Rev Hematol Mex 2006 Vol 7 No 2 - Agrupación Mexicana para el

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Citometría de flujo en el diagnóstico y clasificación
de padecimientos hematológicos: leucemias agudas,
síndromes linfoproliferativos crónicos y glicoproteínas
plaquetarias.
Q.F.B. Josefa Piedras
Departamento de Hematología y Oncologia. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán, México, D.F., México.
INTRODUCCIÓN.
La citometría de flujo (CF) es la
medición de las propiedades de las células
que se encuentran suspendidas en un
fluido y que interrumpen un haz de luz láser.
El método permite el análisis cualitativo
y cuantitativo de diferentes propiedades
como tamaño, estructura y contenido
(análisis multiparámetro), de poblaciones
celulares en líquidos corporales, así como
de cualquier partícula tan pequeña como 0.1
µm. La dispersión de la luz fue usada como
un indicador de la presencia de una célula, y
el reporte Coons y Kaplan de la conjugación
de la fluoresceina a los anticuerpos constituyó
un descubrimiento importante que permitió
la identificación de antígenos tisulares por
anticuerpos específicos usando fluorescencia
(1). Desde la primera generación de los
citómetros de flujo en 1980 ha habido grandes
avances, y los citómetros actuales combinan
una mezcla de tecnologías modernas tales
como: mecánica de fluidos, rayos láser,
óptica, electrónica análoga y digital y computer
software. Hoy en día con los citómetros de
flujo se pueden evaluar de 4 a 8 parámetros,
los que usualmente incluyen mediciones
de tamaño y granularidad junto con 4 a 8
colores de fluorescencia; cuando miden 8
parámetros es posible resolver hasta 64
poblaciones distintas de células con valores
positivos o negativos para cada parámetro
(2). Algunos citómetros de flujo pueden
separar físicamente las células basado en
diferencias de cualquier parámetro medible, y
los instrumentos del futuro también permitirán
medir microbios y organelos celulares. Una
de las áreas más beneficiadas en CF con el
análisis multiparamétrico de las células es
precisamente la hemato-oncología médica.
INMUNOFENOTIPO.
En mayo del 2005 se llevó a cabo en
la Ciudad de Querétaro, México, la segunda
Conferencia de Consenso Latinoamericano
para la inmunofenotipificación de
padecimientos hematológicos malignos
(3), cuyo objetivo fue el de actualizar las
recomendaciones emanadas de la Primera
Conferencia de Consenso (4). Se estableció
la utilidad clínica del inmunofenotipo para
la clasificación, pronóstico y seguimiento
Solicitud de reimpresos: Q.F.B. Josefa Piedras-Ross. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas
y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan 14000, México, D.F., México.
Tel.: 54 870 900 Ext. 2704
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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J Piedras
de los pacientes con leucemia aguda
(LA), y para el diagnóstico, clasificación,
pronóstico y seguimiento de los pacientes
con padecimientos linfoproliferativos crónicos
(PLPC).
Preparación de la muestra. Se
recomendó, para la mayoría de los casos,
el empleo de muestra total de sangre o de
médula ósea sometida a lisis de eritrocitos y
fijación, y la separación celular por gradiente
de densidad sólo en aquellas muestras
contaminadas con células necróticas
estromales o grasas. También se recomendó
reducir el número de células teñidas con el
objeto de disminuir el volumen de anticuerpo
monoclonal utilizado, siempre y cuando la
reducción sea validada experimentalmente.
Paneles de anticuerpos monoclonales. Mediante el inmunofenotipo se pueden
clasificar cuatro tipos de leucemias: a) leucemia aguda linfoblástica de estirpe T (LAL-T),
b) leucemia aguda linfoblástica de precursores de células B (LAL-B), c) leucemia aguda
mieloblástica (LAM) y d) leucemia aguda
bifenotípica (LAB).
La combinación de los marcadores
CD2, CD7 y CD3 citoplásmico se consideró
la más apropiada para definir a la LALT, requiriendo la co-expresión de CD3
citoplásmico con cuando menos uno de
los otros dos antígenos. Para establecer el
grado de madurez se recomendó investigar
la expresión de CD34, TdT y la intensidad
de expresión del CD45. No se consideró de
relevancia clínica una sub-clasificación de la
LAL-T.
Para la clasificación de la LAL-B,
además de la combinación de anticuerpos
anotada en el cuadro 1 se decidió, por
utilidad terapéutica y clínica, adoptar la
sub-clasificación del EGIL (European Group
of Immunophenotyping of Leukemias) en:
Pro-B (B-I), Común (B-II), Pre-B (B-III) y LAL
de células B maduras (B-IV) empleando los
anticuerpos anotados en el cuadro 1.
Al igual que para la LAL-B, para la
identificación de la LAM se consideró el uso
de tres diferentes categorías de anticuerpos
esenciales, junto con un cuarto grupo opcional
(cuadro 2) (figura 1).
Cuadro 1
Panel de anticuerpos para la inmunofenotipificación de la leucemia aguda
linfoblástica de precursor de células B.
Linaje*
CD19
CD79a (citoplásmico)
Madurez
Sub-clasificación
Opcional**
HLA-DR
CD10
CD20
TdT
Ig superficie
CD38
CD34
Cadenas µ citoplásmicas
CD45
*Ambos marcadores CD19 y CD79a deben estar presentes.
** La inclusión de CD20 y CD38 se consideró como informativa para la búsqueda de anormalidades
genéticas comunes en la LAL-B.
Cuadro 2
Panel de anticuerpos para la inmunofenotipificación de la leucemia aguda mieloide.
Linaje*
Madurez
Sub-clasificación
Opcional
MPO (citoplásmica)
HLA-DR
CD15
CD36
CD13
CD34
CD64
CD33
CD45
CD117
* Los blastos deben expresar dos (si MPO+) o más (si MPO-) marcadores mieloides.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.
Figura 1.- Paciente con leucemia mielomonocítica. Por expresión de CD45 se identifican dos poblaciones de
blastos: la verde (mieloide) con expresión intensa de CD117, CD34, CD13, CD33 y expresión débil de CD15;
la azul (monocítica) con expresión intensa de CD64/CD14, CD11b, CD13 y expresión débil de CD34.
La leucemia bifenotípica debe
expresar antígenos de dos o más de los
linajes mencionados. Los marcadores más
específicos para cada estirpe son: CD3 para
células T, CD19 y CD79b para células B y
mieloperoxidasa para células mieloides.
Inmunofenotipo y alteraciones
cromosómicas. En años recientes se ha
demostrado la presencia, en las leucemias
agudas, de correlación entre algunos de los
patrones de expresión de antígenos asociados
a la leucemia y traslocaciones genéticas (5,
6)(cuadro 3). Estas observaciones, junto con
la producción de nuevos anticuerpos que
reconocen proteínas de fusión, o proteínas
expresadas en células portadoras de una
traslocación específica, le han dado mayor
valor al inmunofenotipo en la clasificación y
pronóstico de las leucemias.
PADECIMIENTOS
LINFOPROLIFERATIVOS CRÓNICOS.
En la segunda Conferencia de
Consenso Latinoamericano para la
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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J Piedras
Cuadro 3
Correlación entre características fenotípicas y alteraciones cromosómicas
Alteración cromo- Fenotipo
sómica
t(1;14)(p32;q11)
LAL-T. CD1-,CD2+
CD4-CD7+ y CD10-
Oncogen
Frecuencia
TAL1/TCR
20%
t(1;19)(q23;p13)
LAL pre B. TdT+CD9+C19+
CD22+HLA-DR+ CD10 débil
y Ag mieloides asociados,
ausencia de CD20 y CD34
E2A/PBX1
25% niños
3% adultos
t(8;14)(q24;q32)
t(8;14)(q24;q11)
t(2;8) )(p12;q24)
LAL de células B maduras.
100% de todas las LAL-L3
C-MYC/IgK 5% de
todas las
LAL
t(9;22)(q34;q11.2)
TdT+CD10+CD34+CD38 débil,
con Ag mieloides asociados
BCR/ABL
5% niños
1 0 - 3 0 %
adultos
t(4;11)(q2;q23)
CD19+CD24 débil,CD10-CD20Ag mieloides CD15 ó CD65w+
AF4/MLL
>10% de las
LAL
t(12;21)(p13;q22)
CD10 intenso CD20, CD45 y CD135 débi- TEL/AML-1 >20%
de
les. CD34 débil y heterogéneo.
las LAL de
precursor de
células-B
t(15;17)(q22;q12)
LAM. CD34- ó débil, HLA-DR- ó débil, CD13 PML/RAR
+ heterogéneo CD33++ y CD15- ó débil
5 a 10% de
todas
las
LAM
t(8;21)(q22;q22)
LAM. CD34+CD19+HLA-DR+, CD13 y AML1/ETO
CD33 débiles. Pueden expresar el CD56
5 a 12% de
todas
las
LAM
Inv(16)(p13;q22) ó
t(16:16)(p13;q22)
LAMMEo. CD33+CD13+. Los mileloablas- CBF/MYH1 5 a 10% de
tos son MPO+. Los monoblastos son: CD4,
todas
las
CD11b, CD11c, CD14, CD36 y CD64. CD2,
LAM
CD7 con menor frecuencia.
inmunofenotipificación de padecimientos
hematológicos malignos (3), para la
inmunofenotipificación de los padecimientos
linfoproliferativos crónicos (PLPC) se acordó
el algoritmo del cuadro 4, en el que, el primer
paso permite definir el linaje, el segundo la
clasificación y el tercero la confirmación de
la clonalidad de las células T.
Factores pronósticos de la leucemia
linfocítica crónica. La leucemia linfocítica
crónica de células B (LLC-B) (figura 2) es un
padecimiento heterogéneo, caracterizado
por un curso clínico variable. Algunos
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
pacientes tienen una enfermedad agresiva
requiriendo terapia temprana, mientras que
otros pacientes muestran una enfermedad
indolente, más estable, que no se beneficia
con quimioterapia paliativa. Los sistemas
de clasificaciones de Rai y col. y Binet y
col. permiten predecir la supervivencia y los
requerimientos de tratamiento, pero no tienen
la capacidad de distinguir prospectivamente
pacientes en etapa temprana que progresarán
rápidamente a enfermedad agresiva, de
aquellos destinados a permanecer en etapa
temprana por mucho tiempo.
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Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.
Cuadro 4
Algoritmo para la inmunofenotipificación de padecimientos linfoproliferativos malignos.
Primer paso
Segundo paso
Búsqueda de linaje
Confirmación/clasificación
CD4
CD8
CD3*
CD19
CD56*
Cadenas ligeras κ
Cadenas ligeras λ
Si se sospecha un PLPC
de linaje de células T
CD7
RCT αβ
RCTγδ
(∗) Los anticuerpos CD3 y CD56
se deben
mezclar en el mismo tubo
Tercer paso
Confirmación de clonalidad:
Repertorio Vβ
Rearreglos del RCT
Si se sospecha un LLC-B/LLCP
CD5
CD22
CD23
FMC7
Si se sospecha un LF/LCM/LB de células
B
CD10
CD38
Bcl-2
Si se sospecha LCP/LZM:
C11c
CD103
CD25
Si se sospecha un PLPC de células NK:
CD16
CD57
LLC = leucemia linfocítica crónica; LLCP = linfoma linfocítico de células pequeñas; LF = linfoma folicular; LCM
= linfoma de células del manto; LB = linfoma de Burkitt; LCP = leucemia de células peludas; LZM = linfoma de
zona marginal.
