras 2 no se aisló L. monocytogenes de ninguno de los animales
analizado de forma individual, resultando una media de prevalencia individual del 1.5%.
En vacuno los valores oscilaron entre 5.1 y 10.9%, incrementándose hasta el 72.3% en
una explotación de vacuno de leche, con una media de prevalencia individual del 24.1%
en vacuno de leche y 7.7% en vacuno de carne.
E. coli O157:H7: Las prevalencias individuales de excretores de E. coli O157:H7
establecida tras el análisis de 279 ovejas (6 rebaños) y 30 vacas de carne (un rebaño) fue
del 7.3 y 6.7% respectivamente.
Campylobacter spp.: Para el estudio de prevalencia individual se seleccionaron 11
rebaños positivos (2 de vacuno de carne, 2 de vacuno de leche, 4 de ovino y 3 de
porcino) de entre los cuales se analizaron de manera individual un total de 493
animales. La prevalencia de animales excretores fue significativamente más alta entre el
ganado vacuno de leche (66.7%) y porcino (57.8%) que en ovino (8.8%) o vacuno de
carne (5.4%). Mientras que en vacuno de leche en el 60% de los casos se identificó C.
jejuni, los aislados obtenidos en vacuno de carne fueron siempre distintos a C. jejuni y
C. coli. En las 3 explotaciones de porcino se observaron unas prevalencias individuales
de 16.0, 62.5 y 91.8%, identificándose C. coli en el 70% de los animales positivos. En
las 4 explotaciones de ovino analizadas se obtuvieron prevalencias individuales entre
2.0 y 18.2%, debido a C. jejuni en más de la mitad de los casos.
Aunque en general el muestreo realizado para el estudio de prevalencias individuales
nos permitió cumplir los objetivos previstos, su desarrolló se vio limitado por las
siguientes circunstancias. En primer lugar, las bajas prevalencias de explotaciones
positivas obtenidas para Salmonella y E. coli O157:H7 redujo mucho las posibilidades
de selección de explotaciones para la fase de estudio individual. Sin embargo, esta es
una “limitación” frente a la cual no se puede hacer nada y por tanto los muestreos para
esos dos patógenos fueron en ese sentido buenos. Sin embargo, una limitación
importante fue el largo periodo de tiempo transcurrido entre la detección de positividad
en pooles y la obtención de la muestra individual, que en el 46% de los casos superó los
seis meses, llegando a alcanzar en algún caso el año. Aunque el hecho de que en el
muestreo individual no se detecte ningún positivo puede deberse a circunstancias varias,
tales como la eliminación intermitente del microorganismo en las heces, la
estacionalidad o la no selección de los animales excretantes entre los muestreados, este
largo lapso de tiempo entre ambos muestreos podría estar asociado a algunos casos de
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negatividad individual. Así mismo, aunque se solicitó el muestreo de 50 animales por
explotación, en el 19% de los casos no alcanzó los 40 animales, aunque cabe destacar
que se trataba principalmente de ganado vacuno con rebaños quizás de pocos
individuos.
5.- Caracterización bioquímica y tipado molecular de los aislados
obtenidos según se describe en el apdo. 4
Caracterización bioquímica y serológica. Los resultados correspondientes de la
identificación y caracterización fenotípica por técnicas bioquímicas y serológicas
aparecen reflejados en el apartado anterior.
Caracterización molecular de aislados de Campylobacter mediante análisis en la
longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) y electroforesis en campo
pulsado (PFGE)
Todos los aislados de C. jejuni y C. coli obtenidos del estudio de Prevalencia individual
y al menos un 50% de los obtenidos a partir de los pooles del estudio de Prevalencia de
explotaciones positivas se han tipado mediante digestión del producto de PCR del gen
flaA con el enzima de restricción DdeI. Así, se analizó un total de 90 aislados de C.
jejuni (28 de ovino, 15 de vacuno de carne y 47 de vacuno de leche) y 78 C. coli (6 de
ovino, 66 porcino, 3 de vacuno de carne y 3 de vacuno de leche) procedentes de 54
explotaciones. En total, se obtuvieron 46 patrones diferentes, 24 para C. jejuni, 17 para
C. coli, y 5 patrones compartidas por ambas especies de Campylobacter. El 50% de los
aislados de C. jejuni se agrupaban en 5 patrones y 45% de los de C. coli se agrupaban
en 3 patrones. El patrón más común era compartido por 20 aislados procedentes de 5
explotaciones diferentes (1 de porcino, 1 de vacuno de carne y 3 de vacuno de leche), y
se identificó tanto en C. jejuni (16 aislados) como en C. coli (4 aislados). Otro patrón
muy común fue el encontrado en una explotación de ovino y 3 de porcino que incluía 1
aislado de C. jejuni y 15 de C. coli. El patrón de más amplia distribución en relación a
su presencia en un mayor número de explotaciones fue aquel encontrado en 8
explotaciones (7 de ovino y 1 de vacuno de leche) y representado por 8 aislados de C.
jejuni. La mayor diversidad entre muestras individuales dentro de una misma
explotación se encontró en una granja de porcino en la que se identificaron 13 patrones
distintos entre los 28 aislados de C. coli obtenidos.
