Biotecnología vegetal

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
• Definición: conjunto de técnicas, de cualquier tipo, empleadas sobre vegetales como
organismos enteros o sobre alguna de sus partes (moléculas, tallos, orgánulos, hojas)
• Objetivos: mejorar las especies, obtener nuevos productos, obtener de una especie productos
minoritarios útiles para la industria.
• Cultivo in Vitro: base de la biotecnología. Consiste en el cultivo de partes de una planta
sin tener la planta. Se realiza a partir de zonas meristemáticas (que poseen células similares a las
células madre en animales). Estos meristemos tienen la capacidad de cultivarse y dividirse en
determinadas condiciones. Mediante técnicas de cultivo, si tomo un explanto (fragmento de una planta)
y lo coloco en un medio adecuado, se induce la formación de una nueva planta sin la necesidad de
semillas .Estas plantas se llevan a maceta donde se desarrollan.
• aplicaciones del cultivo in Vitro:
• propagación de especies en vías de extinción
• conservar y cultivar especies de mucho valor
• obtener plantas libres de enfermedades cultivando el meristemo
apical, que no tiene conexión con el resto de la planta y está libre de microorganismos.
• micropropagación (propagación vegetal in Vitro) rápida de
plantas ornamentales que tenemos en tubos de cultivo y fácilmente se pueden llevar a otros piases y allí
se colocan en invernaderos.
• Obtención de híbridos incompatibles sexualmente, juntamos
genomas de 2 plásmidos diferentes, que serán HÍBRIDOS SOMÁTICOS.
• Obtención de plantas homocigóticas rápidamente; sembramos in
Vitro óvulos, obtenemos la mitad de los genes (haploides), damos colchicina y obtenemos un individuo
diploide.
• Transformaciones genéticas: introduciendo genes que nos
interesan
• Almacenamiento de plantas en poco espacio
• Uso de plantas (previamente transformadas) para purificar agua,
mejorar el suelo, eliminar compuestos tóxicos, metales)
• Asepsia
1
• fuentes de contaminación:
• material plástico: se compra estéril
• material de vidrio: si es nuevo se lava con agua desionizada, si se
reutiliza lavar en autoclave (121º) o estufa (140º)
• material metálico; en autoclave a 120º, también al alcohol a fuego.
• Medio de cultivo: en autoclave a 120º 15 min. Si hay sustancias
termolábiles no se puede usar autoclave, una vez preparado se hace pasar por cámara de flujo laminar
con filtro estéril.
• Material biológico: asepsia superficial con lejía, luego eliminar las
células dañadas, las semillas en alcohol etílico (20 seg.) y se evapora al aire. También podemos usar
detergentes
• Área de trabajo y cultivo: el cultivo se desarrolla en una cámara de
aire forzado. El uso de luz UV mantiene la asepsia, pero el 03 liberado es tóxico. Las placas se sellan con
parafilm.
• Procedimiento
• limpiar el material con agua
• preesterilización: 5−30 seg. con etanol
• desinfección con agente tensioactivo
• lavar con agua estéril
• disección con material con pinzas estériles (flambear)
• cerrar y sellar placa con film de parafina
• pruebas de esterilización
Enturbiado (medio líquido)
Aparición de colonias
Mal olor
• preasepsia. Para evitar posible contaminación: almacenamiento en frío,
estimulación climática, tratamientos preculturales
• Medios de cultivo: el más habitual es el medio MS, aunque no existe el medio perfecto.
Puede ser: Sintético: formados por componentes perfectamente definidos.
Complejos: formado por algún compuesto no definido.
Están formados por:
• nutrientes orgánicos: sales de fosfato, N en forma de nitrato o amonio, Fe a
pH= 5.2. se recurre a quelantes.
2
• Nutrientes orgánicos: fuente de energía porque no hacen fotosíntesis, fuente
de C: sacarosa, fructosa, poli OH vitaminas: biotina, tiamina.
• Sustancias reguladoras del crecimiento: auxinas (naturales= AIA o
sintéticas=2,4 −D)
Citoquininas (naturales
=ZEA o sintéticas= KIN).
• gelificación: añadir gelificante en medio semisol.
• Condiciones físicas: luz/ oscuridad .Tª de 25º. Gases: sin problemas excepto por
la acumulación de etileno.
• Niveles de modificación
• Molecular
• A nivel genómico: mapeado y aislamiento de genes de interés.
mapeado: identificar genes de un rasgo determinado (tamaño). Arabidopsis
thaliana, Pirus taeda: deforestación)
aislamiento: los genes puede ser que se expresen
• constitutivamente: siempre y en todos los sitios.
• Selectivamente: sólo en una parte (fase) por ej. Cuando florece.
Podemos hacer que un gen constitutivo se exprese selectivamente, también
podemos silenciar los genes (que no se expresen): interesa que la almendra no produzca amigdalina.
• Control de rutas metabólicas
se puede modificar la actividad enzimática.
se pueden potenciar rutas minoritarias, obteniendo metabolitos secundarios.
hacer que una planta deficitaria en aá no lo sea.
mejorar la ruta de las proteínas
• Desarrollo y diferenciación
favorece el crecimiento de plantas en condiciones diferentes a las de su
naturaleza
favorecer el crecimiento en raíces
3
controlar la talla (pinos más largos y menos ramificados)
captar energía para incrementar la biomasa
hacer que los frutos duren más tiempo tras su recogida
• Interacciones con el medio
el medio puede ser :abiótico, biótico(insectos, hongos)
conseguir plantas resistentes al calor y tolerantes al frío
plantas resistentes al ataque de patógenos
−formando FITOALEXINA
− lanzando compuestos al aire
− organismos que protegen
plantas resistentes a la salinidad, a la sequía
• Estructural (crecimiento)
• para ello, incidimos sobre los parámetros que hacen crecer a la planta.
• Las plantas pueden crecer: aumentando el número de células y aumentando
el tamaño de las células.
El crecimiento de una planta es el sumatorio de los procesos de división celular y diferenciación celular.
Con la división se aumenta el número de células. Con la diferenciación, incrementa la diversidad
celular, no incrementa la materia orgánica.
• el crecimiento celular dependerá (la diferenciación): de relación de
crecimiento, dirección de crecimiento y capacidad de división.
• Para que una célula vegetal crezca hay que ablandar la pared celular, esto se
consigue, disminuyendo el pH, con auxinas, acción enzimática. Ha de ablandarse pero no en exceso.
• Una vez ablandada, se van depositando capas de celulosa de forma: apical
(células alargadas y plantas de gran porte) o difusa (en tallos, frutos, crecimiento en grueso). La
depositación la dirigen los túbulos que forman el citoesqueleto celular.
• La división celular da lugar a la formación de una capa de células, la
división también está algo influenciada por los túbulos, si rompemos el plano de división creado por
los túbulos: crecimiento anárquico. La división también está influenciada por la luz, el calor
• El núcleo condiciona la estructura del vegetal:
4
♦ FITÓMERO: estructura entre 2 hojas, formado por nudo, entrenudo,
hoja y yema.
♦ ÁPICE: zona apical por donde crece la planta, también controla la
salida de hojas
♦ CÉLULAS TRAQUEALES: células conductoras. Su producción está
controlada por túbulos.
♦ CÉLULAS TOTIPOTENTES: células susceptibles de mantener sus
genes y reiniciar su división
• Técnicas más habituales en cultivo in Vitro
• Por semillas
• Por esquejes
• Por biperismo las células vegetales, al ser totipotentes,
• vegetativa cualquier parte de la planta vale para
proliferar
ORGANOGÉNESIS: ruta que conduce a la diferenciación de meristemos que originarán tallos o raíces
adventicias, respectivamente.
Hay que regenerar la planta (organogénesis). Cojo yemas auxiliares, para conseguir una planta clónica.
Es un proceso rápido, muy útil para plantas de mucho valor (sólo obtenemos tantas plantas como
yemas hay). Estas yemas en un medio adecuado dan tallos.
También podemos promover la formación de tallos adventicios (tallos que no había). Esto se hace
cogiendo un explanto que se somete a unas condiciones adecuadas, inicialmente tengo un callo (masa de
células indiferenciadas) en los bordes o lesiones del explanto, tras un tiempo se formarán internamente.