Figura 2.- Paciente con leucemia linfocítica crónica B. El inmunofenotipo de los linfocitos (a) mostra
co-expresión de CD19/CD5 (b), CD23+ y ausencia de expresión de FMC7 (c). Restricción de cadenas
lambda (e) y expresión de CD38 (f) en los linfocitos CD19+ (d).
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
58
J Piedras
En 1999 dos grupos de investigadores
(7, 8) demostraron que los pacientes con un
inmunofenotipo de células de memoria con
genes de inmunoglobulinas (IgVH) mutados,
tenían un desenlace mucho más favorable
y una baja probabilidad de desarrollar
enfermedad progresiva, mientras que
aquellos con genes IgVH no mutados, tenían
mayor probabilidad de desarrollar enfermedad
progresiva y de tener una supervivencia más
corta. Sin embargo, el análisis de la mutación
de gen IgVH se basa en la secuenciación de
ADN, técnicamente difícil y no disponible
para uso clínico rutinario, por lo que, la
identificación de marcadores apropiados
subrogados para el estado mutacional ha
Figura 3.- Citograma en escala logarítmica de la dispersión frontal (FS) y lateral (SS) de plaquetas
de un paciente con síndrome de Bernard Soulier (a). El fenotipo plaquetario muestra la co-expresión
intensa de CD61 y CD41a (b) y la ausencia de expresión de CD42a (c, histograma en negro) y CD42b
(c, histograma en verde). Paciente con trombastenia de Glanzmann (d, e). Las plaquetas muestran
ausencia total de expresión de CD61 y CD41a (d) y expresión normal de CD42a (e, histograma en
negro) y CD42b (e, histograma en rosa).
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.
atraído la atención de muchos investigadores
(9). Aún cuando hay una tendencia para que
las anormalidades cariotípicas adversas se
presenten principalmente en los pacientes
con IgVH no mutado, la asociación no es
absoluta y el estado mutacional del gen de
la inmunoglobulina y el cariotipo son factores
pronósticos independientes (10).
En estudios con microarreglos de DNA
(11) se demostró que las células con el gen
IgVH no mutado se podían distinguir de
aquellas con el gen mutado por la expresión
diferencial de un pequeño número de genes,
uno de los cuales codifica para la proteína
zeta-asociada de 70 kDa (ZAP-70). La
ZAP-70 es una molécula de señalización
clave para linfocitos T y NK y aún cuando
no se expresa en linfocitos B normales se
asocia con incremento en la señalización
intracelular del receptor de las Igs en las
células de LLC-B. Tomando en cuenta las
publicaciones recientes, el ZAP-70 es el
marcador subrogado más promisorio para el
estado de mutación del IgVH (12).
El CD38 es una proteína membranal que
marca la activación y maduración celular y
tiene actividad de señalización. La expresión
de CD38 en células de LLC-B se asocia
con un pronóstico global de la enfermedad
menos favorable y en los estudios iniciales
se consideró como un marcador subrogado
para los dos subgrupos importantes de la
LLC-B : IgVH mutado y no mutado (8). Sin
embargo, después de la publicación de un
buen número de trabajos, se ha podido
demostrar claramente que aún cuando la
expresión de CD38 tiene cierto grado de
correlación con el estado de mutación del
IgVH, ambos parámetros se consideran
variables pronósticas independientes en
LLC-B (13, 14). La información pronóstica
dada por la expresión de ZAP-70 y CD38 es
complementaria. Bakke y col. (15) y Gibbs
G y col. (16) demostraron que el método
citofluorográfico para identificar células
ZAP-70 en LLC no está completamente
estandarizado entre los diferentes
laboratorios.
En el trabajo de Bakke y col. (15)
se analizó la expresión de ZAP-70 en
células de LLC empleando 4 diferentes
anticuerpos comerciales; con uno de ellos los
porcentajes de expresión de ZAP-70 fueron
consistentemente elevados, mientras que con
los otros tres anticuerpos se obtuvo una amplia
oscilación de porcentajes de expresión de
ZAP-70 en las células tumorales, mostrando
además una pobre correlación entre todos. En
este estudio se concluyó que las estrategias
analíticas previas no eran reproducibles, y se
propone una relación métrica, con la cual se
obtuvieron mejores correlaciones.
Gibbs y col. (16) compararon la medición
de la expresión de ZAP-70 en LLC empleando
dos anticuerpos diferentes y dos métodos
de tinción. Con el anticuerpo de Caltag y el
reactivo de permeabilización de Fix and Perm
se obtuvo 91% de concordancia entre la
expresión de ZAP-70 y el estado de mutación
del gen IgVH. Al igual que otros autores no
hubo correlación entre la expresión de CD38
ni con ZAP-70 ni con el estado de IGVH. Los
autores consideran que la expresión de ZAP70 empleando la combinación anticuerpo
Caltag/Fix and Perm podría ser introducida
en el panel de inmunonofenotipificación de
LLC-B.
IDENTIFICACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS
PLAQUETARIAS.
El estudio de pacientes con alteraciones
genéticas de la función plaquetaria ha hecho
posible entender la relación crítica estructurafunción que determina la función normal de la
plaqueta (17). La CF, empleando la dispersión
de la luz y los marcadores inmunológicos,
permite la identificación inequívoca de
las plaquetas en sangre o en mezclas
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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J Piedras
complejas. Mediante la CF se puede aislar
electrónicamente a las plaquetas de la sangre
total o del plasma rico en plaquetas, evitando la
manipulación y en consecuencia la activación
de las mismas. Esta metodología ha permitido
identificar partículas en la sangre que son
fácilmente confundidas con plaquetas, como
fragmentos de eritrocitos o de leucocitos,
complejos inmunes y microorganismos. La
heterogeneidad en el tamaño de las plaquetas
(de 1 µm a 4 ó 5 µm) excede al de cualquier
otra célula hematológica, similar en tamaño a
una bacteria y más grande que los complejos
inmunes (18). En la preparación de plaquetas
para análisis citofluorométrico es necesario
adicionar EDTA al diluyente para evitar
agregación de las plaquetas.
Una aplicación directa de la CF en la
evaluación clínica de las plaquetas es la
cuantificación de las principales glicoproteínas
de superficie de las mismas. El fenotipo
plaquetario se ha usado para definir varios
síndromes genéticos, resultantes de la
expresión anormal de receptores de superficie,
entre otras la trombastenia de Glanzmann y
el síndrome de Bernard Soulier.
La trombastenia de Glanzmann es
una enfermedad autosómica recesiva,
caracterizada por alteración en la agregación
plaquetaria con ausencia de respuesta a los
agonistas necesarios para que el fibrinógeno
se una y forma microagregados. Se
caracteriza por una anormalidad cualitativa y
cuantitativa del complejo glicoproteíco IIb/IIIa
en la membrana plaquetaria (19). Existen en el
mercado diferentes anticuerpos monoclonales
que se pueden usar con CF para demostrar
el grado de deficiencia del complejo GP IIb/
IIIa (CD41a y CD61, respectivamente) en la
superficie de la plaqueta. La principal ventaja
de usar la CF como prueba confirmatoria
del diagnóstico es que los estudios a los
miembros de la familia permiten establecer
la severidad del defecto en el caso índice y
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
el grado de herocigocidad en los familiares.
Además con la CF se puede determinar en los
heterocigotos si la expresión de GPIIb/IIIa se
encuentra uniformemente distribuida en todas
las plaquetas, o si tienen una subpoblación
de plaquetas con ausencia completa de la
glicoproteína.
En el síndrome de Bernard Soulier la
anormalidad morfológica más consistente es
la presencia de plaquetas gigantes (>10 um),
aparentemente como resultado de activación
in vitro de las mismas. En agregometría el
único hallazgo anormal es la respuesta de
las plaquetas Bernard-Soulier a trombina
o a ristocetina más factor WV. En este
síndrome la CF en sangre total permite
el análisis de plaquetas sin necesidad de
realizar el procedimiento técnicamente
difícil de separar físicamente las plaquetas
gigantes, de eritrocitos y de leucocitos de
tamaño similar. La anormalidad bioquímica
de las plaquetas en esta trombastenia, es
la ausencia del complejo glicoproteico1b/
IX/V en la membrana de la plaqueta y del
megacariocito (20). La GPIX (CD42a) y
la GP1bα,β (CD42b) son miembros de la
familia de glicoproteínas ricas en leucina
necesaria para la interacción del factor de
Von Willebrand y la membrana plaquetaria
esencial para una adhesión normal.
Detección de inmunoglobulinas asociadas
a plaquetas. Varios investigadores empleando
la CF han encontrado que las plaquetas de
la mayoría de los pacientes con púrpura
trombocitopénica inmunológica (PTI) tienen
cantidades elevadas de inmunoglobulinas en
la superficie de las plaquetas (21, 22). Sin
embargo, en otros estudios empleando la
misma metodología, se ha demostrado que
otras formas de trombocitopenia también
pueden tener concentraciones elevados de
inmunoglobulinas en las plaquetas (23). En
un estudio que incluyó, además de controles
61
Citometría de flujo en padecimientos hematológicos.
normales pacientes con trombocitopenias no
inmunológicas encontramos una sensibilidad
de 90.3% con especificidad de 39.3%, en el
diagnóstico de PTI, concluyéndose que la
detección, por CF, de inmunoglobulinas
asociadas a plaquetas, constituye un ensayo
sensible pero no específico, haciéndolo
innecesario e inapropiado para establecer el
diagnóstico de PTI (24).
REFERENCIAS.
1.- Coons AH, Kaplan MH. Localization of antigen
in tissue cells. II. Improvements in a method for the
detection of antigen by means of fluorescent antibody.
J Exp Med 1950;91:1-13.
2.- Stewart CC, Goolsby Ch, Shackney SE. Emerging
technology and future development in flow cytometry.
Hematol Oncol Clin North Am 2002;16:477-95.
3.- Ruiz-Argüelles A, Duque RE, Orfao A. Report on
the first Latin American consensus conference for flor
cytometric immnophenotyping of leukemia. Cytometry
1998;343:39-42.
4.- Ruiz-Argüelles A, Rivadeneyra-Espinoza L,
Duque RE, Orfao A. Report on the Second Latin
American Consensus Conference for flow cytometric
immunophenotyping of hematological malignancies.
Cytometry B Clin Cytom 2006;70:39-44.
5.- Riley RS, Massey D, Jackson-Cook C, Idowu M,
Romagnoli G. Immunophenotypic analysis of acute
lymphocytic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am
2002;16:245-99.
6.- Todd WM. Acute myeloid leukemia and related
conditions. Hematol Oncol Clin North Am 2002;16:
301-319.
7.- Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG,
Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are
associated with a more aggressive form of chronic
lymphocytic leukemia. Blood 1999;94:1848-54.
8.- Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Jaletto A,
Allen SL, et al. Ig V gene mutation status and CD38
expression as novel prognostic indicators in chronic
lymphocytic leukemia. Blood 1999;94:1840-7.
9.- Montillo M, Hamblin T, Hallek M, Montserrat
E, Morra E. Chronic lymphocytic leukemia: novel
prognostic factors and their relevance for risk-adopted
therapeutic strategies. Haematologica 2005;90:3919.
