Reacción en Cadena de polimerasa

Análisis de la Presencia de Organismos
Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
M. Somma, M. Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
2
Índice
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Introducción
3
Componentes, estructura y replicación del ADN
3
Principios de la PCR
9
Instrumentación y componentes para la PCR
12
Diseño de cebadores para la PCR
18
PCR especializada
22
La PCR en la práctica
24
Bibliografía
32
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Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
3
Introducción
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus
colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina
molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica
in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes
solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un
único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de
ejemplares en tan solo unas pocas horas.
Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos
comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e
identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de
modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la
investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos,
la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica.
Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en
primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección
siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.
Componentes, estructura y replicación del ADN
Componentes. Una molécula de ADN consta de dos cadenas en hélice,
complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de ácido
fosfórico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases púricas y pirimidínicas,
lo que constituye una estructura helicoidal dextrógira, y lleva la información genética
codificada en la secuencia de las bases. En las células eucarióticas, la mayor parte
del ADN se encuentra en el núcleo y se conoce como ADN cromosómico. Está
separado del resto de la célula (citoplasma) por una membrana de dos capas
(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosómico en las
mitocondrias y cloroplastos.
Los elementos estructurales del ADN, llamados nucleótidos, son los siguientes:
•
dATP, desoxiadenosina-trifosfato;
•
dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;
•
dTTP, desoxitimidina-trifosfato;
•
dCTP, desoxicitidina-trifosfato.
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Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en
inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes
partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina,
C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se
muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de
pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de
carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina
está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa.
Nucleótido
azúcar + fosfato
Desoxiadenosina trifosfato = dATP
Desoxiguanosina trifosfato = dGTP
Desoxicitidina trifosfato : dCTP
Desoxitimidina trifosfato = dTTP
Figura 1. Componentes de los nucleótidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El
ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que
se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de
C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace,
se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se
añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el
ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se
aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un
solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre
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se une con T mediante dos puentes de hidrógeno, y C siempre se une con G
mediante tres puentes de hidrógeno. De esta manera, las dos cadenas son
mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde
para formar la otra.
Extremo 5’
Extremo 3’
Figura 2. Formación de una cadena de ADN a partir de los distintos nucleótidos
(imagen: Andy Vierstraete, 1999).
Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los
grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la
molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable
que una hélice de ADN monocatenario.
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Genoma= total de todos los cromosomas
Mitocondria
Fragmento de cromosoma
Membrana plasmática
Retículo endoplásmico
Aparato de Golgi
Citoesqueleto filamentoso
Cromosoma
Núcleo
Lisosoma
Gen
Pares de bases de los
nucleótidos
Esqueleto de azúcar y fosfato
Puente de hidrógeno
Base
Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
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7
Replicación. El ADN contiene toda la información genética que define la estructura
y la función de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la
transmisión de la información genética:
• replicación;
• transcripción;
• traducción.
Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias
idénticas. Con este proceso se perpetúa la información genética. Durante la
transcripción, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en
una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del núcleo al citoplasma.
Finalmente, durante la traducción, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia
de aminoácidos que forman una proteína (Alberts et al., 1983).
La replicación del ADN es el proceso en que se basa la amplificación por PCR, y se
va a describir en detalle.
Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte
en un ADN molde para la síntesis de una cadena complementaria nueva. Cada
molécula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copia
exacta de la molécula madre.
Hebra original
Hebra nueva
Cebador de ARN
Hebra
retrasada
Hebra adelantada
Las flechas indican la dirección de
la replicación del ADN
Fragmento de Okazaki
Figura 4. La horquilla de replicación.
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Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta
varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN
rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A
continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado
primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar
como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este
cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena
mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de
una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres
para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados
en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace
fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía
conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido
a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero
es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas
hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’.
Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la
ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a
tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas
copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra
adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3',
según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la
síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la
presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP.
Una ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’OH y
un 5’fosfato, libres y adyacentes. Así puede rellenarse el hueco que queda cuando
se elimina el cebador de ARN. Ha de señalarse la importancia de la presencia de
proteínas de unión a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la
horquilla de replicación. El ADN monocatenario es muy lábil, o inestable, y estas
proteínas se unen a él mientras es monocatenario, protegiéndolo así de la
degradación.
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Principios de la PCR
La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN
bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:
•
desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario;
•
unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN
diana;
•
extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los
cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones
Mg2+.
Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas,
que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que
flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de
desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador
constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR. La figura 5 ilustra las
tres fases principales del proceso de amplificación por PCR.
