Principios de dicroismo circular (CD) y sus aplicaciones a las

Principios de dicroismo circular (CD)
y sus aplicaciones a las proteínas
José María Delfino
delfino@qb.ffyb.uba.ar
1
Luz no polarizada, plano polarizada
y circularmente polarizada
2
¿Qué es
dispersión
óptica
rotatoria
(ORD)?
α=[α]cl
nL≠nR
α (Ó φ)
3
Dos sistemas de representación del haz de luz
y
y
z
x
x
4
Tres ejercicios para comprender
la naturaleza (general) de la luz polarizada
1. Un haz plano polarizado resulta de la suma de 2 haces
circularmente polarizados de sentido opuesto (R y L) y en fase
¿Qué resultaría si –en cambio- ocurriere desfasaje?
2. Un haz circularmente polarizado resulta de la suma de 2 haces
plano polarizados perpendiculares entre sí y desfasados +¼ de onda (= +π/2)
¿Qué resultaría si el desfasaje fuere -¼ de onda (= -π/2)?¿Y si estuvieren en fase (=0)?
Recordar este punto para entender la función de la celda de Pockels (ver luego)
3. Un haz plano polarizado - cuya componente circular (R o L) fuere
absorbida (por una muestra dicroica) en mayor medida que la otra- resulta en
luz elípticamente polarizada
(¿Cuál sería la orientación del eje mayor de la elipse?¿Qué resultaría si existiere además desfasaje?
5
¿Qué es
dicroismo
circular
(CD)?
Dos expresiones
equivalentes:
AL≠AR
θ=[θ]cl
ΔA=Δεcl
6
Electromagnetic waves and circular dichroism:
an animated tutorial
By András Szilágyi (szia@enzim.hu)
www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm
7
Dicroismo circular (CD)
8
Dicroismo circular (CD)
Es la absorción diferencial por parte de una
molécula asimétrica (en nuestro caso, la cadena
polipeptídica) de dos haces de luz circularmente
polarizados de sentido opuesto (izquierdo y derecho)
Se mide a través del parámetro elipticidad (θ, theta),
un ángulo que se mide en (mili)grados
9
La luz
polarizada
plana se
convierte en
elíptica por
efecto de un
cromóforo
ópticamente
activo
10
Sin embargo, tanto ORD como CD son
manifestaciones diferentes de un mismo fenómeno,
cual es la interacción de la luz polarizada (ER y EL)
con moléculas quirales
En ORD, la detección consiste en evaluar el cambio de
velocidad de los haces a través del cambio en el índice
de refracción: nR ≠ nL
En CD, la detección consiste en evaluar el cambio en la
amplitud (|ER| y |EL| ) de los haces a través del cambio
en la absorción: εR ≠ ε L
11
Si CD y ORD están en verdad
relacionadas, la información es única
(redundante) y los espectros pueden
convertirse via las transformadas de
Kronig-Kramers:
12
El efecto Cotton es
la manifestación del
fenómeno de
interacción de la luz
polarizada con la
materia quiral.
Así se ve este efecto
en ORD y en CD:
13
CD es más utilizado hoy día que ORD
Existe instrumentación superior para CD (naturaleza
alternada de la detección en CD)
La forma de las bandas de CD (de un solo signo y más
angostas: menor spread) permite mayor facilidad en la
asignación y mejor resolución espectral
La asimetría de los cromóforos en proteínas (amidas,
grupos aromáticos y puentes SS) se induce por la
interacción con grupos vecinos (el entorno químico)
Estimar el contenido de estructura secundaria
Usos
Detectar cambios conformacionales
Medir la unión de ligandos
14
El espectro de ORD se asemeja a la derivada del
espectro de CD, sin embargo la dependencia con λ
es diferente
Por esto, es posible medir actividad óptica en
zonas alejadas del máximo de absorción (ej. azúcares)
En proteínas, en cambio, dada su absorción en el UV, se
mide CD y la concentración se expresa en términos del
peso promedio del residuo de aminoácido:
MRW=MW/#res
15
Condiciones físicas para que exista actividad óptica
Transición
ópticamente
activa
16
Las transiciones en proteínas:
Enlace peptídico: n→π* (br, w) ~ 210 nm
π→π* (sh, s) ~ 190 nm
Cistina:
S
χ3
S
Zona UV lejana
(180-250 nm)
…y residuos aromáticos (ver luego)
Residuos aromáticos (ópticamente inactivos
per se, pero ubicados en entornos asimétricos):
W, Y, F, H,
Cistina (w, ~ 280 nm)
Zona UV cercana
(250-340 nm)
… también grupos prostéticos (ej. hemo) y
metaloproteínas
17
Dicroismo circular (CD)
CD en la zona UV lejana (180-250 nm), donde
absorbe el enlace peptídico, refleja el contenido de
estructura secundaria
18
Dicroismo circular (CD)