10.- Krober A, Seller T, Benner A, Bullinger L, Bruckle
E, Lichter P, et al. VH mutation status, CD38 expression
level, genomic aberrations, and survival in chronic
lymphocytic leukemia. Blood 2002;100:1410-6
11.- Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon
R, Davis RE, Yu X et al. Relation of gene expression
phenotype to immunoglobulin mutation genotype
in B cell chronic lymphocytic leukemia . J Exp Med
2001;194:1639-47.
12.- Wiestner A, Rosenwald A, Barry TS, Wright G,
Davis RE, Henrickson SE, et al. ZAP-70 expression
identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype
with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical
outcome, and distinct gene expression profile. Blood
2003; 101:4944-51.
13.- Crespo M, Bosch F, Villamor N, Bellosillo B,
Colomer D, Rozman M, et al. ZAP-70 expression
as a surrogate for immunoglobulin-variable-region
mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J
Med 2003; 348:1764-75.
14.- Deaglio S, Capobianco A, Bergui L, Düring J,
Morabito F, Dührsen U, et al. CD38 is a signaling
molecule in B cell chronic lymphocytic leukemia cells.
Blood 2003; 102:2146-55.
15.- Bakke AC, Purtzer Z, Leis J, Huang J. A robust
ratio metric mehod for analysis of Zap-70 expression in
chronic lymphocytic leukemia (CLL) Cytometry B Clin
Cytom 2005; en prensa (diciembre 2005).
16.- Gibbs G, Bromidge T, Howe D, Hopkins J,
Johnson S. Comparison of flow cytometric methods
for he measurement of ZAP-70 expression in a routine
diagnostic laboratory. Clin Lab Haematol 2005; 27:25866.
17.- Parker S. Qualitative disorders of platelet function.
En: Greer JP, Foerster J, Lukens JN, Rodgers GM,
Paraskevas F Glader B (eds.) Wintrobe’s Clinical
Hematology 11 th edition. Philadelphia: Lippincott
Williams & Wilkins; 2004. p. 1603-18.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
62
J Piedras
18.- Hickerson DHM, Bode AP. Flow cytometry of
platelets for clinical analysis. Hematol Oncol Clin N
Am 2002;16:421-54.
19.- George JN, Caen JP, Nurden AT. Glansmann’s
trombastenia: the spectrum of clinical disease. Blood
1990;75:1383-95.
20.- López JA, Andrews RK, Afshar-Kharghan V,
Berndt MC. Bernard-Soulier syndome. Blood 1998;91:
4397-418.
21.- Ault KA,Flow cytometric measurement of plateletassociated immunoglobulin. Pathol Immunophatol Res
1988; 7:395-408.
22.- Rosenfeld CS, Nichols G, Bodensteiner DC. Flow
cytometric measurement of anti-platelet antibodies. Am
J Clin Pathol 1987;87:518-22.
23.- Helm M, Peterson B. Detection of plateletassociated
immunoglobulin
in
immune
thrombocytopenia by flow cytometry. Diagn Clin
Immunol 1988; 5:309-13.
24.- Romero-Guzman LT, López-Karpovitch X, Paredes
R, Barrales-Benitez O, Piedras J. Detection of plateletassociated immunoglobulin by flow cytometry for the
diagnosis of immune thrombocytopenia: a prospective
study and critical review Haematologica 2000; 85:62731.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
63
Citometría de flujo en el diagnóstico y clasificación de
padecimientos hematológicos: hemoglobinuria paroxística
nocturna.
Dr. Xavier López-Karpovitch.
Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán, México, D.F., México.
INTRODUCCIÓN.
Dentro de la gran variedad de métodos
de citometría de flujo empleados en la
clínica existen pocos capaces de identificar
enfermedades específicas. La detección de
moléculas ancladas a glucofosfatidilinositol
(GPI) en la superficie celular mediante
anticuerpos monoclonales (AcMo) y citometría
de flujo son la base de una prueba específica
para el diagnostico de hemoglobinuria
paroxística nocturna (HPN) (1).
CARACTERÍSTICAS DE LA HPN.
La HPN es un padecimiento clonal del
tejido hemopoyético, adquirido y de etiología
desconocida. El amplio espectro clínico y
curso variable de la enfermedad son un reto
para el clínico en términos de diagnóstico
y manejo. La presentación clínica clásica
del padecimiento es la anemia hemolítica,
intravascular, lo que llevó a Strübing (2) a
denominarlo como HPN por acompañarse
de hemoglobinuria durante la noche. Además
de la hemolisis, al diagnóstico esta entidad
patológica puede presentarse como aplasia
medular, trombosis e inclusive confundirse
con síndrome mielodisplásico. Un estudio
realizado en México en 164 enfermos con
HPN mostró que 44 % de ellos presentaron
aplasia, 29 % hemolisis, 25 % mielodisplasia y
2 % trombosis (3). Cincuenta años después de
la primera descripción de la enfermedad, Ham
y Dingle (4) demostraron que los eritrocitos
HPN se destruían por presentar mayor
sensibilidad al complemento al acidificar
el suero y posteriormente otros autores
encontraron que también los granulocitos y
las plaquetas mostraban el mismo fenómeno
(5-7). En 1983 se demostró la deficiencia del
factor acelerador del decaimiento (del inglés
decay acceleration factor [DAF] o CD55),
proteína anclada a la superficie celular
mediante GPI que inhibe la formación de
convertasas de C3, en la membrana de los
eritrocitos de pacientes con HPN (8). Este
hallazgo culminó en la demostración de
que todas las proteínas ancladas a GPI se
encuentran disminuidas o ausentes en HPN y
que el anclaje anómalo de las mismas se debe
a una alteración bioquímica en la transferencia
de N-acetilglucosamina a fosfatidilinositol
Solicitud de reimpresos: Dr. Xavier López-Karpovitch. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas
y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan 14000, México, D.F., México.
Tel.: 54 870 900 Ext. 2704
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
64
X López-Karpovitch
(figura 1), es decir en la formación de GPI
(9-12). Finalmente, Miyata (13) en 1993 y
otros investigadores en años posteriores
demostraron que la alteración bioquímica
en HPN es secundaria a mutaciones del gen
Pig-A (del inglés phosphatidylinositol glycan
complementation class A) ubicado en el brazo
corto del cromosoma X. Una característica
biológica importante de la HPN es su
mosaicismo fenotípico, concepto establecido
por Rosse y Dacie (14,15) en eritrocitos, que
consiste en que las células HPN expresan
grados variables de deficiencia de moléculas
ancladas a GPI. Así, se han identificado
células HPN tipo I (expresión normal de
GPI), tipo II (parcialmente deficientes) y
tipo III (moléculas GPI ausentes) fenotipos
que correlacionan con el genotipo Pig-A,
v. gr., activado, parcialmente inactivado y
completamente inactivado, respectivamente
(figura 2).
LA CITOMETRÍA EN LA HPN.
En 1985, dos grupos de investigación
independientes emplearon citometría de
flujo y el AcMo CD55 para estudiar pacientes
con HPN (16, 17). En ambos estudios
se identificaron eritrocitos, granulocitos,
monocitos, linfocitos y plaquetas deficientes
en CD55 confirmando la hipótesis de Dacie
(7) de que la HPN es un padecimiento clonal
que afecta a la célula tronco hemopoyética.
Más aún, también se ha reconocido la
deficiencia de CD55 en células progenitoras
de médula ósea de enfermos con HPN
(18). La identificación de otras moléculas
(antígenos, enzimas y receptores) ancladas
a GPI (cuadro 1) ha permitido avanzar en el
conocimiento de la enfermedad facilitando su
diagnóstico en particular con el uso de AcMo
y citometría de flujo.
Para un adecuado análisis citofluorométrico de las proteínas ancladas a GPI en
células hemopoyéticas es necesario: a) conocer la distribución de los antígenos celulares
identificados por AcMo (CD del inglés cluster
designation) y su expresión de acuerdo al
Figura 1.- Mecanismos involucrados en la formación deficiente de GPI en HPN.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
65
Citometría de flujo en el diagnóstico de la HPN.
Figura 2.- Representación esquemática del mosaicismo en HPN.
Cuadro 1
Expresión de moléculas ancladas a GPI en
células hemopoyéticas.
Antígeno
CD14
CD16
Distribución celular
Monocitos y granulocitos
Neutrófilos, células NK y
subpoblación de linfocitos T
CD24
Células B y granulocitos
CD48
Linfocitos y monocitos
CD52 (Campath) Linfocitos y monolitos
CD55 (DAF)
Todas las células hemopoyéticas
CD58 (LFA-3)
Todas las células hemopoyéticas
CD59 (MIRL)
Todas las células hemopoyéticas
CD66b
Granulocitos
CD66c
Granulocitos
CD66e
Granulocitos
CD73
Subpoblaciones de células T y B
CD87
Células T, NK, neutrófilos y
monolitos
CD90
Subpoblaciones células tronco
hemopoyéticas y T
CD108
Eritrocitos y linfocitos
CD109
Células T activadas, plaquetas,
megacariocitos, subpoblaciones
de células tronco hemopoyéticas
CD157
Células estromales de médula
ósea, monocitos y granulocitos
estadio de diferenciación de las células hemopoyéticas, b) emplear AcMo conjugados con
fluorocromos (fluorescencia directa) y c) estar
familiarizado con las estrategias electrónicas
de “ventaneo” (del inglés gatting), así como
con los términos de dispersión lumínica frontal
(FSC del inglés forward scatter que discrimina
tamaño celular) y lateral (SSC del inglés side
scatter que discrimina características intracelulares).
La figura 3 ilustra un caso de HPN en
el que se analizó la expresión del antígeno
CD55 en linfocitos, monocitos y granulocitos,
así como la expresión de CD59 en eritrocitos.
Tanto en eritrocitos como en linfocitos y
monocitos se identificaron poblaciones tipos
I, II y III, mientras que en granulocitos se
identificaron poblaciones tipos I y II. Aún
cuando en la actualidad no se cuenta con
lineamientos consensuados para establecer
el diagnóstico definitivo de HPN mediante
citometría de flujo, por ello, Hall y Rosse
(19) recomiendan identificar la deficiencia
de dos moléculas ancladas a GPI en por
lo menos dos poblaciones celulares. Esta
recomendación se da debido a la existencia
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
66
X López-Karpovitch
Figura 3.- Identificación de poblaciones celulares tipos I, II y III, mediante citometría de flujo, en un paciente con
HPN. Citograma de eritrocitos mediante SSC y FSC (a). Eritrocitos HPN tipos I, II y III identificados mediante
la expresión de CD59 (b). Citograma de linfocitos (morado), monocitos (verde) y granulocitos (azul) mediante
SSC y FSC (c). Linfocitos HPN tipos I, II y III identificados mediante la expresión de CD55 (d). Monocitos
HPN tipos I, II y III identificados mediante la expresión de CD55 (e). Granulocitos HPN tipos I y II identificados
mediante la expresión de CD55 (f).
de dos padecimientos infrecuentes
caracterizados por la deficiencia heredada
de los antígenos CD55 y CD59 (20, 21).
A continuación, y de manera breve,
algunas recomendaciones para el estudio
de moléculas ancladas a GPI en HPN (1):
• El mejor espécimen para estudiar el
inmunofenotipo HPN es la sangre.
• Efectuar el análisis en eritrocitos y
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
•
•
granulocitos.