30-40 ciclos de 3 fases
Fase 1: desnaturalización
Fase 2: unión
Cebadores directos
e inversos
Fase 3: extensión
Sólo dNTPs
Figura 5. Fases de la amplificación por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).
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Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde
para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta
reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen
definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene
dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de
amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas
longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos
cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de
longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de
amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la
amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se
expresa con la siguiente ecuación:
(2n-2n)x
(1)
donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto
obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo
ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original.
Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,
suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una
PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se
haya conseguido.
En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres
fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento
del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989).
4° ciclo
gen deseado
3er ciclo
2° ciclo
1er ciclo
35° ciclo
ADN plantilla
4
8
16
32
ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares
68000 millones de
ejemplares
Figura 6. La amplificación exponencial del ADN mediante PCR.
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Desnaturalización del ADN molde
Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN
monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la
extensión de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el
aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la
desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C.
De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases
desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se
convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario
ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de
desnaturalización depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH
utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración
salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído.
El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A.
La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más
alta que la de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene
aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que
Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 °C.
Anillamiento del cebador
La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior
(generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos
hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una
molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y
es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador
monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. Los enlaces más estables
duran un poco más (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN
molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con
cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde.
Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre el ADN molde
y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe.
Extensión del cebador
En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando
una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq
polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material diana
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inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC.
Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción
iónica más fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se
invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven
a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensión del
fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el
extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN molde
desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del
cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin
embargo, en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min
para conseguir una extensión completa.
Instrumentación y componentes para la PCR
Instrumentos
El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances:
a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a
temperaturas elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de
polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo;
b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su
temperatura
de
forma
automatizada
y
programada;
se
denominan
termocicladores o máquinas de PCR.
Se utilizan diversos diseños de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y
refrigeración por fluidos, calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por
fluidos, y calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por semiconductores.
En la figura 7 se muestra un perfil típico de los ciclos de temperatura de un protocolo
de tres fases.
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Fase 1 :
Desnaturalización de la ADN
Temperatura (°C)
Fase 3 :
Extensión
del cebador
Un « ciclo »
Fase 2 :
Hibridación del
cebador
Minutos
Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.
Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de
los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y
extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos
descritos en los párrafos siguientes.
ADN diana
En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un
ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor,
también lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN.
Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la
amplificación por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y
unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la
PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la
secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es
necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes
quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de
amplificación.
Cebadores
Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que
permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los
cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni
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motivos repetidos, ya que podrían hibridarse de forma inadecuada con el ADN
molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la
formación de estructuras secundarias del cebador, que impedirían su hibridación con
el ADN molde. También deben evitarse las secuencias complementarias de otros
cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre cebadores o la
formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en relación
con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3’
del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del
extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10
kb en longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento
cuando los cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La
concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta
suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de oligonucleótidos
a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada de
secuencias distintas de la diana.
Por el contrario, la PCR no es eficaz si la
concentración del cebador es limitante.
ADN polimerasa
El método original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de
E. coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a
temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayoría de ADN
molde bicatenario. Así pues, en los primeros experimentos era necesario añadir más
enzima a la reacción tras cada ciclo. Por otra parte, había que trasladar las muestras
desde un baño a una temperatura hasta otro a otra temperatura para permitir el
desarrollo de las distintas fases de desnaturalización, anillamiento y polimerización.
Evidentemente, el uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el
proceso porque ha dejado de ser necesario añadir enzimas tras cada fase de
desnaturalización. En principio, las ADN polimerasas solo pueden incorporar
nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La primera ADN polimerasa
termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus
aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la más utilizada
a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN
polimerasas. En el cuadro 1 se recogen las propiedades de algunas ADN
polimerasas termoestables que se utilizan actualmente para la PCR (Newton y
Graham, 1994).
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Cuadro 1. Características de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR.
Fuente
Aplicación
T½ de actividad
a 95 ºC (min)
Actividad
exonucleásica
de 5’ a 3’
Actividad
exonucleásica
de 3’ a 5’
Procesividad
Velocidad de
extensión
(nt/s)
Extremos de
ADN
resultantes
PM en kDa
Taq/
AmpliTaq
Vent
DeepVent
Pfu
Tth
UITma
Thermus
aquaticus
Thermococcus
litoralis
Pyrococcus
GB-D
Pyrococcus
furiosus
Thermus
thermophilus
Thermotoga
maritima
Taq: natural
AmpliTaq:
para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
Natural
Para
ingeniería
genética
Para
ingeniería
genética
40
1380
400
>120
20
> 50a
Sí
No
No
No
Sí
No
No
Sí
Sí
Sí
No
Sí
50-60
?
7
?
30-40
?