Tras un tiempo aparecen órganos (dependiendo de si en el medio hay auxinas o citoquininas).
Puede haber organogénesis directa: cuando los órganos se originan directamente del explanto en
ausencia de proliferación del callo, aunque normalmente es indirecta.
Puede haber variación somoclonar cuando hay células que mutan espontáneamente.
También podemos recurrir a la embriogénesis somática, con el fin de obtener embriones somáticos (es
una ruta alternativa a la organogénesis). Un embrión somático se forma en el cuerpo de la planta por
los diferentes tratamientos, son estructuras bipolares. Para que se forme un embrión somático, hay que
inducirlo, el principal inductor son las hormonas.
Puede haber embriogénesis directa: si en la superficie del explanto se forma directamente el embrión.
Puede haber embriogénesis indirecta: si en la superficie del explanto, se forman callos y sobre este callo
surge el embrión. La embriogénesis puede ser:
• zigótica: el zigoto está dentro de la planta protegido por ella.
5
• Somática: es más variable.
Para inducir la formación de un embrión somático es imprescindible un tratamiento con auxinas
(2,4−D) y una vez que se ha inducido el crecimiento del embrión hay que retirarles del medio ya que en
vez de estimularse, se inhibe. Además de auxinas, en el medio ha de haber Potasio y Prolina que
desarrollan algo más los embriones.
Para el desarrollo y maduración del embrión podemos utilizar 2 medios, líquido o sólido.
Las auxinas hacen que se formen células más densas de los normal que son las que luego darán el
embrión. Cuando quitamos las auxinas se forman glomérulos de células: FASE GLOMERULAR DE
EMBRIÓN. Los glomérulos pasan por distintas fases:
Estado de corazón fase de torpedo estado cotiledón embrión
• Diferencias entre embriogénesis /organogénesis:
• EMBRIÓN: estructura bipolar, surge normalmente a partir de una célula,
ápices cerrados y hay conexión entre ellos.
• ÓRGANO: formación de estructura monopolar, surge a partir de de varias
células, tallos y raíces se forman de modo independiente, ápices sin cerrar.
• EMBRIÓN CIGÓTICO: de embrión pasa a semilla
• E. SOMÁTICO: de embrión pasa directamente a planta
• Obtención de plantas haploides:
Las plantas haploides tienen la mitad de la dotación cromosómica y no suelen ser viables. Podemos
obtener: plantas androgénicas (2n) a partir del polen (n) o plantas ginogénicas(2n) más viables pero
más difíciles de manejar a partir del óvulos(n).
• ANDROGÉNESIS: obtener una planta a partir del polen. No hay que esperar
a que se forme el polen, quito las antenas y la coloco en un medio adecuado, pueden ocurrir 2 cosas: que
se forme callo, embrión (n), o que haya embriogénesis directa, embrión (n), aunque también pueden ser
2n. Si cultivo el polen se forma un embrión n, nunca uno 2n. Para ver si la planta formada es n o 2n lo
hacemos por citometría, flujo, PCR
• MICROSPOROGÉNESIS: formación normal del polen
• CULTIVO NODRIZA: cultivo en el que se aprovecha un cultivo previamente
hecho como soporte.
• GINOGÉNESIS: obtener una planta a partir del óvulo. Obtenemos plantas
más verdes mientras que en la androgénesis hay 60% albinas, sin clorofila que no proliferan. Es más
complicado porque no es fácil separar el óvulo nitidamente.
• Fecundación de 2 plantas filogenéticamente separadas, perdemos una
6
dotación cromosómica(n)ej. Hard vulgare+ h. Bulvoso.
• Cultivo de órganos: raíz + agrobacterium rizogeus: obtenemos raíces peludas que son muy estables.
1. INGENIERÍA GENÉTICA, TRANSFORMACIÓN Y MANIPULACIÓN: la técnica consiste en:
• Identificar los genes: una manipulación genética puede ser aditiva o eliminativo.
• Extracción del gen: se necesita una secuencia determinada que se corta con enzimas de
restricción que son enzimas específicas de secuenciación que cortan por un punto determinado
• Multiplicación: amplificación, para ello introduzco el gen en una bacteria y así se
obtienen muchas copias.
• Introducción del gen en una planta (formas alternativas):utilizo algún vector (bacteria,
virus) lo más habitual es introducirlo en un plásmido (se corta la parte del plásmido que interesa y se
introduce un gen, así ya se tiene el gen en la bacteria) cuando la bacteria ataque la planta, introduce el
gen, que va al genoma de la planta. El vector más usado es el Agrobacterium.
Otras alternativas son : bombardeo con partículas, proyectar partículas a gran velocidad para que se
introduzcan en las células: MICROBIOLÍSTICA. Las partículas pueden ser An (caras, regulares y
uniformes) o Tusteno (baratos pero irregular). Estas partículas se recubren con el gen que yo quiero
meter, la ventaja es que no hay que liminar bacterias con Ab.
Otro sistema es la ELECTROPROPAGACIÓN: utilización de protoplastos y una serie de liposomas.
Mediante una corriente eléctrica los liposomas se fusionan (con el gen dentro) con la membrana del
protoplasto (célula vegetariana sin pared celular) y así el gen puede llegar al núcleo. También con
jeringas
• Eliminación de la bacteria: con Ab una vez el gen está dentro de la planta
• Regeneración de la planta. Marcadores. Planta transgénica: lo primero es saber qué células
contienen el gen, eso es sencillo porque en el gen que nos interesa, existe además del promotor y una
fase Terminal, tiene un gen marcador o de sección.
TIPO DE MARCADORES:
• de resistencia: por ej. La KANAMICINA: las células que presenten resistencia a la Kanamicina,
serán los que contienen el marcador y por lo tanto nuestro gen. Esto se ha rechazado porque
puede resultar peligroso para los hombres
• de coloración: se usan dos
♦ gen productor de antocianinas: las células se ponen de color azul
♦ gen de la glucorinato sintetasa (GUS): las células con este gen, en presencia de un
sustrato comercial, liberan un colorante azul que no es permanente.
• de fluorescencia: hay que irradiar con luz UV
gen de la luciferasa: irradian fluorescencia
proteína fluorescente verde (GFP): luminosidad verde.
Una vez que tengo las células con un gen, regenero la planta y ya se tiene una planta transgénica
7
(plantas obtenidas artificialmente mediante técnicas de ingeniería genética, alterando alguno de sus
genes con el fin de obtener algún tipo de beneficio)
Se ha encontrado una alternativa que consiste en introducir los genes en los cloroplastos y no en el
núcleo celular, ya que los cloroplastos son específicos de células vegetales.
• Ventajas de introducir los genes en los cloroplastos:
• Los genes se introducen en los cloroplastos de forma definida y no al azar
• Una célula vegetal tiene muchas copias del cloroplasto, es más rentable
• La síntesis que se produce en los cloroplastos, no va a afectar al resto de la célula
• Hay menor posibilidad de contaminación con genes extraños si transforma los cloroplastos
2. LOGROS Y POSIBILIDADES DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
2.1 En agricultura:
− domesticación de plantas: en este caso se abandona una variedad de beneficio de otra.
.− el maiz antes tenía muchas espigas y pocos granos, ahora se ha conseguido que con 2 espigas tengan
más granos.
.− hay una serie de genes que se transmiten juntos, si se logra contar todos, tendremos una planta
domesticada, pero no es posible en todos los casos.
− conseguir más a menos coste: manipulando la siembra, el riegoaumentando la producción.(aumenta
el potencial genético)
− semillas resistentes a determinadas hervicidas
−conseguir nuevas variedades
− hacer plantas tolerantes a determinados alimentos o resistentes a sustancias tóxicas (aluminio
citratosintetasa)
− microrizas: hongos sobre las raíces principales, hacen que exista una capa húmeda.
−infectar la planta con organismos que capten N2 y así la planta puede fijar N2.
−favorecer la absorción de H2O variando el diámetro radicular mediante modificación hormonal,
regular tamaño de hoja y modificando los sistemas estomáticos.
