Acción de los agentes químicos sobre las bacterias. Antibiograma

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TRABAJO PRÁCTICO No. 4
I. ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS BACTERIAS
OBJETIVOS
1. Demostrar la acción antimicrobiana de los compuestos químicos tanto in vivo como in vitro.
2. Demostrar la producción de sustancias antimicrobianas por las bacterias.
3. Realizar e interpretar un antibiograma.
GENERALIDADES
Son muchas las sustancias con efectos letales o nocivos sobre los microorganismos
(Antimicrobianos), algunas de ellas pueden tener un efecto bactericida, fungicida o virucida y destruyen
bacterias, hongos y virus, respectivamente. Otras ejercen un efecto bacteriostático o inhibidor del
crecimiento, en cuyo caso la viabilidad del microorganismo no se pierde. La línea de demarcación entre
ambos tipos de efectos no es precisa, ya que una sustancia bactericida puede inhibir el crecimiento sin
provocar la muerte, a baja concentración o cuando el período de exposición es breve. Generalmente se
observa que, concentraciones inferiores a las que tienen efecto antibacteriano, estimulan el desarrollo de
las bacterias llegando en algunos casos a producir mutaciones en ellas.
Basada en la acción de los agentes químicos sobre el microorganismo se establece la
desinfección. Este proceso conlleva a la muerte o la eliminación de los microorganismos capaces de
causar infección. La desinfección no incluye necesariamente la esterilización, aunque algunos procesos
de desinfección realizan una verdadera esterilización. En general, la desinfección se efectúa utilizando
agentes químicos como el ácido fénico (fenol), formaldehído, cloro, bicloruro de mercurio, etc. Existen
muchos desinfectantes químicos que llevan solo a la microbiostasis, es decir, que no matan
inmediatamente a los microorganismos, sino que inhiben su multiplicación, de modo que los
microorganismos mueren de horas, días o años, después de haber sido aplicado el agente desinfectante,
sin aumento importante de su número. Entre los agentes bacteriostáticos se pueden señalar: desecación,
temperaturas bajas, antibióticos, sulfamidas y ciertos colorantes como el cristal violeta.
1. Acción de los Agentes Desinfectantes y Antisépticos (Método de Difusión).
MATERIAL
a) Cultivo de Escherichia coli, Staphylococcus aureus o Bacillus subtilis de 24 horas en caldo
nutritivo.
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b) Discos de papel de filtro de 0,5 cm. de diámetro.
c) Placa de agar tripticasa soya.
d) Desinfectantes y/o Antisépticos: Fenol al 5%, Cloruro mercúrico al 1:1.000, Tintura de
yodo al 2%,
alcohol al 70%, Merthiolate al 1:1.000.
e) Pinzas.
f) Hisopos
PROCEDIMIENTO
1. Utilizando el hisopo, sembrar por diseminación la placa de agar tripticasa soya, con el cultivo
bacteriano.
2. Dividir ambas placas en cuatro cuadrantes con el marcador. Colocar en cada uno de los cuadrantes
un disco de papel impregnado con la solución de uno de los antimicrobianos en prueba. En cada uno de
los cuadrantes se colocará un desinfectante o antiséptico diferente.
3. Incubar las placas a 37º C durante 48 horas.
4. Observar los resultados midiendo el diámetro de las zonas de inhibición de crecimiento bacteriano.
¿Como determinar el tipo de acción que tiene la solución desinfectante?
1. Se debe subcultivar una porción del halo de inhibición de crecimiento bacteriano. Con un asa estéril
sacar un trocito de agar de cada una de las zonas de inhibición de crecimiento y sembrar en tubos de
caldo tripticasa soya.
6. Incubar a 37º C durante 48 horas y verificar si la acción del desinfectante es bacteriostática o
bactericida. Si hay crecimiento en el subcultivo en caldo tripticasa soya, la acción del desinfectante es
bacteriostática; si no hay crecimiento en el subcultivo en caldo tripticasa soya, la acción del
desinfectante es bactericida.
2. Determinación del efecto Antimicrobiano de las Sustancias Químicas in vivo
2.1. Desinfección de la Piel
MATERIAL
a) 3 placas de agar tripticasa soya.
b) Alcohol yodado al 1:200 en alcohol al 70%.
PROCEDIMIENTO
1. Presionar suavemente los dedos de una mano sin lavar, sobre una placa de agar tripticasa soya.
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2. Lavar seguidamente la mano con agua y jabón; sin secar presionar los dedos suavemente sobre otra
placa de agar tripticasa soya.