Tener presente que después del episodio
hemolítico la frecuencia de eritrocitos
deficientes en GPI puede encontrarse
por debajo del límite de detección del
ensayo.
En pacientes pancitopénicos el número
de granulocitos puede ser insuficiente
para el análisis.
67
Citometría de flujo en el diagnóstico de la HPN.
En resumen, el análisis de proteínas
ancladas a GPI mediante citometría de flujo
es una técnica específica y sensible para
el diagnóstico de HPN. Además, con esta
metodología es posible estimar el tamaño
de la clona HPN (22).
REFERENCIAS.
1.- Richards SJ, Rawstron AC, Hillmen P. Application
of flow cytometry to the diagnosis of paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria. Cytometry 2000;42:22333.
2.- Strübing P. Paroxysmal hemoglobinuria. Dtsch
Med Wochenschr 1882;8:1-3.
3.- Góngora-Biachi RA. Hemoglobinuria paroxística
nocturna: Nuevos conceptos de una vieja enfermedad.
En Góngora-Biachi RA, editor. Hematología:
Actualización 2005. Mérida: Agrupación Mexicana para
el Estudio de la Hematología, A.C.; 2005. p. 31-9.
4.- Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction
of red blood cells . II. Chronic hemolytic anemia
with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Certain
immunological aspects of the hemolytic mechanism
with special reference to serum complement. J Clin
Invest 1939;18:657-72.
5.- Beck WS, Valentine WN. Biochemical studies on
leucocytes. II. Phosphate activity in chronic lymphatic
leukemia acute and miscellaneous hematologic
conditions. J Lab Clin Med 1951;38:245-53.
6.- Lewis SM, Dacie JV. Neutrophil (leucocyte) alkaline
phosphatase in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria.
Br J Haematol 1965;11:549-56.
7.- Dacie JV. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria.
Proc R Soc Med 1963;56:587-96.
8.- Nicholson-Weller A, March JP, Rosenfeld JP,
Austen KF. Affected erythrocytes of patients with
paroxysmal nocturnal hemoglobinuria are deficient in
the complement regulatory protein decay acceleration
factor. Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:5066-70.
9.- Holguin MH, Frederick LR, Bernshaw NJ, Wilcox
LA, Parker CJ. Isolation and characterization of a
membrane protein from normal human erythrocytes
that inhibits reactive lysis of the erythrocytes of
paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. J Clin Invest
1989;84:7-17.
10.- Armstrong C, Schubert J, Ueda E, Knez JJ,
Gelperin D, Hirose S, et al. Affected paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria T lymphocytes harbour a
common defect in assembly of N-acetyl-D-glucosamine
inositol phospholipids corresponding to that in class
A Thy-1-murine lymphoma mutants. J Biol Chem
1992;267:25347-51.
11.- Hillmen P, Bessler M, Mason PJ, Watkins WM,
Luzzatto I. Specific defect in N-acetylglucosamine
incorporation in the GPI-anchor synthetic pathway
in cloned cell lines from patients with paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria. Proc Natl Acad Sci USA
1993;90:5272-6.
12.- Takahashi M, Takeda J, Hirose S, Hyman R,
Inoue N, Miyata T, et al. Deficient biosynthesis of
N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol, the first
intermediate od glycosyl phosphatidylinositol anchor
biosynthesis, in cell lines established from patients
with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. J Exp Med
1993;177:517-21.
13.- Miyata T, Takeda J, Iida Y, Yamada N, Inoue N,
Takahashi M, et al. The cloning of PIG-A, a component
in the early step of GPI-anchor biosíntesis. Science
1993;259:1318-20.
14.- Rosse WF. Variations in the red cells in paroxysmal
nocturnal haemoglobinuria. Br J Haematol 1973;24:
327-42.
15.- Rosse WF, Dacie JV. The role of complement in the
sensitivity of the paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
red cell to immune lysis. Bibl Haematol 1965;23:11-8.
16.- Kinoshita T, Medof ME, Silber R, Nussenzweig
V. Distribution of decay-accelerating factor in the
peripheral blood of normal individuals and patients
with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. J Exp Med
1985;162:75-92.
17.- Nicholson-Weller A, Spicer DB, Austen KF.
Deficiency of the complement regulatory protein “decayaccelerating factor” on membranes of granulocytes,
monocytes, and platelets in paroxysmal nocturnal
hemoglobinuria. N Engl J Med 1985;312:1091-7.
18.- Kanamaru A, Okuda K, Ueda E, Kitani T, Kinoshita
T, Nagai K. Different distribution of decay accelerating
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
68
X López-Karpovitch
factor on hemopoietic progenitors from normal
individuals and patients with paroxysmal nocturnal
hemoglobinuria. Blood 1988;72:507-11.
19.- Hall SE, Rosse WF. The use of monoclonal
antibodies and flow cytometry in the diagnosis of
paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 1996;87:
5332-40.
20.- Reid ME, Mallinson G, Sim RB, Poole J, Pausch V,
Merry AH, et al. Biochemical studies on red cells from a
patient with Inab phenotype (decay-accelerating factor
deficiency). Blood 1991;78:3291-7.
21.- Yamashina M, Ueda E, Kinoshita T, Takami T,
Ojima A, Ono H, et al. Inherited complete deficiency
of 20-kilodalton homologous restriction factor (CD59)
as a cause of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
N. Engl J Med 1990;323:1184-9.
22.- Piedras J, López-Karpovitch X. Flow cytometry
analysis of glycosylphosphatidyl-inositol-anchored
proteins to assess paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
clone size. Cytometry 2000;42:234-8.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
69
Quimerismo por microsatélites.
Olga Verónica Barrales-Benitez, Samuel Canizales-Quinteros.
Departamento de Hematología y Oncología. Departamento de Medicina Genómica y Biología
Molecular, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán,
México, D.F., México.
INTRODUCCIÓN
En medicina el término quimera se emplea
para designar a aquel individuo cuyo cuerpo
contiene poblaciones celulares que provienen
de diferentes individuos de la misma o de
diferente especie, ya sea espontánea o
artificialmente (1). La coexistencia de células
de dos diferentes organismos en el cuerpo es
llamado quimerismo.
El trasplante de médula ósea (TMO) es
una modalidad de tratamiento cuyo objetivo
es proporcionar las condiciones para la
reconstitución de la médula ósea dañada.
En el TMO alogénico el donante pertenece
a la misma especie que el receptor, presenta
la mayor compatibilidad y generalmente es
un familiar de primer grado (2-6). Se pueden
presentar diferentes grados de quimerismo
en el TMO. Cuando el paciente no presenta
ninguna evidencia de células del receptor
después de un tiempo del trasplante se
considera quimerismo completo; mientras que
si el paciente presenta evidencia de células
tanto del receptor como células del donador
se considera como quimerismo mixto (cuadro
1)(8).
Con el surgimiento de procedimientos
de trasplante cada vez más avanzados se
ha hecho necesario establecer el grado de
quimerismo en los pacientes después del
trasplante con el objeto de: a) verificar el
éxito del trasplante, b) prevenir recaída de la
enfermedad, c) iniciar inmunoterapia (linfocitos
del donador) para evitar rechazo, d) observar
el origen de las recaídas debidas y e) intentar
nuevos esquemas de acondicionamiento (2,
5-7, 9, 10).
METODOLOGÍA.
El fundamento en el que se basa la
detección del grado de quimerismo es el
empleo de diferentes marcadores genéticos
polimórficos entre donador y receptor. La
elección del marcador y de la técnica a emplear
depende de la sensibilidad y especificidad, de
si hay diferencia de género entre donador y
receptor, y del tipo de enfermedad del paciente
pre-trasplante. Las diferentes técnicas de
rutina empleadas para detectar grado de
quimerismo se muestran en el cuadro 2. A
pesar de las diferencias en los protocolos de
estas metodologías, todas se basan en que
el receptor y el donador son estudiados antes
del trasplante en la búsqueda de marcadores
genéticos diferentes, los cuales se consideran
marcadores “informativos” (figura1). Un
Solicitud de reimpresos: Olga V. Barrales-Benitez. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y
Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan, C.P. 14000, México, D.F., México.
Tel.: 54 870 900 Ext. 2704
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
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OV Barrales-Benitez, S Canizales-Quinteros
Cuadro 1
Diferentes grados de quimerismo.
Grado de quimerismo
Quimerismo completo
Quimerismo mixto
Quimerismo dividido
Microquimerismo
Definición
Se detecta 100% células de donador, completa sustitución
hematopoyética.
Se detectan células del receptor, en particular parecen linfocitos.
Uno o más linajes pueden ser del receptor o del donador
(células mieloides 100% receptor, células linfoides 100%
donador)
Se detectan menos del 1% de células del receptor, se observa
generalmente en trasplantes de órganos sólidos.
marcador genético se considera “informativo”
cuando: a) se encuentra ampliamente
distribuido en diferentes cromosomas; b)
presenta gran variabilidad o polimorfismo, lo
que permite demostrar múltiples alelos y por
lo tanto heterocigocidad. A continuación estos
marcadores son analizados en el paciente
post TMO alogénico para medir y cuantificar
la cantidad de células del receptor y del
donador, y establecer el grado de quimerismo
(8).
Uno de los métodos más empleado
por diversos investigadores se basa en la
amplificación por Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) de un sistema STR/VNTR
altamente polimórfico que se considera muy
Cuadro 2
Métodos para la detección de quimerismo.
TECNICA
VENTAJAS
DESVENTAJAS
INFORMATIVIDAD
Fenotipificación
eritrocitaria
Simple y efectivo en caso
de Leucemia Mieloide
Crónica.
Transfusiones sanguíneas pueden interferir. Detecta un solo
tipo celular.
Baja
Citogenética
Efectivo para células
cromosoma Filadelfia
positivo.
Menos sensible, evalúa solo
células en división; altos falsos
positivos.
Baja
FISH
Estudia gran número celular; bajos falsos positivos,
muy sensible.
Restringido a donador de sexo diferente a receptor; requiere gran
cantidad de muestra.
Alta
RFLP
Evalúa células nucleadas;
requiere poca cantidad de
muestra.
Baja sensibilidad. Da resultador
erróneos por múltiples sitios de
restricción.
Alta
STR/VNTR
No depende del sexo del
donador ni de compatibilidad de HLA.
Baja sensibilidad (0.4-5 %)por
competición por el cebador.
Muy alta
Marcadores para
cromosoma Y
Muy sensible
Requiere donador de sexo femenino, no sirve si son del mismo sexo
donador y receptor
Alta
Marcadores para
Cromosoma X
Muy sensible
Requiere donador de sexo masculino, no sirve si son del mismo
sexo donador y receptor
Alta
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
71
Quimerismo por microsatélites.
Figura 1.- Análisis de quimerismo para marcadores
genéticos. A y C son marcadores informativos R =
receptor; D = donador.
informativo y sensible (11). Los STR (del
inglés short tandem repetition, repetidos
cortos consecutivos) y los VNTR (del inglés
variable number tandem repetition, número
variable de repetidos consecutivos) son
secuencias repetidas agrupadas de DNA que
constituyen aproximadamente de un 10 a un
15% del genoma y consisten en formaciones
de varias repeticiones cortas que se organizan
consecutivamente (en tandem).