−plantas resistentes a agentes biológicos para no tener que hacer uso de pesticidas.
Resistente a:
Virus: hacer que la planta exprese genes sin sentido. Explanaos sin virus para obtener la planta
Bacterias: con la producción de fitoalexinas que son componentes antimicrobianos de bajo Pm, que se
sintetizan y acumulan en las plantas después de la exposición al organismo. Su producción se dispara
por la acción de los ELICITORES.
Hongos: producción de Ab. Haciendo que se exprese la estilbeno sintetasa que provoca la síntesis de
8
resveratol que inutiliza al hongo(en la vía). Producción de quitinasa que destruye al hongo mediante
lisis (arroz resistente al hongo)
Insecto: se puede usar baculovirus: el insecto se lo come y muere
Insecticidas naturales: el Bacillus Thurigensis, al esporular produce un cristal que si es comido por el
insecto, destruye su interior.
Nemátodos: casi todos los nematicidas están prohibidos
Plantas resistentes a Ab:
Tº: introducir genes CORI 5ª que la hacen resistente al frío.
segura: introducir genes mesembriaterum (de zonas desérticas)
hervicidas: introducir genes BAR: tolerancia a fosfatos
2.2 En alimentación : interesa eliminar agentes que afecten a la cosecha, hacer que el coste sea menor
que la producción, aumenta el consumo de otros vegetales, aumenta el tamaño de los sumideros (alta
producción alimentos/hectárea) alta calidad de los alimentos.
− proteínas:
Animales: más completas
Más caras
Vegetales: más carencias −cereales: déficit de Lys
Más barata − legumbres: déficit de aá azufrados
− alfalfa: déficit de aá azufrados
Hacemos modificaciones introduciendo genes que aumenta el contenido en aá deficitarios.
− patatas transgénicas ricas en triptófano
− colza americana rica en lisina
− alfalfa rica en aá azufrados= mejor lana
− girasoles ricos en metionina
− trigo con más gluten para harinas diferentes
− grasas:
alargar la cadena de ácidos grasos; soportan mejor el calor y así podemos reutilizar el aceite.
se potencian los de tipo oleico
9
− glúcidos:
muchas o pocas ramificaciones del almidón para bollería, pan
transformar celulosa en fructano que no aporta calorías???
menos cantidad de lignina (sabor desagradable) introduciendo un gen sin sentido/ contrasentido.
alfalfa con fitasa que mejora el metabolismo
− carotenoides:
usando genes (narciso y agrobacterium) se han conseguido arroz con carotenos que no hay en el arroz
corriente y que provoca avitaminosis en Asia.
astaxantina que da color rosita al salmón.
− minerales:
gen de la ferritina introducido en el arroz, así aporta 100 veces más de Fe.
eliminar cianoalanina (latinismo)de alimentos
mediante cruces se ha obtenido la colza doble O que no posee ácido erúcico (malo)
− frutos y semillas:
frutos que duren más tiempo: flave−save: tomates que duran incluso un mes, alterando peptidasas.
flores que duren más tiempo: actuando sobre receptores de etileno
frutos sin semillas: para mejorar el paladar, facilitar elaboración de tomates, Ketchup, actuando sobre
auxinas.
café descafeinado del árbol: introducción de xantin−7−transferasa (enzima productora de cafeína) que
es una enzima sin sentido (café con 1− 2% cafeína)
NORMAS DE LA OMS PARA EL CONSUMO DE TRANSGÉNICOS:
1− No contener sustancias peligrosas
2− No superar la toxicidad permitida
3− Advertir la presencia de compuestos nuevos o alergénicos
2.3 Industriales
− grasa vegetal/aceites usados como combustibles (diesel) o lubricantes en hidráulica.
−aceites que valen como aislantes, adhesivos, emulsionantes.
−obtener algodón de colores, usando determinados genes, son plantas de algodón transgénicas
10
− detergentes: la subtilisina es una enzima que destruye la grasa, se está modificando para que además
sea resistente a la lejía.
−aditivos y colorantes
−espesantes
−obtención de plásticos biodegradables mediante bacterias que son capaces se síntesis de
polihidroxivaleratas.
2.4 En sanidad:
.− glucobrassicina: protege el estómago
.− cataratas: antileucémico
.− obtención de vacunas orales
.− en tomate se ha introducido el gen spaA del tabaco que inhibe la adhesión a piezas dentales (menos
caries)
2.5 En el medio ambiente.
a. fitorreparación: sólo es necesario agua y sal, se eliminan metales, disolventes
.− corregir los malos efectos del MAN
.− FITOEXTRACCION: las plantas toman productos y los acumulan en la parte aérea, se cogen, se
queman y se eliminan. El gen mer P y mer T eliminan compuestos orgánicos de Hg que son muy
tóxicos.
.−RILOFILTRACIÓN: las raíces, al filtrar el agua acumulan compuestos.
.−FITOESTABILIZACIÓN: mediante el uso de compuestos que liberan las raíces se estabilizan y
solubilizan los metales.
.− FITOVOLATILIZACIÓN : los compuestos que se abs por el agua, se expulsan al aire y se degradan.
.− RIZODEGRADACIÓN: las raíces, al ir avanzando remueven la tierra y captan sustancias que las
bacterias usan para degradar sustancias tóxicas.
b. fitodegradación: * control hidráulico, mediante:
1. bombas hidráulicas: aprovechar el efecto de la transpiración para hacer pasar por la planta mucha
agua.
2. Corredores ribereños: usando por ejemplo álamos con baja concentración de nitratos de 150 mg/l a 3
mg/L.
2.6 Vitaminas hidrosolubles
2.7 Ética en biotecnología vegetal:
11
. Riesgo : ha de ser menor que el beneficio
. principio de autonomía: el paciente o la población ha de estar informada
. Principio de justicia: los beneficios han de ser para todos
. Información: ha de ser veraz y dada por el científico
a. riesgos o problemas que dan las plantas transgénicas: hay que ver si el riesgo es en el producto final o
en el hombre. Se exige que el riesgo se detecte antes de que el producto se use, aunque en muchos casos
no es detectable.
1. problema para el hombre: que se produzcan toxinas y alergias
2. problemas para el ambiente: al introducir genes extraños en una planta, puede ocurrir: muerte de la
planta, la planta se asilvestra, se pasen genes de una planta a otra= flujo transversal (sólo en plantas que
se polinizan por el viento) de genes, de 3 formas:
polen
restos de la planta
exudado de hojas o raíces
O por último apilamiento de genes: que se encuentren los genes que hemos introducido por transgénesis
con los que la planta ha cogido de las plantas próximas.
b. patentes: propiedad intelectual: se pueden patentar productos y procesos pero no la vida, las patentes
se hacen para recuperar la inversión hecha en la investigación.
Las patentes han de cumplir unos requisitos:
1. exclusión
2. innovación: se patentan descubrimientos totalmente novedosos.
3. reproducibles: se han de poder repetir
4. subjetividad: en cada país hay unos requisitos
5. limitación en el tiempo: normalmente 10 años.
Hay que etiquetar los transgénicos obligatoriamente, en EEUU no es obligatorio.
3. CULTIVOS LÍQUIDOS: se utilizan para el cultivo de órganos (tallos, raíces) y células.
3.1 Cultivo de órganos: explanto (plántula) da callo y de ahí raíces y tallos
El cultivo de tallos se utiliza para la formación de metabolitos secundarios.
El cultivo de raíces se utiliza para el estudio de los requerimientos nutritivos del vegetal y para la
producción de metabolitos secundarios
12
Se necesita plántula joven (formada en condiciones de asepsia), se asila la raíz y se corta en pequeñas
secciones, lo que nos interesa es el meristemos apical (que no tiene conexión con el resto de la planta y
estará libre de org). Se coloca en un medio adecuado con fuente de C (sacarosa) y tiamina, así se
forma el callo.
Al cabo de un tiempo crecen raíces laterales/tallos.
Subcultivo, se realiza cortando los ápices de las nuevas raíces laterales y así sucesivamente.