En lo que respecta a los aislados procedentes de pollos se han analizado 88 aislados
(entre uno y dos por nave positiva), 33 de C. jejuni y 55 de C. coli. Entre los aislados de
C. jejuni se identificaron 14 patrones distintos, 4 detectados también en aislados ovinos,
otros 4 encontrados en vacuno, y 3 presentes tanto en ovino como en vacuno. Entre los
aislados de C. coli se obtuvieron 10 patrones distintos, de los cuales solo 4 habían sido
encontrados en los otros hospedadores (1 en ovino, 1 en vacuno, 1 en porcino y otro en
vacuno y porcino). La explotación con mayor diversidad fue una con las tres naves
positivas, y en la que se detectaron 3 patrones distintos entre los 5 aislados de C. jejuni
y otro para el único aislado de C. coli. El patrón de C. coli más común se identificó en 5
explotaciones distintas (además de otras 4 explotaciones ovinas), mientras que los
patrones de C. jejuni encontrados aparecieron como máximo en 3 explotaciones
distintas.
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Aunque ninguno de los patrones fue encontrado en las cuatro especies animales (ovino,
vacuno, porcino y aves), 5 patrones se encontraron en tres especies. Así, 4 patrones
aparecieron en aislados ovinos, bovinos y de pollos, y 1 en bovino, porcino y pollos. Por
el contrario, 17 de los patrones estaban representados por un único aislado (3 de ovino,
7 de vacuno, 4 de porcino y 3 de pollos).
Una pequeña selección de aislados con patrones comunes flaA PCR-RFLP se han
analizado por PFGE utilizando la enzima de restricción SmaI, confirmándose la gran
diversidad genética de los aislados obtenidos.
Para la caracterización de los aislados de Salmonella, y paralelamente al serotipado, se
han puesto también a punto técnicas de PCR para la identificación del serovar
Enteritidis mediante la amplificación del gen que codifica para el antígeno de la fimbria
SEF14, y para la identificación del serovar Typhimurium se aprovecha la presencia
específica de la secuencia IS200 en la región intergénica fliB-fliA.
Determinación mediante PCR múltiple de la presencia y distribución de los genes que
codifican para los principales factores de virulencia
Todos los aislados de VTEC obtenidos se caracterizaron por PCR de los genes stx1, stx2,
eaeA y E-hlyA para determinar la distribución de estos genes asociados a la virulencia.
En total se analizaron 49 aislados de E. coli O157:H7 y 209 de VTEC no-O157. Todos
los aislados de E. coli O157:H7 fueron positivos al gen stx2, el gen eaeA se detectó en el
95.9% de ellos y E-hlyA en el 77.6%, de manera que el 75.5% presentaron el perfil
toxigénico stx2/eaeA/E-hlyA. Entre los VTEC no-O157 la prevalencia del gen eaeA fue
significativamente más baja (5.3%) y E-hlyA se detectó en el 50.2% de los aislados
aunque sólo esporádicamente asociado a la presencia de eaeA. Entre los genes stx, stx2
fue predominante en aislados VTEC no-O157 de origen vacuno, mientras que en ovino
predominó la combinación stx1/stx2.
Realizar un trazado epidemiológico de posibles brotes de infección mediante el análisis
de los patrones moleculares obtenidos.
La identificación por PCR y/o aglutinación de los serotipos a los que pertenecían los
aislados de Salmonella ha permitido comprobar la permanencia o no del serotipo
aislado en la fase inicial del estudio de Prevalencia de explotaciones positivas en la fase
posterior del estudio de Prevalencia individual realizado al cabo de entre 1 y 6 meses.