Las familias de DNA satélite varían de
acuerdo con su localización en el genoma,
la extensión total de la formación consecutiva
y la longitud de las unidades repetidas que
constituyen la formación (12). Cuando la
secuencia de repeticiones consecutivas
tiene una longitud de 2 a 8 nucleótidos se
denomina STR o microsatélite (figura 2); y si
tiene de 15 a 50 nucleótidos se llama VNTR
o minisatélite (13,14). Estas secuencias
polimórficas son heredadas de manera
mendeliana codominante.
Existen tres características importantes de
estas secuencias STR o VNTR que las hacen
muy útiles para los estudios de ligamiento
genético. Primero, un microsatélite con
frecuencia tiene varios alelos (extensiones
de nucleótidos repetidas) presentes en la
población, haciendo que la probabilidad
de que un individuo sea heterocigoto sea
mayor del 70% (figura 3). Los marcadores
más informativos tienen hasta varias docenas
de alelos o más y, por lo tanto, resulta poco
probable que dos individuos no emparentados
compartan los mismos alelos Segundo, a
diferencia del análisis con RFLP (del ingles
restriction fragment lenght polimorfism
polimorfismo en la longitud del fragmento de
restricción) o con VNTR, la genotipificación
con microsatélites no requiere el uso de
tediosas técnicas como Southern blot.
Con la técnica de PCR se usan cebadores
complementarios a secuencias específicas
de DNA que flanquean los microsatélites
y generan productos de amplificación que
difieren en longitud, dependiendo de cuantos
repetidos estén presentes (figura 3). Tercero,
miles de microsatélites han sido totalmente
identificados en el genoma humano, de
manera que muy pocas regiones del genoma
no pueden ser mapeadas usando estos
marcadores (12)
Por otra parte, el uso de amplificación
del DNA permite determinar el grado de
quimerismo con muy poca cantidad de
muestra, una gran ventaja cuando el paciente
esta rechazando el injerto y presenta severa
leucopenia. Dependiendo de la longitud del
Figura 2.- Análisis de quimerismo por marcadores
microsatélites. Repetidos consecutivos STR que
muestran la diferencia en número de repetidos en
dos cromosomas. F = cebador delantero, R = cebador
inverso.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
72
OV Barrales-Benitez, S Canizales-Quinteros
Figura 3.- Demostración por microsatélites de los diferentes alelos que presenta un individuo debido al
diferente número de repetidos consecutivos . Esto se observa gráficamente en un gel de electroforesis (lado
izquierdo).
fragmento y de la eficiencia de la amplificación,
la sensibilidad del método para detectar grado
de quimerismo es de 1% a 5 % (15).
EXPERIENCIA EN EL INSTITUTO.
En el Instituto Nacional de Ciencias
Médicas y Nutrición SZ se emplea un panel
de ocho marcadores que se consideran
“informativos” por haber sido previamente
identificados en un grupo de familias
mexicanas (16). Estos marcadores se
encuentran ubicados en cromosomas
diferentes y están unidos a diversos fluoróforos
(cuadro 3), lo que permite que se pueda
amplificar en un mismo tubo de reacción
dos o tres marcadores para, posteriormente
analizar en un secuenciador automatizado
(ABI-PRISM 373). De esta manera se puede
mostrar, en un gel de electroforesis, los
diferentes alelos que permitan determinar
cuales son los marcadores informativos para
cada paciente antes del trasplante (figura 4).
Los pacientes son estudiados nuevamente
a tiempos variables post-trasplante para
Cuadro 3
Marcadores microsatélites fluorescentes.
Locus
Cromosoma
Fluorocromo
Tamaño
D1s534
1
FAM
196-212
D1s1661
1
FAM
89-101
D2s1360
2
FAM
126-181
D3s1764
3
TET
225-253
D3s4545
3
FAM
192-240
D5s1470
5
TET
163-207
D9s1121
9
HEX
184-212
D12s2078
12
FAM
250-282
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
73
Quimerismo por microsatélites.
Figura 5.- Estimación del grado de quimerismo en
un paciente post trasplante mediante microsatélites.
Los marcadores D2s1360, D3s4545 y D12s2078
son “informativos” para este paciente. D = donador,
R(pre) = receptor pre- trasplante, R(post) = receptor
post-trasplante.
Figura 4.- Panel de 8 marcadores microsatélites
de un paciente y su donador previo al TMO donde:
D2s1360, D3S4545 y D12s2078 resultaron marcadores
“informativos”. D = donador, R = receptor.
determinar el grado de quimerismo y de
esta forma prevenir un rechazo o recaída
de la enfermedad (figura 5). A la fecha se
han estudiado 27 pacientes en los que la
frecuencia de los 8 marcadores “informativos”
fue como sigue: D2s1360 en el 63% de los
pacientes; el D3s1764 en 59%; el D5s1470
en 52%; el D9s1121 y el D3s4545 en 48%
cada uno de ellos; el D12s2078 en 44%; el
D1s1661 en 15% y el D1s534 en 7%.
REFERENCIAS.
1.- McCann SR, Lawler M. Mixed chimerism: detection
and significance following BMT. Bone Marrow
Transplant 1993;11:91-4.
2.- Mapara MY, Kim YM, Marx J, Sykes M. Donor
lymphocyte infusion-mediated graft-versus-leukemia
effects in mixed chimeras established with a
nonmyeloablative conditioning regimen: extinction of
graft-versus-leukemia effects after conversion to full
donor chimerism. Transplantation 2003;76:297-305.
3.-Kvaniscka HM, Wickenhauser C, Thiele J, Varus E,
Hamm K, Beelen DW, et al. Mixed chimerism of bone
marrow vessels (endothelial cells, myofibroblasts)
following allogeneic transplantation for chronic
myelogenous leukemia. Leuk Lymphoma 2003;44:
321-8.
4.-Elmaagacli A, Peceny R, Steckel N, Trenschel
R, Ottinger H, Grosse-Wilde H, et al. Outcome of
transplantation of highly purified peripheral blood
CD34+ cells with T cells add back compared with
unmanipulated bone marrow or peripheral blood stem
cells from HLA identical sibling donors in first chronic
phase CML. Blood 2003;102:446-53.
5.- Bader P, Hancock J, Kreyenberg H, Goulden NJ,
Niethammer D, Oakhill A, et al . Minimal residual
disease (MRD) status prior to allogeneic stem cell
transplantation is a powerful predictor for posttransplant outcome in children with ALL. Leukemia
2002;16:1668-72.
6.-Bader P, Beck J, Frey A,Schlegel PG, Hebarth H,
Handgretinger R, et al. Serial and quantitative analysis
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
74
OV Barrales-Benitez, S Canizales-Quinteros
of mixed hematopoietic chimerism by PCR in patients
with acute leukemias allows the prediction of relapse
after allogeneic BMT. Bone Marrow Transplant 1998;
2:487-95.
7.-Bader P, Holle W, Klingebiel T, Handgretinger R,
Brenda N, Schlegel PG, et al. Mixed hematopoietic
chimerism after allogeneic bone marrow transplantation:
the impact of quantitative PCR analysis for prediction of
relapses and graft rejection in children. Bone Marrow
Transplant 1997; 19:697-702.
8.-Khan F, Agarwal A, Agrawal S. Significance of
chimerism in hematopoietic stem cell transplantation:
new variations on an old theme. Bone Marrow
Transplant 2004; 34:1-12.
9.- Blazar BR, Lees CJ, Martin PJ, Noeller RJ, Kwon
B, Murphy W, et al. Host T cells resist graft-versushost disease mediated by donor leukocyte infusions.
J Immunol 2000; 165:4901-9.
10.- Mackinnon S, Barnett L, Heller G, O’Reilly RJ.
Minimal residual disease is more common in patients
who have mixed T-cell chimerism after bone marrow
transplantation for chronic myelogenous leukemia.
Blood 1994; 83:3409-16.
11.- Choi SJ, Lee KH, Lee JH, Kim S, Chyng HJ, Lee
JS, et al. Prognostic value of hematopoietic chimerism
in patients with acute leukemia after allogeneic bone
marrow transplantation: a prospective study. Bone
Marrow Transplant 2000; 26:327-32.
12.- Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF.
Thompson & Thompson. Genetics in medicine . 6ª. ed.
Philadelphia: WB Saunders Company; 2001. p.31.
13.- Weber JL, May PE. Abundant class of DNA
polymorphism which may be typed using the
polymerase chain reaction. Am J Hum Genet 1989;
44:388-96.
14.- Jeffreys AJ, Wilson V, Neuman R, Keyte J.
Amplification of human minisatellites by the polymerase
chain reaction: Towards DNA fingerprinting of single
cells. Nucleic Acids Res 1988; 16:10953-71.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
15.- Thomas ED, Blume KG, Forman SJ. Hematopoietic
cell transplantation. 2ª. ed. Massachussets: Blackwell
Science; 1999. p. 201.
16.- Canizales-Quinteros S, Aguilar-Salinas CA,
Reyes-Rodriguez E, Riba L, Rodríguez-Torres M,
Ramirez-Jimenez S, et al. Locus on chromosome 6p
linked to elevated HDL cholesterol serum levels and
to protection against premature atherosclerosis in a
kindred with familial hypercholesterolemia. Circ Res
2003; 92:569-76.
75
Talasemias: aspectos bioquímicos,
moleculares y diagnósticos.
Beatriz Ibarra, Francisco José Perea.
División de Genética, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, CMNO, Instituto
Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco, México.
INTRODUCCIÓN.
La Organización Mundial de la Salud
(OMS) ha estimado que cerca del 7% de
la población mundial son portadores de
alguna hemoglobinopatía, y que al año
nacen aproximadamente 370,000 niños
homocigotos heterocigotos compuestos para
anemia drepanocítica o para algún tipo de
talasemia severa (1).
Las talasemias son un grupo heterogéneo
de anemias hemolíticas hereditarias que se
caracterizan por la ausencia o disminución en
la síntesis de una o más cadenas globínicas,
que conducen a un desequilibrio en la relación
de cadenas α/no-α. Las más comunes y
clínicamente importantes son las talasemias
α y β.
TALASEMIA ALFA.
El término talasemia α (Tal-α) define
los desórdenes hereditarios que afectan
la síntesis de cadenas α globina. Debido a
que las cadenas α están presentes tanto en
hemoglobinas fetales y adultas, la deficiencia
de su producción afectará la síntesis de la
mayoría de las hemoglobinas. En la vida
fetal la ausencia o reducción en la síntesis de
cadenas α resulta en un exceso de cadenas
γ, la cual forma tetrámeros γ4 o hemoglobina
Bart. En la vida adulta, el exceso de cadenas
β, forma tetrámeros β4 o hemoglobina H (2).
La familia de genes globínicos α se
localiza en una extensión aproximada de 35
kilobases (Kb), región en la que se encuentran
además aproximadamente 50 genes (factores
de transcripción, dedos de zinc, enzimas,
proteínas estructurales, etc.) y la conforman
4 genes, 3 de ellos funcionales: ζ que se
expresa sólo en el período embrionario, los
α2 y α1, que se sintetizan desde la etapa
fetal. El gen θ se localiza en el extremo 3’
del gen α1, su expresión a nivel de ARNm
se ha demostrado en saco vitelino, hígado
fetal y células eritroides adultas, pero no hay
evidencias de la formación de una proteína
estable. En este bloque se encuentran
también cuatro pseudogenes (ψζ, ψα2, ψα1
y ρ), 5 regiones hipervariables (secuencias
de ADN altamente repetitivas) y 12 regiones
Alu (secuencias medianamente repetitivas)
(figura 1).