La única diferencia fisiológica entre una raíz de laboratorio y una normal es que nunca se forman
raíces con crecimiento secundario en el laboratorio y que se pierde la respuesta gravitrópica
3.2 Cultivo de células:
Células aisladas en un medio líquido: suspensión celular. Este tipo de cultivo proporciona células
relativamente homogéneas que crecen en un líquido de composición definida. El contacto con los
nutrientes es grande porque deben crecer con agitación y se facilita el intercambio gaseoso entre el
medio y la población. A este medio nutritivo se le pueden añadir productos exógenos fácilmente:
modificando el crecimiento celular.
Cualquier órgano puede ser donante de células, las células se aíslan de forma mecánica (raspando,
incisiones) o por tratamiento enzimático (tto con pectinas que degradan la pectina que las une=
Generalmente a partir del órgano se forma el callo y si este es suficientemente friable, en un medio
adecuado y con agitación, las células se separan.
El medio de cultivo es similar al de formación de callos (fuente de C, tiamina, hormonas..)
Se lleva a la cámara de cultivo
Se cámara de crecimiento aproximadamente 2 semanas
Una vez incubadas se puede hacer el subcultivo
* Si queremos que el proceso sea más rápido y que crezcan más células, lo que hacemos es transferir un
poco de células formados a un medio líquido.
3.3 Caracterización de suspensiones celulares: curva de crecimiento
DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO
CURVA SIGMOIDEA
FASE 1: FASE DE LATENCIA (LAG): no hay división celular
FASE 2: FASE EXPONENCIAL O LINEAL: división celular muy activa
FASE 3: FASE ESTACIONARIA: casi no hay división
FASE DE LATENCIA: preparación de las células para la división
! ATP y ! NADPH
13
!invertasa, enzima que rompe sacarosa en glucosa y fructosa. Pequeños aumento de RNA
FASE EXPONENCIAL: ! síntesis de ácidos nucleicos.
FASE ESTACIONARIA: la división disminuye y los nucleótidos se estabilizan. Gran consumo de
nutrientes
Se producen metabolitos secundarios, la producción de metabolitos secundarios está asociada a la
diferenciación celular que no es más que una diferenciación metabólica.
3.4 Técnicas para conocer la cinética de crecimiento.7+ ensayos de tinción diferencial.
1. Aumento de peso: peso seco/peso fresco
2. Contaje de células: cámara de recuento (muy fiable)
3. Calcular el volumen celular de empaquetamiento: por sedimentación tras centrifugación y midiendo
la altura del sedimento.
4. Contenido en proteínas y DNA: observar en qué fase están las células
5. Conductividad del medio: disminuye según envejece la población celular
6. Viabilidad celular: va disminuyendo
* ENSAYOS DE TINCIÓN DIFERENCIAL:
1. TINCIÓN POSITIVA: tinción de células vivas
a: Cloruro de trifenil tetrazolium: incoloro en solución y al reducirse queda rojo (las mitocondrias
reducen el compuesto y la célula queda roja)
b: Diacetato de fluoresceína: incoloro en forma de sal, pero al liberar la fluoresceína se queda
fluorescente. Las células tienen actividad estearasa en su membrana y rompe el enlace ester, por lo que
quedan células fluorescentes. Es necesario un microscopio de fluorescencia.
2. TINCIÓN NEGATIVA: tiñen células muertas
a. Azul de Evans: tiene alto Pm y es rechazado por las células vivas. Entra en células muertas porque su
membrana ya no es selectiva.
7. Consumo de nutrientes: valoración de azúcares totales, nitratos y fosfatos.
3.5 Cultivos celulares en suspensión
a. discontinuos: a lo largo del tiempo, va variando la composición del medio, también varía la población
y el metabolismo celular
b. continuos: se va añadiendo medio frasco continuamente (a distinta temperatura), la composición del
medio no varía. Con la población ocurren dos cosas:
1. CERRADOS: aumenta la población celular porque se can recuperando las células que salen con el
14
medio
2. ABIERTOS: no hay aumento de población.
APLICACIONES DEL CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN:
• Modelo para estudio de las rutas de metabolitos secundarios.
• Para estudio de enzimas y asilamiento de genes
• Purificación enzimática
• Manipulación bioquímica, lo que permite incrementar la síntesis de determinadas sustancias.
• Realizar estudios de replicación de DNA
• Aislamiento de mutantes
• Selección de líneas tolerantes al stress
• Selección de líneas resistentes a hervicidas, Ab
• Usos industriales: producción de metabolitos secundarios
Producción de productos no nativos
Biotransformación
• Aislamiento de mutantes y variantes:
Puede que en una planta se den mutaciones espontáneas. Podemos encontrar:
• Mutaciones: son raras y ocurren con poca frecuencia. Consiste en
un cambio en la secuencia de bases de un gen. Son estables y heredables.
• Cambios cromosómicos: frecuentemente nos encontramos con :
• eiploidías: cambio en el número simple de
cromosomas (ej. Síndrome de Down= 23n− por lo que quedan 47n)
• polipoidías: cambio en la dotación total de
cromosomas (ej. Planta 2n a 4n)
• translocaciones: un trozo de cromosoma normal se
separa y se une a otro cromosoma
• inversiones: se separa un trozo de cromosoma y se
vuelve a unir pero en sentido contrario.
• Mutaciones recesivas:(auxótrofo: necesita para crecer algún aminoácido)
Tiene la mutación pero no se observa fenotípicamente. Es difícil conseguir mutaciones recesivas.
Pueden aislarse mediante:
• aplicación de selección positiva: añadir a la
15
suspensión el metabolito del que queremos conseguir células resistentes. Sólo sobreviven las
células que confieran resistencia (mutantes resistentes). En la práctica es más difícil porque al
añadir el componente tóxico lo normal es que el grueso de la población muera. Es complicado
rescatar los mutantes resistentes. Para ello hacemos un PLANTING CELULAR y añadimos
antimetabolito. Tomamos una alícuota. Se diluye con el medio de cultivo que contenga
antimetaboliro y agar a 40º. Las alícuotas diluidas han de tener densidad conocida. Se dispersa
en una placa petri. Como la concentración de células es escasa, las células quedan separadas y al
incubar se producen células clones en colonias que serán resistentes al antimetabolito.
• Selección negativa: las células mutantes no
crecen. En un medio sin prolina (necesaria para el desarrollo de las células), se añadió
bromouracilo (análogo de prolina). La población que se dividió era la salvaje. Se puso a la luz y
el bromouracilo destruyó a las células con fenotipo salvaje y sobrevivieron los mutados que se
rescataron mediante plating no selectivo.
• Agentes mutagénicos:
Se utilizan para aumentar la frecuencia de las mutaciones. Pueden ser:
• Agente químico: análogos de base (bromouracilo),
con muy alta toxicidad
• Agentes físicos: radiaciones con luz UV, rayos X y
rayos , que producen daños en los pares de bases del DNA.
Hay que dejar que el cultivo se exprese 2 o 3 generaciones para que se exprese la mutación.
CULTIVO DE UNA ÚNICA CÉLULA
Obtener un clon que provenga de una única célula se puede hacer mediante:
• Plating: no es fiable al 100% porque pueden caer 2 células juntas y no se
detectan. Lo mejor es sacar una célula con una pipeta y ver al copio.
• Cultivo nodriza: en un tubo de ensayo se cultiva el callo del que se ha
sacado la suspensión celular: se pone en un papel de filtro sobre el que se coloca una única
célula. El callo dará todas las señales fisico−químicas y hormonales que la célula necesite para
crecer. Para bloquear la división celular, el callo se irradia con luz UV.
• Técnica de la microcámara: variante del cultivo nodriza, usando un
medio acondicionado. Sencillo y barato. Sobre una porta se colocan los cubres que quedan
levantados, entre ambos se pone una gota de parafina y sobre ella el medio nutritivo con una
célula. Encima se pone un tercer cubre. Queda una cámara con un ambiente ideal para que la
célula crezca y se divida el callo, lo que ocurre en medio sólido.