Así, en 5 de las 7 explotaciones analizadas de forma individual se volvió a aislar el
mismo serotipo, lo que sugiere que se ha mantenido dentro del rebaño. Por el contrario,
en las dos explotaciones restantes en el segundo muestreo se detectó un serotipo
distinto, lo cual podría indicar una nueva fuente de infección. Sin embargo, puesto que
tanto los 30 animales muestreados en la primera fase para formar el pool como los 50
analizados individualmente la segunda fueron elegidos al azar y podrían no coincidir.
Cabe destacar que en estos dos casos el periodo transcurrido entre ambos muestreos fue
de 1 y 5 meses respectivamente. Para la detección de la presencia de VTEC en las heces
animales se realizaron PCRs en pooles de 10 colonias que en caso de ser positivas se
analizaron individualmente. De esta manera se pudo detectar la presencia de aislados
distintos, es decir, con distintas combinaciones de factores de virulencia (stx1, stx2,
eaeA, hlyA) dentro de 14 explotaciones ovinas (22.6% de las explotaciones positivas),
21 de vacuno de carne (36.8%) y 3 de vacuno de leche (15.6%). De igual manera, la
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caracterización molecular de los aislados de C. jejuni y C. coli detectó una alta
diversidad genética, tanto en los aislados procedentes del estudio de Prevalencia de
explotaciones positivas y por tanto sin ninguna relación epidemiológica, como entre los
aislados procedentes del estudio de Prevalencia individual. Además permitió detectar la
presencia de patrones compartidos entre animales de distinta especie (4 patrones
aparecieron en aislados ovinos, bovinos y de pollos, y 1 en bovino, porcino y pollos).
6.- Conclusiones
Este proyecto ha permitido desarrollar métodos analíticos para el estudio de cuatro de
los principales patógenos bacterianos de importancia en seguridad alimentaria:
Salmonella spp., L. monocytogenes, E. coli verotoxigénicos y Campylobacter
termofílicos. Con los resultados obtenidos en este proyecto se han podido establecer las
metodologías más adecuadas para el aislamiento de estos patógenos a partir de muestras
de heces animales. Así, los métodos propuestos serían los siguientes: la utilización de la
técnica de detección inmunoenzimática VIDAS para L. monocytogenes; el uso
combinado de VIDAS y el cultivo en paralelo en el medio semisólido selectivo
MSRV para la detección de Salmonella spp.; la detección inmunomagnética para E. coli
O157 y la PCR directa sobre las colonias obtenidas a partir de la siembra del preenriquecimiento selectivo en Agar McConkey para detectar cepas VTEC; y el uso de
técnicas bacteriológicas clásicas con medios selectivos para Campylobacter
termofílicos. Los métodos moleculares en base a la PCR desarrollados en este proyecto
permiten la detección de cepas de E. coli verotoxigénicos y la confirmación de aislados
sospechosos de E. coli O157:H7, la identificación de las especies C. jejuni y C. coli
entre los aislados identificados como Campylobacter spp., la identificación de L.
monocytogenes y la identificación de Salmonella spp. y de los tipos multirresistentes
DT104/U302. Utilizando estas herramientas se ha llevado a cabo el primer estudio a
gran escala para la determinación de la prevalencia de estos cuatro patógenos en las
explotaciones del País Vasco, observándose valores similares a los detectados en países
europeos con un estatus sanitario avanzado.
Las prevalencias de Salmonella en torno al 4.5% en heces ovinas, porcinas y de vacuno
son las esperables, aunque cabe destacar que se han identificado tres de los serotipos
más importantes en infección humana (Typhimurium, Enteritidis y Virchow) lo que
indica que aunque la prevalencia de Salmonella spp. sea baja, la proporción de casos en
que se trata de un serotipo patógeno para el hombre es relativamente alta. Por lo que en
el caso de que se produjese contaminación de la canal y ésta llegase infectada al
consumidor, el riesgo para la salud humana podría ser importante. En pollos sin
embargo la prevalencia encontrada es menor de la esperada, una única explotación en la
que se aisló el serotipo Enteritidis. Esto podría ser debido que al tratarse de
explotaciones de producción al aire libre en la que los animales están sometidos a menor
stress que en los sistemas de producción industrial en los que se suelen registrar mayor
prevalencia de infección.
Los valores de prevalencia observados para L. monocytogenes aunque elevados, en
particular en el caso del ganado vacuno, son los esperables dada la ubicuidad de este
organismo. Llama la atención sin embargo no haber aislado ninguna L. monocytogenes
en las muestras porcinas, aunque en cualquier caso el numero de explotaciones
analizadas no ha sido muy elevado.
