Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial
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1 Enfermedad producida por un patógeno Qué interesa determinar? Detectar e identificar al patógeno Tipificación y detección de una determinada variante Identificación de cepas resistentes a drogas anti microbianas o antivirales Detección en suero de anticuerpos anti patógeno Cuantificación del patógeno 2 Como detectar aquellos genes que pueden Identificación y tipificación de patógenos Sondas, oligos específicos, Antígenos específicos Constituir factores de virulencia o cuya actividad es indispensable para la supervivencia del patógeno en el huésped. Diagnóstico Blanco para drogas Genes indispensables para su supervivencia in vitro Condiciones Genes cuyo producto de lugar a la inducción de una respuesta inmune protectiva Nuevas vacunas 3 Detección de genes diferenciales útiles para diagnóstico y/o de genes de virulencia o útiles como blanco para drogas y/o de genes útiles para vacunas Genes útiles para diagnóstico Hibridación comparativa DNA del patógeno Corte con enzima de restricción Clonado en un vector DNA marcado del patógeno DNA marcado del no patógeno Contiene secuencia específica del patógeno 4 Secuencias repetitivas Utiles en ensayo diagnóstico: diferenciación entre cepas por Rep-PCR Detección de secuencias repetitivas: parásitos Hibridación con DNA marcado de P. falsiparum Colonias marcadas más Intensamente (DNA repetitivo) Identificación de elemento repetitivo específico Hibridación con DNA marcado de distintas especies Biblioteca genómica con ADN de Plasmodium falsiparum Differential display genómico RAPD-PCR sobre genoma Comparación de perfil de bandas en geles (entre patógeno y no patógeno) Extracción de bandas diferenciales Clonado y secuenciación 5 Tester DNA with adapter 1Driver DNA (en exceso) Tester DNA with adapter 2 Hibridacion sustractiva (por supresión, SSH) Construcción de biblioteca Microarray PCR c/ambos primers 6 Genes de virulencia o necesarios para supervivencia en el huésped Mutantes en distintos genes. Estudio de virulencia en modelos animales Mutaciones letales Mutagénesis generalizada etiquetada (STM: signature-tagged mutagenesis). Ventajas y Limitaciones Tag PCR con dNTP marcados Hibridación 7 Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨) Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real Microarray Differential display Genes del huésped que se expresan durante la infección Hibridación sustractiva por supresión de cDNA 8 IVET (tecnología de expresión in vivo) (ej. de técnicas de atrapamiento de promotores) El procedimiento consiste en utilizar fragmentos de DNA genómico que se ligan a un vector que contiene un gen metabólico esencial para su crecimiento in vivo, como puede ser por ejemplo egf (factor de crecimiento) y un indicador, como es el caso de lacZ. La construcción se transfiere a una bacteria auxotrófica para el gen metabólico. Las bacterias transformadas se utilizan para infectar animales o cultivos celulares, seguido de la recuperación de las viables y del screening in vitro para la actividad del gen indicador. 1) El patógeno requiere un factor de crecimiento esencial durante su condiciones in vivo. 2) Plásmido con el marcador de selección egf y el gen reporter lacZ. 3) Clonado de fragmentos de ADN al azar río arriba de los genes 4) 5) Transformación de la biblioteca de ADN en la bacteria patogénica auxotrófica. Puede quedar en plasmido replicativo, o utilizar un plásmido suicida y buscar el evento de recombinación en el cromosoma egf lacZ pathogen in vivo 2) 6) Infección del ratón con la bacteria recombinante Aislamiento de la bacteria patogénica del ratón. in vitro 7) Selección de colonias blancas (no hay actividad de β-galactosidasa) 8) Secuenciación del plásmido e white colonies carry in vivo induced promotors 9 10 IVET en humanos Resolvasa P Res Suc B Res Vector 11 Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨) Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real Microarray Differential display Genes del huésped que se expresan durante la infección Hibridación sustractiva por supresión de cDNA 12 Cuantificación de mRNA Staphilococcus aureus es una bacteria que causa infecciones en pacientes inmunocomprometidos (HIV) y en fibrosis cística siendo la enfermedad pulmonar causada por esta bacteria causa de muerte en estas afecciones. Un tratamiento antibiótico no alcanza a veces para una clarificación del sistema bronquial. A Tratamiento con DNasa B C (control sin reverse Transcriptasa) A B C Clonado PCR con sec promotor fago T7 Transcripción