0 M, W T
42
0.0 M, trunc.
-1
2.0 M, trunc.
5.0 M, trunc.
28
6.6 M, trunc.
6.6 M, W T
2
0
[ θ ] (deg cm dm ol )
ES-βL
S126C S265C ES-βL
S126C ES-βL
S265C ES-βL
2
-1
[θ] (grados cm dmol )
50
-50
-100
14
0
-14
-150
250
260
270
280
290
300
310
Longitud de onda
320
330
250
260
270
280
290
300
310
320
W avelength (nm)
CD en la zona UV cercana (250-340 nm), donde
absorben las cadenas laterales de W,Y,F,H y los puentes
disulfuro, revela características de la estructura terciaria a
través de la asimetría del entorno de esos residuos
19
La relación lineal entre elipticidad molar ([θ]) y la
diferencia de coeficientes de extinción molar (Δε)
Ley diferencial
de Lambert-Beer
Definición de
absorbancia A
20
La elipticidad molar ([θ]) y la diferencia en el
coeficiente de extinción molar (Δε) son medidas
interconvertibles por un factor
21
¿Cómo resulta [θ] = 3300 Δε?
22
Las expresiones básicas de ORD y CD
ORD
CD
Las unidades:
ORD
O
cm2 dmol-1
CD
O
cm2 dmol-1
23
J-815 Circular Dichroism Spectrometer
El instrumento de medida:
el espectropolarímetro
JASCO proudly announces the
new model J-815 Spectropolarimeter, our latest Circular Dichroism spectrometer.
Unparalleled optical performance and optionally available measurement modes are
combined in a manner to make the J-815 a true "chiro-optical spectroscopy workbench".
Instrument control and data processing are handled effortlessly by our JASCO's user
friendly and innovative cross-platform software, Spectra Manager™ II. As an option,
Spectra Manager™ CFR provides secure access and compliance features for 21 CFR Part
11.
•Compact benchtop design
•Air cooled 150W Xenon lamp or Water cooled 450W Xenon lamp
•Highest Signal-to-Noise ratioRange of precise temperature control accessories
Automated titration and stopped-flow accessories
•Spectra Manager™ II software for control and data analysis
•Spectra Manager™ CFR option for 21 CFR 11 compliance
•Flexible design allows field upgrades for different measurement modes and accessories as
applications evolve.
Measurement modes and Hyphenated techniques
Standard
Optional Accessories
•Peltier cell holders, single and six position
•Scanning emission monochomator
•Automatic titration system
•2, 3, and 4 syringe stopped-flow systems
•LD, ORD attachments
•Permanent, electro and super-conducting magnets
•Near IR extended detection
•And many more!
Optional Program
•Protein secondary structure estimation program
•Detatured protein analysis program
•Multi-WL variable temperature measurement program
•Macro command program
•And many more!
•Circular Dichroism/UV/VIS absorbance
Optional
•Linear Dichroism (LD)
•Optical Rotatory Dispersion (ORD)
•Total Fluorescence (TF)
•Scanning EM Fluorescence
•Fluorescence Detected CD (FDCD)
•Stopped-Flow CD
•Stopped-Flow Absorbance
•Stopped-Flow Fluorescence
•Chiral HPLC Detection
•Magnetic CD (MCD)
•Near Infrared CD (NIRCD)
24
El instrumento de medida:
el espectropolarímetro
Celda de Pockels
25
La calibración del
espectropolarímetro
CSA
Δε -4.9 @ 192.5 nm
Δε +2.36 @ 290.5 nm
Rango A280 ~ 0.4-1.0 en proteína
26
Aspectos instrumentales I:
Fabricantes: Horiba-Jobin Yvon, Jasco, AVIV
Fuentes de luz más intensas vs. fotodetectores
ΔA ~ 10-4 A
eficientes y electrónica superior para reducir ruido
Celdas de 1 a 10 cm en la zona UV cercana: señales débiles y
Celdas de 1, 0.5, 0.1 mm (y hasta 0.05 y 0.01 mm!) en la zona UV
lejana, para minimizar la absorción del solvente
Flujo de N2 continuo: evitar daño por ozono de la óptica (espejos)
Conocer exactamente la concentración de proteína en la muestra
medida al momento de la determinación: por espectrofotometría (con
un ε confiable), o por análisis de aminoácidos cuantitativo
27
Aspectos instrumentales II:
Reducción de ruido espectral via:
- suma de varios barridos/suavizamiento digital (Savitzky-Golay, FT)
- aumento del tiempo de colección de datos (especialmente en UV
muy lejano, donde la absorción es muy alta, p.ej. 1 nm/min y 4 seg
constante de tiempo). En general, mantener el producto:
vel. barrido (nm/seg) . constante de tiempo (seg) < 0.33
- alternar toma de espectros de muestra con blancos de buffer y
patrones standard
Cuidar la transparencia de buffers (fosfatos, perclorato, Tris, boratos, de
elección) y aditivos (DTT o βME < 1 mM, EDTA < 0.1 mM)
Pueden admitirse muestras con dispersión apreciable de luz (p.ej. proteínas
de membrana en micelas) MOPS, lubrol y SDS aceptables
El contenido de información espectral aumenta mucho cuanto menor sea la
λ de colección (barrer hasta λ < 190 nm)
28
Usos comunes del dicroismo circular (CD) en
proteínas:
- Estimar el contenido de estructura secundaria