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Puesto que se asocia con infecciones graves como el síndrome urémico hemorrágico, la
mayoría de los estudios sobre E. coli se centran en el serotipo O157:H7, y es por ello
también que muchas de las técnicas disponibles son específicas para el aislamiento de
este serotipo. Sin embargo, otras cepas VTEC pueden causar infecciones igualmente
graves y como ha demostrado este estudio, se encuentran con mucha mayor prevalencia
que O157:H7 en rumiantes. Este estudio ha permitido desarrollar y aplicar metodologías
para el estudio de E. coli vertoxigénicos demostrando que en general el ovino representa
un mayor riesgo potencial, puesto que tanto la prevalencia de cepas O157:H7 como de
otros serotipos VTEC y la presencia de cepas eaeA positivas fue mayor que en vacuno.
Dentro del vacuno, el de producción lechera parece estar infectado con mayor
prevalencia, aunque tal vez el riesgo relativo podría ser menor puesto que la leche se
somete a tratamientos térmicos que destruyen al microorganismo.
De los cuatro patógenos estudiados fue para Campylobacter para el que se encontró una
mayor proporción de explotaciones positivas. Sin embargo, de nuevo, los valores
obtenidos no se diferencian mucho de los que se describen en otros países de nuestro
entorno. Como era de esperar las prevalencias más altas se encontraron en las
explotaciones de aves, aunque la especie más frecuentemente identificada fue C. coli,
seguida de cerca por C. jejuni y en tres explotaciones se detectó la presencia simultanea
de ambas especies. La carne de aves es considerada la principal fuente de infección
humana por C. jejuni y C. coli, sin embargo, los resultados obtenidos demuestran que
rumiantes y porcino son también importantes reservorios. Concretamente, el ganado
porcino sería fuente de infección por C. coli, la especie aislada con más frecuencia (no
se detectó C. jejuni), mientras que ovino y vacuno supondrían mayor riesgo de infección
por C. jejuni. Además de estas dos especies, se aislaron otros Campylobacter
termofílicos con prevalencias más altas de las esperadas. Especies como C. lari, C.
upsaliensis o C. hyointestinalis han sido también relacionadas con algún caso de diarrea
en el hombre, por lo que la identificación de estos aislados a nivel de especie sería
interesante con objeto de evaluar el papel de rumiantes y cerdos como reservorio de
estas otras infecciones. Por ello, estos al igual que un importante número de otros
aislados se conservan en el laboratorio para posteriores estudios. La caracterización
molecular de los aislados de C. jejuni y C. coli detectó una alta diversidad genética. En
lo que se refiere a los aislados procedentes del estudio de Prevalencia de explotaciones
positivas es lógico encontrar patrones diversos, puesto que en general se trata de
explotaciones sin ninguna relación epidemiológica. En el caso de los aislados
procedentes del estudio de Prevalencia individual resulta interesante comprobar que
también se detecta una variabilidad importante. Un ejemplo que llama especialmente la
atención es el de una explotación de cerdos en la que se identificaron 13 patrones
distintos entre los aislados procedentes de 28 animales. Esto sugiere la existencia de
diversas fuentes de infección, frente a la posibilidad de que se trate de transmisión de la
misma cepa entre los animales del rebaño. El solapamiento de los patrones entre
animales de distinta especie (4 patrones aparecieron en aislados ovinos, bovinos y de
pollos, y 1 en bovino, porcino y pollos) indicaría que ciertas cepas están adaptadas a
distintos hospedadores y sugiere un posible fuente de infección común.
Los diferentes sistemas de manejo podrían explicar las diferencias de prevalencia
encontradas en los distintos sistemas de producción. A diferencia de lo que ocurre en las
explotaciones de vacuno de leche que se mantienen estabulados durante la mayor parte
del tiempo, las ovejas y el ganado vacuno de carne pasan largas temporadas en pastos de
montaña. Las posibilidades de reinfección a partir de las heces de animales infectados
son mayores en condiciones de estabulación. Aunque habría que tener en cuenta otros
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factores como la estacionalidad, la edad o la dieta, las diferencias en los sistemas de
manejo podrían explicar la menor prevalencia de los cuatro patógenos encontrada en
vacuno de carne con respecto al vacuno de leche.
En conclusión, se puede afirmar que este estudio ha logrado los objetivos previstos. En
primer lugar, ha permitido desarrollar métodos analíticos para el estudio de cuatro de los
principales patógenos bacterianos de importancia en seguridad alimentaria: Salmonella
spp., L. monocytogenes, E. coli verotoxigénicos y Campylobacter termofílicos.