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS
16
Un protoplasto es una célula vegetal desprovista de pared celular, se usan para hacer:
♦ estudios de regeneración de la pared celular
♦ estudios de regeneración de membranas
♦ estudios de transformación genética
• Aislamiento de protoplastos
• Hay que quitar la pared celular, lo mejor es un tratamiento enzimático que rompa los
componentes de la pared, que son :
polisacáridos: celulosa=celulasas; hemicelulosa= hemicelulasas; pectinas= pectinasas, en
realidad es una mezcla de las 3.
• Hay que tener en cuenta que las células vegetales tienen una gran vacuola
llena de agua por lo tanto hay que mantener las condiciones osmóticas (medio hiperosmótico).
Interesa que exista plasmólisis, se separa la membrana de la pared celular= medio hipertónico.
• Tener pH de 5.7 o 5.8, en oscuridad, tiempo de incubación de 4 a 24 h, Tª de
digestión es aproximadamente 24º= el proceso se acelera aumentando la temeperatura a 37ª
• Añadir soluciones protectoras ClCa y Cl2Mg en altas concentraciones
• El tejido determina que queramos obtener el protoplasto, ha de ser un tejido
joven, preferentemente tejido folial, además de ser una planta sana y vigorosa.
RESUMEN:
• Se incuba el tejido donador en un medio con agente osmótico (sorbitol
o manitol) y un protector de la membrana plasmática (Cl2Mg). En 1hora se logra la separación
de la membrana por plasmolisis (en medio hiperosmótico)
• El tejido plasmalizado se incuba en presencia de enzimas, en
oscuridad y a Tª ambiente durante 4 a 24 horas. Pasado ese tiempo tenemos: protoplastos,
células rotas, células que no se han digerido, fragmentos de pared celular.
• Purificación de protoplastos: puede hacerse de dos formas:
• filtración−centrifugación: la mezcla se hace pasar por un
filtro donde quedan retenidos los fragmentos grandes. El filtrado se centrifuga y en el fondo
queda lo que más pesa, normalmente protoplastos. Quitamos el sobrenadante y el sedimento se
resuspende en el e medio de cultivo sonde se vayan a cultivar esas células. La centrifugación se
repite 4 o 5 veces.
*INCONVENIENTES: en el 5º centrifugado se recupera poco; es un proceso largo; pueden
romperse los protoplastos
• Flotación: se filtra y centrifuga para quitar la solución
enzimática, los protoplastos se resuspenden en una solución de sacarosa (alta densidad) y
17
volvemos a centrifugar (10min). Los protoplastos son estructuras esféricas, las demás células no
lo son. Al ser esféricas son menos densas, por lo tanto tras centrifugar los protoplastos quedarán
en la superficie. Se recuperan con una pipeta y se comprueba que están vivos.
• Cultivo de protoplastos: hacemos un test de viabilidad para ver si el protoplasto aún
está vivo (protocolos de tinción)
El medio de cultivo debe tener la misma composición que el medio utilizado para obtener
el callo= sales y hormonas, además de un agente osmótico (glucosa, sacarosa)
El objetivo es que el protoplasto se divida y a largo plazo una planta.
El medio puede ser: líquido (sin agitación), líquido sobre sólido, y medio sólido (similar al
plating)
• Resultados
♦ Los protoplastos duran poco, ya que la pared celular se regenera
rápidamente (24−72 horas)
♦ Una vez regenerada la pared celular comienza la división celular
♦ (NO HAY MITOSIS SIN PARED CELULAR)
♦ Cuando la regeneración de la pared no es completa, hay una falsa
división conocida como GEMACIÓN( en las partes de la pared celular no se ha regenerado, el
citoplasma se expande)
♦ Si se agotan las reservas, hacemos subcultivos, normalmente
utilizamos callos. El medio de cultivo es nuevo y con agente osmótico aunque en menor
cantidad (podemos eliminar el agente osmótico a partir del tercer subcultivo)
APLICACIONES DEL CULTIVO DE PROTOPLASTOS
• Estudio de receptores
• Estudio de flujos iónicos
• Estudio de regeneración de la pared celular
• Estudio de transformación genética( un gen aislado, y con dotación genética completa)
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA:
♦ Se pude hacer en un gen aislado o alterando la dotación genética completa=
obtener híbridos.
♦ En la naturaleza la única forma de obtención híbridos es por reproducción
sexual. Pero mediante el empleo de protoplastos, podemos obtener 2 células somáticas
(híbridos)= HIBRIDACIÓN SOMÁTICA: obtención de híbridos mediante la fusión de 2
protoplastos.
♦ ¿qué ocurre cuando los protoplastos distintos se fusionan? spA y spB
◊ Fusión de 2 protoplastos de misma sp: homocarionte
◊ Fusión de 2 protoplastos de distinta sp: heterocarionte
◊ Fusión de núcleos en heterocariontes: sincarionte/ híbrido verdadero
18
◊ Si en un heterocarionte se destruye un núcleo: heteroplasto/cíbido (no es un
híbrido)
♦ El proceso de fusión de protoplastos puede ser espontáneo o inducido:
♦ F. espontánea: ocurre con poca frecuencia y es producido por repulsión de cargas
ya que cuando una célula pierde la pared celular se quedan con una membrana
fuertemente negativa.
♦ F. Inducido: por agentes químicos o agentes físicos:
Ttos químicos: el objetivo es neutralizar las cargas, el pH es alto (10.7) para la
neutralización de cargas, se procede a una incubación de protoplastos en polietilen glicol
(15 min) (aglutinamiento/acercamiento de protoplastos)a 37ºC con lo que se producen la
fluidificación de membranas
*No pueden fundirse más de dos protoplastos porque a partir de células polinucleares
no se puede obtener una planta (regenerar una planta)
Ttos físicos: electrofusión: se aplica un campo de corriente alterna (que provoca
aglutinamiento de células) y posteriormente un campo de corriente continua (rotura de
la membrana)OOOOOO: fusión de protoplastos (OO!OO!O)
♦ Rescate de híbridos: recuperación de protoplastos fundidos
− La mayoría de las técnicas se basan en:
1) Pruebas de complementación genética (para mutantes recesivos)
Auxótrofo para poliuria Auxótrofo para glutamina
En un medio sin pro y sin glu: se complementan dando un híbrido
Albino en gen X Albino en gen Y
Híbridos verdes: se complementan y donde uno tiene la mutación, pero el otro no y al
revés, así crecen las plantas
2) Pruebas de complementación fisiológica (para requerimiento del cultivo)
Planta albina que Planta verde que no
regenera en medio X regenera en medio X
Cultivando productos de fusión en medio X, se regeneran los híbridos
3) Pruebas de rescate visual: se aplica cuando no es posible la aplicación de las
anteriores
♦ Características que ha de tener una planta híbrida/ Ensayos para confirmar que
tenemos una planta híbrida:
♦ características morfológicas de la planta: ej. Tallo de una planta y
19
hojas de otra.
♦ Características enzimáticas: en la planta híbrida, las isoenzimas
deben ser el total de ambas sp. HÍBRIDOS ASIMÉTRICOS: cuando la dotación
genética (parte) de una de las sp se pierde. A pesar de ello estas plantas son totalmente
fértiles.
♦ Características citológicas: ej 14+16: el híbrido tendrá 30
cromosomas.
◊ las plantas híbridas deben poder propagarse por semillas
TRANSFORMACIÓN GENÉTICA EN PLANTAS
Utilidad:
◊ Obtener plantas resistentes a infecciones
◊ Obtener plantas resistentes a Tª extremas
◊ Obtener plantas resistentes a sequía, salinidad
◊ Obtener plantas que tengas menor la fotorespiración
◊ Incrementar el valor nutricional de una cosecha
◊ Prolongar la vida media de almacenamiento
◊ Introducir enzimas bacterianas responsables de la captación de N2 (por
algunas bacterias) en la planta: aumentamos la producción.
◊ Mejorar el aspecto (para el consumidor)
◊ Para obtener sustancias que no son de origen vegetal (interferón, Ac,
vacunas)
¿CÓMO HACERLO?