TALASEMIA BETA.
La Talasemia β (Tal-β) muestra una
Solicitud de reimpresos: Beatriz Ibarra. División de Genética, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, CMNO, Instituto Mexicano
del Seguro Social. Sierra Mojada No. 800, Col. Independencia, C.P. 44340, Guadalajara, Jalisco, México.
Tel.: 01 33 36 18 94 10
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
76
B Ibarra, FJ Perea
Figura 1.- Esquema de la familia de genes globínicos α.
considerable heterogeneidad clínica y
fenotípica revelada por los parámetros
hematológicos y bioquímicos. Sí hay
ausencia total de globina-β se llaman alelos
β° y si sólo hay reducción de globina-β se
denominan alelos β+.
Con base en el estado clínico de los
pacientes se clasifican en: a) Tal-β mayor o
anemia de Cooley, b) Tal-β intermedia, y c)
Tal-β menor (2-5).
BASES
MOLECULARES
DE
TALASEMIA β.
Los genes globínicos no α o semejantes
a β, se localizan en 11p15.5 tienen una
extensión aproximada de 65 kilobases (Kb)
y consta de 5 genes funcionales: ε, γG, γA, δ
y β y de un pseudogen llamado ψβ (3). En
todo el bloque se encuentran dos secuencias
medianamente repetidas de la familia Kpn y
ocho de la familia Alu (2, 5) (figura 2).
Éstos genes globínicos tienen una
estructura interna similar con una longitud
aproximada de 1.6 Kb (figura 2) y están
constituidos del extremo 5’ a 3’ como se
muestra en el esquema de la Figura 1 (3, 6).
Hasta Agosto de 2005, se han descrito
238 alelos que causan Tal-β, la mayoría
de ellos tienen debidos a una mutación
puntual, como cambios de una base por
otra, deleción o inserción de una o varias
bases. Una lista completa de las mutaciones
que originan talasemia beta puede ser
consultada en las páginas de acceso libre
en Internet como Globin Gene Server (http:
//globin.cse.psu.edu), en la Base de Datos
inglesa Human Gene Mutation Database (http:
//www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html), y
en la pagina del Online Mendelian Inheritance
in the Man (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
dispomim.cgi?id=141900), que regularmente
las están actualizando.
Los estudios poblacionales han mostrado
que aproximadamente 25 mutaciones
representan la mayor parte de los alelos
Figura 2.- Esquema de la familia de genes globínicos β y organización interna del gen.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
77
Talasemias.
Cuadro 1
Ejemplos de Alelos observados en diferentes regiones geográficas del mundo (7).
Frecuencia
Frecuentes
Poco frecuentes
Raros
Mutaciones
País o Región
Sin sentido codón 39 C→T
IVS1:1 G→ A
IVS1: 6 T→ C
IVS1:110 G→A
África del Norte, Europa Occidental, Balcanes, Mediterráneo, y Medio Oriente
IVS2:745 C→G
IVS 2: 1 G→ A
IVS1: 1 G→ T
IVS1:5 G→C
DML codón 41/42 –CTTT
Deleción de 619 pb
-28 A→C
-87 C→G
Italia, Grecia, Turquía, Francia, España,
Macedonia, Bulgaria
Oriente Medio, Asia y Sureste Asiático,
Malasia
Sin sentido codón 17 A→T
IVS1:5 G→A
(δβ)) - Talasemia tipo español
DML codón 11 –T
(δβ)) - Talasemia tipo sicilia
implicados en todas la poblaciones con alta
frecuencia de Tal-β (7, 8), de manera que con
base en su frecuencia se pueden agrupar
en: a) alelos frecuentes o comunes, si se
encuentran en frecuencias mayores a 10.0%;
b) alelos poco frecuentes, con frecuencias
entre 5.0% a 10.0% y c) alelos raros con
frecuencia menor a 5.0% (cuadro 1).
TALASEMIA β EN MÉXICO.
La Tal-β es la hemoglobinopatía más
común en nuestro país, ya que se ha
encontrado en cerca del 70 % de los pacientes
con desórdenes de la hemoglobina estudiados
en el Centro de Investigación Biomédica de
Occidente y en los Laboratorios Clínicos de
Puebla, respectivamente, tanto en estado
homocigoto (β Tal/β Tal) como heterocigoto
simple (βTal/β) o compuesto (βTal/βS, βTal/βD)
(9, 10) . En nuestro Centro de Investigación
hemos analizado la patología molecular de
80 cromosomas, entre los cuales hemos
identificado 17 alelos distintos (β 0 y β +),
incluyendo una nueva mutación, deleción
Angola, Turquía, Kurdistan, México
Italia, Grecia, Turquía, Francia, Yugoslavia
Bulgaria
China y Tailandia
Italia, Turquía, Grecia, España
España, México
Islas de Sicilia y Cerdeña
de una citosina en el codón 77 ó 78. Seis
mutaciones constituyen el 78.4 % de los
alelos observados. La mayoría de ellos son
considerados de origen Mediterráneo (10
alelos), 3 de origen Asiático, 3 alelos privados,
uno de ellos particularmente de origen Curdo,
y el alelo restante, a la fecha, sólo se ha
encontrado en nuestra población (11, 12)
(cuadro 2).
El espectro de mutaciones observado
en nuestra población, es característico de
las poblaciones con baja frecuencia de
talasemias. Sin embargo, hace patente la
necesidad de considerar la presencia de
talasemia al realizar el diagnóstico diferencial
de anemia microcítica hipocrómica.
DIAGNÓSTICO DE TALASEMIA EN EL
LABORATORIO.
El diagnóstico de la talasemia se
fundamenta en tres evaluaciones:
hematológica, bioquímica y molecular.
a) Hematológica.
Citometría hemática. El análisis de
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
78
B Ibarra, FJ Perea
Cuadro 2
Distribución alélica observada en pacientes mexicanos con talasemia beta.
1. Alelos Transcripcionales
-87 C→T
-28 A→C
2. Procesamiento ARN
IVS1:1 G→A
IVS1:5 G→A
IVS1:5 G→C
IVS1:110 G→A
IVS2:1 G→A
IVS2:745 C→G
3. Alelos en la Traducción
3.1 Inicio codón
ATG→GTG (MET→VAL)
3.2 Sin sentido
Codon 39 C→T
Codon 17 A→T
3.3 Desviación Marco de Lectura
Codon 6 –A
Codon 11 –T
Codon 77/78 –C
Codones 41/42 -TTCT
4. Alelos por Deleción
(δβ)0-talasemia tipo Español
5. Alelos por Fusión
Hb Lepore Washington Boston
Total de genes analizados
los índices eritrocitarios obtenidos en
equipo automatizado es fundamental, ya
que permite sospechar la presencia de
talasemia, en particular de Tal-β. Los valores
para considerar el rasgo de Tal-β menores
Volumen Corpuscular Medio (VCM) <78 fL y
Hemoglobina Corpuscular Media (HCM) <27
pg (13, 14).
Frotis sanguíneo. La elaboración de
un frotis sanguíneo teñido con WrightGiemsa ayuda a establecer la presencia
de normoblastos, dianocitos, drepanocitos,
o punteado basófilo. Para descartar la
presencia de un componente hemolítico se
recomienda realizar la cuenta de reticulocitos
(13, 14).
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
Total
%
Tipo de alelo
2
5
2.4
6.0
β+
β+
12
5
2
12
1
1
14.5
6.0
2.4
14.5
1.2
1.2
β°
β+
β+
β+
β°
β+
3
3.6
β°
26
1
31.4
1.2
β°
β°
2
3
1
1
2.4
3.6
1.2
1.2
β°
β°
β°
β°
5
6.0
β°
1
83
1.2
100.0
β+
Cuando se sospecha de talasemia alfa
se puede realizar una incubación de 2 horas
a 37 °C, con colorante para reticulocitos una
alícuota enriquecida de eritrocitos jóvenes,
para observar los cuerpos de inclusión
generados por la precipitación de la HbH
(15).
b) Evaluación Bioquímica.
Electroforesis de Hemoglobina. Por
muchos años ha sido considerada la prueba
ha realizar para la detección e identificación
de variantes estructurales y de Tal-β. Este
ensayo está basado en las propiedades
electroforéticas y cromatográficas de las
variantes en estructura.
Convencionalmente la electroforesis se
79
Talasemias.
realiza en acetato de celulosa a pH alcalino
(8.6), si se observa algún cambio en la
movilidad de las Hbs se realizan estudios
confirmatorios a pH ácido (6.2). Con este
esquema de trabajo es posible identificar las
variantes estructurales más comunes como
por ejemplo, HbS, HbC, Hb E, Hb Bart y HbH
entre otras.
En ocasiones es necesario realizar otras
técnicas electroforéticas para identificar
y caracterizar variantes estructurales. La
alternativa más utilizada es la electroforesis
de globinas en condiciones desnaturalizantes,
para establecer cual es la globina variante y
su comportamiento a pH alcalino y ácido. El
isoelectroenfoque es una alternativa reciente
con un gran poder resolutivo, pero por su alto
costo no se implementa en laboratorios con
pocos recursos.
Cuantificación de las Hbs F y A2. La HbF
se evalúa por métodos que se consideran de
alta resistencia a desnaturalización alcalina.
Esta Hb se encuentra elevada en diferentes
formas de persistencia hereditaria de HbF,
así como de Tal-β mayor, Tal-β intermedia y
Tal-δβ.
La evaluación de HbA2 se realiza por
microcromatografía de intercambio aniónico y
es fundamental para establecer el diagnóstico
de Tal-β.
Los métodos automatizados basados
en cromatografía líquida de alta resolución
permiten cuantificar los diferentes
componentes de Hbs con el consiguiente
ahorro de tiempo y esfuerzo, sin embargo,
resultan demasiado onerosos para utilizarlos
de forma convencional para el diagnóstico de
hemoglobinopatía.
Otros estudios. Para confirmar la
presencia de una Hb inestable se realizan
pruebas de estabilidad a calor, isopropanol y
butanol. Como existen algunas variantes que
co-migran con la HbS, además de inducción
de cuerpos de Heinz es importante realizar
las pruebas de inducción a drepanocitos con
metabisulfito de sodio y de solubilidad, que
son positivas en presencia de HbS.
c) Evaluación Molecular.
La identificación de alelos frecuentes
y raros en una población es esencial
para la implementación de las estrategias
metodológicas apropiadas para realizar la
identificación de las mutaciones de manera
oportuna.
La técnica de Southern blot, que fue
utilizada para la identificación de HbS y de
algunos alelos de Tal-β, fue entrando en
desuso con el advenimiento de la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Sin embargo todavía en la actualidad se utiliza
para detectar los alelos que conducen a Tal-α1, debidos a deleción de grandes segmentos
de ADN (13, 14).
Amplificación de los genes globínicos por
PCR. La PCR es fundamental para realizar
la detección de mutaciones puntuales en los
genes globínicos. El conocimiento de las
mutaciones presentes en la población permite
establecer una estrategia para el diagnóstico
temprano de las hemoglobinopatías.
Se emplean una gran variedad de
técnicas, basadas en la amplificación con
PCR, para la identificación de mutaciones,
entre las que se incluyen análisis por
hibridación en manchas o dot-blot, análisis
reverso de hibridación por mancha (dt-blot
reverso), amplificación con iniciadores alelo
específico, análisis con enzimas de restricción
y Gap-PCR. Cada método tiene sus ventajas
y desventajas, y cada laboratorio elige los
procedimientos que más convengan a sus
capacidades técnicas.