3. Repetir la operación anterior, agregando alcohol yodado.
4. Incubar las placas a 37º C, durante 48 horas.
5. Observar y comparar los resultados.
3. Acción de los Antibióticos
Los microorganismos en su hábitat natural pueden modificar ciertas las condiciones ecológicas,
así tenemos por ejemplo, que al producir sustancias metabólicas que se excretan al medio, estas bien
pueden, modificar las condiciones físico-químicas del sustrato como: pH, presión osmótica, tensión
superficial, etc., haciendo el ambiente desfavorable a otros microorganismos; o bien pueden tener
propiedades tóxicas que interfieren en el proceso de reproducción de otras especies microbianas,
produciendo un efecto letal o inhibiendo su multiplicación. A estas particularidades de la ecología
microbiana se le conoce como Antibiosis, la cual se define como la vida en comunidad de especies
microbianas en la cual una alteración del hábitat perjudica el desarrollo de otras especies microbianas,
estableciendo en forma natural el equilibrio ecológico microbiano. La actividad de las sustancias
activas puede ser determinada cualitativamente en el laboratorio utilizando técnicas de fácil realización.
Las sustancias activas para su estudio pueden tener tres orígenes:
a) Animal: (Lisozima) clara de huevo, lágrima, moco nasal y varios órganos.
b) Vegetal: Allicina (Alliun sativus) en el bulbo del ajo. Rafanina (Raphanus satirus) en el rábano.
c) Microbiano: Estreptomicina (Streptomices griseus), Cloramfenicol (Streptomyces venezuelae)
Polimixina (Bacillus polymyxa), Penicilina (Penicillium notatum), Griseofulvina (Penicillium
griseofulvum).
3.1. Acción de la Subtilina sobre los Microorganismos (Demostrativa)
Bacillus subtilis Cepa 6633 ATCC, de sus siglas en inglés “American Type Culture Collection”
produce una sustancia de acción antibiótica, la subtilina, con poder de inhibición sobre algunos
microorganismos.
MATERIAL
a) Crecimiento de B. subtilis (cepa 6633 ATCC) en estría simple sobre agar nutritivo en placa.
b) Cultivo de Sarcina lutea y de Escherichia coli en caldo nutritivo de 24 horas.
Método de Estrías Cruzadas
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3.2. ANTIBIOGRAMA
Se conoce con el nombre de Antibiograma a la prueba realizada para la determinación in vitro
de la sensibilidad y resistencia de una bacteria a un antibiótico y/o una mezcla de ellos entre si o con los
quimioterápicos.
Al analizar la infección encontramos que desde el punto de vista tradicional, intervienen el
microorganismo y el macroorganismo, hoy en cambio, es aceptado la triada de la infección, donde
juega papel fundamental el microorganismo, el hospedador y el agente antimicrobiano. En todo proceso
infeccioso el laboratorio microbiológico debe suministrar al clínico una información valedera que
permita establecer una terapia antimicrobiana para controlar la infección; para ello es necesaria la
identificación del agente etiológico y el antibiograma, indicando claramente que antibióticos son
activos y cuales no tienen ningún efecto sobre este agente.
El laboratorio microbiológico cuenta hoy con una serie de métodos que permiten estudiar in
vitro la sensibilidad y resistencia mediante los cuales podemos determinar:
- Actividad de una sustancia activa contra los microorganismos.
- Potencia del antibiótico.
- Límite de actividad de un antibiótico.
- Detectar en los líquidos orgánicos la presencia de sustancias activas.
Los métodos para realizar el antibiograma pueden ser por dilución y difusión. En el sistema de
discos impregnados con antibióticos la amplitud de la zona de inhibición no constituye necesariamente
una medida exacta de la potencia de la sustancia activa, dicha zona es la resultante de: concentración
del antibiótico, sensibilidad del microorganismo, capacidad de difusión de la droga en el medio sólido,
tiempo de incubación, temperatura, pH, y composición del medio de cultivo.
a) Sensibilidad y Resistencia a los Antibióticos - Método por Difusión (Antibiograma)
MATERIAL
a) 1 placa de Petri con agar dextrosa.
b) Los cultivos usados en los experimentos anteriores.
c) 1 tubo conteniendo hisopos de algodón estériles.
d) Discos impregnados con diferentes antibióticos (Discos de sensibilidad).
PROCEDIMIENTO
1. Inocular la placa de Petri, extendiendo el microorganismo sobre la superficie del agar con el hisopo
de algodón estéril. Dejar la placa inoculada en reposo por 5 minutos para que se seque la superficie.
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2. Esterilizar las puntas de una pinza a la llama y dejarla enfriar por unos segundos. Transferir
asépticamente los discos de antibióticos colocándolos sobre el agar, procurando no colocar más de 5
discos en cada placa, equidistantes, asegurándose de que los discos han hecho buen contacto con la
superficie del agar.
3. Incubar las placas a 37º C durante 48 horas.
4. Pasado el tiempo de incubación observar la zona de inhibición del crecimiento bacteriano indicado
por una zona clara (sin crecimiento) que rodea al disco. Medir el diámetro (en mm) de la zona de
inhibición de crecimiento bacteriano y comparar con los valores establecidos para cada tipo de bacteria
en la tabla de referencia (Tabla de Kirby-Bauer).
5. Interpretar el resultado comparando el diámetro de la zona de inhibición del crecimiento obtenida
con los valores de la tabla de Kirby - Bauer y establecer si el microorganismo es sensible o resistente al
antibiótico.
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