in vitro [target]A respecto a [target]B [referencia]A [referencia]B 13 También por RT-PCR en tiempo real Gen de referencia Gen en estudio (target) [target]A respecto a [target]B [referencia]A [referencia]B 14 IL1-b A Referencia B Referencia A IL1-b B Numero de veces diferentemente expresado = (Cigen/Ciref)A = Coeficiente de Eficiencia –(ΔCtA-ΔCtB) en A respecto a B (Cigen/Ciref)B = E –(ΔCtGen-ΔCtReferencia) ΔCtA= Ct gen-Ct referencia en la condición A (in vivo) C=Ci 2n ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B (in vitro) C=Ci En CCt=Ci 2Ct 15 Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨) Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real Microarray Differential display Genes del huésped que se expresan durante la infección Hibridación sustractiva por supresión de cDNA 16 Microarrays ADN genómico Plásmidos o productos de PCR cADN Oligonucleótidos (a partir de la información en base de datos) Proteínas Sonda / probe 17 Material de soporte Poroso: membrana de nylon o de nitrocelulosa reutilizable Macroarrays Marcación isotópica No poroso o liso: vidrio, plástico u oro Mayor resolución de puntos, mayor número Microarrays Marcación con fluorescencia Diana / target 18 Inmovilización del ADN Adsorción física aplicando vacío (sobre la NO2-celulosa) Covalente (en microarray) Modificación del ADN u oligonucleótido Hay que activar la superficie y la sonda Activación mediante grupos tiol, amino o biotina Tratamiento previo con grupos amino, o aldehído o estreptavidina Capa uniforme de grupos reactivos Molécula espaciadora Adquiridos comercialmente Activación de la sonda: introducción de grupo reactivo durante síntesis química (oligonucleótido) o en la PCR utilizar un oligo derivatizado. O por reacción enzimática: en el 3´ un aminoalkyl dUTP por acción de la deoxinucleotidil transferasa, o utilizando la T4 polinucleótido kinasa para introducir en el 5´un grupo tiol a partir de la reacción con dATP que tiene el P en γ reemplazado con el grupo tiol Deposición robotizada 19 Síntesis in situ de oligonucleótidos Grupo protector Aplicación de la máscara Máscara Irradiación Solución de nucleósidos 20 Detección de diana o target Directa Indirecto Diana marcada con: Diana unida a biotina y detección con estreptavidina conjugada a fluorcromo Isotopo radioactivo: 33P. 125I (NO2celulosa) Diana unida a digooxigenina y agregado de Ac Anti-digooxogenina conjugado a fluorcrómo Fluorcromo: Cy3, Cy5. Scanners especiales 2 muestras en el mismo array 21 Análisis del RNA de la muestra Identificar potenciales genes de virulencia para blanco para drogas o formulación de vacunas. Comparación del perfil de Expresión del patógeno in vitro e in vivo (dificultoso). Identificación de los cambios en la expresión de los genes del patógeno debido a un compuesto antimicrobiano, da idea del mecanismo de acción del compuesto. Identificar los cambios en la expresión de los genes del patógeno debido a una mutación desconocida Entender la respuesta del huésped a la infección con un patógeno. Cuales son los genes del huésped que se requieren para sostener la infección viral. Identificar blanco para droga. También identificar mecanismos de resistencia al patógeno que puedan ser potenciados Macroarray Normalización de los datos, determinar que genes se expresan diferencialmente y validación de los resultados 22 Scatter plot Comparación de dos hibridaciones de la misma muestra Determinación de Cutoff Comparación de hibridación de dos muestras distintas Cutoff Análisis de cluster 23 Macroarray (nitrocelulosa) Varias replicas para cada gen en la misma nitro distintas hibridaciones para cada muestra Replicas biológicas Normalización: restar el background y relacionar a controles que no varían en las ≠ condiciones Microarray (marca fluorescente) Idem Para cada spot determinar la intensidad de fluorescencia en cada canal restado del background y normalizar respecto a controles invariantes en las distintas condiciones ó respecto al promedio de intensidades de todos los spots. Marcación inversa Determinar para cada spot la relación Cy3/cy5 normalizada Imagen virtual Se saca el promedio de intensidad para cada gen en todas las replicas Realizar el promedio de todas las relaciones obtenidas para cada spot en todas las réplicas ( replica dentro del mismo slide, ≠ slides, replicas biológicas.. Promedio de Intensidades para cada gen en cada muestra ± δ s Relación de Promedios entre las dos muestras: excluír los que son menores a Cutoff y los que la diferencia entre los valores de una condición y otra no presenta un P≤ 0.05 24 Extraer RNA total y separar