- Medir fenómenos de unión de ligandos
- Evaluar cambios conformacionales
29
Algunos sitios de interés sobre dicroismo circular (CD)
Breve introducción, tutorial c/ejs. y pgmas: www.imbjena.de/ImgLibDoc/cd/index.htm
Breve análisis crítico de la técnica:
www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss_960531_21.html
Clase sobre CD con aplicaciones a proteínas y ácidos nucleicos:
www.newark.rutgers.edu/chemistry/grad/chem585/lecture1.html
Aspectos prácticos de transiciones: www.aplab.com/circular_dichroism.htm
Conceptos básicos e instrumentación: www.ruppweb.org/cd/cdtutorial.htm
Teoría sobre luz polarizada con animaciones:
www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm
Un banco de datos de espectros de CD en construcción:
pcddb.cryst.bbk.ac.uk
Sobre la deconvolución de espectros de CD: DICHROWEB:
www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html
Tutorial simple con enfoque aplicado: wwwstructure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
30
Libros de
referencia
1979
2005
1997
1996
1984
1998
1980
31
32
Estimación del contenido de estructura secundaria
Los espectros
de base (basis
set) para los
diferentes tipos
de estructura
secundaria:
hélice α, hoja β,
y ovillo al azar
Un problema mayor
es la elección
criteriosa de los
standards
A partir de polímeros de
aminoácidos
(Fasman)
Problema: dependencia
con el largo de las hélices,
hojas o coils, incierto
aporte de los turns
A partir de estructuras
3D tomadas del pdb:
hélice α, hoja β
paralela y antiparalela,
turns β tipo I, II y III
(Wetlaufer)
33
Deconvolución del espectro en componentes standard
34
Existen muchos métodos para deconvolucionar espectros de CD, de
modo que pueda derivarse el contenido de estructura secundaria:
SSE
CONTIN
BELOK
VARSLC 1
Self-consistent
LINCOMB/CCA (convex constraint analysis)
BPNN (usa redes neuronales)
SOM-BPN
PROT CD
Consultar el sitio DICHROWEB: www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html
Sin embargo, persisten problemas referidos a la confiabilidad de los basis
sets (p.ej. hay menos datos sobre estructura β que sobre α), y la contribución
variable de los residuos aromáticos en esta región espectral (ver luego)
35
Proteínas todo
α
36
Proteínas β
37
Proteínas α
+β
38
Proteínas α/β
39
Proteínas desordenadas
40
La contribución de los residuos aromáticos
41
Una nota de precaución a la hora de interpretar
las contribuciones a [θ]222!
42
43
La unión de ligandos: unión de calcio a calmodulina
44
La unión de un intercalador a DNA de doble cadena
45
Dos equilibrios ligados: plegamiento de la
proteína P y unión de ligandos aniónicos
46
Dos proteínas estructuralmente muy similares
con mecanismos de plegamiento muy diferentes:
alfa-lactalbúmina bovina (α-LA) y lisozima (HEWL)
HEWL
apo α-LA
HEWL
apo α-LA
47
Intermediarios
de plegamiento
en α-LA y
HEWL
U
N
N
(Kuwajima)
El estado MG de
α-LA conserva la
señal dicroica en
la zona UV lejana
y la pierde en la
zona UV cercana
U
HEWL
MG α-LA
U/MG
U
N
N
HEWL
α-LA
48
Un ejemplo de molten globule (MG):
conservación de estructura secundaria con
pérdida de interacciones terciarias, un paso crítico
en la inserción de colicina A en membranas
pH 2
pH 2
pH 7
pH 7
49
El polipéptido canal P190
cambia su conformación
en función del pH
50
Cinéticas de plegamiento
detectadas por CD
(time resolved CD)
El caso del citocromo c
(Elöve, Englander, Roder)
51
Cinéticas de
plegamiento de
HEWL y α-LA
(Kuwajima)
52
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54
55
56
57
58
59
Algunos sitios de interés sobre dicroismo circular (CD)
Breve introducción, tutorial c/ejs. y pgmas: www.imbjena.de/ImgLibDoc/cd/index.htm
Breve análisis crítico de la técnica:
www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss_960531_21.html
Clase sobre CD con aplicaciones a proteínas y ácidos nucleicos:
www.newark.rutgers.edu/chemistry/grad/chem585/lecture1.html
Aspectos prácticos de transiciones: www.aplab.com/circular_dichroism.htm
Conceptos básicos e instrumentación: www.ruppweb.org/cd/cdtutorial.htm
Teoría sobre luz polarizada con animaciones:
www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm
Un banco de datos de espectros de CD en construcción:
pcddb.cryst.bbk.ac.uk
Sobre la deconvolución de espectros de CD: DICHROWEB:
www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html
Tutorial simple con enfoque aplicado: wwwstructure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
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Libros de
referencia
1979
2005
1997
1996
1984
1998
1980
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