Búsqueda de mutaciones comunes en
México. La técnica de amplificación con
iniciadores alelo específico es ampliamente
empleada para identificar mutaciones
conocidas de Tal-β y Tal-α. Con esta técnica
es posible buscar hasta 3 alelos diferentes en
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
80
B Ibarra, FJ Perea
un tubo de reacción. La técnica se fundamenta
en la utilización de un iniciador común y un
iniciador que presenta la mutación buscada en
el extremo 3’, de tal forma que si la mutación
está presente es reconocida y se logra
un fragmento amplificado. Pero si no está
presente la mutación buscada, no amplifica.
Esta técnica permite un procedimiento rápido,
sencillo y económico para la identificación de
mutaciones.
El análisis de restricción es un
procedimiento que se emplea cada vez menos
en nuestro laboratorio para la búsqueda de
mutaciones en el gen globínico beta, ya
que siete de las mutaciones descritas son
identificadas por enzimas de restricción.
Estos dos procedimientos nos permiten
identificar cerca del 80% de las mutaciones
que conducen a talasemia beta en los
pacientes mexicanos. El 20% restante entra a
la búsqueda de mutaciones desconocidas.
Búsqueda de deleciones conocidas.
Actualmente se emplea la variación
denominada Gap-PCR que consiste en
utilizar iniciadores que hibridan en las zonas
cercanas a los sitios de ruptura y unión de
las deleciones. Con esta técnica se detectan
cerca de 8 deleciones comunes de talasemia
alfa, aproximadamente 5 deleciones de
talasemia beta, 4 deleciones de tal-δβ y 5
deleciones de Persistencia Hereditaria de
Hemoglobina fetal (13, 14).
Búsqueda de mutaciones desconocidas.
Para la identificación y caracterización
de mutaciones desconocidas en los
genes globínicos se han descrito varios
procedimientos entre los que se encuentra
polimorfismo conformacional de cadena
sencilla, análisis de Heteroduplex,
electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante. Los fragmentos que
muestran alguna anomalía en las técnicas
antes mencionadas son después dirigidas
a secuenciación de nucleótidos. En nuestro
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
laboratorio empleamos directamente la
secuenciación de nucleótidos para detección
y caracterización de mutaciones puntuales
desconocidas.
Finalmente, el estudio de las talasemias en
México de una forma integral (hematológica,
clínica, y molecular), permitirá definir con
mayor certeza la evolución clínica del
paciente, así como las bases moleculares de
la fisiopatología. Estamos convencidos de que
esta enfermedad hereditaria en nuestro país
es mucho más compleja de lo que parece, por
lo que se requiere realizar más investigación
en este campo.
REFERENCIAS.
1.- Watherall DJ, Clegg JB. Inherited haemoglobin
disorders: an increasing global health problem. Bull
World Health Organ 2001;79:704-12.
2.- Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood
WG. The Hemoglobinopathies. In: The Metabolic &
Molecular Bases of Inherited Disease. Scriver Ch R,
Beaudet AR, Sly WS, Valle D, (Eds). McGraw Hill, New
York, Vol III, pages 4571-4636, 2001a.
3.- Thein S. β- thalassaemia. En: Sickle cell disease
and thalassaemia, G.P. Rodgers, (Ed) 11(1):91-126,
1998.
4.- Ibarra B, Perea FJ, Jaloma AR, Romero F,
González-García JR. Genética y Hematología.
En: Guízar-Vázquez J. (Editor). Genética Clínica.
Diagnóstico y Manejo de las enfermedades hereditarias.
México: Editorial El Manual Moderno; 2001. p. 512-7.
5.- Weatherall DJ: The Thalassaemias. In: William’s
Hematology. Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps
TJ, Seligsohn U. (Eds) 6th edición. McGraw Hill, 547580, 2001b.
6.- Bunn H, Forget B. Hemoglobin: Molecular Genetic
and Clinical Aspect. Dyson J (ed). Philadelphia: W B
Saunders Company; 1986.
7.- Huisman THJ, Carver MFM, Baysal E. A Syllabus of
Thalassemia Mutations. Sickle Cell Anemia Foundation,
GA, USA, 1997.
81
Talasemias.
8.- Flint J, Harding E, Boyce A, Clegg JB. The
population genetics of the haemoglobinopathies.
Baillière´s Clinical Haematology 1998; 11:1-52.
9.- Ruiz-Reyes G, Ibarra-Cortés B, GonzálezMartínez P, Lisker R. Anemias hereditarias en
México. En Góngora-Biachi RA, editor. Hematología.
Actualización 2004. Mérida: Agrupación Mexicana para
el Estudio de la Hematología, A.C.; 2004. p. 15-25.
10.- Ruiz-Arguelles GJ, López Martínez B, Ruiz-Reyes
G. Heterozygous beta-thalassemia: not infrequent in
Mexico. Arch Med Res 2001; 32:293-5.
11.- Villalobos-Arámbula AR, Bustos R, CasaCastañeda M, Gutiérrez E, Perea FJ, Thein LS, Ibarra
B. β-Thalassemia and βA globin gene haplotypes in
Mexican mestizos. Hum Genet 1997; 99:498-500.
12.- Perea FJ, Magaña MT, Cobian JG, Sanchez-Lopez
JY, Chavez ML, Zamudio G, et al. Molecular spectrum
of beta-thalassemia in the Mexican population. Blood
Cells Mol Dis 2004; 33:150-2.
13.- Cao A. Carrier screening and genetic counselling
in beta-thalassemia. Int J Hematol 2002; 76 (Suppl 2):
105-13.
14.- Old JM. Screening and genetic diagnosis of
haemoglobin disorders. Blood Rev 2003; 17:43-53.
15.- Pan LL, Eng HL, Kuo CY, Chen WJ, Huang
HY. Usefulness of brilliant cresyl blue staining as an
auxiliary method of screening for alpha-thalassemia.
J Lab Clin Med 2005; 145:94-7.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
83
Diagnóstico en el laboratorio del
anticoagulante lúpico.
Virginia Domínguez-Martínez, Rosario Villa-Márquez, Darinel Hernández-Hernández.
Laboratorio de Coagulación. Departamento de Hematología-Oncología. Instituto Nacional de
Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F., México.
INTRODUCCIÓN.
El anticoagulante lúpico (AL) está
compuesto de anticuerpos heterogéneos
dirigidos en contra de los fosfolípidos con carga
negativa. Esta reacción es dependiente de
la presencia de ciertas proteínas plasmáticas
como la β2-glicoproteína 1 (β2-GP1),
protrombina, proteína S y anexina V. Desde
los años 60 existe evidencia que indica que
la presencia de AL se asocia con incremento
en el riesgo de tromboembolismo arterial/
venoso, en pacientes con o sin enfermedades
autoinmunes. Además, se ha asociado a
perdida fetal en mujeres “sanas”.
Los procedimientos para detectar el AL se
basan en la prolongación de los tiempos de
coagulación de las pruebas dependientes de
fosfolípidos, y se sospecha la presencia de
éste cuando al agregar una cantidad igual
de plasma normal al plasma problema, esta
prolongación no revierte.
Para la confirmación de la presencia
del AL se realizan pruebas en las cuales se
incrementa la concentración de fosfolípidos, o
se emplean fosfolípidos con una conformación
específica (v. gr.: fosfolípidos en fase
hexagonal). Ambos procedimientos acortan
el tiempo de coagulación en los plasmas que
contienen AL (1).
De acuerdo a este principio, el diagnóstico
de laboratorio del AL debe seguir 4 pasos:
1) Presencia de los tiempos de coagulación
dependiente de fosfolípidos alargados
(escrutinio).
2) Presencia de un inhibidor demostrado
con el procedimiento de mezcla de plasma
problema con plasma normal sin corrección
del tiempo de coagulación.
3) Confirmación de la naturaleza
antifosfolípidica del inhibidor por corrección
del defecto de la coagulación, mediante el
uso de un procedimiento de neutralización
del inhibidor (incremento de la cantidad de
fosfolípidos).
4) Ausencia de inhibición específica sobre
un factor de la coagulación.
Los primeros 2 pasos son necesarios para
probar la presencia de un inhibidor y los otros
Solicitud de reimpresos: Virginia Domínguez-Martínez. Departamento de Hematología y Oncología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas
y Nutrición SZ. Vasco de Quiroga 15, Colonia Sección XVI, Delegación Tlalpan, C.P. 14000, México, D.F., México.
Tel.: 54 870 900 Ext. 2704
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
84
V Domínguez-Martínez, R Villa-Márquez, D Hernández-Hernández
Figura 1.- Abordaje diagnóstico en el laboratorio para la detección de anticoagulante lúpico. ACO =
anticoagulación oral. LA1 y LA2 = fosfolípidos a diferentes concentraciones.
para diferenciar un AL de otro inhibidor de la
coagulación (figura 1)(2, 3).
A pesar de estos criterios, en pacientes
con alteraciones diferentes a la presencia
de AL, la interpretación de los resultados
en las pruebas de detección de AL resulta
problemática (cuadro 1). Un ejemplo
específico lo constituyen los pacientes con
anticoagulación oral (ACO), por la dificultad
en la interpretación de los resultados en
las pruebas de coagulación dependientes
de fosfolípidos. La interpretación de la
Cuadro 1
Diagnósticos diferenciales de inhibidores de la coagulación.
1. Inhibidores asociados con sangrado
a) anti-factor VIII
b) anti-factor II, VII, IX, X, XI
c) anti-fibrinógeno/fibrina
d) anticoagulantes similares a la heparina
2. Inhibidores con o sin sangrado
a) anti factor V
3. Inhibidores usualmente no asociados con sangrado
a) anticoagulante lúdico
b) antifactor XII
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
85
Aticoagulante lúpico.
magnitud de la corrección o acortamiento
del tiempo de coagulación, que precisamente
constituye la base de muchos procedimientos
confirmatorios diseñados para detectar AL, se
hace muy difícil, ya que la prolongación en el
tiempo de coagulación causada por la ACO
se traslapa con la inducida por el AL. Se han
descrito procedimientos confirmatorios que
aparentemente no son modificados por
el ACO, sin embargo, su eficacia no está
plenamente evaluada ni comprobada.
En nuestro laboratorio, la causa principal
de prolongación de los tiempos de coagulación
esta dada por los pacientes con ACO. Muchos
de estos pacientes se encuentran en estudio
de una probable trombofilia, y entre estos
estudios se incluye la búsqueda de AL. En
esta situación, sería necesario esperar al
término del periodo de anticoagulación para
realizar la determinación, o suspenderla
transitoriamente. Ambas alternativas
pueden ser deletéreas para el paciente. Sin
embargo, el conocer la condición respecto
al AL ayudaría a la decisión de la duración
e intensidad de la ACO, para prevenir
recurrencia de la trombosis.
Por las razones mencionadas, en los
últimos 20 años se han desarrollado diversos
tipos de pruebas de escrutinio y confirmación
para la identificación de AL, no obstante
hasta la fecha no hay una única prueba para
detectar AL que sea 100% específica. Estas
pruebas incluyen varios procedimientos
o modificaciones de los mismos, como el
tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPa), tiempo de coagulación con caolín,
tiempo de coagulación con sílice (SCT),
tiempo de protrombina diluido o inhibición de
la tromboplastina tisular (TPd) y tiempo de
veneno de víbora de Russell diluido (TVVRd).