75
?
>80
60
>33
?
3’A
> 95 %
romos
> 95 %
romos
?
3’A
Romos
94
?
?
92
94
70
ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de
la bacteria Thermus aquaticus que vive en una fuente caliente del parque nacional
de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas próximas a los 85 ºC. La temperatura
óptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a 80 ºC, a la que la bacteria
sintetiza ADN a la velocidad de 35 – 100 nucleótidos/segundo. Se conoce como
procesividad el número medio de nucleótidos que incorpora una enzima al ADN
antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima
modificada genéticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante,
su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es
posible que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con
algunas secuencias homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una
ADN polimerasa que no se haya expresado con E. coli como organismo hospedador.
Tanto la ADN polimerasa Taq como la AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de
5’ a 3’, con lo que eliminan nucleótidos por delante de la cadena en crecimiento.
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ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad
exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta
que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad
exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto,
la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que
utilizar cebadores modificados químicamente.
ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa
AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un
periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador debe
incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR
con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben
efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica.
Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR
Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita
un tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de
la enzima utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un
tampón 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más
común utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:
•
Tris 10 mM, pH 8,3
•
KCl 50 mM
•
MgCl2 1,5-2,5 mM.
En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de
MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la
concentración óptima se determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990).
Los iones Mg2+:
•
forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la
incorporación de estos;
•
estimulan la actividad polimerásica;
•
aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la
interacción entre las dos cadenas).
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Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o
incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se
acumulen productos inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en
la solución de ADN molde haya una concentración elevada de agentes quelantes,
como el EDTA, o de grupos iónicos con carga negativa, como el fosfato. En la
bibliografía actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y
suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la
espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para aumentar la especificidad o
el rendimiento de la reacción (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN
polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en presencia de tales
suplementos (Rolfs et al., 1992).
Desoxirribonucleósido-trifosfatos
Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP).
La concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y
200 µM, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para
minimizar los errores de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que
suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de
los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP
(generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para
garantizar que el pH de la reacción final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin
embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya
ajustado.
Número de ciclos y efecto de meseta
El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en
un gel depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar
50 moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para
amplificar 3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y
30 ciclos (Innis y Gelfand, 1990). Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto
denominado de meseta, que es la atenuación de la velocidad exponencial de
acumulación del producto en las últimas etapas de una PCR, cuando el producto
alcanza la concentración de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a una degradación de los
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Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
18
reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo
primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición por el
producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de
productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva
hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se
obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1
µl) del producto amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o
30 ciclos en una nueva mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo
más ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentración del ADN molde,
esta nueva amplificación puede proporcionar un buen producto, mientras que la
extensión de los ciclos a más de 40 no lo hace.
Diseño de cebadores para la PCR
Es posible que el parámetro más crítico para tener éxito con la PCR sea el diseño de
los cebadores. A igualdad de todos los demás factores, un cebador mal diseñado
puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios
aspectos, como la posición y la longitud del producto, su temperatura de fusión y
finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseñado puede
hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificación
inespecífica o a la formación de dímeros de cebador, lo que puede llegar a competir
con la formación de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de
aplicación es dar normas que deben seguirse en el diseño de cebadores para la
PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento más completo de
este tema (Dieffenbach et al., 1995).
Selección del cebador
Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre
ellas cabe destacar:
•
la longitud del cebador;
•
la temperatura de fusión (Tf);
•
la especificidad;
•
las secuencias complementarias del cebador;
•
el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G);
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•
19
la secuencia del extremo 3’.
En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos críticos.
Longitud del cebador
Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridación dependen en
parte de la longitud del cebador, este parámetro es crítico para que tenga éxito la
PCR. En general, los oligonucleótidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una
especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea
óptima. La longitud del cebador también influye en la eficacia de la hibridación. En
general, cuanto más largo sea el cebador, menos eficaz será la hibridación. Al
cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de
forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores
tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicación lo exija
específicamente. Como se comenta más abajo, el objetivo debe ser diseñar un
cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 ºC.
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es una de las
«cajas negras» de la PCR. Una regla empírica general es utilizar una temperatura de
hibridación inferior en 5 ºC a la temperatura de fusión. Con frecuencia es posible que
la temperatura de hibridación determinada de esta forma no sea óptima y haya que
efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura óptima.
La manera más fácil de hacerlo es con un termociclador de gradiente.
Temperatura de fusión (Tf)
Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en
relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse
de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se
ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no
darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a
temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a
temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de
fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más
próximo con la fórmula:
Tfcebador = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273,15°C + 16,6 log 10 [K+]
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(2)
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
20
donde H es la entalpía y S es la entropía de la formación de la hélice, R es la
constante molar de los gases y c es la concentración de los cebadores.