Utilizando estas herramientas se ha llevado a cabo el primer estudio a gran escala para
la determinación de la prevalencia y caracterización molecular de estos patógenos en las
explotaciones del País Vasco, observándose valores similares a los detectados en países
europeos con un estatus sanitario avanzado. El estudio ha permitido reunir una
importante colección de cepas de campo que se podrá utilizar en posteriores estudios
destinados a profundizar más en el conocimiento de estos cuatro patógenos. En
definitiva, este estudio de prevalencia supone un primer paso para identificar posibles
causas de infección en el primer eslabón de la cadena alimentaria (explotaciones
ganaderas), a partir del cual poder desarrollar estrategias de vigilancia epidemiológica y
control que permitan prevenir futuras infecciones alimentarias en el hombre.
7.-Información científica generada
Publicaciones Científicas Internacionales
-
BEATRIZ OPORTO, JON I. ESTEBAN, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Prevalence and strain diversity of thermophilic
campylobacters in cattle, sheep and swine farms. Journal of Applied
Microbiology, en prensa.
-
BEATRIZ OPORTO, JON I. ESTEBAN, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Escherichia coli O157:H7 and non-O157 Shiga
toxin-producing E. coli (STEC) in healthy cattle, sheep and swine herds in
Northern Spain. Zoonoses and Public Health, en revision.
-
JON I. ESTEBAN, BEATRIZ OPORTO, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. A survey for food-borne pathogens in free-range
poultry farms. En evaluación.
-
JON I. ESTEBAN, BEATRIZ OPORTO, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Faecal prevalence of Listeria monocytogenes and
Salmonella spp. in healthy cattle, sheep and swine herds in Northern Spain. En
preparación.
Publicaciones Científicas Nacionales
González, Fernando; Urarte, Eduardo; Garcia, Esther; Aduriz, Gorka; Moreno,
Bernardino; Esteban, Jon Imanol; Hurtado, Ana; Echeita, Aurora; Orive, José Ramón
(2004) “Salmonella. Transmisión vertical en un brote familiar”. Boletín de Salud
Publica del GV.
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Comunicaciones a Congresos, Reuniones, Simposios
-
URARTE, EDUARDO; ADURIZ, GORKA; GONZALEZ, FERNANDO;
MORENO, BERNARDINO; ESTEBAN, JON IMANOL; HURTADO, ANA;
GARCÍA, ESTHER; ECHEITA AURORA; ORIVE, JOSE RAMON.
“Salmonelosis familiar y transmisión vertical desde sus propias gallinas”. XIV
Congreso de Microbiología de los Alimentos, Girona 19-22 Septiembre 2004.
-
JON I. ESTEBAN, BEATRIZ OPORTO, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. “Prevalence and characterisation of food-borne
bacterial pathogens on farms in the Basque Country (Northern Spain)”. Food
Pathogen Epidemiology: Microbes, Maladies and Methods (EU-RAIN), Padua,
Italia, 2-3 Diciembre 2004.
-
ADURIZ, GORKA; HURTADO, ANA. Programas de prevención de zoonosis
en la CAPV con especial atención a Listeria, Salmonella, Campylobacter y E.
coli VT. X Congreso Internacional de ANEMBE. Donostia (Gipuzkoa), 13-14 de
Mayo 2005.
-
JON I. ESTEBAN, BEATRIZ OPORTO, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. First on-farm prevalence study on food-borne
bacterial pathogens in the Basque Country (Northern Spain). Med-Vet-Net
General Scientific Meeting, 3-6 Mayo 2006, Qawra, Malta.
-
BEATRIZ OPORTO, JON I. ESTEBAN, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Occurrence and strain diversity of thermophilic
campylobacters in swine, cattle and sheep farms in the Basque Country. MedVet-Net General Scientific Meeting, 3-6 Mayo 2006, Qawra, Malta.
-
JON I. ESTEBAN, BEATRIZ OPORTO, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Prevalencia de Salmonella spp., E. coli
verotoxigenicos (ECVT), Listeria monocytogenes y Campylobacter spp. en
explotaciones de pollos “free range” del País Vasco. XXI Congreso Nacional de
Microbiología, Sevilla 17-20 Septiembre 2007.
-
BEATRIZ OPORTO, JON I. ESTEBAN, GORKA ADURIZ, RAMÓN A.
JUSTE, ANA HURTADO. Escherichia coli O157:H7 y otros E. coli
verotoxigénicos (ECVT) en rebaños de ganado vacuno, ovino y porcino del País
Vasco. XXI Congreso Nacional de Microbiología, Sevilla 17-20 Septiembre
2007.
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