el correspondiente al patógeno Análisis del transcriptoma durante la infección Separar patógeno y huésped y luego extraer RNA del patógeno Infección con Neisseria meningitidis Tratamiento con EDTA y tripsina Bacteria no adherida Centrifugación a baja velocidad Lisis diferencial de Célula huésped Extracción de RNA usando el kit para atrapar y descartar el resto de RNA de la célula huésped Centrifugar Descartar sobrenadante Pellet bacteriano Extracción de RNA usando el kit para atrapar y descartar el resto de RNA de la célula huésped Se sintetizan oligonucleótidos con un grupo amino en el 5´ NH2-linker-5´oligo (3 oligos para cada ORF del genoma del patógeno). Se unen a superficie activada con grupos aldehído. Cantidades iguales de RNA Marcación: Transcripción reversa Con Cy3-dUTP o Cy5-dUTP con primers específicos para todas las secuencias presentes en el array. Se podrían usar primers al azar Mezcla cDNA Hibridación array de oligonucleótidos Normalización, cálculo de cantidades relativas promediando varias réplicas de los valores correspondientes a los 3 oligos Confirmación por RT-PCR en tiempo real 25 Validacion: RT-PCR en tiempo real, Northen blot IL1-b A Referencia B Referencia A IL1-b B Numero de veces diferentemente expresado = Coeficiente de Eficiencia –(ΔCtA-ΔCtB) ΔCtA= Ct gen-Ct referencia en la condición A ΔCtB= Ct gen- Ct referencia en la condición B 26 Genes bacterianos que se expresan más dentro del huesped Métodos corrientes para estudiar expresión diferencial IVET (tecnología de expresión ¨in vivo¨) Expresión de genes determinados por RT-PCR competitiva y RT-PCR en tiempo real Microarray Differential display Genes del huésped que se expresan durante la infección Hibridación sustractiva por supresión de cDNA 27 Variacion de Transcriptoma del huésped frente a una infeccion: utilización de metodología de microarray Estudio de variación de expresión de genes del huésped ante infección con el virus de la Influenza Extraen RNA total, purifican mRNA por afinidad y obtienen a partir del mismo cDNA marcado con el marcador fluorescente utilizando un oligodT como primer Dependiente de la replicación 2 Independiente de la replicación 1 28 Perfil de expresión de mRNA unido a polisomas Expresión genómica vs proteómica Niveles de mRNA no se corresponden con niveles de proteínas Regulación transcripcional, estabilidad del mRNA, localización de mRNA, regulación Traduccional, degradación de proteínas. 29 Otras aplicaciones de la metodología de microarray Investigación Diagnóstico Comparación de ADN/ARN de distintas cepas, ejemplo: patógeno vs no patógeno e identificación de posibles sondas para diagnóstico. Detección de patógenos en una muestra y genotipificación del patógeno hallado. Array de secuencias específicas de distintos patógenos o de distintas variantes de un determinado patógeno e hibridación con ADN proveniente de muestra de enfermo previamente amplificado por PCR o multiplex PCR. 30 Hibridación genómica comparativa por la metodología de microarray Con el conocimiento del genoma de una de las especies es util para comparación con genomas bacterianos no secuenciados Array con productos de PCR a partir del conocimiento del genoma completo 2 cepas distintas Extracción de ADN Marcación con aminoallyl-dUTP , dNTP, random primers y klenow Unión a Cy3 y Cy5 ADN genómico Hibridación con mezcla (hibridación competitiva) De la cepa cuyo genoma se conoce Cepa con la que se quiere comparar Cepa cuyo genoma está spoteado Escaneo de fluorescencia Construcción de la imagen Spot amarillo: igual pegada de cada uno de los dos ADN marcados Spot rojo o verde : potencial deleción o repetitividad del gen, respectivamente Mycobacterium: a) diferencia entre M. tuberculosis y distintas cepas de BCG y de M. bovis virulenta: diagnóstico para diferenciar infección por M. tuberculosis y M. bovis, b) discriminación de inmunización por vacunación de inmunización por infección, c) deducción de causas de la pérdida de efectividad de las vacunas actuales. 