♦ Identificar: el carácter que queremos introducir (gen que confiera resistencia a Ab+)
♦ Asilar el gen: gracias a las enzimas de restricción que cortan el DNA en secuencias
específicas de nucleótidosy luego las DNA ligasas que permiten la unión de 2 extremos
cohesivos de 2 hebras de DNA. Al aislar el gen , hay que obtener múltiples copias, para
ello lo clonamos, existen moléculas que lo hacen , llamados VECTORES DE
CLONACIÓN: plásmidos, bacteriófagos. Los plásmidos no tiene vida independiente, se
multiplican dentro de sus huéspedes, con esto podemos transformar genéticamente un
vegetal.
♦ Transformación genética de plantas, puede hacerse:
♦ transformación directa: hacen falta protoplastos, para introducir el plásmido en el
protoplasto podemos incubar el protoplasto con el plásmido que contiene el gen de
interés, para que el plásmido se introduzca en el protoplasto.
mediante: inyección , PEG+ Cl2Ca y electrosporación
inconvenientes: difícil regenerar una planta a partir de protoplasto(solución
20
MICROBIOLÍSTICA). El gen no se suele incluir en el cromosoma y es degradado.
ventajas: útil para hacer expresión transitoria del gen
♦ transformación indirecta. Agrobacterium tumefaciens
utiliza un taxi molecular que lleva nuestro gen a su destino llamado VECTOR
DE TRANSFORMACIÓN.
Vector de clonación (gen) TAXI MOLECULAR planta, mejor si se dirige directamente
al
Vector de transformación núcleo
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS: gram +, un cromosoma y diversos plásmidos, el
más conocido es plásmido Ti.
♦ Induce la división celular: tumor
♦ Al cultivar el tumor en un medio con sales minerales y sacarosa, las células se dividen
indiscriminadamente (sin necesidad de hormonas)
♦ Al incubar esas células tumorales en presencia de Ab, la bacteria muere pero las células
siguen proliferando.
◊ La bacteria le ha conferido algo a la célula vegetal que le ha dado un nuevo
carácter indefinidamente.
◊ Plásmido Ti (tumor inducing) cuando la bacteria invade la célula le
transfiere los genes oncogénicos y los genes de las opinas (aá especiales). En condiciones
normales, se liberan las opinas, que son una fuente de C y N para la propia bacteria. Se
transfiere una secuencia conocida como T−DNA que se caracteriza porque está
circundando por una secuencia de 25 pares de bases, repetidas e imperfectas que
reciben el nombre de borde izquierdo y borde derecho. Se transfiere lo que está en
medio.
Hay varios oncogenes:
iaaM codifican para la síntesis de ác. Indolacético (auxina)
ica H
ipt codifica para la síntesis de isopentilalanina que también en una citoquinina
Por lo tanto la bacteria al introducir estas hormonas, le da a la célula la capacidad de
dividirse pero no de regenerarse.
¿QUÉ NECESITA AGROBACTERIUM PARA INFECTAR LA PLANTA?
◊ genes VIR
◊ Bordes izquierdo y derecho
◊ Genes CHV: están fuera del plásmido (transfieren el T−DNA) en el cromosoma.
Proceso:
◊ herida: se liberan al suelo fenoles que son agentes quimiotácticos
21
◊ la bacteria se dirige hacia la herida de la planta
◊ tiene que existir contacto físico entre la bacteria y la planta. Los genes chv son
los que permiten este acercamiento, son genes constitutivos que están
codificando continuamente.
◊ Introducción del T−DNA: los genes VIR funcionan como un operón. El primer
gen de esta secuencia es el VIR−A que es un gen constitutivo que se está
expresando continuamente, pero los fenoles liberados hacen que se sobreexprese,
generando múltiples copias de la proteína VIR−A, el fenol que lo produce es la
ACETOSIRINGONA. Esta sobreexpresión, hace que se active un segundo gen
que estaba silenciado es el gen VIRR−G que a su vez activa otros genes (VIR O2
y VIR E2) los productos de estos genes son enzimas que actúan parecido a las
endonucleasas. Estas enzimas rompen el DNA por unos sitios que ellos
reconocen, por el borde derecho e izquierdo, pero sólo se libera una de las
hebras de DNA (cadena simple) y se une a uno de los extremos.
COMPLEJO T
VIR D2 VIR E2
Este complejo T, abandona la bacteria, penetra en la célula vegetal y se dirige al
núcleo (ayudados por otros genes VIR−B). Una vez en el núcleo, las dos
proteínas lo dirigen a un cromosoma (al azar) y se incorpora al genoma vegetal.
Se integra una cadena simple que gracias a la maquinaria de la célula vegetal se
replica.
** se logró eliminar el T−DNA de Agrobacterium y meterle un gen resistente a
Kanamicina. Esta bacteria es contacto con células de tabaco les hizo plantas
resistentes a kanamicina.
Podemos hacerlo utilizando un plásmido o 2 plásmidos.
Manejar el plásmido Ti no es fácil, se han diseñado 2 sistemas o vectores de
transformación. Para que se incluya el gen ha de estar entre el borde derecho e
izquierdo (dentro del complejo T)
◊ VECTORES O SISTEMAS COINTEGRADOS: tenemos el plásmido de E. coli
en
el cual se introduce el gen que quiero transferir. Además se introduce un gen de
resistencia a kanamicina. También hay un plásmido Ti (totalmente modificado).
El plásmido Ti debe tener los genes de virulencia y los bordes para que el
plásmido Ti pueda infectar a una célula vegetal, le quitamos el T−DNA y se
sustituye por información genética del plásmido anterior (E. coli)
Introducimos el plásmido Ti en Agrobacterium que pasa a tener plásmido de E.
coli. Dejamos que la bacteria se multiplique y también los plásmidos. Puede que
al dividirse se mezclen ambos plásmidos (recombinaciones). En este caso,
tendremos la bacteria con su cromosoma y un solo plásmido con los genes de
virulencia, el gen resistente a Kanamicina y parte del plásmido de E. coli. Vector
22
cointegrado: un plásmido Ti modificado.
◊ VECTORES O SISTEMAS BINARIOS: usamos 2 plásmidos. La bacteria tiene
su cromosoma, un plásmido de E. coli y un plásmido Ti. El de E.coli con el gen
foráneo y una resistente a Kanamicina. El plásmido Ti conserva los genes de
virulencia. En los genes que se quieran transferir, además de la secuencia
modificadora, para que el gen se exprese se necesita un promotor que indica
cuántas copias, cuándo u dónde y también una secuencia terminadora:
PROMOTOR−CODIFICADOR−TERMINADOR
MÓDULO DE EXPRESIÓN= GEN QUIMÉRICO
Además del gen Quimérico, debemos tener un gen marcador que nos indique si
la
información genética de la célula está modificada o no.
PROCESO DE INFECCIÓN Y OBTENCIÓN DE PLANTAS
TRANSGÉNICAS:
⋅ El más usado es el sistema de disco de hoja.
⋅ A los discos de hoja se les añade una solución de bacterias que contengan
el
gen que queremos transferir, se deja aproximadamente 2horas.
⋅ Se secan los discos con papel de filtro y se llevan a un medio de cultivo
que
contenga auxinas y citoquininas aproximadamente 2 días.
⋅ Hay que eliminar a la bacteria
⋅ A los dos días se añade un Ab que mate a la bacteria (cefotaxina contra
Arobacterium) y añadimos el marcador que si es de selección se añade
Kanamicina. Las células resistentes a este Ab serán la que se regeneren.
⋅ Agrobacterium sólo es útil para dicotiledóneas.
*** en el tomate, se introduce un gen que transfiere rigidez a la pared del
tomate. Se introduce el gen responsable del deterioro de la pared en antisentido
que bloquea la producción de la proteína responsable.
***Agrobacterium rhizogens= tiene un plásmido Bi
CULTIVO DE TEJIDOS PARA LA OBTENCIÓN DE METABOLITOS
SECUNDARIOS
◊ Metabolito primario: sustancia esencial para el desarrollo de las funciones
vitales de la
planta. Además su distribución es generalizada en toda la especie. Las células lo
usan para multiplicarse.
23
◊ Metabolito secundario: sustancia que no es esencial para el desarrollo de las
plantas.
Suelen estas restringidos a ciertas especies, incluso a ciertos momentos de la vida
de una planta. MECANISMO DE DEFENSA.