La forma más fácil de hacerlo es con paquetes de programas informáticos de
diseños
de
cebadores
Afortunadamente,
con
que
la
existen
fórmula
en
el
siguiente
mercado
puede
(Sharrocks,
calcularse
1994).
una
buena
aproximación de trabajo de este valor (válido generalmente para oligonucleótidos de
entre 18 y 24 bases):
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
(3)
donde A, T, G y C son las bases púricas y pirimidínicas.
El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas
longitudes que se han calculado mediante esta ecuación (denominada fórmula de
Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981).
Cuadro 2. Cálculo de la longitud de los cebadores con la ecuación de Wallace.
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
Longitud del
cebador
Tf = 2(A+T) + 4(G+C)
4
12°C
22
66°C
6
18°C
24
72°C
8
24°C
26
78°C
10
30°C
28
84°C
12
36°C
30
90°C
14
42°C
32
96°C
16
48°C
34
102°C
18
54°C
36
108°C
20
66°C
38
114°C
Las temperaturas calculadas según la fórmula de Wallace son imprecisas en los
extremos de este cuadro. Al calcular las temperaturas de fusión de los cebadores,
ha de velarse por que la temperatura de fusión del producto sea suficientemente
baja como para obtener el 100 % de fusión a 92 ºC. Este parámetro ayuda a
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
21
conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR
tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se
amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto
puede calcularse con la fórmula siguiente:
Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud
(4)
Especificidad
Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos
parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos más oligonucleótidos
distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de
forma que tengan una secuencia única dentro del ADN molde que debe amplificarse.
Un cebador diseñado con una secuencia muy repetitiva dará como resultado un
borrón al amplificar ADN genómico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una
sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa
Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensión del cebador se
producirá a las temperaturas inferiores de hibridación. Si la temperatura es
demasiado baja, podrá darse un cebado inespecífico, que podrá ser extendido por la
polimerasa si hay una corta homología en el extremo 3’. En general, los mejores
resultados se obtienen con una temperatura de fusión de 55 a 72 ºC (lo que
corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, según la regla de
Wallace).
Secuencias complementarias del cebador
Es absolutamente necesario que el diseño de los cebadores no incluya ninguna
homología interna del cebador de más de 3 pares de bases. Si un cebador tiene
alguna de estas zonas de auto-homología, pueden formarse estructuras con
cambios bruscos u horquillas, parcialmente bicatenarias, capaces de interferir con la
hibridación al ADN molde. Otro peligro relacionado es la homología entre cebadores.
Una homología parcial en las regiones centrales de dos cebadores puede interferir
con la hibridación. Si la homología se produce en el extremo 3’ de cualquiera de los
cebadores, pueden formarse dímeros de cebadores, que en general impiden la
formación del producto deseado por un mecanismo de competencia.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
22
Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)
La composición de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de
GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G
ni poli-C que puedan favorecer la hibridación inespecífica. También deben evitarse
los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden «respirar» y abrir tramos del complejo
cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificación. También
deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que
el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucleótidos, un contenido de GC del
50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estará en la
banda de 56 – 62 ºC (Dieffenbach et al., 1995).
Secuencia del extremo 3’
Se ha visto claramente que la posición terminal 3' de los cebadores de la PCR es
fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las
homologías de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusión
de un residuo de G o C en el extremo 3’ de los cebadores. Este «cepo de GC»
contribuye a que sea correcta la unión en el extremo 3’, debido a la mayor fortaleza
del puente de hidrógeno de los residuos de G/C. Esto también ayuda a mejorar la
eficacia de la reacción por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber.
PCR especializada
Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos
normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos
especializados de PCR para aplicaciones específicas.
PCR anidada
Pueden utilizarse conjuntos anidados de cebadores para mejorar el rendimiento de
la PCR de la secuencia diana de ADN (Newton y Graham, 1994). La PCR con
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23
cebadores anidados se efectúa haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto
de cebadores y después otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores
respecto a una región interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. Así
pues, el fragmento más largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como
ADN molde para la segunda PCR. El método de PCR anidada puede aumentar
espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del ADN.
Mejora particularmente la especificidad porque esta técnica elimina casi siempre los
eventuales productos de amplificación inespecíficos que perturban el proceso. Esto
se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales
productos inespecíficos sean suficientemente complementarios de los cebadores
anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificación posterior, y así lo que
se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente
de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminación, y deben
extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un
laboratorio de diagnóstico.
PCR Múltiplex
Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para
amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de
cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de
muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como
el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de
cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN
(Atlas y Bey, 1994).
Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de
hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser
similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se
favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que
implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte,
los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que
reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más
largos de ADN durante la PCR Múltiplex.
Los productos de la PCR Múltiplex pueden seguir hibridándose con una sonda
específica del gen con fines de verificación.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
24
La PCR en la práctica
Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy
difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No
obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza
de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un
ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental
realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de
contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y
dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al
mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las
normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de
la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a
fuentes diversas, como las siguientes:
•
mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con
preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados;
•
contaminación cruzada entre muestras;
•
productos de amplificaciones anteriores por PCR.
Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos
normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para
cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras
tratadas (Roth et al., 1997).
Métodos físicos de prevención
Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse
de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente:
1. Zona de preparación de muestras
Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la
amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN).
2. Sala de disposición de la PCR
Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p.
ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).
3. Zona post-PCR
Esta zona se reserva a la amplificación de la secuencia del ADN diana, y a la
detección y análisis de los productos de la PCR.
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
25
Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:
•
Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y
suministros).
•
Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y
la fecha de preparación.
•
Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de
trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares prePCR.
•
Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de
desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.
•
Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de
aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la
PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.
•
Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada
de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes
desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR.
•
Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de
etanol al 70 %.
Manipulación de las muestras
•
Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se
trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con
frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones
que contengan ADN molde.
•
Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre
materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados.
•
Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este
tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben
pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.
•
Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que
solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas
cantidades.
•
Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formación de aerosoles que puedan
transportar contaminantes.
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
•
26
Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control
negativo («sin ADN»), que contenga todos los componentes de la reacción
excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con éxito en
PCR anteriores.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
27
Métodos bioquímicos de prevención
Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede
amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar
una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso
positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por
PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar
esta contaminación.
Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por
la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El UADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR
posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y
descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada
(95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase
la figura 8).
UracilADN
─►
Glucosilasa
Calor
─►
pH alcalino
A=Adenina
U=Uracilo
G=Guanina
Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa.
Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con
dUTP en lugar de con dTTP.
Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que
contengan dU en aplicaciones posteriores:
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Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
•
28
los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que
contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes
para la técnica del didesoxi;
•
los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se
transforman en hospedadores bacterianos UNG-;
•
un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de
restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I,
Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;
•
no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni
sobre la interacción del ADN con proteínas.
Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el
tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con
una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del
ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe
efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la
eficacia de la amplificación por PCR.
Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)
Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una
ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos
(dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos
los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen
suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra).
La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se
añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de
contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:
•
se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos
para una serie de análisis;
•
disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes;
•
pueden pipetearse volúmenes mayores;
•
hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.
El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la
calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la
complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
29
nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse
constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del
tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la
transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de
genoma en una cantidad definida de ADN.
Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y
número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de
ADN.
Muestra
Tamaño del
Ejemplares de genoma en
Ejemplares de genoma
genoma
1 µg ADN
en
1 ng ADN
Maíz
5 x 109 pb
1,85 x 105
185
Soja
1,55 x 109 pb
5,98 x 105
598
Tabaco
3,8 x 109 pb
2,43 x 105
245
Arroz
8
4 x 10 pb
2,31 x 10
6
2310
Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el
25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109
pb) representa
alrededor
del
0,00002 %
del
ADN
aportado.
Hace
falta
aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener
el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los
resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN
molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica
es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso
podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por
electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran
un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos,
ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica.
Controles
Como se señalaba en la sección anterior, se encuentran fuentes posibles de
contaminación por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de
laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos
Sesión nº 6
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
30
fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los
siguientes:
1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;
2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN
diana de una muestra a otra;
3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores;
4. degradación de productos por reacciones de descontaminación.
Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el
último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en
primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las
PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método
UNG favorece la formación de complejos con los cebadores.
Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto
positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados
para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácido
nucleico.
Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.
Control
Método
Contaminación de los reactivos con
el ADN diana
Control negativo de la PCR sin ADN molde
(solo mezcla maestra)
Especificidad de la reacción
Controles para detectar productos
secundarios e inespecíficos
Desarrollo y sensibilidad de la
reacción
Controles positivos y negativos para verificar
que se cumplen las condiciones y
rendimientos buscados
Integridad de la mezcla de PCR
PCR con control positivo de ADN
Controles positivos
Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extracción y
amplificación del ADN. Lo ideal es dar límites de detección en equivalentes
genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos,
con pequeños números de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
31
preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana
estudiado.
Controles negativos
Puede darse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos)
durante el aislamiento y la purificación del ADN diana, así como durante la
preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es necesario
introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
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