31 Otras aplicaciones de la metodología de microarray Investigación Diagnóstico Comparación de ADN/ARN de distintas cepas, ejemplo: patógeno vs no patógeno e identificación de posibles sondas para diagnóstico. Detección de patógenos en una muestra y genotipificación del patógeno hallado. Array de secuencias específicas de distintos patógenos o de distintas variantes de un determinado patógeno e hibridación con ADN proveniente de muestra de enfermo previamente amplificado por PCR o multiplex PCR. 32 Genotipificación del virus de la Influenza Se arma una grilla de 8x8 con cADN obtenido por RT-PCR a partir de RNA de distintos virus. Oligo con grupo reactivo Amino. Superficie activada con grupos aldehído. Se hibrida con cADN de la cepa a ensayar marcado, obtenido por RT-PCR utilizando Cy3-dCTP. Multiplex RT-PCR sobre aislamientos Discriminación entre los distintos subtipos posibles en la reacción de RT-PCR. Uso de microarray para detectar cual fue el amplicón obtenido. Genotipoficación de subtipos de HPV: PCR única sobre secuencias consenso y discriminación posterior de subtipo por hibridación específica en microarray 33 Detección de antígenos inmunodominantes para vacunas y para diagnóstico 1) Bibliotecas de expresión + Suero pacientes Inmunodetección Phage display: Streptococcus-proteasa de IgA1 Selección por afinidad los fagos que poseen los epitopes buscados 34 2) Proteómica + Suero pacientes Marcadores para diagnóstico Espectrometría de Masa Identificación de la proteína Clonado del gen Sobre-expresión en sistema heterólogo Comparación entre proteomas (patógeno vs no patógeno) Que el antígeno no sea reconocido por suero de pacientes afectados con otra enfermedad Determinar especificidad para diagnóstico de los Acs generados Proteínas candidatas Inmunizar y determinar capacidad protectiva de los Acs generados Mutagenizar el gen codificante y ver importancia en virulencia (candidato como blanco de drogas) 35 •Búsqueda en el genoma y análisis comparativo de genomas •1995: Haemophilus influenzae (primer genoma secuenciado) •Actualmente: alrededor de 1500 genomas completos de bacterias y 3000 de virus Genes que se encuentren en cepa patógena y no en no patógena Alineamiento de genes y búsqueda de polimorfismos para tipificación por PCR o PCR en tiempo real Secuencias comunes conservadas entre las distintas cepas patógenas para vacunas. Genes que se encuentran en patógenos y no en genoma de huésped. Genes homólogos a aquellos que en otros patógenos se conocen como genes de virulencia o como blanco para drogas. Genes necesarios para adaptación a nicho intracelular (genes regulatorios, genes que codifican para proteínas de adhesión, proteasas, proteínas secretadas, genes de resistencia o que permitan escapar de los mecanismos de defensa del huésped y de tolerancia a stress). Genes que codifiquen para caminos metabólicos fundamentales para el crecimiento del patógeno (síntesis de pared, síntesis de ácidos nucleicos, proteínas, síntesis de ácidos grasos). Genes que comparten el mismo mecanismo regulatorio que otros genes de virulencia conocidos. Búsqueda en plásmidos o cromosoma de islas de patogenicidad (presencia de integrasas, transposasas, Secuencias de inserción, distinto porcentaje de GC). Genes que codifiquen para proteínas con conocidos motivos estructurales. Por ejemplo proteínas con motivos asociados a transporte (proteínas de superficie) y pueden ser buenos candidatos para vacunas. Se investiga si son inmuógenos protectivos (Vaccinología reversa). 36 Vaccinología reversa ó varias proteínas de manera de abarcar las distintas cepas patógenas posibles 37 Enfermedad producida por un patógeno Qué interesa determinar? Detectar e identificar al patógeno Tipificación y detección de una determinada variante Testeo de susceptibilidad a drogas anti microbianas Detección en suero de anticuerpos anti patógeno Cuantificación del patógeno Identificación de genes marcadores útiles para diagnóstico Identificación de genes de virulencia Detección de potenciales blanco para drogas Detección de potenciales genes útiles para vacunas 38 SARS: síndrome respiratorio agudo severo Muestras: aspirados nasofaríngeos, esputo, suero, materia fecal, biopsias Investigación microbiológica y molecular para virus y bacterias conocidas por producir enfermedades pulmonares: yersinia, micoplasma, clamidia, legionella, rickettsia, virus de la influenza A y B, parainfluenza, adenovirus, etc. 1) técnicas de cultivo bacteriano específicas 2) propagación en líneas celulares in vitro para virus 3) inoculación en ratones 4) detección de patógenos conocidos por reacción Ag-Ac. IFA, ELISA. 5) Detección en suero de Acs anti patógenos conocidos 6) PCR, RT-PCR con primers específicos para patógenos conocidos. 39 Propagación in vitro en cultivo de células Efecto citopático Microscopía electrónica Presencia de partículas virales con morfología comparable a coronavirus. Utilización como antígenos para Detectar anticuerpos en suero de Pacientes. IFA RT-PCR Con oligos con secuencias al azar (comparando células infectadas con no infectadas) Con oligos diseñados sobre secuencias conservadas en distintos coronavirus Secuenciación y diseño de oligos específicos. 40