◊ RUTA DEL ÁC, SIKÍMICO: met 1º: lignina. Met 2º taninos
◊ RUTA DEL ACETATO− MECALONATO: met 1º: fitol. Met 2º:digoxinas
◊ RUTA DEL ACETATO− MALONATO: met 2º: poliacetileno.
◊ Funciones de los metabolitos secundarios:
◊ Contribuyen al desarrollo de la planta generalmente.
◊ Defensa frente a herbívoros: repelentes
◊ defensa frente a org: fitoalexinas
◊ defensa entre plantas: compuestos alelopáticos
◊ atracción: insectos para polinización, bacterias beneficiosas, insectos predadores
de
otros insectos, animales que dispersen semillas.
ELICITOR: sustancias que activan/inducen estimulación metabólica. Todo
aquello que desencadena una actividad metabólica, ej: producción de
fitoalexinas. Pueden ser biotinas: agente biológicos o abióticos: agentes
fisico/químicos
En cultivo in Vitro, si añado el elicitor, se obtiene la fitoalexina que puede tener
interés económico.
ESTOMAS: poros que se encuentran en la superficie foliar, formados por dos
células de guarda, cuyos movimientos regulados por la turgencia controlan el
tamaño del poro y de este modo regulan el intercambio gaseoso.
CLON: individuo genéticamente exactamente igual a otro
PRECURSOR: sustancia utilizada para inducir la síntesis de un compuesto
SUSPENSIÓN CELULAR: conjunto de células en medio líquido. Muy
heterogéneas genética y cinéticamente. Muy inestables.
NECESIDADES DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL CRECIMIENTO EN
SUSPENSIONES CELULARES
⋅ Se habla de una evolución similar a la de una muestra microbiana, llega
un momento en que tiende a detenerse( se han acabado los nutrientes)
⋅ Es lo menos frecuente, la producción de metabolitos depende del número
de células ( a mayor crecimiento, mayor producción)
⋅ Cuando cesa el crecimiento de células, aumenta la producción de
metabolitos
(lo más frecuente).
El material obtenido por el metabolito primario es lo que las células utilizan
para multiplicarse (crecer). Cuando ya no crecen más, usan los metabolitos
secundarios.
24
La producción inicial, no se tiene en cuenta, lo que valoramos es la producción
final. Necesitamos una masa celular muy grande para iniciar la producción en el
Biorreactor.
◊ hay que diseñar un medio de crecimiento para obtener un gran crecimiento y
por
lo tanto una gran producción (más sencillo pero menos frecuente)
◊ hay que diseñar 2 medios, uno para el crecimiento y otro para la producción.
Para
el crecimiento, usamos el medio inicial, variando poca cosa. Una vez establecido
el medio de crecimiento hay que manipularlo para mejorar la producción,
medios que detengas el crecimiento y que induzcan una mejora en la
producción. Se suele manipular sobre todos los niveles de fosfato y nitrógeno.
Tomamos la suspensión y reducimos algún componente (p o N) y vemos con cual
obtenemos los mejores resultados. Normalmente disminuye el P se incrementa la
producción y se detiene el crecimiento. Otro ag. Nutritivo es la fuente de C
(sacarosa). Lo que ha dado resultado es el incremento de niveles de sacarosa, se
incrementa la producción de metabolitos secundarios ya que como tiene energía
suficiente, el metabolito primario que en un segundo plano, aunque realmente lo
que ocurre es que se produce un stress osmótico y el crecimiento se detiene y se
induce la formación de metabolitos secundarios.
El metabolito secundario normalmente es un mecanismo de defensa. También es
muy efectivo disminuyendo N y sacarosa, aunque el resultado depende de cada
especie. Ej: silimarina: eliminando Ca++, duplicamos la producción añadiendo
Li, también hay incremento por estrés.
EJ: DIGITALIS: Si sustituyo Sr por Ca no aumenta la producción, hay una
relación especial. El Li también aumenta la producción por estrés.
El nivel hormonal también se puede manipular, del balance hormonal también
depende la diferenciación (que dé raíces o tallos). En general los regímenes
hormonales que favorecen la producción de metabolitos secundarios son los que
potencian la diferenciación, sobretodo si la diferenciación va encaminada a la
obtención de embriones somáticos.
En la práctica esto no es aplica porque si queremos incrementar la producción
un medio y otro diferente para la diferenciación.
Los parámetros físicos también se manipulan, normalmente para el
mantenimiento del cultivo (pH, Tª, luz, aireación)
modificación pH: afecta a la toma de nutrientes. Cambios en permeabilidad de
la membrana.
⋅ Lo normal es usar un pH óptimo para el crecimiento (5−6) y el mismo
para el medio de producción (mejor no modificar)
Tª: ocurre lo mismo
25
Luz: tiene un efecto importante. Va ha variar el tipo de metabolitos (ej. Nicotina
en ausencia de luz). Depende de cada especie y del metabolito. En la mayoría de
los casos se requiere luz.
El problema de aportar luz es que se incrementen los costes en energía y en
enfriar porque la luz calienta, por lo tanto se prefiere una menor producción y
así disminuimos los costes, a no ser que si al aumentar la producción los costes
no sean demasiado altos y por lo tanto compensa ese aporte de luz.
*los cultivos celulares aunque estés verdes no realizan la fotosíntesis, por eso,
hay que aportar sacarosa.
El OL se manipula para el mantenimiento de cultivos a gran escala. El O2 es
necesario para las mitocondrias para obtener energía, ya que no realizan la
fotosíntesis. A nivel de laboratorio no se manipula el O2. Ya tenemos la línea
celular, hemos seleccionado los dos mediosahora a nivel industrial usamos
BIORREACTORES.
EMPLEO DE BIORREACTORES PARA OBTENER METABOLITOS
SECUNDARIOS
◊ Sistemas de biorreactores
El metabolismo que se produce se acumula en la célula, no sale al exterior, por lo
tanto para obtenerlo, tengo que destruir el cultivo. Tenemos dos tipos de
biorreactores:
◊ Continuo: vamos metiendo nutrientes en el medio, tubo por sonde hay una
entrada del medio, por otro lado extraigo el medio pobre que arrastra a los
metabolitos, pero esto es lo menos frecuente porque normalmente los
metabolitos no están en el medio.
◊ Tandas: destruyo la célula para tomar el metabolismo y lo pongo en otro medio
(ej. Matraz es un sistema de tandas). A nivel industrial se usan biorreactores,
tandas más grandes. Útiles cuando el metabolismo secundario se queda dentro
de la célula. Es el más usado.
◊ Semicontinuo: variante, variedad de tandas, en vez de vaciar el biorreactor
totalmente, sólo se vacía la mitad. De la mitad que se vacía se obtiene el producto
(destruyendo las células), y rellenamos con la mitad y lo que había actúa como
inoculo para nueva producción.
◊ Multifásico: 2 fases normalmente. Un biorreactor para desarrollar la biomasa
(crecimiento)
◊ se retira el medio (no es bueno para ka producción) y ponemos otro medio (en el
mismo reactor)
26
◊ Se pasa a otro biorreactor con el medio adecuado para la producción(usamos
dos
biorreactores)
2.Diseño de la estructura del biorreactor
− condicionado por el tamaño de las células
− hay que tener en cuenta:
Necesidad de administrar nutrientes a las células
Necesidad de administrar oxígeno a las células.
Hay problemas derivados de la estructura celular (A TENER EN CUENTA EL
SISTEMA DE AGITACIÓN)
−Células grandes y pared rígida (la agitación hace que las células choquen y se
produce el efecto cizalla o tijera que puede provocar ruptura de la pared celular.
− Tienden a formar agregados, las células tienden a disminuir y el reparto de
nutrientes y O2 no es muy equitativo.
A TENER EN CUENTA POR EL SISTEMA DE AIREACIÓN:
− Hay cierta cantidad de material celular libre (proteínas) que con el aire
(agitación) tiende a formar espuma. En el biorreactor si genera espuma (sobre
todo en superficie), la espuma se adhiere a la pared y sistemas fijos del
biorreactor, todas las células que hay en la espuma no son útiles para la
producción por lo tanto hay que evitar la formación de espuma.