Desafortunadamente, hay variaciones en la
sensibilidad y especificidad de estas pruebas
para la detección del AL o inhibidores similares,
ya que la composición de fosfolípidos es un
determinante crítico para la sensibilidad
de una prueba determinada; y como se ha
mencionado previamente, esta variación se
incrementa en los pacientes con ACO (3,
4). La mezcla de plasma del paciente con
plasma normal es una forma de compensar
la prolongación en el tiempo de coagulación
en este tipo de muestras, sin embargo, este
procedimiento consume tiempo y reactivo,
por lo que resulta una solución cara (1, 5)
(figura1).
Debido a que muchos de los pacientes
a quienes se les solicita AL se encuentran
anticoagulados, en estudios previos se ha
reportado que ciertas pruebas como el SCT,
realizado con concentraciones bajas y altas
de fosfolípidos sin adición de plasma normal
y el TVVRd, procesado con fosfolípidos y sin
adición de plasma normal no son alteradas
con la ACO y se sugiere que pueden ser
usadas para la detección de AL en este tipo
de pacientes (6).
En el Instituto se realizó un estudio para
establecer la utilidad diagnóstica del TPd (con
una tromboplastina tisular recombinante), y del
TVVRd (sin la adición de plasma normal) en la
detección de AL en pacientes anticoagulados y
no anticoagulados, empleando como “estándar
de oro” la prueba de fosfolípidos hexagonales
(FH) (1, 3).
Se estudiaron 40 muestras de pacientes
de la Clínica de Anticoagulantes del Instituto
con ACO y cuadro(s) de trombosis previa(s).
De estas muestras, 12 pertenecían a pacientes
con diagnóstico de síndrome antifosfolípido
(SAF) primario o secundario, 9 eran de
pacientes con enfermedad inmunológica
(lupus eritematoso generalizado (LEG),
artritis reumatoide (AR), hepatitis autoinmune,
enfermedad de Graves) y sospecha de SAF;
17 muestras eran de pacientes anticoagulados
por otras razones (fibrilación auricular, prótesis
valvulares, cáncer, etc.) y 2 de pacientes en
estudios de trombofilia: 1 con antecedente
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V Domínguez-Martínez, R Villa-Márquez, D Hernández-Hernández
de trombosis recurrente y otra con abortos
recurrentes. Además se estudiaron 27
muestras de pacientes no anticoagulados,
20 de ellas para detección de AL, y el resto
con prolongación del TTPa por otras razones
(cirrosis hepática, metástasis hepáticas,
cáncer hepático). Para la obtención de cifras
de referencia se estudiaron 26 muestras de
individuos clínicamente sanos (cuadro 2).
Métodos. Las muestras de plasma
citratado se almacenaron a –70°C hasta la
realización de las pruebas. El TPd se realizó
en un instrumento automatizado (BCS®,
Dade Behring) en el modo de TTPa, usando
tromboplastina tisular recombinante (Innovin®,
Dade Behring), diluida 1:100 y 1:200 en buffer
veronal. Los cocientes del TPd se calcularon
dividiendo el tiempo obtenido en cada muestra
problema entre la media del valor obtenido
en los controles: 34.1 para la dilución 1:100
y 46.1 para la dilución 1:200.
El TVVRd se realizó en el mismo equipo
automatizado, empleando muestras de
plasma pareadas, a las que se les agregó
como activador el veneno de víbora (Dade
Behring) y 2 concentraciones diferentes de
fosfolípidos (LA1 y LA2). Los resultados se
expresaron como porcentajes de corrección,
de acuerdo a la siguiente formula:
% corrección = [(VVRd1p /VVRd1n) - (VVRd2p
/VVRd2n)] / ((VVRd1p /VVRd1n) x 100
Para la prueba de FH se empleo el
reactivo Staclot® LA (Stago) procesándose
como prueba pareada de TTPa sin (tiempo de
coagulación 1) y con (tiempo de coagulación
2) fosfolípidos hexagonales (FH), agregados a
una mezcla de plasma problema con plasma
normal, y de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. Los resultados se expresaron como
la diferencia en segundos entre el tiempo de
coagulación 1 y 2. Se consideró un plasma
positivo para AL cuando la diferencia entre
el tiempo de coagulación 1 y el tiempo de
coagulación 2 estuvo por arriba del valor de
corte de la población control.
De los 67 plasmas analizados,
(59.7%) trece correspondieron a pacientes
anticoagulados. (32.5%) de éstos con
diagnóstico de SAF primario o secundario.
Los otros 27 plasmas eran de pacientes no
anticoagulados: 20 fueron enviados para
la detección de AL, la mayoría de ellos de
pacientes con enfermedades inmunológicas
y con TTPa prolongado que no corrigieron al
mezclar con plasma normal, 8 plasmas con
TTPa prolongado debido a falla hepática.
La prueba de los FH fue positiva en 33
de los 67 plasmas analizados y de éstos 19
correspondieron a pacientes anticoagulados.
La sensibilidad en la identificación de AL del
TPd 1:100, 1:200 y el TVVRd en los pacientes
con ACO fue muy similar a la encontrada en
los pacientes sin ACO (cuadro 3), sin embargo,
la especificidad de las tres pruebas fue menor
en los pacientes con ACO. Con la prueba del
TVVRd se obtuvieron las cifras más altos de
sensibilidad (>90%) y especificidad (de 86%
a 92%), mientras que con el empleo del TPd
1:100 y 1:200, en los pacientes con ACO
la especificidad disminuyó a 33% y 57%,
respectivamente. En forma similar de las 3
pruebas de laboratorio estudiadas, con el
Cuadro 2
Valores de la percentila 95 de un grupo de 26 sujetos sanos para las pruebas
fosfolípidos hexagonales (FH), tiempo de protrombina diluido (TPd) y tiempo de
veneno de Rusell diluido (TVVRd).
Punto de corte
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
FH
TPd !:100
TPd 1:200
TVVRd
6.0 s
1.66
2.0
21.7%
87
Aticoagulante lúpico.
Cuadro 3
Sensibilidad (sens.) y especificidad (esp.) del tiempo de protrombina diluido (TPd) y del tiempo
de veneno de Rusell diluido (TVVRd) en la detección de anticoagulante lúpico en pacientes
con y sin anticoagulación oral (ACO) y empleando como prueba diagnóstica los fosfolípidos
hexagonales.
PACIENTES
TPd 1:!00
TPd 1:200
TVVRd
sens. %
esp. %
sens. %
esp. %
sens. %
esp. %
Todos n=67
85
50
85
65
94
88
Con ACO n=40
84
33
84
57
95
86
Sin ACO n=27
86
77
86
77
93
92
TVVRd se obtuvieron las cifras más altas de
valor predictivo positivo y negativo en los 2
grupos de pacientes (cuadro 4).
El AL se identificó en 78.5% de
pacientes con SAF (11/14 pacientes con
diagnóstico conocido de SAF; 2 de ellos no
anticoagulados), en 69% de pacientes con
enfermedad inmunológica y/o sospecha de
SAF (20/29 muestras con solicitud de AL;
11 de ellos anticoagulados) y en 20.8% de
pacientes con otras enfermedades (2 con
cáncer, 2 con hipertensión arterial pulmonar e
insuficiencia cardiaca y 1 con DM 2). Aunque
el porcentaje de detección de AL en pacientes
con diagnóstico conocido SAF es aceptable,
existe la posibilidad que sean positivos para
anticuerpos antifosfolípidos en fase sólida,
pero no para AL.
Los resultados del estudio indican que el
mejor balance de sensibilidad especificidad se
observó en los pacientes no anticoagulados.
Considerando ambos grupos de pacientes
el TPd 1:100 y 1:200 mostró sensibilidad
adecuada, pero pobre especificidad para
la búsqueda de AL, y aunque en estudios
previos se ha reportado que la dilución 1:
200 es la que tiene mayor sensibilidad, en
nuestra experiencia ésta fue muy similar a
la obtenida con el TPd 1:100. En conclusión,
de las tres pruebas analizadas, el TVVRd
es una prueba útil para detectar AL en
pacientes con o sin ACO. La ventaja de
esta prueba, comparativamente con la de
FH, se basa principalmente en que puede
Cuadro 4
Valor predictivo positivo (vpp) y valor predictivo negativo (vpn) del tiempo de protrombina
diluído (TPd) y del tiempo de veneno de Rusell diluído (TVVRd) en la detección de anticoagulante
lúpico en pacientes con y sin anticoagulación oral (ACO) y empleando como prueba diagnóstica
los fosfolípidos hexagonales.
PACIENTES
TPd 1:!00
TPd 1:200
TVVRd
vpp %
vpn %
vpp %
vpn %
vpp %
vpn %
Todos n=67
62
77
70
81
89
94
Con ACO n=40
53
70
64
80
86
95
Sin ACO n=27
80
83
80
83
93
92
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automatizarse, lo cual reduce el tiempo de
realización, economiza reactivos, minimiza
las variables pre-analíticas que pueden
alterar los resultados y por lo tanto reduce
los costos. La prueba de FH (Staclot® LA) es
difícil de realizar en sistemas automatizados,
ya que la cantidad de reactivos usados y los
tiempos de incubación necesarios exceden la
capacidad de la mayoría de los instrumentos
automatizados. Además, el costo institucional
por paciente con cada prueba de Staclot®
LA es de aproximadamente $300 pesos,
mientras que el de TVVR es de $100 pesos.
Estos hallazgos han hecho que en el
Instituto se emplee el TVVRd, sin añadir
plasma normal, como primera elección
para la búsqueda de AL en pacientes con
ACO. Sin embargo, el diagnóstico de AL
sigue basándose en la realización de varias
pruebas de escrutinio y de confirmación
que implican ambas vías de la coagulación.
Aunque hay lineamientos internacionales
para tratar de estandarizarlas, la principal
limitante es la ausencia de controles
internacionalmente aceptados, lo que obliga
a llevar el control de calidad interno en las
muestras positivas de pacientes, lo cual
dificulta la estandarización.
REFERENCIAS.
1.- 1.Tripodi A, Chantarangkul V, Clerici M. Laboratory
diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral
anticoagulant treatment. Thromb Haemost 2002:8;5836.
2.- Arnout J, Vanrusselt M, Huybrechts E. Optimization
of the dilute prothrombin time for the detection of the
lupus anticoagulant by use of a recombinant tissue
thromboplastin. Br J Haematol 1994;87:94-9.
3.- Wong RC, Adelstein S, Gillis D, Favaloro EJ.
Development of consensus guidelines for anticardiolipin
and lupus anticoagulant testing. Semin Thromb Hemost
2005; 31:39-48.
Revista de Hematología Vol. 7, No. 2, 2006
4.- Arnout J. Antiphospholipid syndrome: Diagnostic
aspects of lupus anticoagulants. Thromb Haemost
2001; 86:83-91.
5.- Chantarangkul V, Tripodi A, Arbini A. Silica
clotting time (SCT) as a screening and confirmatory
test for detection of the lupus anticoagulants. Thromb
Res 1992; 67:355-65.
6.- Lawrie AS, Purdy G, Mackie IJ. Monitoring of oral
anticoagulant therapy in lupus anticoagulant positive
patients with the antiphospholipid syndrome. Br J
Haematol 1997; 98:887-92.