También hay que tener en cuenta las posibilidades de iluminación.
◊ con agitación mecánica: con entrada y salida de aire, con palos de
agitación (2 palas separadas de giro, hélice que sube y baja, distintas palas
pequeñas, una única pala plana grande.
PROBLEMAS: generan aumento de la fuerza de cizalla, son costosos,
consumen energía. Peligro de contaminación porque hay muchos sistemas fijos.
♦ dentro de estos hay una variante, giran en torno a su eje;
eso produce la
agitación (no palas). Puede ser (cilindro hueco y doble cilindro)
♦ VENTAJAS: se incrementa la relación entre superficie y
volumen. Como
el eje es ajeno/exterior, se evita contaminación al ser mayor la superficie, se
facilita la iluminación
27
♦ PROBLEMAS: para este volumen (tengo que dejas
espacio), necesito un
biorreactor muy grande
◊ con agitación por aire
◊ biorreactor de burbujas(forma de balón): maya que fragmenta el
aire en pequeñas burbujas (difusor de aire)
♦ las burbujas al ascender a parte de aportar O2, agita
♦ disminuye la fuerza de cizalla, es bueno para células
frágiles
♦ aumentan los problemas de formación de espumas
• biorreactor de elevación por aire: con dos cámaras, por dentro
lleva
un compartimiento que se comunica con otro exterior.
⋅ entra aire a Presión
⋅ se forman burbujas, que bajan por la
camisa exterior
⋅ se mejora el burbujeo, hay flujo, menor
fuerza de cizalla
⋅ mejora el reparto de nutrientes
⋅ el más usado
⋅ aunque forman espuma, se añade un
agente antiespumante.
También hay biorreactores que combinan agente mecánica con
aire, la pala hace que
disminuya la espuma.
• biorreactor a chorro: turbina que gira y crea una corriente que
incrementa la velocidad de reparto.
Aumenta la fuerza de cizalla para mejorar el reparto.
iv: hay unos biorreactores modernos ( en experimentación):
tienen palas, baja fuerza de cizalla, todo gira en el mismo sentido
y es antiespumante.
TÉCNICAS PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN (una vez
que tenemos el biorreactor adecuado)
También alternativas a las suspensiones celulares.
• Adición de percusores: el metabolito secundario entra en
competencia con el primario y este es esencial para las células.
Tenemos una ruta metabólica:
!!A metabolito primario A´
28
Metabolito secundario A´´ (ramificación)
El que funcione hacia A´o A´´ depende de lo que la célula
necesite. Puede ocurrir que:
⋅ A sea abundante y forme suficiente A´ y
también podemos obtener A´´.
En vez de A (metabolito común), si le doy un precursores de la
ruta de A´´, el metabolito M, lo toma y el A pasa a A´ y M a A´´
sin necesidad de competencia.
⋅ Los precursores son más efectivos cuanto
más próximos están al producto
final= BIOTRANSFORMACIÓN (añadir precursores, uno o dos
pasos enzimáticos anteriores para obtener el producto final).
⋅ En suspensiones celulares hay problemas:
entrada del precursor dentro de la célula.
que se estimule la transformación
que puede el precursor atravesar la membrana celular, pero
haciendo pequeñas modificaciones, podemos hacer que penetre la
membrana. Ej: la digoxina es una transformación de la
digitoxina (la digoxina no atraviesa las membranas, pero sí la
metil−digoxina.
Será rentable si el precursor es barato o se puede obtener por
síntesis. La digoxina no la producen todos los Digitalis. El
precursor, al añadirlo puede resultar tóxico para la célula.
• Elicitación Otra técnica empleada para mejorar la producción,
es el uso de
ELICITORES que son sustancias que actúan sobre el agente
invasor (fitoalexina) es un sistema de defensa de las plantas. Se
ha comprobado que el inductor es un producto de la propia
planta.
El elicitor es el que produce fitoalexinas, que no sólo se forman
por ataques bianos, también por estrés (lluvia ácida, luz UV, Tª
extremas). El elicitor induce la estimulación metabólica=
formación de fitoalexinas.
Se puede n diferenciar 2 tipos de elicitores:
⋅ E. bióticos: agentes biológicos
⋅ E. abiótico: agente físico−químico
ELICITOR: todo aquello que desencadena una actividad
metabólica.
29
En cultivo in Vitro, si añado al cultivo el elicitor, se obtiene la
fitoalexina (metabolito que de forma natural no existe en la
planta o en el cultivo in Vitro) que puede tener interés
económico.
Ej: glycine max (soja) para obtener gliceolina.
. la producción de gliceolina es proporcional a la C del elicitor.
Thalictrum rugosum: berberina
. llega un momento en el que si C. elicitor es muy alto, la
producción de berberina disminuye.
ALTERNATIVAS A LAS SUSPENSIONES CELULARES
PARA OBTENER METABOLITOS SECUNDARIOS
• Usar células inmovilizada: Fijar las células que tengo en
suspensión a un soporte; hay distintos sistemas de fijación:
• Adherir las células a una superficie (poco en plantas, más para
org)
• Incluir las células en el interior de un sistema, hay 2:
• Polimerización: al polimerizar, atrapa las células. Al polimerizar,
se
forma una maya y atrapa a las células. Usamos agar, se forman
bolas, con cámaras en el interior que permiten el paso de
nutrientes.
• Obtener el polímero y hacer que las células invadan los canales
del
polímero. Se usa poliuretano (esponja) con tamaño de poro muy
pequeño, se mete en el matraz con la suspensión y las células van
entrando.
Por ambos sistemas se obtienen células fijajas. Se suele
polimerizar por goteo (células + agente polimerizante)
• Ventajas sobre suspensiones celulares.
• Al estar atrapadas, las células mantienen el contacto, la
comunicación es
intensa y estable.
• Se restringe el crecimiento de forma física, no se altera el estado
de la célula.
No se deja espacio para crecer. Al estar restringido el
crecimiento, se incrementa la producción
30
• La mayor facilidad en la manipulación de las condiciones del
cultivo
• Se mejora la recuperación del producto, hay algunos metabolitos
secundarios
que se liberan mejor al medio.
En principio se pueden usar los mismos biorreactores, pero se
prefiere diseñar otros (ya que el medio es diferente) son incluso
más sencillas.
• Se puede usar una columna de matriz fija, se introduce el
medio y se hace que pase por la matriz de perfusión. Esto será
útil cuando el producto se libere al medio fácilmente.
• También se puede usar una columna con lecho fluido, en el
cual está la maya. El problema es que inmovilizar células es muy
caro y sólo se hace cuando la producción es interesante.
• Cultivar órganos in Vitro.
Se pueden cultivar tanto órganos aéreos como raíces. Lo primero
que se cultivó fueron raíces (antes que células). Las raíces se
pueden formar a partir de otra raíz, cortada de la planta o bien a
partir de callos. Hay una alternativa, usando A rhizogenes que
invaden raíces, transfiriendo genes (activan anpina (azúcar), no
válido para la raíz, pero si a la bacteria, activan la síntesis de
auxinas.
La diferencia es que obtengo raíces transformadas, las cuales no
necesitan que al medio le añadamos hormonas porque la
síntetizan ellas mismas. Crecen a ritmo alto. Tienen gran
cantidad de pelos radicales: raíces pilosas/peludas. Si el
metabolismo se produce en la raíz, es uncultivo interesante de
realizar.
Ej: Nicotina: si se sintetiza en la raíz, aunque luego vaya a la
hoja. Aquí si sería útil el cultivo in Vitro de raíces.
El cultivo de tallos, se hace a partir de yemas apicales, que se
multiplican. También puede ser a partir de la planta, a partir de
callo o usando A. tumefaciens que transfiere que se estimule la
producción de citoquininas. El crecimiento de parte aérea es
menor que el de las raíces. Presenta problemas de esterilidad. La
invasión de bacterias produce teratomas o llagas.
Se usan biorreactores de niebla, no hay agitación. Se genera una
niebla del medio que se difunde sobre raíces o tallos.
31